Avano e perfis comparativos nas tecnologias de produo usando estado Slido e fermentao submersa para celulases microbianas

Introduo As celulases so enzimas que hidrolisam o b1, ligaes 4glucosidic de celulose. Eles esto presentes em 13 das 82 famlias glicosdeo hidrolase identificadas por anlise de seqncia [1]. Celulases hidrolisam a b1 ligaes, 4dglucan em celulose e produzir como produtos primrios de glicose celobiose e cellooligosaccharides. Este o complexo de enzimas mais estudados vrios composto de endoglucanases (EG), celobiohidrolases (CBH) e bglucosidases (BGL). Endoglucanases nicks produz o polmero de celulose expondo redutores e no termina, os atos celobiohidrolases sobre esses redutores e no acaba de liberar cellooligosaccharides e unidades de celobiose e bglucosidases fende a celobiose para liberar glicose, no completando a hidrlise [2]. O sistema completo, incluindo celulases CBH, EG e componentes BGL, portanto, atua em sinergia para converter a celulose em glicose cristalina. As celulases so atualmente o terceiro maior da enzima industrial no mundo, por volume de dlares, devido s suas amplas aplicaes no processamento de algodo, reciclagem de papel, na extrao de suco, como enzimas detergentes e aditivos para alimentao animal. No entanto, pode celulases se tornar o maior volume de enzima industrial, se o etanol de lignocelulose biomassa atravs da via enzimtica torna-se um importante combustvel para transporte. Tem havido um interesse crescente em todo o mundo para uma fonte alternativa de combustvel sustentvel, devido reserva limitada de combustvel fssil. Etanol a partir de biomassa lignocelulsica parece promissora, como matria-prima onipresente, abundante e pode desempenhar um importante papel na reduo de gases estufa. Tem sido afirmado que 10% de mistura de bioetanol com gasolina iria reduzir as emisses de dixido de carbono por 3-6%, o que torna o bioetanol um combustvel mais limpo, alm de ser uma alternativa renovvel ao petrleo [3]. Etanol produo de biomassa lignocelulsica por via biolgica parece muito atraente e sustentvel devido a vrias razes entre as quais a natureza renovvel e onipresente da biomassa e sua no competitividade com as culturas alimentares so os principais. Cerca de 2,9 103 milhes de toneladas de resduos lignocelulsicos esto disponveis a partir de culturas de cereais e 3 103 milhes de toneladas de pulso e oleaginosas. Tambm 5,4 102 milhes de toneladas so produzidas anualmente a partir de lavouras em todo o mundo [4]. Biomassa lignocelulsica responsvel por 50% do total de biomassa disponvel no mundo afirmando seu potencial como matria-prima vivel para produo de etanol. Bioconverso de biomassa celulsica utilizando celulases para produzir etanol visto como a mais importante aplicao desta enzima. A principal limitao no desenvolvimento de um etanol de lignocelulose vivel. A tecnologia o custo elevado e baixos ttulos de produo de celulases. H uma grande variedade de microrganismos envolvidos na produo de celulase, incluindo bactrias aerbias e anaerbias [5-8], podrido branca e fungos da podrido mole [9-11] e fungos anaerbios [12,13]. Em fungos filamentosos, actinomicetos e bactrias aerbias, as celulases so principalmente secretado como molculas

livres. A maioria das celulases exploradas para aplicaes industriais so a partir de fungos filamentosos como o Trichoderma, Penicillium, Fusarium, Humicola, Phanerochaete, etc, onde um grande nmero de celulases so encontrados [11,1417]. Embora a forma de crescimento filamentoso que provoca dificuldades na transferncia de massa em comparao com fermento ou crescimento bacteriano, tecnologias eficientes foram desenvolvidos para cidos, antibiticos e produo biolgica da enzima nativa de fungos filamentosos [18]. Estes fungos filamentosos produzem celulase complexos com todas as trs classes de enzimas em diferentes propores necessrias para a completa hidrlise da celulose.Trichoderma reesei um entre os produtores mais potente celulase estudada em detalhe. Ele produz dois celobiohidrolases (CBH I e CBH II) e os dois endoglucanases (GE1 e GE2), numa proporo aproximada de 60:20:10:10, que juntas podem fazer at 90% do coquetel de enzimas, enquanto sete bglucosidasesBGLIBGLVII secretadas por esse fungo normalmente makesup menos de 1% [19-21] .

