MDULO DE MICROBIOLOGA

CARMEN EUGENIA PIA LPEZ, M.Sc. CIENCIAS BIOLGICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERA 2008

Enfoque del curso Este curso de Microbiologa busca unir la calidad acadmica de los contenidos disciplinares con posibilidades de interaccin del estudiante con las fuentes hipertextuales e hipermediales organizadas para un uso amigable y de ptimo refuerzo didctico, que motive una navegacin entusiasta en el proceso de construccin autnoma de los conceptos disciplinares y un proceso entusiasta de interaccin con las herramientas de comunicacin del curso, tales como foro, Chat, correo electrnico y otros. El curso est orientado a la autogestin estudiantil de los conocimientos tericos necesarios para la comprensin de la estructura y funcionamiento de los microorganismos en su biodiversidad como resultado evolutivo. Este conocimiento se aborda como un insumo de conocimiento transferible a futuras situaciones de desempeo profesional y de comportamiento biotico, como un bagaje de trabajo inter y transdisciplinar (orientado con procesos de investigacin formativa) totalmente necesario para seres que deben actuar con inteligencia en su medio ambiente, o sea en su base material y cultural de supervivencia como especie. En otros aspectos, se puede decir que la apropiacin terica del conocimiento en microbiologa, se guiar por el cuerpo disciplinar que maneja la comunidad acadmica internacional (ver estado del arte), identificando, seleccionando y organizando de manera pedaggica unos contenidos bsicos fundamentales, totalmente necesarios para aprehender los conocimientos estructurales de la disciplina. El componente prctico se desarrollar mediante laboratorios previamente apoyados en vdeos didcticos introductorios y se complementar con observaciones de campo. Para efectos de precisin de conceptos el estudioso puede apoyarse en el glosario, espacio que adems de definiciones importantes, agrupa respuestas a preguntas enviadas por los estudiosos en busca de una mayor aclaracin. El objetivo es trabajar en red colaborativa de tutores y estudiosos para enriquecer este banco de definiciones y de respuestas a preguntas frecuentes. Bienvenidos! Carmen Eugenia Pia Lpez (Autora) Requerimientos Resolucin ptima 1024 x 768 px

Ficha Tcnica Nombre del curso: Palabras clave: Institucin: Ciudad: Autora del Protocolo Acadmico: Ao: Unidad Acadmica: Campo de formacin: Microbiologa cdigo 201504 http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia _mutimedia/inicio.htm Tendencias disciplinares de la microbiologa, crecimiento, cultivo y tcnicas de laboratorio y seguridad microbiana, aplicaciones industriales Universidad Nacional Abierta y a Distancia -UNAD. Bogot Colombia Carmen Eugenia Pia Lpez microbiologia_carmene@yahoo.es carmen.pina@unad.edu.co 2008. Unidad de Ciencias Bsicas Bsica disciplinar

rea del conocimiento: Ciencias Naturales. Crditos acadmicos: Tipo de curso: Destinatarios: Tres (3), correspondiente a 144 horas de trabajo acadmico: 106 horas promedio de estudio independiente y 38 horas promedio de acompaamiento tutorial. Metodolgico. Terico -prctico Estudiantes de diversos programas de pregrado y cursos abiertos de la Universidad Nacional Abierta y a DistanciaUNAD-. El estudiante identifica y describe con propiedad los enfoques tericos de la microbiologa, as como sus aplicaciones en los problemas del entorno, aspectos que configuran el campo terico de la microbiologa, mediante el anlisis de alternativas de uso seguro a nivel industrial apoyadas en experiencias previas de laboratorio y en procesos de investigacin formativa. Adems el estudiante potencia su capacidad de autodireccin del aprendizaje. A distancia. Documentos impresos en papel, Web; CD-ROM. Se en el curso hpermedia se encuentran una serie de vdeos, animaciones. interactividades que potencian el autoaprendizaje 1. Tendencias disciplinares de la microbiologa. 2. Crecimiento, cultivo y tcnicas de laboratorio y seguridad microbiana. 3. Aplicaciones industriales.

Competencia general de aprendizaje:

Metodologa de oferta: Formato de circulacin:

Denominacin de las unidades didcticas:

El Esquema Epistemolgico de Microbiologa delimita el campo de estudio y seala en que se fundamenta este conocimiento disciplinar, el rol interactivo de los microorganismos con el sistema inmunolgico, la orientacin sistemtica para la investigacin, los ecosistemas o ambientes de manifestacin y las condiciones tecnolgicas para el avance del conocimiento y aprovechamiento industrial de los microorganismos.

