CAPTULO 2.5.10.

ARTERITIS VIRAL EQUINA

RESUMEN
La arteritis viral equina (AVE) es una enfermedad vrica y contagiosa de los quidos causada por el virus de la arteritis equina (EAV), un virus con ARN clasificado en la familia Arteriviridae. Hasta el momento solo se ha identificado un serotipo importante del virus de la arteritis equina. El virus se encuentra en las poblaciones de caballos de muchos pases por todo el mundo. Aunque en el pasado se describan muy raramente, los brotes de AVE parecen en aumento. La mayora de las infecciones adquiridas naturalmente con el EAV son subclnicas. Cuando aparecen, los sntomas clnicos de la AVE varan en extensin y gravedad. La enfermedad se caracteriza principalmente por fiebre, depresin, anorexia, edema, en especial en las patas y en el escroto y prepucio de sementales, conjuntivitis, una reaccin cutnea de tipo urticario, abortos, y, en raras ocasiones, neumona fulminante y neumoenteritis en potros jvenes. Excepto por la mortalidad en potros jvenes, la frecuencia de casos con mortalidad en los brotes de AVE es muy baja. Por lo general, los caballos afectados se recuperan por completo desde el punto de vista clnico. En un porcentaje variable de sementales infectados se establece un estado de portador permanente, pero no en yeguas, caballos castrados o en potros sexualmente inmaduros. Identificacin del agente: Clnicamente la AVE no puede diferenciarse de otras enfermedades equinas de tipo respiratorio y sistmico. El diagnstico de la infeccin por el EAV descansa en el aislamiento del virus, la deteccin del antgeno vrico o su cido nucleico, o en la demostracin de una respuesta especfica de anticuerpos. Se debe intentar el aislamiento del virus en cultivos celulares de rin de conejo, caballo o mono, a partir de muestras clnicas apropiadas o en las obtenidas post mrtem. La identidad de los aislamientos del EAV debe confirmarse por pruebas de neutralizacin, por la reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin inversa (RT-PCR), o por mtodos inmunoqumicos, fundamentalmente por inmunofluorescencia indirecta o por tcnicas de avidinabiotinaperoxidasa. En casos sospechosos de enfermedad la deteccin e identificacin del cido nucleico del EAV tambin puede intentarse utilizando la prueba RT-PCR y cebadores apropiados especficos del ARN vrico. Cuando la mortalidad se asocia con un brote sospechoso de AVE, debe examinarse una amplia variedad de tejidos para evidencia histolgica de panvasculitis, que es especialmente notable en las pequeas arterias de todo el cuerpo. Las lesiones vasculares caractersticas que se presentan en el animal maduro no son una propiedad destacable en los abortos relacionados con la AVE. En tales casos, los antgenos vricos de la arteritis equina pueden observarse mediante anlisis inmunohistoqumico de tejidos fetales y de la placenta. Pruebas serolgicas: Para la deteccin de anticuerpos frente al EAV se han utilizado varias pruebas serolgicas que incluyen la neutralizacin vrica (NV), fijacin del complemento (FC), inmunofluorescencia indirecta, inmunodifusin en medio slido, enzimoinmunoensayo (ELISA), y el inmunoensayo de microesferas fluorescentes. Las pruebas actualmente ms utilizadas son la prueba de la NV aumentada con complemento y la tcnica ELISA. La prueba de la NV es muy sensible y especfica y tiene mucho valor en el diagnstico de la infeccin aguda y en estudios de seroprevalencia. Se han desarrollado varios mtodos de ELISA, ninguno de los cuales ha sido validado tan ampliamente como la prueba de la NV aunque algunos parecen mostrar una especificidad y sensibilidad casi idntica. La prueba de la FC es menos sensible que cualquiera de estos procedimentos, pero puede utilizarse para diagnosticar una infeccin reciente.

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Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Existen dos vacunas comerciales contra la AVE derivadas de cultivo de tejidos. Una es una vacuna con virus vivo modificado (MLV) que se prepara a partir de un virus que se ha atenuado para los caballos por mltiples pases seriados en cultivos primarios de clulas de caballo y de conejo. Se ha demostrado que es segura y protectora para caballos sementales y yeguas no preadas. Est contraindicada la vacunacin de potros menores de 6 semanas de edad y de yeguas gestantes en los dos ltimos meses de gestacin. No existe evidencia de reversin del virus vacunal a virulento despus de su utilizacin en el campo durante ms de 20 aos. La segunda vacuna es un producto inactivado y con adyuvante que se prepara con virus obtenido de cultivo celular equino que puede usarse tanto en caballos de reproduccin como en los no reproductores. A falta de datos apropiados sobre seguridad, no se recomienda en la actualidad el uso de la vacuna en yeguas gestantes.

A. INTRODUCCIN
La arteritis viral equina (AVE) es una enfermedad vrica contagiosa de los quidos causada por el virus de la arteritis equina (EAV), un virus con ARN monocatenario y con polaridad de mensajero, que es el miembro prototipo del gnero Arterivirus, de la familia Arteriviridae, orden Nidovirales (10). Algunas de las denominaciones descriptivas que se usaron en el pasado para referirse a una enfermedad clnicamente muy semejante a la AVE son linfangitis epizotica de ojo rosado, fiebre tifoide y rotlaufseuche. El espectro natural de hospedadores del EAV parece restringido a los quidos, aunque existe alguna evidencia de que tambin puede incluir los camlidos del nuevo mundo, como las alpacas y las llamas (63). Los virus no constituye un riesgo sanitario para los humanos (59). El EAV est presente en los caballos de muchos pases en todo el mundo (59). En los ltimos aos ha habido un aumento en la incidencia de la AVE asociada a una mayor frecuencia de movimiento de caballos y a la utilizacin de semen transportado (2, 59). Aunque la mayora de los casos de infeccin aguda con el EAV son subclnicos, algunas cepas del virus originan enfermedad con una gravedad variable (59). Los casos tpicos de AVE se pueden presentar combinados con cualquiera de los siguientes sntomas o una combinacin de los mismos: fiebre, depresin, anorexia, leucopenia, edema, especialmente en las patas, escroto y prepucio de los sementales, conjuntivitis, descargas oculares, edema supra y periorbital, rinitis, descarga nasal, reaccin cutnea local o generalizada de tipo urticario, aborto, mortinatos y, raramente, neumona, enteritis o neumo-enteritis fulminante en potros jvenes. Independientemente de la gravedad de los sntomas clnicos, los caballos afectados se recuperan casi siempre por completo. La frecuencia de casos mortales en brotes de AVE es muy baja; en general, la mortalidad solo se presenta en potros muy jvenes, sobre todo en aquellos con infeccin congnita del virus (37, 59, 62) y muy raramente en caballos adultos que por lo dems, estn sanos. La AVE no se puede diferenciar clnicamente de varias enfermedades respiratorias y sistmicas equinas, siendo las ms comunes la gripe equina, las infecciones por herpesvirus equinos 1 y 4, las infecciones con los virus A y B de la rinitis equina y por adenovirus, as como las infecciones debidas a estreptococos, particularmente la prpura hemorrgica. La enfermedad tambin presenta similitudes clnicas con la anemia infecciosa equina, casos de infeccin con el virus Hendra o el virus Getah, e intoxicacin causada por el aliso gris (Berteroa incana). Despus de la infeccin, el EAV se multiplica en macrfagos y monolitos circulantes (18) y se propaga a travs de varias secreciones y excreciones de los animales en fase de infeccin aguda con una gran concentracin del virus en el tracto respiratorio (42). Un porcentaje variable de sementales con infeccin aguda se convierten ms tarde en portadores crnicos del virus en el tracto reproductivo y en excretores continuos a travs del semen (59, 60). Se ha demostrado que el estado de portador depende del carcter andrgeno y solo se ha encontrado en sementales, pero no en yeguas, caballos castrados o potros sexualmente inmaduros (59). Se han encontrado pruebas inequvocas del estado de portador solo en sementales seropositivos para los anticuerpos frente al virus (60). Aunque la disminucin temporal de los niveles de testosterona circulante mediante la utilizacin del antagonista GnRH o mediante inmunizacin con GnRH parece acelerar la exclusin del estado de portador en algunos sementales, an est por determinar de forma fehaciente la eficacia de cada uno de esos dos tratamientos. Existe la preocupacin de que ese enfoque teraputico pueda ser utilizado para enmascarar de forma deliberada la condicin de verdadero portador.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.
a)