2. Cellulase Cenrio de mercado a procura de celulases consistentemente a aumentar devido suas diversas aplicaes. Existem vrias empresas envolvidas na produo de celulases para o detergente txtil, indstrias de papel e outras indstrias.Globalmente, existem dois grandes jogadores conhecidos para a produo de celulases para a biomassa de converso "Genencor" e "Novozyme". Ambas as empresas tem desempenhado um papel significativo na reduo dos custos de celulase diversas dobras de sua pesquisa ativa e continuam a fazer descer os custos atravs da adopo de novas tecnologias. Recentemente, lanou Genencor Accelerase 1500, um complexo celulase especificamente destinados a lignocelulsicos indstrias de transformao de biomassa [22]. Alega-se a ser mais rentvel e eficiente para as indstrias de bioetanol do que seu antecessor, Accelerase 1000.Accelerase 1500 produzido com uma cepa geneticamente modificada de T. reesei. Esta preparao enzimtica reivindicada a conter nveis mais elevados de atividade bglucosidase que todos outras celulases comerciais disponveis hoje, de modo a assegurar a converso quase completa de celobiose em glicose [22]. Genencor tambm lanou Accelerase XY complexo enzima xilanase acessrio que melhora a xilana (C5) e glucana (C6) converso, quando misturados com outros Accelerase produtos da enzima [22]. Da mesma forma, Accelerase XC uma xilanase acessrio / complexo enzima celulase que contm um perfil amplo de atividades hemicelulase e celulase e melhora a xilana (C5) e glucana (C6), a converso, quando misturada com outros produtos Accelerase enzima [22]. Alm disso, Accelerase BG uma enzima bglucosidase acessrio que melhora a converso glucano (C6) quando misturado com outros produtos celulase [22]. Existem vrias celulases potenciais que podem revelar-se eficaz para a hidrlise da biomassa, quando suplementados com bglucosidase, indicando a importncia da Accelerase BG. A Novozymes tambm tem uma grande variedade de preparaes celulase disponveis com base na aplicao como Cellusoft AP e Cellusoft CR para bioblasting em fbricas txteis, Carezyme e Celluclean para a lavanderia no

detergente, Denimax 601l para a indstria stonewash a baixa temperatura, assim como muitos outros especfico para determinada aplicao [23]. Novozyme tambm anunciou a disponibilidade de preparao celulase especificamente para a hidrlise de biomassa no ano passado, embora no haja informaes disponveis sobre a fonte de produo, bem como a disponibilidade no mercado. Amano Enzyme Inc. no Japo e na ndia MAP na ndia so outros da indstria de enzimas envolvido ativamente na produo de celulases. Embora, a maioria das empresas produtoras de enzimas em todo o mundo est envolvido na produo e comercializao de celulases para diversas aplicaes, existem muito poucos deles que desenvolvem celulases para a converso de biomassa, a mais bem sucedida delas provavelmente a ser Genencor e Novozyme. A Tabela 1 mostra os principais jogadores celulases marketing com a marca diferente e sua fonte de origem, muitos dos quais podem ser modificados geneticamente cepas. 3. Celulases para bioconverso Celulases microbianas encontram aplicaes em uma variedade de indstrias onde celulases de diferentes graus de pureza so desejados. Apesar de celulases foram inicialmente investigados h vrias dcadas atrs para a bioconverso de biomassa, este mais tarde se tornou desinteressante e outras aplicaes industriais da enzima como na alimentao animal, alimentos e produtos txteis e de detergentes na indstria de papel eram predominantemente perseguido [24]. No entanto, com a escassez de combustveis fsseis ea necessidade decorrente de encontrar fontes alternativas de energia renovvel e combustveis, h uma renovao do interesse na bioconverso de biomassa lignocelulsica utilizando celulases, enzimas e outros. O desempenho de misturas de celulases em processos de converso de biomassa depende de vrias de suas propriedades, incluindo estabilidade, inibio pelo produto, o sinergismo entre as diferentes enzimas, ligao produtivo da celulose, o estado fsico, bem como a composio da biomassa da celulose [25].Celulases esto disponveis no mercado, sob diferentes nomes ou marcas para diferentes aplicaes, o que tambm pode ser julgado por hidrlise da biomassa.Nieves et al. [26] e Kabel et al. [27] analisaram e avaliaram o potencial de vrias celulases comerciais para converso de biomassa. Eles realizaram os ensaios de tipo para diferentes enzimas como papel de filtro Atividade (FPU), CMCase, bglucosidase e xilanase. No seria vivel para estimar a eficincia de celulases para a bioconverso, com base em testes padro, j que no existem relaes claras entre as atividades de celulase sobre substratos solveis e as insolveis em substratos [28].Assim, os substratos solveis no devem ser usadas para prever a eficincia de celulases para processamento relevantes substratos slidos, como paredes celulares das plantas. A escolha da preparao enzimtica para um particular a biomassa seria mais dependente das caractersticas da biomassa em vez de atividade enzimtica medida padro [27]. Preparaes com FPUs superior so desejveis para a bioconverso, desde papel de filtro altamente celulose cristalina, a degradao dos quais depende da combinao de atividades de EG e CBH, onde o GE cria nova cadeia termina para a CBH para ciso celobiose que mais atacado por BGL para dar [glicose 29,30]. Preparaes de celulase de um nico organismo pode no muito eficiente para a hidrlise de um estoque de alimentao especial.