UNIDAD DIDCTICA 1 PERSPECTIVAS Y TENDENCIAS DE LA MICROBIOLOGA Capitulo 1 Introduccin y Tendencias

Introduccin La Microbiologa es una ciencia en constante avance por el proceso de interaccin entre los microorganismos y el sistema inmunitario de hombres, plantas y animales, lo cual obliga a investigar las caractersticas de accin de cada tipo microbiano. Objetivos Identificar y describir los enfoques tericos de la microbiologa. Identificar la interrelacin de esta ciencia con diversos campos de estudio, desde una perspectiva cientfica y prctica Leccin 1 - Definicin de Microbiologa Leccin 2 - Historia y Evolucin Leccin 3 - Campos de Aplicacin Conclusin Las necesidades de defensa, aprovechamiento y control de los microorganismos para mantener un ambiente saludable, han impulsado la investigacin de estos microorganismos. Definicin de Microbiologa - Qu son los microorganismos?- Comparacin de tamaos en el estudio microbiolgico Definicin de Microbiologa La microbiologa estudia los microorganismos u organismos generalmente microscpicos, aunque algunos pueden ser observados a simple vista. Hay muchos campos de estudio especfico en microbiologa: bacteriologa, protozoologa, micologa, virologa, microbiologa agrcola, microbiologa de alimentos, microbiologa ambiental, entre otras. El objeto material de la microbiologa viene delimitado por el tamao de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos 5

estructurales, funcionales y taxonmicos: desde partculas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias: eubacterias, arqueas, los protozoos, parte de las algas, los hongos y levaduras La microbiologa es una disciplina que aporta tanto conceptos como tcnicas y metodologas tiles para la gestin industrial de muchos procesos que aprovechan la capacidad de los microorganismos para la produccin rpida de una serie de insumos y de transformaciones de materiales, necesarios para el desarrollo humano y econmico, tales como aumento y rendimiento de cultivos, biofertilizantes, biocontrol, vectores para transferencias de informacin gentica en el desarrollo de plantas transgnicas, produccin de compuestos qumicos y aditivos para alimentos, eliminacin de materiales contaminantes y residuos txicos del medio ambiente entre otras. Qu son los microorganismos? Son los seres ms numerosos que habitan en todas las regiones del planeta: suelo, aire, agua, hielo, rocas, cuerpo del hombre y de los animales, en plantas, alimentos. Sin ellos nuestro planeta no podra sobrevivir. La mayora son de tamao microscpico, aunque los hay visibles a simple vista como es el caso de algunos hongos y algas. Los microorganismos se adaptan a las condiciones en que ningn otro organismo podra sobrevivir (cidas, saladas, presin y temperaturas ms extremas en la tierra), por ejemplo, el astrobilogo de la NASA Jack Farmer estudia microorganismos que habitan en las aguas hirvientes de las fuentes termales en el Parque Nacional de Yellowstone. Estos microorganismos utilizan hidrgeno como fuente de energa. A excepcin de los virus los microorganismos pueden existir como clulas individuales o como colonias de clulas. Una clula microbiana puede realizar de forma independiente todos los procesos metablicos necesarios para vivir. De acuerdo con su estructura celular los microorganismos pueden ser procariotas y eucariotas. Dentro de los procariotas se encuentran las bacterias: eubacterias y arqueas, microorganismos unicelulares. Dentro de los eucariotas se agrupan: los hongos filamentosos pluricelulares de mayor tamao y las levaduras unicelulares pertenecientes al reino Fungi, las algas (rojas, diatomeas y verdes.) y los protozoos pertenecientes al reino protista. Tambin encontramos microorganismos acelulares de tamao submicroscpico como son los virus, viroides, virusoides y priones. Los microorganismos pueden ser: patgenos cuando son agentes causantes de enfermedades, no patgenos habitantes de la flora normal del cuerpo y microorganismos benficos utilizados en medicina, en la industria y en el control de la contaminacin. El papel de los microorganismos en el mantenimiento de los ecosistemas es de vital importancia, ya que son los responsables del reciclamiento de la materia. En los ciclos biogeoqumicos, todos los ecosistemas terrestres y acuticos dependen de los microorganismos para sostener sus requerimientos nutricionales.

Comparacin de tamaos en el estudio microbiolgico Ciencia Virologa Tamao Equivalencia 18 y 20 nanmetros de 1 nanmetro (m) = Virus ancho 1 millonsima parte de 1 milmetro Nanobacterias o 20 a los 200 nanmetros o ultramicrobacterias 0.02 -0.20 m 1000 nm = 1 m Arqueas 0,5-5 m, Cianobacterias Bacteriologa Micrmetro (m) = 1/1000 milmetros, es tambin conocido Nanobacterias 0.05 m como micra (.) Micoplasmas 0.2 a 0.3 m Epulopiscium una 1 m = 0,001 mm bacteria de gran tamao 0.5 mm 1 mm = 1000 m E. coli 0.5 m de ancho por 2 m de largo Levaduras 2,5 -10 m de ancho y 4, 5-21 m. de largo hongos filamentosos 2 mm a 20 cm. de 1 m hasta las que se observan a simple vista 10 m a varios mm. 1 a 10 m Microorganismo

Bacterias

Micologa

Hongos

Ficologa Protozoologa

Algas Protozoos

Evolucin Histrica: Teora de la generacin espontnea - teora de la biognesis - la microbiologa como una ciencia- la microbiologa y el estudio de la enfermedad infecciosa- relacin de la gentica microbiana con la biologa molecular Evolucin Histrica: Teora de la generacin espontnea El estudio de la microbiologa aclara mejor los conceptos al analizar su evolucin histrica a travs del trabajo de los grandes pioneros de esta disciplina. La primera invencin que abri la posibilidad de estudio de lo pequeo fue la creacin del microscopio a comienzos del siglo XVII por el holands Antony van Leeuwenhoek. Hasta la segunda mitad del siglo XIV la gente crea que los organismos surgan espontneamente del suelo hmedo, del estircol o de la carne en descomposicinTeora de la generacin espontnea-. Una de las implicaciones de la invencin del microscopio y la posible observacin de estos minsculos seres vivos fue el inters de la comunidad cientfica por el origen de estos seres microscpicos.