Identificacin del agente

Aislamiento del virus
Cuando se sospecha la aparicin de un brote de AVE o cuando se intenta confirmar un caso de una infeccin subclnica por el EAV, debera aislarse el virus de frotis nasofarngeos y conjuntivales, muestras

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de sangre no coagulada, y semen de los sementales que puedan ser posibles portadores del virus (59). Para aumentar la probabilidad de aislar el virus, se deben obtener muestras representativas lo ms pronto posible despus de la aparicin de la fiebre en los caballos afectados. Hay evidencias de que la heparina puede inhibir el crecimiento del EAV en clulas de rin de conejo (lnea celular RK-13) (1) y, por tanto, su empleo como anticoagulante est contraindicado ya que puede interferir con el aislamiento del virus a partir de sangre completa. El cido citrato dextrosa y el cido etilndiamino tetraactico (EDTA) son los anticoagulantes de preferencia para utilizar en la obtencin de muestras sanguneas no coaguladas. Cuando en casos de mortalidad de potros y animales ms viejos se sospeche que se trata de la AVE, se puede intentar el aislamiento del EAV de varios rganos, especialmente de los ganglios linfticos asociados con el tracto alimentario y rganos asociados, y tambin de los pulmones, hgado y bazo (42). En brotes de aborto relacionados con la AVE y/o en los casos de potros mortinatos los lquidos placentarios y fetales, as como los tejidos fetales (especialmente los de pulmn), placentarios y linforeticulares pueden ser una fuente productiva de virus (59). Los frotis tomados para el aislamiento deben introducirse en un medio adecuado de transporte y, junto con lquidos o tejidos recogidos para aislamiento del virus y/o para pruebas por la reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin inversa (RT-PCR), deben enviarse al laboratorio refrigerados o congelados en un contenedor con aislamiento, utilizando con preferencia un servicio nocturno de transporte. Las muestras de sangre no coagulada deben transportarse refrigeradas pero no congeladas. Cuando sea posible, las muestras se enviarn al laboratorio competente para realizar las pruebas relacionadas con esta infeccin. Aunque se ha descrito que no siempre se logra en casos naturales de infeccin por EAV (43, 59), el aislamiento del virus se debe intentar a partir de muestras clnicas o de tejidos de necropsias utilizando cultivos celulares de rin de conejo, caballo o mono (43, 57, 59). Se pueden usar lneas celulares seleccionadas como RK-13 (ATCC CCL-37), LLC-MK2 (ATCC CCL-7) y cultivos primarios de rin de caballo o conejo, aunque el sistema de eleccin son las clulas RK-13 (57). Con el paso de los aos, la experiencia nos ha enseado que los aislamientos primarios del EAV a partir de semen puede provocar ms dificultades que los procedentes de otras muestras clnicas o los de tejidos infectados, salvo que se utilice un sistema adecuado de cultivo celular. El aislamiento primario del EAV en clulas RK-13 a partir del semen parece influenciado por varios factores (49). Se obtienen aislamientos ms frecuentes cuando se utilizan monocapas de 35 das de edad, un gran inculo en comparacin con el rea que presenta la superficie celular en frascos o en placas con multipocillos inoculados y, sobre todo, cuando se incorpora carboximetil celulosa al medio (viscosidad del medio, 400800 cps). Debe advertirse que la mayora de las clulas RK-13, incluyendo la ATCC CCL-37, estn contaminadas con el virus de la diarrea bovina, cuya presencia parece aumentar la sensibilidad de este sistema para el aislamiento primario del EAV, especialmente el obtenido de semen. Hay evidencia abundante que indica que el aislamiento primario del EAV, sobre todo de semen, aumenta cuando se utilizan clulas RK-131 con una historia de elevado nmero de pases (57). Los cultivos inoculados se examinan diariamente para observar efecto citoptico (ECP), que normalmente aparece a los 26 das. En ausencia de ECP visible, los sobrenadantes de cultivo deben volver a inocularse en monocapas celulares confluentes despus de 47 das. Mientras que la inmensa mayora de los aislamientos del EAV se logran en el primer pase por cultivo celular, una pequea parte de los mismos solo se hace evidente en el segundo pase o en pases ulteriores in vitro (59, 60). La identidad de los aislamientos se puede confirmar en una prueba de neutralizacin, por el ensayo de RT-PCT estndar o en tiempo real (2, 12, 51, 53) o por un mtodo inmunocitoqumico (36), fundamentalmente por inmunofluorescencia indirecta (16) o por la tcnica de la avidinabiotinaperoxidasa (ABC) (36). Se ha utilizado un antisuero policlonal de conejo para identificar el EAV en cultivos celulares infectados. Tambin se han desarrollado anticuerpos monoclonales de ratn contra la protena de la nucleocpsida (N) (2, 40) y de la glicoprotena principal de envoltura (GP5) del EAV (2, 17) y un antisuero especfico de conejo contra la M de la envoltura no glicosilada (2, 39, 40), que permiten detectar varias cepas del virus en clulas RK-13 a las 1224 horas de la infeccin (2, 36).

Aislamiento de virus del semen (Prueba prescrita para el comercio internacional)

Existe amplia evidencia de que los sementales excretan constantemente a corto y largo plazo el EAV en el semen, pero no en secrecciones respiratorias o en la orina; tampoco se ha demostrado el virus en la capa leucocitaria de la sangre (clulas mononucleares perifricas de la sangre) de dichos animales (59, 60). La sangre de los sementales debe probarse primero mediante la prueba de neutralizacin vrica (NV), o mediante un enzimoinmunoensayo (ELISA) validado adecuadamente o mediante otros procedimientos de pruebas serolgicas. Se debe tratar de aislar el virus del semen de los sementales seropositivos (ttulo 1/4) con anticuerpos anti-EAV que no tengan antecedentes de vacunacin contra AVE asegurndose de que sean seronegativos (ttulo <1/4) en el momento de la vacunacin inicial. Tambin se recomienda el

Dicha linea celular (RK-13) puede obtenerse del Dr. P.J. Timoney, Director, Gluck Equine Research Center, Dept of Veterinary Science, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40546-0099, EE. UU. (E-mail address: ptimoney@uky.edu).