Embora, os fungos filamentosos so a principal fonte de celulases e hemicelulases e as cepas mutantes de Trichoderma reesei incluindo T., T. viride e T. longibrachium so os melhores produtores da enzima conhecida, tambm sabido que estas espcies de Trichoderma tm um baixo nvel de atividade bglucosidase [31]. Celulases para a converso de biomassa pode ser uma mistura de enzimas ou coquetel contendo exocellulase endoand, xilanase, bglucosidase, pectinase, etc, que podem variar de diferentes biomas, com base em sua composio. A eficincia hidroltica de um complexo multienzimtico para sacarificao lignocelulose depende tanto de propriedades das enzimas individuais e sua relao no coquetel multienzimtico [32].O complexo celulase ideal deve ser altamente ativa sobre a biomassa como matriaprima destinada, capazes de hidrolisar completamente a biomassa, funcionam bem em pH levemente cido, suportar o esforo, processo e ser rentvel [33]. O sucesso de qualquer projeto de etanol lignocelulsico depender da capacidade de desenvolver sistemas de celulase tal. A chave para desenvolver as celulases so eficazes no sentido de uma matria-prima de biomassa em particular constru-los artificialmente, quer pelo conjunto de enzimas para formar um cocktail ou para projetar os produtores de celulases para expressar combinao desejada de enzimas celulase [1]. Ambas as abordagens tm sido experimentados com xito. coquetis enzimticos foram desenvolvidos atravs da mistura de T. reesei celulase com outras enzimas, incluindo as xilanases, pectinases e bglucosidases, e estes cocktails foram julgados por hidrlise de matria-prima diferentes [34,35]. Um dos exemplos recentes de coquetis desenvolvidos, incluem o complexo multienzimtico desenvolvido com base em celulases lucknowense altamente ativa Chrysosporium [32]. Caracterizao de celulases foi conseguida em grande medida por mutagnese sitedirected [28]. Esses estudos, bem como cristalografia de raios X das enzimas [28], tm levado identificao e caracterizao de resduos catalticos putativos e vinculativa, eo aprisionamento de complexos enzima-substrato. No entanto, o entendimento do mecanismo de degradao da celulose natural substratecrystalline permanece um grande desafio [2]. Existem vrios desafios que ainda precisam ser superados, por exemplo, a recalcitrncia da biomassa lignocelulsica, o que exige a etapa de pr-tratamento para abrir as fibras e diminuir a cristalinidade da celulose, que por sua vez aumentam o custo da tecnologia de etanol de lignocelulose. mtodos de pr-tratamento tambm precisa variar a partir de biomassa para a biomassa com base em suas caractersticas de composio [36]. Para o desenvolvimento de uma tecnologia economicamente vivel, a utilizao de matrias-primas mais baratas como substrato para produo de celulases poderia derrubar os custos de produo [2]. Tambm elimina as etapas de processamento a jusante da enzima para a bioconverso pode ajudar a reduzir o custo das celulases, como seria de outras abordagens, como melhorar as actividades especficas, a temperatura ea tolerncia a pH baixo, bem como engenharia do organismo para melhorar a produo. A maioria das celulases comerciais disponveis so produzidos a partir T. reesei e Aspergillus niger, mas T. reesei falta quantidade suficiente de b-glicosidase para realizar uma hidrlise adequada e completa [32]. Assim, a celobiose acumuladas devido a uma converso incompleta causada pela limitao dos montantes bglucosidase inibe exoand endoglucanases [2]. bGlucosidases tambm esto sujeitos inibio do produto pela glicose para alm de certos nveis, que variam entre as diferentes preparaes e as fontes da