http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/recorrido-historico/como-se-origina-lavida/los_primeros_experimentos.php

Los italianos Francisco Redi (mediados siglo XVII) y Lazzaro Spallanzani (mediados siglo XVIII), lograron desvirtuar la teora de la generacin espontnea. Redi coloc pedazos de carne en frascos abiertos y cerrados. Not que slo aparecan gusanos en los frascos abiertos y Lazzaro Spallanzani mediante sencillos experimentos, hirviendo un caldo que contena microorganismos en un recipiente de vidrio, y cerrndolo despus hermticamente para evitar la entrada de aire, impidi el crecimiento de microorganismos al mantenerse el caldo claro y estril. Teora de la Biogensis En 1858 el alemn Rudolf Virchow contrapuso a la teora de la generacin espontnea la teora de la biognesis: toda clula viva proviene de otra clula viva. Rudolf Virchow contrapuso a la teora de la generacin espontnea la teora de la biognesis: toda clula viva proviene de otra clula viva. Louis Pasteur en 1861 fue quien en definitiva logr refutar la teora de la generacin espontnea al demostrar experimentalmente que los microorganismos presentes en el aire, slidos y lquidos eran los responsables de la contaminacin de la materia y que estos microorganismos podan ser destruidos por accin del calor. Pasteur utiliz recipientes con cuellos largos y curvos, en los que coloc un caldo que haba hervido durante algunos minutos. Al retirarlo del fuego, el aire entraba por el cuello, pero los microbios quedaban atrapados en l, lo que impeda que contaminaran el lquido y permita conservarlo estril indefinidamente. Slo cuando se rompa el cuello, aparecan organismos en el caldo.

http://es.geocities.com/joakinicu/imagen0016.htm La Microbiologa como ciencia La edad de Oro de la microbiologa tuvo lugar durante los aos 1857 a 1914 cuando se lograron innumerables avances que establecieron a la microbiologa como una ciencia. Algunos de estos avances son los aportados por Louis Pasteur sobre: la teora de la enfermedad infecciosa, el desarrollo de la pasteurizacin, la fermentacin por accin de levaduras, el desarrollo de las tcnicas de inmunizacin; los desarrollados por Robert Koch como el descubrimiento del Bacillus anthracis causante del carbunco , del Mycobacterium turbeculosis agente de la tuberculosis, de la bacteria Vibrio cholerae 9

causante del clera; otros cientficos continuaron con el descubrimiento de ms microorganismos causantes de enfermedades. En 1928 Alexander Fleming descubri de forma accidental un hongo al que llam penicilina, capaz de inhibir el crecimiento de las bacterias. Ms tarde este hongo fue identificado como Penicillium notatun La microbiologa y el estudio de la enfermedad infecciosa El cambio de enfoque que tuvieron los cientficos a comienzos del siglo XX influy en la independencia que obtuvo la microbiologa de la biologa general. Los principales intereses de los microbilogos en este periodo fueron la caracterizacin de enfermedades infecciosas, el estudio de la inmunidad y de sus funciones en la prevencin y curacin de las enfermedades, la bsqueda de agentes quimioteraputicos y el anlisis de las actividades qumicas de los microorganismos, mientras que los bilogos estaban concentrados en la organizacin de la clula y su papel en la reproduccin, el desarrollo y los mecanismos de herencia y evolucin de vegetales y animales. Gracias a los desarrollos alcanzados en la microbiologa se crearon nuevas ramas de esta ciencia como la virologa, la inmunologa. Relacin de la gentica microbiana con la biologa molecular Aos despus, aportes importantes de la microbiologa en la bioqumica y la gentica pusieron fin a un largo aislamiento de sta entre las principales corrientes del pensamiento biolgico y establecieron la base para la segunda revolucin importante de la biologa: la biologa molecular. La relacin de la gentica microbiana con la biologa molecular di origen a la tecnologa del ADN recombinante que permite obtener microorganismos modificados genticamente para: Producir hormonas como la insulina humana utilizada en pacientes diabticos y que es obtenida a partir de la levadura transgnica de Saccharomyces cervisiae, o de bacterias Escherichia coli modificadas genticamente; la hormona del crecimiento que se obtiene a partir de bacterias transgnicas. Elaborar frmacos, vacunas, anticuerpos. Fabricar aditivos para los alimentos como edulcolorantes, aminocidos. Producir enzimas utilizadas en la fabricacin de productos de panadera, en cervecera, en la fabricacin del queso. Degradar residuos compuestos txicos como los detergentes, como los hidrocarburos, por ejemplo las bacterias transgnicas de Pseudomonas utilizan como nutrientes compuestos polihalogenados, convirtindolos en productos inocuos para el medio ambiente. Esta tcnica se conoce como biorremediacin.