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aislamiento del virus en el caso de semen, cuando no se dispone del estatus serolgico ni del posible historial de vacunaciones del semental donante. A ser posible, el aislamiento del virus a partir del semen debe intentarse con dos muestras, que se pueden recoger el mismo da, en das consecutivos o a intervalos de das o semanas. No hay evidencias de que el resultado del aislamiento del virus de un semental particular est influenciado por la frecuencia del muestreo, el intervalo entre la toma de muestras o la poca del ao. El aislamiento del EAV debe realizarse con preferencia en una porcin del eyaculado completo recogido mediante una vagina artificial o mediante un condn y un maniqu. Cuando no es posible obtener semen de este modo, un mtodo alternativo menos deseable es tomar una muestra en la monta. Se debe tener cuidado en no usar antispticos o desinfectantes en la limpieza de los genitales externos del semental antes de la recogida. Las muestras deben contener la fraccin de la eyaculacin rica en esperma con la que se asocia el EAV, ya que el virus no se presenta en la fraccin pre-esperma del semen (59, 60). Inmediatamente despus de la recogida, el semen debe refrigerarse en hielo o en nevera para su traslado al laboratorio sin retraso. Cuando se pueda producir alguna demora en el envo del semen al laboratorio para su anlisis, se puede congelar a 20C, o menos, durante un breve periodo de tiempo. No se ha detectado que la congelacin de las muestras disminuya el aislamiento del EAV del semen de un semental portador. En situaciones en las que no sea factible determinar el estatus de portador del semental mediante el aislamiento vrico o por RT-PCR, podr comprobarse mediante su apareamiento con dos yeguas seronegativas, cuya seroconversin frente al virus ser verificada 28 das despus de la monta (59). i) Procedimiento de la prueba Al llegar al laboratorio, debe observarse si cada una de las muestras de semen est congelada, refrigerada o a temperatura ambiente. Debe examinarse cada muestra para asegurarse de que contiene la fraccin de la eyaculacin rica en esperma. Esto se puede determinar mediante el examen microscpico de preparaciones de la muestra montadas en fresco. Adems, las muestras de la eyaculacin deben inspeccionarse ocularmente para comprobar el color y la presencia contaminacin con partculas grandes. Si el espcimen de semen est contaminado con sangre, lo que puede derivarse de traumas de los genitales externos del semental durante la recogida, deber requerirse una repeticin de la muestra ya que el ensayo de tales muestras de un semental seropositivo puede poner en cuestin la fiabilidad de resultado del aislamiento vrico. Aunque ya no se considere como un paso esencial, el pretratamiento del semen antes de su inoculacin en cultivo celular mediante sonicacin a corto plazo (en tres ciclos de 15 segundos) facilita la mezcla y la dispersin efectivas de la muestra. Despus de eliminar el medio de cultivo se inoculan monocapas confluentes de clulas RK-13 de 3 5 das, dispuestas en frascos de cultivo de tejidos de 25 cm2 o en placas con pocillos mltiples, con diluciones decimales seriadas (101103) del plasma seminal en un medio de mantenimiento para cultivo de tejidos que contenga 2% de suero fetal bovino y antibiticos. Se utiliza un inculo de 1 ml en frascos de 25 cm2 y se inoculan al menos dos frascos por cada dilucin de plasma seminal. Cuando se utilizan placas con pocillos mltiples, se prorratea el tamao del inculo y el nmero de pocillos inoculados por dilucin de la muestra. En cada prueba se deben incluir diluciones apropiadas de una muestra control de semen positivo para el virus o de un virus utilizado como control de ttulo conocido diluido en el medio de cultivo. Los frascos se cierran, se vuelven a colocar las cubiertas sobre las placas multipocillo y se rotan cuidadosamente para dispersar el inculo cobre las monocapas celulares. Los cultivos inoculados se incuban a continuacin durante 1 hora a 37C en un incubador aerbico o en un incubador con humedad y una atmsfera con un 5% de CO2, dependiendo de si se emplean frascos o placas con pocillos mltiples. Sin extraer el inculo ni lavar la monocapa celular, se recubre esta ltima con medio que contiene 0,75% de carboximetil celulosa y antibiticos. Los frascos o las placas se incuban de nuevo a 37C y se analizan microscpicamente para ECP vrico, que por lo general se aprecia a los 26 das.

ii)

iii)

iv) v)

vi) vii)

viii) En ausencia de ECP visible, los sobrenadantes de cultivo se vuelven a inocular en cultivos monocapas de clulas confluentes RK-13 de 57 das. Despus de eliminar el medio con el que se cubren, las monocapas se tien con una solucin de cristal violeta tamponada y formalina al 0,1%. La identidad de cualquier virus aislado debe confirmarse por NV, por inmunofluorescencia (16), o por la tcnica ABC, utilizando un antisuero monoespecfico anti-EAV o MAb frente a las protenas estructurales N o GL del virus (18, 36, 37), o bien mediante una prueba de tipo RT-PCR estndar o en tiempo real (5, 38, 64). En la prueba de neutralizacin, se prueban diluciones decimales seriadas del virus aislado frente a un MAb o a un antisuero neutralizante monoespecfico preparado contra la cepa Bucyrus que es prototipo del EAV (ATCC VR 796) y tambin con un suero negativo para anticuerpos neutralizantes del virus. Como controles

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de la prueba se realizan las titulaciones correpondientes al virus prototipo Bucyrus con los mismos anticuerpos reaccionantes de referencia. La prueba se realiza en frascos de 25 cm2 para cultivo de tejidos o en placas con pocillos mltiples. Se inactivan durante 30 minutos cantidades apropiadas de anticuerpos positivos y negativos frente a EAV en un bao a 56C y se diluyen 1/4 en solucin salina tamponada con fosfato, pH 7,2; a continuacin, se distribuyen 0,3 ml del anticuerpo diluido en cinco tubos para cada aislamiento de virus problema. Se realizan diluciones decimales seriadas de cada virus (101105) en Medio Mnimo Esencial de Eagle con 10% de suero fetal bovino, antibiticos y 10% de complemento de cobaya fresco. Luego se aaden 0,3 ml de cada dilucin de virus a los tubos que contienen anticuerpos positivos y negativos. Se agitan los tubos y la mezcla de virus y anticuerpos se incuba durante 1 hora a 37C. Despus las mezclas se inoculan en cultivos confuentes en monocapa de clulas RK-13 de 35 das, en frascos de 25 cm2 o en placas con pocillos mltiples, utilizando dos frascos o pocillos por cada dilucin de virus. Cada frasco se inocula con 0,25 ml de la mezcla virus y anticuerpos; cuando se utilizan placas con pocillos mltiples se prorratea el tamao del inculo. Los frascos o placas inoculadas se incuban 2 horas a 37C, movindolas con cuidado a la hora para dispersar el inculo sobre la monocapa celular. Sin extraer el inculo ni lavar las monocapas celulares, estas se recubren con medio que contiene 0,75 % de carboximetil celulosa y se incuban 45 das a 37C en una incubadora aerobia o en una incubadora con humedad y una atmsfera con el 5% de CO2. Despus de eliminar el medio, las monocapas se tien con una solucin de cristal violeta tamponada y formalina al 0.1%. Se cuentan las placas o calvas producidas, y se determina el ttulo de infectividad del virus tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos anti-EAV utilizando el mtodo de SpearmanKrber (34). La confirmacin de la identidad de un aislamiento se basa en el recuento de las placas de reduccin de al menos 102 logs del virus en presencia del suero positivo para anticuerpos contra la cepa Bucyrus del EAV. La inmensa mayora de los EAV aislados en sementales portadores se logra en el primer pase en cultivo celular empleando el procedimiento indicado de la prueba (59, 60). La existencia de toxicidad no vrica o de contaminacin bacteriana en las muestras no es un problema importante cuando se trata de aislar este virus del semen de sementales. Si se observa toxicidad no vrica, normalmente aparece en las monocapas inoculadas con la dilucin 101 del plasma seminal y mucho ms raramente con la 102. Para superar este problema se ha empleado con cierto xito un tratamiento del plasma seminal con polietiln glicol (peso molecular 6000) (25). El mtodo descrito implica aadir polietiln glicol a las diluciones 101103 del plasma seminal hasta una concentracin final del 10% para cada dilucin. Las mezclas se mantienen una noche a 4C con agitacin suave y despus se centrifugan a 2.000 g durante 30 minutos, eliminndose el sobrenadante. Los precipitados se resuspenden en el medio de mantenimiento de los cultivos a la dcima parte del volumen de las diluciones originales y las mezclas se homogenizan. A continuacin se centrifugan a 2.000 g durante 30 minutos y los sobrenadantes se toman y se usan para inoculacin. No hay evidencias que indiquen que el pretratamiento del plasma seminal de este modo reduzca la sensibilidad del procedimiento para aislar el virus (25). Si la contaminacin bacteriana de una muestra presenta algn problema, es preferible requerir la repeticin de la recogida del semen del mismo semental. Si eso no es posible, puede intentarse el control de la contaminacin mediante el pretratamiento de la muestra con un antibitico que contenga el medio de transporte para el virus, conservndolo toda la noche a 4C y realizando a continuacin la ultracentrifugacin u resuspensin del precipitado antes de diluir e inocular el espcimen en cultivo celular. La presencia de la actividad de los anticuerpos anti-EAV en el plasma seminal de algunos sementales que excretan virus no parece influir en la deteccin del estado de portador en estos animales.