enzima. Uma maneira de resolver este problema adicionar um bglucosidase tolerantes glicose mistura de reao contendo celulase outros componentes e empregar este cocktail para a hidrlise da biomassa, que permitir aumentar a eficincia de hidrlise [2]. H vrios relatos disponveis, onde um coquetel de enzimas tem sido empregada com sucesso para converso de biomassa [28,37-39]. 3.1. As caractersticas desejveis dos preparativos celulase por bioconverso Lote de caractersticas especficas, tais como maior eficincia cataltica em insolveis substratos celulsicos, maior estabilidade temperatura elevada e em um determinado pH e tolerncias mais elevadas a inibio produto final so desejveis em celulases para a converso de biomassa [40]. celulases cidas so geralmente mais desejvel para a bioconverso de uma vez em situaes em que o pr-tratamento cido da biomassa empregada ou quando a enzima tem que trabalhar no cocktail com enzimas de T. reesei, cujo ideal atividade est no prximo de 5, uma faixa de pH de 4-6 preferenciais. A maioria das celulases tentou, recomendada ou por bioconverso um melhor desempenho na faixa de pH de 4-6. Accelerase 1500 tem um pH timo de 4,6-5,0 mas fica abaixo de 4,0 ou inativada acima de pH 7.0. Normalmente 50? C de temperatura empregado para a hidrlise de celulases [39], mesmo Accelerase temperatura 1500 funciona bem em variando de 50 a 65 anos? C embora s extremidades inferiores da faixa de temperatura, o tempo de vida til da enzima maior. A maioria dos fungos filamentosos, tais como T. reesei e A. niger produzir celulases cidas, que so adequados para a hidrlise da biomassa. Algumas das caractersticas importantes de celulases comercialmente disponveis com potencial para ser utilizada na converso de biomassa esto listadas na Tabela 2. 4. Avano em pesquisa no bioprocesso de produo de celulases Celulase uma rea importante de investigao a nvel mundial, e com o interesse rejuvenescido criado devido as suas aplicaes na converso de lignocelulose, vrios pesquisadores em todo o mundo esto trabalhando em algum aspecto da celulase [2]. A produo de baixos ttulos de celulase foi sempre uma preocupao amajor e trabalhadores, assim, vrias est tentando melhorar a produo de ttulos atravs da adopo de abordagens multifacetadas, que incluem a utilizao de melhores tecnologias de bioprocessos, usando mais barato ou matrias-primas brutas como substratos para produo de enzimas, os microrganismos bioengenharia, etc [2,19]. Uma parte significativa da investigao tenta abordar as estratgias de melhoria de bioprocessos para melhorar o rendimento e as atividades especficas de celulases. Sukumaran et al. [2], em sua reviso discutiu as tecnologias empregadas bioprocesso para a produo de celulase utilizando diversos microorganismos e os desafios futuros. A maioria dos relatrios sobre a produo de celulases microbianas utiliza a tecnologia de fermentao submersa (SMF) eo organismo amplamente estudada utilizados na produo de celulase-T. reesei tambm foi testado principalmente em meios lquidos. No entanto, na natureza, o crescimento e utilizao de celulose de microrganismos aerbios elaborao celulases provavelmente parecida com a fermentao de estado slido de um lquido de cultura [41,42]. Durante duas ltimas dcadas de fermentao de estado slido recuperou de juros devido ao altos ttulos de produo da enzima empregando culturas de fungos [43]. O tipo de substrato lignocelulsico teve o maior impacto sobre a secreo de celulases. Alguns dos substratos estimulou significativamente a sntese da enzima