Campos de aplicacin y perspectivas La relacin de la microbiologa con otras disciplinas ha generado el desarrollo de otros campos del conocimiento como:

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La microbiologa de alimentos, estudia los microorganismos como productores de alimentos y como agentes de deterioro de alimentos. En el primer caso selecciona, mantiene, y mejora microorganismos tiles en la generacin de productos alimenticios, con nuevas caractersticas sensoriales: texturas, olores o sabores, en el segundo caso se encarga de desarrollar mecanismos para prevenir y controlar el contacto con los alimentos. La microbiologa industrial se encarga de estudiar y manipular los microorganismos a gran escala para que produzcan compuestos o realicen funciones tiles como la produccin y transformacin de alimentos, frmacos, vacunas, disolventes orgnicos. Por ejemplo la protena unicelular utilizada en la alimentacin animal y producida por microorganismos cultivados sobre desechos industriales da rendimientos muchsimo ms elevados que la producida en las cosechas. La microbiologa mdica estudia e identifica los agentes causantes de enfermedades y su proceso infeccioso, as como la respuesta inmunolgica del paciente (sistema inmune y proteccin ante agresiones externas), y la seleccin del tratamiento antimicrobiano. La microbiologa agrcola estudia los procesos microbianos tiles para el crecimiento de las plantas, adems de las enfermedades de las plantas causadas por hongos, bacterias, virus, viroides entre otros. La microbiologa Sanitaria desarrolla procesos de ingeniera a gran escala para el tratamiento de residuos. La microbiologa del agua potable investiga y aplica mtodos para eliminar las bacterias patgenas en redes de agua. Igualmente gracias al estudio de los microorganismos, en la actualidad, se han desarrollado otras ramas de la Biologa, como la Gentica Microbiana, la Ingeniera gentica y la Biotecnologa. Gentica microbiana estudia la funcin de los genes, su expresin y regulacin. La Ingeniera gentica con importante aplicacin tanto en la en la parte clnica y en la agricultura. Mediante tcnicas de ADN recombinante se han producido protenas como la insulina, la hormona del crecimiento, el interfern, el factor VIII de coagulacin, las beta endorfinas que suprimen el dolor, vacunas contra microorganismos causantes de enfermedades La biotecnologa microbiana se conoce como el manejo, modificacin gentica y propagacin de microorganismos vivos mediante el uso de tecnologas como el cultivo de tejidos y la ingeniera gentica, que dan como resultado la obtencin de microorganismos nuevos o mejorados.

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Estado del arte Actualmente existen en Colombia organizaciones, institutos, corporaciones universidades trabajando continuamente para el desarrollo de la microbiologa. y

En el Boletn Informativo No. 28 Marzo 2001, ISSN-0123-7896 del Instituto de Investigacin de Recursos biolgicos Alexander Von Humboldt se sealan las prioridades de la investigacin de la diversidad microbiana en Colombia. A lo largo del siglo XX la tradicin institucional de la investigacin microbiolgica en Colombia ha estado centrada en atender soluciones a problemas en los campos de la salud y la agricultura, dejando un invaluable legado y un conjunto de colecciones de germoplasma microbiano que constituyen la base de futuras investigaciones. Entre las ms importantes colecciones microbianas se encuentran los ceparios de la Universidad Nacional de Colombia, el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), CORPOICA, la Universidad de Antioquia, la Universidad Industrial de Santander, la Universidad de los Andes, el Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB) y el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Aqu reposa gran parte del legado de la patologa animal y vegetal del pas, as como un reservorio de inters para estudios bsicos y aplicados. No obstante, no existe un inventario sistemtico sobre diversos puntos de la geografa nacional, haciendo que nuestro conocimiento sobre la presencia, distribucin y funcin de la diversidad microbiana sea bastante reducido. Respecto al hombre, la importancia de los microorganismos es notable en la agricultura, la nutricin, la biotecnologa y la salud, entre otras. En general, la vida microbiana regula y mantiene los procesos geofisiolgicos: temperatura, qumica atmosfrica, circulacin de nutrientes a escala planetaria haciendo que se mantenga el balance que sostiene la biosfera. No podramos tener bosques, pramos, sabanas y manglares y dems biomas sin la presencia de bacterias, hongos, protozoos, algas y virus los cuales conforman la diversidad microbiana. Por ello no cabe duda que nuestros biomas y ecosistemas constituyen un reservorio importante de diversidad microbiana y por lo tanto sta se encuentra expuesta a las mismas fuerzas y condiciones que amenazan actualmente la biodiversidad en general y la de especies de flora y fauna en particular. http://www.humboldt.org.co/download/bol28.pdf Las principales prioridades y pautas que el Instituto Humboldt pone a consideracin en pro de la elaboracin de una estrategia para el desarrollo del estudio de la Biodiversidad Microbiana en el contexto de la agenda nacional de biodiversidad son: Zonas y ecosistemas de inters para la caracterizacin de la diversidad Microbiana en Colombia

1. Ecosistemas dentro del Sistema Nacional de Parques Naturales y reas protegidas 2. Zonas de transicin o ecotonos (gradientes)

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3. Paisajes rurales (Agroecosistemas y mosaicos productivos) 4. Relictos de bosque seco 5. Relictos de bosque andino 6. Pramos 7. Manglares y arrecifes de coral 8. Sabanas 9. Ambientes extremos (fuentes termales, ambientes hipersalinos, anxicos, aparato digestivo de insectos, etc.) Justificacin del estudio por reas