b)

Mtodos de reconocimiento del cido nucleico

Las pruebas RT-PCR en dos pasos, RT-PCR en un solo paso y RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR) son cada vez ms aceptadas y utilizadas como alternativa al aislamiento vrico para la deteccin del EAV en el material de diagnstico. Los ensayos basados en la RT-PCR proporcionan un medio de indentificacin del ARN especfico del virus en muestras clnicas; en concreto, filtrados de frotis nasofarngeos, capas de clulas leucocitarias, semen fresco y extendido, orina, y muestras de tejido post mrtem (5, 6, 27, 55, 56, 64). Se han elaborado y evaluado las pruebas estndar RT-PCR en dos pasos, RT-PCR en un paso, RTPCR anidada (RT-nPCR), y rRT-PCR con TaqMan en un solo tubo para la deteccin de varias cepas del virus en lquido de cultivo de tejidos, semen y secreciones nasales (5, 6, 12, 27, 38, 50, 51, 53, 55, 56, 64, 66). Tres pruebas se orientaron a seis zonas de lectura abierta (ORF) diferentes en el genoma del EAV (los ORF 1b, 37). Sin embargo, existe una variacin considerable en la sensibilidad y especificidad de los ensayos RT-PCR que incorporan diferentes pares de cebadores orientados a varias ORF (6). Se han obtenido resultados comparables a los del aislamiento vrico con algunas pero no con todas las pruebas RT-PCR estndar de un paso, las RT-PCR en dos pasos, la RT-nPCR o la rRT-PCR con TaqMan en un solo tubo (5, 6, 9, 27, 38, 51, 53, 56, 66). Si las comparamos con el tradicional aislamiento vrico, estas pruebas basadas en la RT-PCR son frecuentemente ms sensibles, menos caras y mucho ms rpidas de realizar, pues la mayor parte requieren menos de 24 horas para su realizacin. Adems, las pruebas RTPCR tienen la ventaja de no requerir virus viables para su realizacin. La prueba rRT-PCR en un solo tubo para el EAV proporciona un mtodo simple, rpido y fiable para la deteccin e identificacin del cido

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nucleico del virus en el semen y el lquido de cultivo de tejido equino (5, 38). La rRT-PCR en un solo tubo tiene las siguientes ventajas importantes sobre la RT-PCR estndar en dos pasos: 1) se elimina la posibilidad de la contaminacin cruzada entre muestras con los productos previamente amplificados puesto que nunca se abre el tubo con la muestra; y 2) disminuye la posibilidad de reacciones positivas falsas porque el producto de la rRT-PCR se detecta con una sonda especfica de secuencia. Sin embargo, debido a la gran sensibilidad de la prueba RT-PCR, y en ausencia de precauciones adecuadas en el laboratorio, es posible la contaminacin cruzada entre las muestras, provocando de este modo resultados positivos falsos. Por ejemplo, la pruebas RT-nPCR, a la vez que proporciona una mayor sensibilidad para la deteccin del EAV, tambin aumenta la posibilidad de resultados positivos falsos (6). El riesgo de contaminacin es mayor cuando se utiliza la prueba RT-nPCR porque el segundo paso de amplificacin por PCR incluye el producto de la primera reaccin por RT-PCR. A fin de minimizar el riesgo de contaminacin cruzada, debe tenerse sumo cuidado, sobre todo durante los pasos de extraccin de ARN y la preparacin de la reaccin. Deben incluirse en cada prueba RT-PCR moldes positivos y negativos de control y cuando resulte adecuado, cido nucleico extrado del lquido de cultivo de tejido de clulas sanas. As pues, en muchas circunstancias, la utilizacin de la RT-PCR de un paso o la rRT-PCR en tubo nico puede ayudar a evitar los problemas relativos a la contaminacin cruzada. La seleccin de los cebadores es crucial para la sensibilidad de la prueba RT-PCR, siendo preferible utilizar los cebadores (y la sonda en el caso de la prueba rRT-PCR) diseados preferentemente para la regin ms conservada del genoma o genomas del EAV. El anlisis comparativo de las secuencias de nucletidos ha puesto de manifiesto que la ORF 1b (codifica la polimerasa vrica), la ORF 6 (Protena M) y la 7 (protena N) estn ms conservadas que el resto de las ORF entre las cepas del EAV analizadas hasta ahora y procedentes de Norteamrica y Europa (3, 4, 38, 64). El gen ms conservado entre las diferentes cepas del EAV es el ORF7, y con los cebadores especficos para la ORF7 (as como la prueba rRT-PCR) se ha detectado una variedad de cepas del virus de origen norteamericano y europeo (5, 6, 38, 53, 56). Es ms, el uso de muchos pares de cebadores especficos para las ORF 1b ([directo: 5-GAT-GTC-TAT-GCT-CCATCA-TT-3 e inverso: 5-GGC-GTA-GGC-TCC-AAT-TGA-A-3]) (12) y/o [directo: 5-CCT-GAG-ACA-CTGAGT-CGC-GT-3 e inverso 5-CCT-GAT-GCC-ACA-TGG-AAT-GA-3]) (27), las ORF 6 ([directo: 5-CTGAGG-TAT-GGG-AGC-CAT-AG-3 e inverso: 5-GCA-GCC-AAA-AGC-ACA-AAA-GC-3]) (51) y las ORF 7 ([directo 5-ATG-GCG-TCA-AGA-CGA-TCA-CG-3 e inverso 5-AGA-ATA-TCC-ACG-TCT-TAC-GGC-3]) (53) aumenta de forma significativa la posibilidad de detectar las cepas del EAV norteamericano y europeo mediante la prueba. Los dos pares de cebadores especficos para el ORF 1b son adecuados para su uso en la prueba RT-nPCR (6, 12, 27). Si bien se ha encontrado que la RT-PCR es muy sensible para la deteccin del cido nucleico del virus en semen fresco, existen pruebas de que no es tan fiable cuando se aplica con semen extendido o crioconservado de muy baja infectividad vrica (66). Adems de las citadas pruebas RT-PCR, se han descrito pruebas rRT-PCR con TaqMan en un solo tubo y basadas en el uso de sondas fluorognicas para la deteccin del cido nucleico del EAV (5); cebadores ([directo: 5-GGC-GAC-AGC-CTA-CAA-GCT-ACA-3, inverso: 5-CGG-CAT-CTG-CAG-TGA-GTG-A-3] y sonda [5FAM-TTG-CGG-ACC-CGC-ATC-TGA-CCA-A-TAMRA-3] (64); cebadores [directo: 5-GTA-CACCGC-AGT-TGG-TAA-CA-3, inverso: 5-ACT-TCA-ACA-TGA-CGC-CAC-AC-3] y sonda [5FAM-TGG-TTCACT-CAC-TGC-AGA-TGC-CGG-TAMRA-3]). No obstante, debe advertirse que la variacin genmica dentro de los aislamientos naturales del EAV puede disminuir la sensibilidad de las pruebas RT-PCR y rRTPCR, incluso en el caso de que los cebadores y las sondas estn ubicadas en la regin ms conservada del genoma del EAV (ORF 7 [38]). Al no existir un consenso generalizado o un conjunto cebadores universalmente admitido para la deteccin del EAV, y puesto que no se puede determinar la infectividad real de una muestra con ninguna de las pruebas RT-PCR, se aconseja el uso conjunto de las pruebas RT-PCR y rRT-PCR para la identificacin del virus en muestras clnicas clnicas o post mrtem. Las cepas del EAV aisladas de diferentes zonas del mundo se han clasificado en grupos filogenticos mediante el anlisis de secuencias de los genes de las protenas de envoltura GP3, GP5 y M (los ORF 3, 5 y 6 respectivamente) y del gen de la protena de la nucleocpsida (N) (ORF 7 [2, 8, 13, 54, 65]). Se ha demostrado que el gen GP5 es el ms til y fiable para ese propsito (8, 54, 65). Las relaciones entre las cepas a nivel de la secuencia de los nucletidos es un instrumento molecular epidemiolgico de utilidad para trazar el origen de brotes de AVE (2, 4, 65).