lignocelulolticos sem suplementao do meio de cultura com indutores especficos [44]. No entanto, as vantagens de um melhor acompanhamento e tratamento ainda so associados com as culturas submersas [15].Atualmente usado bioprocessos e do estatuto da produo de celulases com base na literatura so apresentadas na Tabela 3.Adirect comparao dos rendimentos e as atividades da celulase nesses relatrios so impossveis devido s diferenas nos mtodos de ensaio ea forma como as atividades esto sendo expressos, apesar do fato de que h um mtodo aprovado pela IUPAC de ensaio para determinao da atividade da celulase [45]. Alm disso, no h forma de comparar celulases produzidas por FES e SMF diretamente. 4.1. fermentao estado slido Fermentao Estado Slido (SSF) definida como a fermentao, na ausncia ou quase ausncia de gua livre [46]. SSF para a produo de celulases est rapidamente ganhando interesse como uma tecnologia rentvel como os microorganismos, principalmente as culturas de fungos produz ttulos comparativamente alto de celulase, devido s condies de fermentao o que mostra semelhana com o ambiente natural [47,48]. Os fungos filamentosos como T. reesei, A. niger, Penicillium sp., etc tm sido empregadas para a produo de celulase atravs da fermentao de estado slido em uma clula basal e sais minerais foi utilizado para umedecer o substrato. Chahal [49] relataram um rendimento mais elevado de celulases de T. reesei em culturas SSF em relao ao meio lquido.Tengerdy [50] comparou a produo de celulase em sistemas de SMF e SSF e indicou que houve uma reduo de cerca de 10fold no custo de produo quando a FES utilizada para a produo. Solidstate culturas so recomendadas para sistemas de produo de celulases em preo inferior culturas submersas [51], a concentrao do produto continua a ser bastante mais elevados, reduzindo assim a etapa de processamento a jusante, por sua vez, reduzindo o custo de operao. Nigam e Singh [52] analisaram a utilizao de resduos agrcolas como substratos para produo de enzimas celulolticas no SSF e acreditamos firmemente que, com a tecnologia adequada, design biorreator melhorado, e controles de operao, SSF pode tornar-se um mtodo competitivo para a produo de celulases. A reviso por Pandey et al. [53] a FES para a produo de enzimas industriais tambm descreve a aplicao da tecnologia para a produo de celulase. SSF pode assim ser considerada como uma tecnologia do futuro para a produo comercial de celulases, considerando a entrada de baixo custo e capacidade de utilizar as fontes disponveis naturalmente de celulose como substrato. As celulases produzidas em Solidstate mostra de cultura notvel estabilidade para a temperatura, pH, ons metlicos, etc Dutta et al. [54] afirmou que o celulase produzida por Penicillium citrini SSF empregando apresentaram tolerncia ao alcalide, pela primeira vez. SSF prova ser tecnologia eficiente para produo de celulases para a bioconverso, uma vez que a pureza no uma necessidade muito rigorosos para essa aplicao, e uma preparao enzimtica concentrada serviriam ao propsito. Tambm foi relatado que a enzima produzida utilizando a biomassa da mesma a ser utilizada para bioconverso se mostra mais eficiente do que o produzido em outros celulsico substrato [19]. Otimizao das condies de FES para a produo, quando tentou ainda pode melhorar a economia global de produo e tambm torn-la uma

tecnologia atrativa para produo de celulases. Ele oferece muitas vantagens sobre o SMF, incluindo alta produtividade volumtrica, maior concentrao de produtos, menor gerao de efluentes e represso catablica baixa, o que torna uma tecnologia promissora em futuro prximo [43]. 4.2. fermentao submersa

Fermentao submersa foi definida como a fermentao na presena de excesso de gua. Quase todas as enzimas em larga escala a produo de instalaes esto usando a tecnologia comprovada de SMF devido a um melhor acompanhamento e facilidade de manuseio. Embora as bactrias e actinomicetos tambm so relatados para a produo de celulase, os ttulos so muito baixas para tornar a tecnologia economicamente vivel. A maioria das celulases comerciais so produzidas pelo fungos filamentosos-T. reesei e A. niger em FSm [6,55]. produo de celulases nas culturas fortemente influenciado por diversos parmetros, incluindo a natureza do substrato de celulose, pH do meio, a disponibilidade de nutrientes, a suplementao de indutor, fermentao a temperatura, etc, e uma produo em larga escala requer de celulases entendimento e controle adequado do crescimento e da capacidade de produo de enzimas do produtor. As celulases produzidas por organismos de compostagem, como a fungos filamentosos, Trichoderma, Penicillium e Aspergillus, Humicola, etc, pode executar em escalas diferentes de pH e temperatura. A composio do meio de fermentao de preocupao significativa uma vez que nenhuma composio geral pode dar o timo crescimento e produo de celulases. Tambm os meios utilizados so principalmente especficas para o organismo em causa. Em T. reesei, um meio basal aps Mandels e Reese [56] ou Mandel e Weber [57] tem sido mais freqentemente usado com ou sem modificaes. No entanto, vrios destes meios so extremamente complicada, pois muitos fatores e suas interaes podem afetar a produtividade de celulases [58]. Celulases microbianas esto sujeitas a mecanismos de induo e represso eo processo de concepo e formulao de meios para a produo de celulase tem que cuidar destes aspectos. Entre os indutores conhecidos de genes de celulase, a lactose considerada o aditivo s economicamente vivel em meios de fermentao industrial [21]. Embora a maioria dos processos descritos so processos batch, tem havido tentativas de produzir celulases na fedbatch com a produo de enzimas melhoradas [59-61], ou de modo contnuo [62-64], que supostamente ajuda a substituir a represso causada pelo acmulo de acares redutores. Maior tempo de fermentao com uma baixa produtividade tem sido a principal limitao tcnica na produo fermentativa de celulases, desde h muito. Um processo de duas fases contnuas para produo de celulases poderia ser empregado em que a fase de crescimento ea fase de produo foi separada por diferentes valores de pH e temperatura timos. Isto foi descrito j em 1979 [65]. Represso por glicose e celobiose so conhecidas caractersticas dos sistemas de celulase e diversas tentativas tm sido direcionados para o desenvolvimento de mutantes resistentes represso catablica [66,67]. Celulases de T. reesei uma enzima e melhores atividades foram relatados quando cultivadas em meio contendo celulose. Principalmente, os preparativos de celulose pura, como SolkaFloc Avicell e tem sido utilizado nas culturas de microorganismos celulolticos