1. Conocer los patrones de distribucin La ubicacin espacial de distribucin de especies o comunidades microbianas de inters cientfico o particular constituye un elemento de lnea base que resulta de utilidad para el desarrollo de estrategias de monitoreo y restauracin ambiental, bioprospeccin y conservacin, entre otras. 2. Estudios de sistemtica La caracterizacin taxonmica, as como el estudio de la filogenia - relaciones genealgicas entre especies- contribuyen a entender la naturaleza organizativa de la biodiversidad. 3. Conservacin y uso sostenible Conocer como trabajan los microorganismos nos permite encontrar soluciones a problemas ambientales complejos, tales como: degradacin y prdida de suelos, regeneracin de plantaciones forestales, contaminacin ambiental, etc. El uso de tales agentes debe tener implcito una estrategia de conservacin y preservacin. 4. Infraestructura cientfica Ninguno de los anteriores programas es viable sin la formacin del recurso humano necesario pare ello. Por ello, resulta necesario que el SINA apoye un plan de organizacin y dotacin de infraestructura cientfica para implementar los estudios de monitoreo ambiental de microorganismos involucrados en problemas y soluciones ambientales. Pautas para el estudio por reas

1. Investigacin multidisciplinaria Es necesario entender la diversidad microbiana como un componente conectado al entorno ambiental, el cual incluye otras formas de vida y habitats interrelacionados e interdependientes, facilitando as el trabajo en equipo que facilita cruzar disciplinas. 2. Trabajo en cooperacin

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Debe evitarse la atomizacin interinstitucional de la investigacin y permitir que las instituciones compartan sus intereses dentro del plano de metas comunes de forma organizada y eficiente. 3. Consolidacin de un sistema nacional de informacin en Diversidad Microbiana. Crear una base de datos con toda la informacin disponible sobre diversidad microbiana en Colombia. Mantener informacin actualizada sobre infraestructura y desarrollos adelantados. Ceparios y bancos de germoplasma microbiano. Metodologas y reas geogrficas estudiadas. 4. Establecimiento de metodologas bsicas unificadas. Basado en el sistema de buenas prcticas de laboratorio se pueden tener estndares de aplicacin para el estudio de grupos microbianos de particular inters y por consiguiente su preservacin. Algunos de los avances de mayor importancia en el campo de la microbiologa hacen referencia a: la secuenciacin completa de genomas bacterianos, el primero que se describi, en 1995, fue el de la bacteria Haemophilus influenzae, responsable de causar trastornos respiratorios y meningitis; posteriormente se complet el estudio de muchos genomas de bacterias y hongos, la identificacin de microorganismos utilizando tcnicas genotpicas, el conocimiento, conservacin y uso de la diversidad microbiana, el desarrollo de la microbiologa clinica, la composicin de protenas (o proteoma) de muchos microorganismos y ms recientemente se han desarrollado herramientas para estudiar el perfil completo de expresin del ARN mensajero ( el trascriptoma), este cido nucleico es el encargado de llevar la informacin de los genes a las fbricas de protenas que son los ribososmas.

CAPTULO 2 DIVERSIDAD MICROBIANA Taxonoma

Introduccin El presente captulo aborda el estudio de los microorganismos para diferenciarlos por dominios o tipos y categoras especficas, lo cual permite la sistematizacin del conocimiento entre la red de investigadores a nivel mundial. Objetivo especfico Mostrar la diversidad microbiana desde el punto de vista sistemtico Leccin 4 - Clasificacin Microbiana

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Leccin 5 - Sistemtica de Procariotas segn Bergey Conclusin La comunicacin internacional de las comunidades cientficas dedicadas al estudio de la micro-biodiversidad no sera posible sin la existencia de un sistema estandarizado de clasificacin para los microorganismos.

Clasificacin Microbiana
Diversidad Microbiana- Introduccin a la taxonoma - Arbol de la Vida -Tres Dominios Relaciones evolutivas entre organismos vivos- Identificacin y clasificacin de los microorganismos - Ejemplo de clasificacin de un microorganismo Objetivo Mostrar la diversidad microbiana desde el punto de vista sistemtico

Diversidad

microbiana.

Comprender la diversidad microbiana requiere conocer las races evolutivas de las clulas. Debido a que la evolucin ha forjado todas las formas de vida en la Tierra, la diversidad estructural y funcional que apreciamos en las clulas representa un conjunto de xitos evolutivos que, a travs del proceso de la seleccin natural, confieren un valor de supervivencia (adaptabilidad) a los microorganismos de hoy. La diversidad microbiana puede ser apreciada en trminos de variaciones en el tamao celular y la morfologa, estrategias metablicas, movilidad, divisin celular, biologa del desarrollo, adaptacin a ambientes extremos y muchos otros aspectos estructurales y funcionales de la clula. Para poder comprender la gran diversidad de microorganismos existentes es preciso agruparlos y organizar los grupos generales en una estructura jerrquica sin superposiciones. De eso se encarga la Taxonoma, que es la ciencia de la clasificacin biolgica. Introduccin a la taxonoma microbiana La taxonoma de los microorganismos se refiere a las formas de clasificacin con sus respectivos mtodos. La taxonoma se encarga de la clasificacin, identificacin y nomenclatura de los organismos. La clasificacin se relaciona con la agrupacin de los organismos en grupos o taxones en funcin de semejanzas mutuas o del parentesco evolutivo -filogeniaLa nomenclatura se ocupa de la asignacin de nombres a grupos taxonmicos de acuerdo con normas establecidas.