c)

Mtodos histopatolgicos e inmunohistoqumicos

Cuando se asocia la mortalidad a un brote sospechoso de AVE, se deben examinar muchos tejidos para las verificaciones histolgicas de panvasculitis, que es especialmente pronunciada en las pequeas arterias de todo el cuerpo, especialmente en el ciego, colon, bazo, glndulas linfticas asociadas y corteza adrenal (16, 18, 36). La presencia de una arteritis necrotizante diseminada que afecta a las clulas endoteliales y medias de los vasos se considera patognomnica de AVE. Las lesiones vasculares caractersticas que se presentan en el animal maduro no son, sin embargo, una propiedad destacable en muchos casos de abortos relacionados con la AVE (32).

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Captulo 2.5.10. Arteritis viral equina

El antgeno del EAV se puede identificar en varios tejidos de animales afectados por la AVE en presencia o en ausencia de lesiones (18). Se ha demostrado el antgeno en el pulmn, corazn, hgado, bazo y placenta de fetos abortados (18, 56). Se ha investigado tambin la utilizacin del examen inmunohistoqumico de muestras de piel para biopsia como medio de confirmacin de la infeccin aguda por el EAV. Aunque tiene cierto valor, no es del todo fiable para el diagnstico de la enfermedad. Se puede detectar el antgeno vrico en el citoplasma de clulas infectadas por inmunofluorescencia utilizando un suero equino policlonal anti-EAV conjugado (16) o por la tcnica ABC utilizando MAbs de ratn contra las protenas GP5 (28) o N del virus (18, 37, 40, 56).

2.

Pruebas serolgicas

Para detectar anticuerpos anti- EAV se han usado varias pruebas serolgicas que incluyen la neutralizacin (microneutralizacin [52], y reduccin de placas o calvas ([41] NV), la prueba de la fijacin del complemento (FC) (22), la inmunofluorescencia (16), la inmunodifusin en medio slido (16) y las pruebas ELISA (11, 14, 30, 31, 35, 48) y el inmunoensayo de microesferas fluorescentes (MIA (comunicacin personal). Actualmente, la prueba de mayor uso internacional para el diagnstico de la infeccin, para realizar estudios sobre prevalencia, y para examinar caballos para exportacin, es una prueba de microneutralizacin en presencia de complemento. Tambin se ha utilizado para el examen de sangre de corazn fetal para el diagnstico retrospectivo de casos de aborto asociados a la AVE (56). Adems de la prueba NV, la prueba FC se ha utilizado para diagnosticar infecciones recientes por el EAV, puesto que los anticuerpos que fijan el complemento son de una duracin relativamente transitoria (22). En contraste, los ttulos de anticuerpos neutralizantes anti-EAV pueden persistir con frecuencia durante aos despus de la infeccin natural (59). Aunque se han desarrollado varias pruebas ELISA (11, 14, 30, 31, 35, 48), ninguna se ha validado tan ampliamente como la NV, pese a que algunas parecen ofrecer una sensibilidad y especificidad casi iguales (11, 30, 31, 48). A diferencia de la prueba NV, una reaccin positiva por ELISA no refleja necesariamente el estado de proteccin inmune de un caballo individual anti-EAV ya que estn implicados anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes. Mediante protocolos convencionales de inmunizacin se han preparado en caballos y en conejos antisueros antiEAV no purificado. Adems, se han desarrollado en ratn anticuerpos monoclonales y en conejo anticuerpos monoespecficos para la protena de la nucleocpsida (N), la glicoprotena principal de la envoltura (GP5) y la protena de la envoltura no glicosilada (M) del EAV (7, 17, 28, 39, 40). La OIE dispone de sueros estandarizados para el EAV2 que pueden facilitar la estandarizacin de la prueba de la microneutralizacin y la del ELISA. Hasta la fecha solo se ha reconocido un serotipo importante (41, 59). Este est representado por la cepa prototipo Bucyrus (ATCC VR 796). El virus de referencia utilizado en la prueba de NV para el EAV es la cepa del CVL-Bucyrus (Weybridge). El stock de virus se obtiene en la lnea celular RK-13, se clarifica de restos celulares por centrifugacin a baja velocidad y se guarda en alcuotas a 70C. Se descongelan varias alcuotas y se determina la infectividad del virus por titulacin en clulas RK-13.

a)

Neutralizacin del virus (prueba prescrita para el comercio internacional)

La prueba de NV se utiliza para examinar sementales por si hay evidencia de infeccin por el EAV y para determinar si se necesita detectar el virus en semen mediante cultivo celular o por una prueba RT-PCR. Se utiliza tambin con finalidad diagnstica para confirmar la infeccin en casos sospechosos de AVE. El procedimiento de la prueba de la NV de uso ms difundido es el desarrollado por los Laboratorios del Servicio Nacional Veterinario del Departamento de Agricultura de los EE. UU. (52). Es importante obtener una muestra de sangre estril para evitar que la contaminacin bacteriana interfiera en el resultado de la prueba. Se recomienda realizar la prueba en clulas RK-13 utilizando como virus de referencia la cepa aprobada CVL-Bucyrus (Weybridge)3 (20). La historia completa de pases de la cepa CVL (Weybridge) no est documentada aunque deriva originalmente de la cepa Bucyrus prototipo del virus. La sensibilidad de la prueba de la NV para detectar anticuerpos anti-EAV est muy influenciada por varios factores, especialmente por el origen y la historia de pases de la cepa vrica utilizada (20, 21). La cepa CVL-Bucyrus (Weybridge) y la cepa vacunal MLV muy atenuada del EAV son de sensibilidad semejante para detectar sueros positivos de ttulo bajo, especialmente en caballos vacunados contra AVE. Se continan realizando esfuerzos para lograr una mayor uniformidad en el protocolo de la prueba y los resultados serolgicos entre los laboratorios que utilizan la prueba NV u otras pruebas serolgicas comparables para esta infeccin.