lquido para a produo de enzimas naturais e materiais celulsicos, quando utilizado como fonte de carbono apresentaram rendimentos de enzima pobres [68]. Enquanto estiver usando substratos solveis, a quebra produtos pode prejudicar a sntese de celulase, promovendo a represso catablica devido ao acmulo de acares livres. As fontes de carbono na maioria das impurezas celulase comercial so a biomassa celulsica variando a partir de celulose pura palha, passou casca de cereais e leguminosas, farelo de arroz ou de trigo, bagao de cana, resduo da indstria de papel, esterco e de vrios outros resduos lignocelulsicos [60,69 - 73]. Aumento da produo em fermentadores podem ser alcanados por uma alimentao de um gradiente adequado de celulose e manuteno das condies do processo em seu ideal [61]. A maioria desses so capazes de induzir o sistema de celulases em fungos, muitas vezes a par com os indutores conhecidos ou s vezes at melhor [15]. As celulases produzidas por FES adicionar FSm foram listadas na Tabela 3. 4.3. Morfolgica relao crescimento / com a produo de celulases

Produo de celulase em culturas o crescimento associado. Os fungos filamentosos tm a tendncia a crescer aderidas a superfcies ea influncia deste tipo de crescimento sobre a fisiologia de fungos ainda no foi bem estudada, principalmente quando relacionados com a produtividade [74]. Em condies naturais, entre em contato com superfcies de fungos necessrio para a absoro de nutrientes, secreo de enzimas e crescimento apical das hifas.Os fungos filamentosos podem crescer de forma significativa, na ausncia de gua livre [75]. Considerando que o crescimento submerso de flutuao livre de fungos no natural, o crescimento e dentro substratos slidos fundamentalmente relacionados com a adeso celular. morfologia de crescimento de fungos filamentosos um parmetro importante relacionado com a produtividade de diversos processos industriais. Embora favorvel aspectos fisiolgicos so compartilhadas com a fermentao de estado slido, os biofilmes de fungos apresentam melhores possibilidades de controle de processo e scaleup [74]. Importncia da morfologia da produtividade de fungos processos submersos, colocando biofilmes em uma categoria preferencial tem sido elucidada pela Villena e GutierrezCorrea [74]. biofilmes de fungos so morfologicamente sistemas eficientes para a produo da enzima. Em vrias espcies de fungos, principalmente aqueles que aderem atravs da produo de adesivos, a adeso pode ser considerada como um processo metabolicamente ativo [76,77] envolvendo sinalizao e mecanismos de expresso diferencial de genes [78]. Uma clara relao entre a morfologia ea produtividade no foi ainda estabelecida [79]. Uma vez que, fungos morfologia influencia a produtividade das fermentaes fngicas, de grande importncia para conhecer o comportamento de fungos durante o cultivo para produo de celulase. Fermentao componente de mdio bem como os fatores fsico-qumicas podem ser responsveis pela variao na morfologia. Mesmo alm do sistema de buffer diferentes com variados concentrao; influncia da morfologia de fungos, o que demonstra uma clara transio de forma agregada s formas peletizada em culturas [80]. Fngicas crescimento, bem como a morfologia podem ser fortemente correlacionada com a produo de celulase.