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La identificacin determina a que taxn pertenece un determinado organismo. La base en que se fundamenta la taxonoma microbiana se origina en la investigacin de las relaciones filogenticas resultantes de la evolucin, la cual desemboc en las tres grandes categoras o dominios denominados por Carl Woese: * Arqueobacteria o Archaea * Eubacteria o Bacteria comprende las cianobacterias, los micoplasmas y las llamadas "bacterias verdaderas" * Eucariota o Eukarya a este domino pertenecen los microorganismos de los reinos Protisto: protozoos y algas y del reino Fungi: los hongos filamentosos y los unicelulares como las levaduras y los organismos del reino Plantas y del reino Animal. Estos dominios agrupan a los microorganismos conocidos a excepcin de los microorganismos acelulares como los virus, viroides y priones. La distancia entre cada uno de los grupos incluidos en cada dominio indica el grado de parentesco entre ellos.

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Relaciones evolutivas entre organismos vivos. Adaptado de: http://es.geocities.com/joakinicu/apartado1e.htm En la actualidad se pueden determinar relaciones filogenticas (evolutivas) entre los microorganismos. Para establecer estas relaciones se utilizan una serie de mtodos basados en comparaciones de la secuencia de cidos nucleicos, particularmente en la secuencia del ARN ribosmico (ARNr), esto es, el ARN estructural del ribosoma que constituye la estructura clave de la clula implicada en la traduccin del ARN. De hecho, uno de los descubrimientos recientes ms importantes en biologa es que los cambios en la secuencia nucleotdica del ARN ribosmico (determinados en definitiva por mutaciones en el ADN que codifica el ARN ribosmico) pueden ser usados como una medida para establecer relaciones evolutivas entre clulas. A partir de estudios sobre secuencias de ARN ribosmico se pueden definir tres linajes celulares evolutivamente diferentes, dos de los cuales presentan estructura procaritica y uno que es eucaritico.

Los grupos o dominios se llaman Eubacteria, Archaea o Arqueobacteria y Eukarya o Eucariota. Pese al hecho de que a nivel molecular tanto Eubacteria como Arqueobacteria son procariotas, los dos grupos difieren evolutivamente entre s tanto como del grupo Eucariota. Se piensa que los tres grupos se originaron muy pronto en la historia de la vida sobre la Tierra por divergencias a partir de un organismo ancestral comn, el "antepasado universal". Eubacteria y Arqueobacteria representan ramas evolutivas que nunca evolucionaron ms all del nivel microbiano

Identificacin y clasificacin de los microorganismos Adems de comprender y valorar los orgenes filogenticos de los organismos celulares resulta importante, ser capaz de identificar y clasificar los microorganismos. Una identificacin rpida de un microorganismo causante de enfermedades en humanos o animales es esencial para establecer el tratamiento adecuado del paciente. Se han usado varios criterios para caracterizar microorganismos y, en la actualidad, se tienen en cuenta tanto caractersticas celulares como filogenticas para la clasificacin. Tras un estudio profundo de la estructura y funcin de un microorganismo, incluyendo su gentica, metabolismo, comportamiento y otras propiedades distintivas, es posible reconocer un cierto nmero de caractersticas nicas en un microorganismo dado. Una vez que el organismo ha sido definido en funcin de esa serie de caractersticas propias, recibe un nombre. Los microbilogos usan el sistema binomial de nomenclatura establecido inicialmente por Linneo para designar animales y plantas. El sistema binomial consta de dos 17

nombres: el gnero y la especie. El gnero es un nombre que se aplica a ciertos organismos relacionados; dentro del gnero, cada tipo de organismo recibe un nombre de especie. Los nombres de gnero y especie se usan siempre juntos para describir un tipo especfico de organismo, ya sea una clula aislada o un grupo de clulas. La primera palabra corresponde al nombre cientfico del gnero y se escribe la primera letra con mayscula y en cursiva, mientras que la segunda palabra corresponde a la especie, la cual se escribe en minsculas y en cursiva. Por ejemplo, la bacteria Escherichia coli, o abreviadamente E. coli, tiene una designacin de gnero, Escherichia, y un nombre de especie, coli. En microbiologa la unidad taxonmica bsica es la especie microbiana, cepa o estirpe.