2 3

Puede obtenerse del Dr P.J. Timoney, Maxwell H. Gluck Equine Research Center, Dept of Veterinary Science, University of Kentucky, Lexington, Kentucky 40546-0099, United States of America; Correo electrnico: ptimoney@uky.edu. Puede obtenerse del: Dr T.W. Drew, Mammalian Virology Department, Veterinary Laboratories Agency, Weybridge, New Haw, Addlestone KT15 3NB, United Kingdom; E-mail address: tdrew.vla@gfnet.gov.uk.

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i) ii)

Procedimiento de la prueba Los sueros se inactivan 30 minutos en agua a 56C (sueros control solamente una vez) En placas de microtitulacin para cultivo celular con 96 pocillos de fondo plano, se realizan diluciones dobles seriadas del suero problema inactivado (volmenes de 25 l) con medio de cultivo libre de suero, comenzando con la dilucin a 1/2 y utilizando filas duplicadas de pocillos para cada suero problema. La mayora de los sueros se analizan inicialmente a dilucin 1/4 y 1/8 (dilucin final del suero, despus de aadir a cada pocillo un volumen igual de la dilucin apropiada del stock de virus). Las muestras positivas a la dilucin 1/8 se pueden volver a comprobar, si se desea, y titularse por determinacin por punto final. Deben incluirse en cada prueba controles individuales de suero, as como controles negativos y positivos de ttulo conocido alto y bajo. Se prepara una dilucin del stock de virus que contenga en 25 l de 100 a 300 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) utilizando como diluyente medio de cultivo celular sin suero que contenga antibiticos y complemento fresco de cobaya o de conejo a una concentracin final del 10%. A cada pocillo con 25 l de cada dilucin de suero se aaden 25 l de la dilucin apropiada del stock de virus, excepto en los pocillos de control del suero problema. Se incluye una re-titulacin de la dilucin de trabajo del stock de virus, utilizando cuatro pocillos por cada dilucin decimal, para confirmar la validez de los resultados de la prueba. Se cubren las placas y se agitan suavemente para facilitar la mezcla suero/virus. Las placas se incuban durante 1 hora a 37C en una atmsfera hmeda enriquecida con un 0,5% de CO2.

iii)

iv) v) vi) vii)

viii) Se prepara una suspensin de clulas RK-13 de cultivos de 35 das cuya concentracin asegure la formacin de monocapas confluentes en los pocillos de las placas de microtitulacin a las 1824 horas de la siembra. ix) x) xi) A cada pocillo se aaden 100 l de la suspensin celular, se cubren las placas con sus tapas o se sellan con cinta aislante y se agitan suavemente. Se incuban las placas a 37C en una atmsfera hmeda de 0,5% de CO2 en aire. Se observan las placas microscpicamente a las 1218 horas para ECP no vrico y de nuevo a las 48 72 horas de incubacin para el ECP vrico. La validez de la prueba se confirma estableciendo que la dilucin de trabajo del stock de virus contena de 30300 DICT50 y que los ttulos de los controles de suero positivo estn dentro de 0,3 unidades logartmicas decimales de sus ttulos predeterminados.

Una solucin de suero se considera positiva si hay una reduccin del 75%, o preferiblemente del 100%, en la cantidad del ECP vrico en los pocillos del suero problema en comparacin con el que se presenta en los pocillos con la dilucin ms baja de virus control. A continuacin se calculan los puntos finales de titulacin por el mtodo de SpearmanKrber (34). Un ttulo de o superior se considera positivo. Un suero negativo debe mostrar solo trazas (menos del 25%) o ninguna neutralizacin vrica a la dilucin ms baja ensayada. A veces los ttulos de anticuerpos pueden ser difciles de definir si se observa una neutralizacin parcial a lo largo de varias diluciones del suero. Raras veces puede encontrarse que los sueros causen cambios txicos a las diluciones ms bajas. En tales casos puede ser imposible establecer si la muestra es negativa o positiva con bajo ttulo. El problema puede superarse probando otra muestra de suero del animal en cuestin o volviendo a ensayar la muestra txica en placas de microtitulacin con monocapas confluentes de clulas RK-13 sembradas el da anterior. Se ha descrito que la toxicidad del suero puede reducirse o eliminarse en algunos casos si la muestra se adsorbe a clulas RK-13 antes de la prueba o mediante la sustitucin de complemento de cobaya por el de conejo en el disolvente del virus. En la evaluacin de sueros que originan citotoxicidad no vrica se debe tener en cuenta el estado de vacunacin para herpesvirus equinos. Se ha demostrado que una de las vacunas contra los herpesvirus equinos disponible actualmente en Europa puede estimular a los anticuerpos contra clulas de rin de conejo utilizadas en la fabricacin de vacunas. Estas a su vez, pueden producir citotoxicidad normalmente en diluciones de suero de 1/4 y/o 1/8 y causar dificultades en la interpretacin de los resultados de la prueba (26, 47).

b)

Enzimoinmunoensayo
Para detectar anticuerpos anti-EAV se han desarrollado varios ELISA directos o indirectos (11, 14, 30, 31, 35, 48). Estos se basan en la utilizacin de virus purificados o de antgenos recombinantes derivados de los virus. La utilidad de las pruebas iniciales estaba limitada por la frecuencia de reacciones positivas falsas (15), que se asociaban con la presencia de anticuerpos contra varios antgenos de los cultivos de tejidos en los sueros de caballos que haban sido vacunados con antgenos derivados de cultivos de tejidos (15). La identificacin del importante papel de la protena GP5 en la estimulacin de la respuesta inmune humoral contra el EAV condujo al desarrollo de varios ELISA que emplean una porcin de ella, o la protena recombinante completa producida en un sistema de expresin bacteriano o de baculovirus (14, 17, 30). Ms