5. Projetado

celulases

artificial

Embora vrios fungos filamentosos so capazes de produo de celulases, o rendimento da enzima e os nveis de componentes de celulase individual muitas vezes no so satisfatrias para a comercializao. Melhorias nos ttulos de celulase, assim como a habilidade de costurar as relaes de exoglucanases endoand e bglucosidase produzidas por organismos so altamente desejado para a converso de biomassa.Informaes muito relevantes relacionados com a regulao do gene da celulase foi revelada mais de uma dcada atrs, como evidente a partir da publicao. Uma recente publicao sobre o estudo do genoma do T. reesei [81] revelou que apesar de ser o melhor produtor de celulases conhecido, o genoma do fungo contm celulases e hemicelulases menos do que qualquer outros fungos seqenciado. Os autores no conseguimos encontrar profundo conhecimento sobre o mecanismo extremamente eficiente de protenas de secreo no fungo. Este trabalho tem enormes implicaes na compreenso da gentica deste organismo importante, e tambm permitiria a produo melhorou os processos crticos para a reduo do custo de converso de biomassa. T. reesei e outros fungos filamentosos noncomplexed produzir celulases. Celulase de engenharia para sistemas de celulase noncomplexed contm trs direes de pesquisa principais: (1) projeto racional para cada celulase, com base no conhecimento da estrutura de celulase e do mecanismo cataltico [1,82], (2) cassete de expresso e de evoluo dirigida para cada celulase, em que o melhor enzimas ou aqueles com novas propriedades foram selecionadas aps mutagnese aleatria e / ou de recombinao molecular [55,83-85] e (3) a reconstituio dos cocktails celulase ativos insolveis em substratos celulsicos, rendendo uma taxa de hidrlise melhorada ou maior digestibilidade da celulose [39,86-89]. Melhorias nas atividades especficas para as misturas de celulase celulase noncomplexed pode ser implementada atravs de engenharia celulase baseado no desenho racional ou evoluo dirigida para cada componente da celulase, como bem como a sua reconstituio [90]. Artificial celulase concepo parece abrir uma nova avenida para o campo e parece ser mais promissor para a criao de celulases com as caractersticas desejadas.Altamente termoestvel classe II celobiohidrolase (CBH II) quimeras foram desenvolvidos por recombinao estrutura guiada de trs fungos classe II celobiohidrolase (CBH II) [25]. O aumento da termoestabilidade e melhoria na atividade do CBH II foram dois objetivos principais. Optimizado misturas de celulase para a converso de biomassa pode ser formulado uma vez inventrios de celulases estveis esto disponveis. mutagnese Sitedirected tem enormes oportunidades para a introduo de caractersticas desejadas para as enzimas solveis agindo em substratos, mas celulases com seu complexo e heterogneo substrato insolvel celulose relativamente difcil de manipular [1] Entre as diversas razes para este desafio a interao dinmica entre inexplicvel a ligao de celulose domnio (CBD) eo domnio cataltico [25]. Ainda existem vrios excelentes comentrios que resumem vrios estudos utilizando mutagnese sitedirected para investigar os mecanismos de celulase e melhorando as propriedades da enzima [1,82]. Baker et al. relataram uma melhoria de 20% na atividade sobre a celulose microcristalina de amodified endoglucanase Cel5A de cellulolyticus Acidothermus