Ejemplo de clasificacin completa de un Microorganismo: la bacteria Neisseria meningitis es: Dominio Eubacteria Reino Mnera Phylum Proteobacteria Clase proteobacteria Orden Neisserriales Familia Neisseriaceae Gnero Neisseria Especie Neisseria meningitis

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UNIDAD 2 DIVERSIDAD MICROBIANA

Captulo 3 Tipos de Microorganismos: Microorganismos Acelulares Introduccin El presente captulo aborda el estudio de la estructura, funcin, importancia biolgica y econmica de los virus, priones y viroides, as como su incidencia en la salud del hombre, los animales y las plantas Objetivos especficos Identificar y describir con propiedad los grupos acelulares conocidos como virus, viroides y priones. Identificar las enfermedades y las aplicaciones tiles o industriales de estos microorganismos Leccin 6 - Virus Leccin 7 - Viroides y Priones Conclusin Uno de los retos ms fundamentales para la supervivencia humana, es el conocimiento de las caractersticas de los microorganismos acelulares y la forma de controlarlos. Los Virus Caractersticas de los virus

Los virus se encuentran en todos los lugares: en el aire, agua, suelo, en todos los materiales, no como estructuras aisladas, sino parasitando las clulas de bacterias, hongos, plantas, animales, hombre a las que pueden infectar. Son organismos submicroscpicos (observables solo a travs del microscopio electrnico), de forma variable, pueden ser alargados, en forma de de valos puntiagudos o de ladrillos con las esquinas redondas, otros son polidricos, icosadricos (polgono de 20 lados), otros tienen apariencia de cuerdas con bucles, otros como los bacterifagos que atacan a las bacterias, tienen forma ms compleja su estructura presenta cabeza y cola

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Microfotografas de Adenovirus Tomada de: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity_1.htm Organizacin y composicin de los Virus Los virus contienen solamente un tipo de cido nucleico que puede ser: ADN (cido desoxirribonucleico) o ARN (cido ribonucleico), de banda sencilla o de doble banda. El cido nucleico esta rodeado de una cubierta de protena denominada cpsida viral la cual tiene como funcin proteger el cido nucleico vrico de la accin de las nucleasas presentes en los lquidos biolgicos adems de propiciar la unin del virus con los receptores de la clula a infectar. La cpsida a su vez est constituida por fragmentos de protenas llamadas cpsomeros. La cpsida constituye la mayor parte de la masa del virus. Algunos tipos de virus como el de la inmunodeficiencia humana, poseen una envoltura que envuelve la cpsida y esta constituida por lpidos y protenas. La envoltura tiene su origen en la membrana de la clula infectada y es tomada en el momento en que el virus abandona la clula. La presencia de lpidos en la envoltura hace que los virus sean sensibles a disolventes de grasa como el ter. A esta estructura completa se la denomina partcula vrica o virin Los virus no tienen organizacin celular, carecen de de ribosomas, de sistemas productores de energa (ATP) y de sistemas enzimticos para la sntesis de cido nucleico y protenas, elementos necesarios para realizar sus procesos metablicos de manera independiente, como son su crecimiento y replicacin, para lo cual el genoma viral utiliza el metabolismo de la clula hospedadora, constituyndose los virus en parsitos intracelulares obligados. Motivo por el cual se les sita en el lmite entre lo vivo y lo no vivo. Los virus tienen especificidad por el tipo de clula a infectar. Por ejemplo un virus puede infectar una clula vegetal pero no una animal y solamente un tipo de clula dentro del organismo animal o vegetal. Algunos virus pueden existir en portadores sanos, pero al ser transmitidos a otro ser, este puede sufrir la infeccin. Es el caso del virus del SIDA. Formas de accin viral. Los virus pueden actuar de dos formas distintas: 20

 Como agentes infecciosos productores de enfermedades en el hombre, las plantas y los animales. Se reproducen en el interior de las clulas que infectan de donde obtienen todo el material y los mecanismos requeridos para su replicacin. Al no poseer metabolismo propio son insensibles a los antibiticos y a otros frmacos que actan sobre las vas metablicas, siendo en su mayora susceptibles al interfern. Como agentes genticos que modifican el material hereditario de las clulas que infectan, al unirse a su material gentico y causar variabilidad gentica. Los virus que infectan a las bacterias se denominan bacterifagos.

Grfica: Representacin esquemtica de un virus bacterifago Fuente: Carmen Eugenia Pia

Grfica Representacin esquemtica de bacterifago infectando una bacteria Fuente: Carmen Eugenia Pia

Mecanismo de replicacin de los virus.

El mecanismo de replicacin de los virus depende la constitucin del virus (tipo de cido nucleico, presencia o ausencia de envoltura) y del tipo de clula husped. El proceso se inicia con la adhesin del virus a la clula. El virus penetra dentro de la clula e inyecta en ella su cido nucleico (material gentico). Si es ADN el cido nucleico del virus, este se inserta en el ADN de la clula hospedera. El ADN de la clula hospedera fabrica las protenas vricas y el cido nucleico viral se replica en la clula que parsita utilizando las enzimas, el material y los mecanismos de la clula que lo hospeda. Si el cido nucleico del virus es ARN, el virus debe primero cambiar su ARN en ADN, empleando la maquinaria de la clula hospedera para poder insertarse. Luego la clula hospedera fabrica las protenas vricas y el cido nucleico viral se replica en la clula que parsita utilizando las enzimas, el material y los mecanismos de la clula que hospeda.