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recientemente, se ha utilizado un pptido sinttico conjugado con ovoalbmina que presenta los aminocidos 81106 de la protena GP5 (48). Algunas de estas pruebas parecen presentar una sensibilidad y especificidad casi idnticas a las de la prueba NV y pueden detectar anticuerpos anti-EAV antes de que se pueda obtener una reaccin positiva por la prueba de la NV (11. Sin embargo, pueden ocurrir reacciones negativas falsas en algunas de estas pruebas. El anlisis al azar de una batera de pptidos fgicos con sueros policlonales de caballos infectados por el EAV permiti la identificacin de ligandos, que se purificaron y emplearon como antgenos en un ELISA para el EAV (31). Sin embargo, no se encontr correlacin entre los valores de absorbancia obtenidos con este ensayo y los ttulos de anticuerpos neutralizantes, lo que indica que los anticuerpos detectados estaban dirigidos fundamentalmente contra eptopos no superficiales del virus. Un ELISA basado en el uso combinado de las protenas estructurales GP5, M o N del EAV, expresadas por baculovirus recombinantes, detect con xito los anticuerpos en caballos infectados natural o experimentalmente, pero no en animales vacunados contra AVE (30). Respecto a cualquier ELISA para EAV basado en la protena GP5 es muy importante considerar el hecho de que la sensibilidad de la prueba vara en funcin de la secuencia del dominio o regin superficial que se utilice en el ensayo de esta protena vrica. Entre aislamientos del EAV (47) se ha encontrado una considerable variacin en la secuencia de aminocidos de este dominio (4). Para aumentar la sensibilidad de un ELISA basado en GP5 puede ser necesario incluir varias secuencias del dominio superficial que representen diferentes aislamientos fenotpicos de EAV en vez de depender de una nica secuencia superficial. Otros dos ELISA de descripcin ms reciente parecen ofrecer un diagnstico ms prometedor y fiable de las infecciones por el EAV (14, 48). Se ha descrito un ELISA bloqueante que utiliza MAbs producidos contra la protena GP5 con una sensibilidad del 99.4% y una especificidad del 97.7% en comparacin con la prueba NV (14). Otra prueba, que es un ELISA con un pptido sinttico de GP5 conjugado a ovoalbmina, tiene una sensibilidad y especificidad del 96.75% y 95.6%, respectivamente, utilizando una referencia de 400 sueros positivos por NV y 400 muestras negativas por NV (48). Es posible que se disponga en breve de un ELISA con una sensibilidad y especificidad similar a la de la prueba NV.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Se han desarrollado contra el EAV varias vacunas experimentales y comerciales. En la actualidad hay dos vacunas disponibles comercialmente y ambas derivan de cultivos celulares. La primera es una vacuna con virus vivo modificado (MLV) preparada con virus atenuado para caballos despus de mltiples pases en cultivos de clulas de caballo y de conejo (19, 41). Esta vacuna est autorizada para uso en sementales, yeguas no gestantes y caballos no reproductores. Aunque los caballos no reproductores se pueden vacunar en cualquier poca, los sementales y las yeguas deben vacunarse por lo menos 3 semanas antes de la reproduccin. No se recomienda utilizar la vacuna en yeguas gestantes, especialmente en los ltimos 2 meses de la gestacin, ni en potros menores de 6 semanas a menos que exista un riesgo importante de exposicin a la infeccin natural. La vacuna est comercializada en EE.UU. y Canad. Tambin se ha empleado en Nueva Zelanda, sometida a control gubernamental, para ayudar al programa de erradicacin de la AVE en dicho pas. La segunda vacuna comercializada contra la AVE es un producto inactivado que se prepara con virus crecido en cultivo de clulas de caballo, que se filtra, se inactiva qumicamente y se combina a continuacin con un adyuvante metabolizable. La vacuna est autorizada para su aplicacin en caballos reproductores y no reproductores. A falta de datos apropiados sobre su seguridad, no se recomienda en la actualidad para utilizacin en yeguas gestantes. El rgimen inicial de vacunacin supone dos dosis de vacuna administradas intramuscularmente y separadas 36 semanas. El fabricante recomienda una vacunacin de refuerzo a intervalos de 6 meses. La vacuna inactivada est autorizada para uso comercial en algunos pases europeos como Dinamarca, Francia, Alemania, Hungra, Irlanda, Suecia y Reino Unido. En Japn se ha desarrollado otra vacuna inactivada contra la AVE por si ocurre un brote de AVE en ese pas (24). Es una vacuna acuosa inactivada con formalina que se ha demostrado que es segura y eficaz en caballos reproductores y no reproductores. Para una inmunizacin ptima con esta vacuna, los caballos necesitan una fase inicial de dos inyecciones a intervalos de 4 semanas, con una dosis de refuerzo administrada cada 6 12 meses. Como la vacuna no est comercializada actualmente, no se suministran detalles acerca de su produccin. Las directrices para la produccin de vacunas se presentan en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las indicaciones dadas aqu y en el captulo 1.1.8. son de naturaleza general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Tanto las vacunas comerciales con MLV o inactivadas derivan de la cepa prototipo Bucyrus del EAV (ATCC VR 796). La evidencia disponible seala la existencia de un nico serotipo principal de virus, y la variacin entre cepas no se considera importante en relacin con la eficacia de las vacunas (41, 59).

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En el caso de la vacuna con MLV, el virus prototipo se atenu por pases seriados en cultivos primarios de rin de caballo (HK-131), rin de conejo (RK-111), y una lnea celular diploide de la dermis de caballo, ATCC CCL57 (ECID-24) (19, 29, 41). Las indicaciones de empleo de esta vacuna sealan que el virus es seguro e inmunognico entre los pases 80 y 111 en clulas primarias de rin de conejo (19, 29, 41, 44, 45, 61). La vacuna inactivada y con adyuvante se prepara a partir de una cepa prototipo Bucyrus del EAV no atenuada (ATCC VR 796) que se ha purificado en calvas al cuarto pase seriado en lnea celular diploide de la dermis de caballo (ECID-24). Despus de crecer en cultivo celular, el virus se purifica por filtracin antes de ser inactivado qumicamente y aadir el adyuvante. Los lotes apropiados del inculo primario de virus para cada vacuna deben mantenerse en nitrgeno lquido o un sistema equivalente.

b)

Mtodo de cultivo
El virus de las vacunas que contengan MLV o inactivadas debe crecer en un sistema estable de cultivos celulares, como las clulas de dermis de caballo, con un medio apropiado que se suplementa con suero bovino estril o con seroalbmina bovina como sustituto del suero bovino en el medio de cultivo. Las monocapas celulares deben lavarse antes de la inoculacin del virus para eliminar las trazas del suero bovino. En 23 das debe obtenerse un crecimiento vrico que se manifiesta por la aparicin de cambios citopticos en el 80100% de las clulas.

c)

Validacin como vacuna

Tanto en el caso de vacunas con MLV como inactivadas, las respectivas cepas vricas deben crecerse en un sistema de cultivo celular apropiado que se haya aprobado oficialmente para produccin de vacuna y que est libre de bacterias, hongos, micoplasmas y virus ajenos (46). La identidad del virus vacunal en el inculo primario debe confirmarse mediante la neutralizacin con un suero homlogo anti-EAV. Se ha documentado cientficamente la neutralizacin incompleta del EAV con antisueros homlogos de caballo o de conejo (46, 52) y constituye un problema para analizar el virus del inculo primario en cuanto a virus ajenos y para confirmar la identidad del virus vacunal. El problema se ha evitado rebajando el ttulo de infectividad del inculo primario por debajo del requerido para la produccin de inculo vrico antes de realizar la prueba de neutralizacin sobre el virus diluido. Las mezclas de virus y suero se prueban para los virus vivos residuales por pases seriados en cultivo celular. No debe encontrarse evidencia de virus citopticos, virus hemoadsorbentes o cepas no citopticas del virus de la diarrea bovina, sobre la base de intentos de aislar los virus en cultivo celular. Si se utilizan clulas de origen equino, debe comprobarse que estn libres del virus de la anemia infecciosa equina. En el futuro, las nuevas tecnologas de PCR y ELISA de captura de antgeno pueden usarse como ayuda para el aislamiento en el anlisis de agentes contaminantes. Se ha demostrado que la vacuna con MLV es segura y eficaz para emplearla en sementales y en yeguas no gestantes (44, 45, 61). Aunque el fabricante no la recomiende para las yeguas preadas, especialmente a los dos meses de gestacin, la vacuna se ha utilizado para inmunizar a las yeguas preadas teniendo en cuenta el gran riesgo de la exposicin natural al EAV, habindose informado de la existencia de efectos adversos mnimos. La vacunacin proporciona un alto nivel de inmunidad de proteccin que perdura durante varios aos (29, 41, 59). En estudios experimentales y despus de una dilatada utilizacin de la vacuna en condiciones de campo desde 1985, no hay evidencias de que el virus vacunal revierta a forma virulenta ni de que se recombine con la cepa natural del EAV. Adems, no se ha confirmado la existencia de evidencia de que la cepa atenuada del EAV en la vacuna actual se localice y establezca el estado de portador en el tracto reproductor del semental vacunado (45, 59, 60, 61). Las vacunas comerciales inactivadas no provocan reaccin y son seguras para su aplicacin en caballos sanos de cra y no reproductores. Se pueden observar reacciones locales transitorias en menos del 10% de los caballos vacunados con la vacuna inactivada. Los limitados estudios de campo con esta vacuna sealan que es inmunognica, estimulando un grado de inmunidad satisfactorio cuya duracin todava no se ha descrito. Aunque no hay datos publicados sobre la eficacia de ninguna vacuna comercial para evitar el establecimiento del estado de portador en los sementales, se ha comprobado que una vacuna acuosa experimental inactivada con formalina contra la AVE evita la persistencia vrica en el tracto genital de los sementales vacunados despus de un posterior desafo mediante infeccin con el EAV (23).