[91].A endoglucanase Cel5A, cuja estrutura cristalogrfica de alta resoluo est disponvel, foi submetido a uma srie de mutaes destinadas a alterar a qumica do lado productleaving da fissura stio ativo. Um mutante (Y245G) foi mostrado para aumentar Ki de celobiose por 15fold, por substituio de um resduo no aromticos no local 245. No entanto, hoje no existem regras gerais para as estratgias de mutagnese stio direcionado para melhorar atividade da celulase sobre a celulose substratos slidos e ainda permanece em uma experimentao e teste processo [28]. genes de celulase de fungos filamentosos potentes, tais como, Trichoderma e Aspergillus podem ser isolados, clonados e expressos em hospedeiros de fungos para obter uma melhor combinao ou sinergismo. O celobiohidrolase I (CBH I) promotor de T. reesei um promotor conhecido altamente eficiente com uma taxa anormalmente elevada de expresso sob celulase condies de induo e tem sido utilizado para conduzir a expresso de bglucosidase [92] e endoglucanase [93], assim, melhorar o perfil de celulase da linhagem hospedeira. O promotor tambm tem sido utilizado para conduzir a expresso de diversas protenas homlogas e heterlogas em Trichoderma [94,95]. Glicose represso de genes de celulase foi abordada atravs de um CBH truncado I promotor faltam stios de ligao para o repressor catablica CRE1 [96]. Outra importante estratgia utilizada para melhorar produo de celulases em presena de glicose a utilizao de promotores que so insensveis a represso por glicose. NakariSetala e Pentill [97] usou os promotores de fatores de transcrio de alongamento e um tef1, e que de um DNA no identificado (cDNA1) para dirigir a expresso da endoglucanase e celobiohidrolase em T. reesei com o resultado da desrepresso destas enzimas. Esses estudos indicam que a engenharia adequada para a obteno de seqncias de expresso de protenas de cbh1 promotor e manipulaes do promotor de abolir a represso pode melhorar drasticamente a produo da protena clonada. O sistema de celulase de T. reesei, bem como de vrios outros fungos limitada pela quantidade relativamente menor de bglucosidase e sua inibio por feed back da glicose. b-glucosidase, que insensvel ou pelo menos tolerante glicose e celobiose altamente desejado para a converso de biomassa da celulose em glicose como sistemas de celulase de vrios outros fungos so limitados pela quantidade relativamente menor de bglucosidase e sua inibio por feed back de glicose [15 ]. A investigao sobre esta linha tem rendido bglucosidases potencial de microorganismos diferentes, como peltata Candida [98], Aspergillus oryzae [99], e A. niger [15.100]. Uma das enfermeiras das abordagens mais importantes tomadas para a melhoria do complexo celulase para a hidrlise da biomassa aumentar o nmero de cpias do gene bglucosidase e, assim, a quantidade da enzima BGL na mistura de celulases produzidas pelo T. reesei [101], enquanto outra alterar o perfil de celulase de T. reesei por introduo de glucose gene BGL tolerantes ao fungo [92]. Preparaes de celulase de um nico organismo pode no ser muito eficiente para a hidrlise de matria-prima diferente (ver seco 3). Outra idia interessante o uso de celulossomas artificial gerado por bactrias engenharia celulossoma rolamento para expressar celulases heterloga. celulossomas quimricos tm sido descritos para a degradao dos substratos celulsicos, quer atravs da incorporao de bactrias [102.103] ou fngicas [104] celulases em celulossomas pela engenharia gentica. Os complexos artificiais de celulase atividades reforado do que os correspondentes sistemas livres, pelo menos, no caso das enzimas bacterianas [102.103]. Os benefcios do desenvolvimento de sistemas de

expresso heterloga de celulases em rpido crescimento de bactrias incluem aumento substancial da estabilidade da enzima e atividade especfica, o potencial de maior densidade celular utilizando culturas fedbatch, uma reduo drstica no tempo cellgrowth, eo potencial de superproduo da protena [104]. O aumento da atividade foi proposta a ser resultante da sinergia adicional induzido pela proximidade da enzima no interior do complexo e do efeito do mdulo de celulose de ligao oferecida pelo andaime quimrico em que ancora todo o complexo na superfcie do substrato [104]. abordagens discutidas acima poderia ser til para o desenvolvimento de celulases para vrias aplicaes especficas, o mais importante para a bioconverso. 6. Concluses Desenvolvimento de celulases melhorado para bioconverso parece ajudar a concretizar o sonho de desenvolver o etanol lignocelulsico ecofriendly a uma realidade. Melhoria na celulases foi atingido em parte pela evoluo da tecnologia de produo, tais como, adotando a tecnologia mais barata de bioprocessos, empregando mais barato substrato e empregando organismos manipulados e em parte pela evoluo da artificial / celulases engenharia e coquetis de enzima. As empresas enzima levando crdito e tambm derrubou o preo das celulases significativamente. Embora a produo de etanol lignocelulsico comercial s comeou em algumas partes do mundo, ainda pesquisa contnua necessria para melhorar diversos aspectos sobre a produo de celulase (tais como custo, atividade especfica e especificidade de substrato) para alcanar uma melhor viabilidade tecno. Artificial / celulases engenharia e coquetis de enzima rica em glicose bglucosidase tolerante foi provado sucesso para aumentar a taxa ou eficincia de hidrlise da biomassa, de modo a provar que a tecnologia economicamente vivel.Mas, o fato no se pode negar que, apesar de vrios esforos, celulase por bioconverso embora disponveis no mercado no facilmente acessvel. Ela significa o caminho mais longo at para ir.