2.

Mtodo de produccin

Tanto la vacuna con MLV como la inactivada se producen mediante el cultivo de los inculos vricos respectivos en un sistema celular de dermis de caballo. Antes de la inoculacin con el virus de siembra las monocapas

10

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celulares deben lavarse para eliminar restos de suero bovino del medio de cultivo. Los cultivos inoculados deben mantenerse en un medio adecuado. La recogida de los cultivos infectados debe efectuarse cuando el ECP caracterstico afecta a casi toda la monocapa celular. Se recoge el sobrenadante y las clulas, y se clarifica la preparacin mediante filtracin de los restos celulares y el material no deseado. En el caso de la vacuna inactivada, el virus purificado se inactiva despus qumicamente y se aade un adyuvante metabolizable.

3.

Control del proceso

Las vacunas con el MLV o las inactivadas deben producirse en una lnea celular estable cuya identidad se haya probado y confirmado que est libre de bacterias, hongos y de micoplasmas y otros agentes contaminantes. Adems de la prueba previa a la produccin sobre contaminantes tanto en el inculo primario de virus para cada vacuna como en la lnea celular, los cultivos celulares infectados con los respectivos virus vacunales deben examinarse macroscpicamente para evidenciar el crecimiento microbiano o de otros contaminantes extraos durante el perodo de incubacin. Si no se puede determinar con seguridad el crecimiento en un recipiente por inspeccin visual, se deben realizar subcultivos, examen microscpico, o ambas cosas.

4.
a)

Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se presentan en el captulo 1.1.9.

b)

Inocuidad
En cada lote de produccin de vacuna debe probarse la contaminacin bacteriana, fngica o por micoplasmas, tanto en el caso de vacunas con el MLV como en las inactivadas. Debe comprobarse la seguridad de la vacuna mediante la inoculacin intramuscular de al menos dos caballos seronegativos para anticuerpos neutralizantes contra la AVE, cada uno con una dosis liofilizada (46). Ninguno de los caballos pirexia, durante un perodo posterior de observacin de 2 semanas. Adems, se deben inoculados debe desarrollar sntoma alguno de la enfermedad, excepto una leve tomar diariamente frotis nasofarngeos de cada caballo para el aislamiento de virus; tambin se debe determinar diariamente la frmula leucocitaria y la temperatura corporal. Despus de la vacunacin no deben aparecer cambios febriles o hematolgicos significativos (45, 59, 61). Ocasionalmente, se puede observar en el caballo vacunado una excrecin limitada de virus vacunal por el tracto respiratorio que no supera los 7 das (61). Tras la vacunacin del semental no hay evidencias de la persistencia del virus de la vacuna en el tracto reproductivo (45, 60, 61). Para asegurar una inactivacin completa del virus vacunal, en cada serie de lotes de vacuna inactivada debe comprobarse la presencia de virus viables mediante tres pases seriados en clulas de la dermis del caballo y por inmunofluorescencia directa marcando con el conjugado especfico para el EAV antes de aadir el adyuvante. Esto debera continuar con pruebas de seguridad en cobayas y ratones.

c)

Potencia
La potencia de la vacuna en los contenedores o recipientes finales se determina por ensayos de infectividad con formacin de calvas en monocapas cultivadas de clulas de la dermis del caballo y por una prueba de vacunacin de desafo mediante infeccin experimental en caballos (46). La vacuna debe probarse en cultivo celular por triplicado, calcularse el ttulo infectivo medio, y determinarse el contenido en dosis teniendo en cuenta que cada dosis de vacuna debe contener un mnimo de 3 104 unidades formadoras de calvas del EAV. La potencia in vivo de la vacuna con el MLV o inactivada se estima mediante una nica prueba de vacunacin de desafo en 1720 caballos vacunados y en 57 caballos control o en dos pruebas cada una de las cuales comprende diez vacunados y cinco controles no vacunados. La concentracin de antgeno vrico en la vacuna inactivada es superior a mil veces la concentracin del antgeno vrico presente en la vacuna con el MLV.

d)

Duracin de la inmunidad
Entre 1 y 2 meses despus a la vacunacin con MLV, en la mayora de los caballos deben aparecer ttulos de anticuerpos neutralizantes contra el VEA (44, 45, 58, 59,61). Las respuestas a la vacunacin primaria de las que se tiene noticia han sido variables segn dos estudios. De acuerdo con un estudio sobre la vacunacin de sementales, hubo un rpido descenso en el ttulo de anticuerpos y un nmero significativo de animales revirtieron a la seronegatividad a los 13 meses post-vacunacin (61). Por otra parte, otros estudios se han caracterizado por una respuesta excelente y duradera, con persistencia de altos niveles de neutralizacin vrica durante al menos uno o dos aos (58). La revacunacin con esta vacuna ocasiona una

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respuesta anamnsica excelente, desarrollndose elevados niveles de anticuerpos que permanecen relativamente estables durante varios aos (59). Varios estudios experimentales han mostrado que la mayora de los caballos vacunados con una vacuna inactivada desarrollan ttulos de anticuerpos neutralizantes anti-EAV bajos o moderados hacia el da 14 despus de la segunda vacunacin. No existe informacin publicada sobre la duracin de la inmunidad debida a esta vacuna.

e)

Estabilidad
La vacuna liofilizada con el MLV se puede mantener a 27C por lo menos durante 34 aos sin prdida de infectividad, con tal de que se mantenga en la oscuridad (29). La infectividad se conserva mucho ms tiempo si la vacuna se congela a 20C o a temperatura inferior. Sin embargo, una vez rehidratada, debe utilizarse en 1 hora o destruirse. La vacuna inactivada se conserva como suspensin lquida a 28C. Sin prdida de potencia en al menos 1 ao, si est protegida de la luz.

f)

Conservantes
Los conservantes que se aaden a las vacunas con MLV o inactivadas son neomicina, polimixina B y anfotericina B.

g)

Precauciones (riesgos)
Las yeguas gestantes no deben vacunarse con vacuna que contenga el MLV durante los ltimos 2 meses de gestacin ya que hay riesgo, aunque mnimo, de invasin fetal por el virus vacunal. Puede surgir la posibilidad de una reaccin anafilctica producida por la vacuna, aunque muy raramente, con la administracin de uno u otro tipo de vacuna. A falta de datos adecuados sobre seguridad, no se recomienda en la actualidad la utilizacin de vacunas inactivadas en yeguas gestantes. Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad
Con excepcin de la vacuna inactivada, para la que se necesita comprobar su esterilidad una segunda vez para asegurar la ausencia de contaminacin, no se necesitan pruebas de seguridad adicionales de las vacunas inactivadas o con MLV.

b)

Potencia
En los productos finales no se necesitan pruebas de potencia adicionales a las realizadas para cada lote de produccin de las vacunas inactivadas o con MLV.

REFERENCIAS
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66.

* * *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la arteritis viral equina (vase el cuadro en la parte 3 del presente Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

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