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Cuando hay suficiente cantidad de cido nucleico viral este se ensambla con la protena vrica y abandona la clula. Los virus emplean las enzimas de la clula hospedera para fabricar nuevas cpsidas y otras protenas virales. Los nuevos genes virales y las protenas se ensamblan en nuevas partculas virales. Los nuevos virus son liberados de la clula hospedera. Clic para observar Vdeo sobre los virus Clic para ver Animacin sobre el ciclo ltico o ciclo de reproduccin de los virus http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/micro/contenidos3.htm

Ciclo vital de los virus o mecanismo de replicacin ltico http://es.wikipedia.org/wiki/Ciclo_reproductivo_de_los_virus El ciclo vital de los virus consta de las siguientes cuatro fases: entrada en la clula, eclipse, multiplicacin y liberacin del virus. Veremos primero el ciclo vital de un virus, explicado de la forma ms general posible, para pasar a continuacin a estudiar las diversas modalidades que pueden presentarse en cada una de las fases del ciclo. 1. Entrada La entrada en la clula consta a su vez de dos etapas: la adsorcin o fijacin del virus en la superficie celular, y la penetracin a travs de la membrana. En la fase de fijacin el virus se une a la membrana de la clula hospedadora de forma estable. Hay una alta especificidad en la fijacin de un virus a la membrana de su clula hospedadora, porque se ha de producir la unin entre determinadas protenas de la cpsida vrica y determinadas glicoprotenas de la membrana plasmtica de la clula que lo hospeda. A lo largo de un proceso evolutivo, cada virus ha ido adquiriendo sitios de unin especficos para anclarse en la membrana de un determinado tipo celular. La penetracin o inyeccin a travs de la membrana sigue diversas modalidades. Como resultado, bien el virus completo, bien solamente su cido nucleico, logra invadir el citoplasma celular. Por regla general, se necesita el concurso de muchos virus para que alguno de ellos logre penetrar en la clula. 2. Eclipse La fase de eclipse corresponde a un tiempo, despus de la penetracin, en que el virus parece desaparecer, pues no se advierte ningn indicio de su presencia ni de su actividad. Lo que ocurre en esta fase es que se da un desensamblaje de las piezas del virus (si es que ha penetrado completo), y su cido nucleico queda asimilado en las estructuras celulares aptas para los procesos de replicacin y trascripcin. 22

Esta fase, variable de unos tipos de virus a otros. Durante esta fase se produce la sntesis del ARN, necesario para generar las copias de protenas de la cpsida. Tambin se produce la continua formacin de cidos nucleicos virales y enzimas destructoras del ADN bacteriano. Termina con la sntesis de los ARNm necesarios para que se sinteticen las protenas que actuarn en la multiplicacin del virus. 3. Multiplicacin y ensamblaje La multiplicacin del virus consiste tanto en la replicacin de su cido nucleico, como en la sntesis de las protenas de la cpsida. Los cidos nucleicos y las protenas recin sintetizadas se ensamblan rpidamente, producindose nuevas partculas vricas. En esta fase se produce la unin de los capsmeros para formar la cpsida y el empaquetamiento del cido nucleico viral dentro de ella. 4. Liberacin y Lisis La liberacin del virus consiste en la salida de las nuevas partculas vricas o viriones, que podrn infectar nuevas clulas iniciando un nuevo ciclo. Los viriones salen de la clula, mediante la lisis o ruptura enzimtica de la pared bacteriana que conlleva a la muerte celular. Los nuevos virus se encuentran en situacin de infectar una nueva clula. Modalidades de penetracin en la clula Los virus complejos producen una ruptura en la membrana bacteriana en uno de los puntos de anclaje, gracias a la presencia de algunas molculas de enzimas hidrolticas entre las protenas de la cpsida. A travs de la ruptura, el tubo central inyecta del ADN vrico, quedando la cpsida vaca en el exterior de la bacteria. La presencia de cpsidas en la superficie bacteriana es un buen indicio de que la bacteria ha sufrido una infeccin vrica. Otros virus sin envoltura lipdica se introducen en la clula con cpsida y todo, lo cual puede realizarse de dos maneras: Por penetracin directa: despus de la fijacin, el virus abre una brecha en la membrana y se introduce en el citoplasma. Por endocitosis: la membrana forma una invaginacin en torno al virus, llegando a formar una vescula que penetra en la clula. Formada la vescula, el virus abre una brecha en la membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolticas que l mismo transporta, penetrando as en el citoplasma. Los virus con envoltura lipdica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta lipdica se funde con la membrana, ya que tienen la misma naturaleza. Esta fusin de membranas puede realizarse en dos lugares distintos: Fusin en la superficie celular: de manera que el virin penetra directamente en el citoplasma. 23

 Fusin con un lisosoma: se forma una vescula por endocitosis, a la que se une un lisosoma para digerir la partcula introducida; entonces, la cubierta lipdica del virus se funde con la membrana del lisosoma y el virin escapa hacia el citoplasma.

Modalidades de fase de eclipse Segn la duracin de la fase de eclipse, se suelen distinguir dos modalidades de ciclo infeccioso de un virus: Ciclo ordinario: el cido nucleico vrico procede inmediatamente a la transcripcin de su mensaje gentico en los ARNm necesarios para su multiplicacin, y prosigue rpidamente el ciclo vital. Este tipo de ciclo es el ms extendido en la naturaleza. Ciclo lisognico: fue descubierto por Lwoff en bacterifagos. El ADN vrico se cierra por sus extremos generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en un lugar especfico en el que la secuencia de nucletidos bacterianos es semejante a alguna regin del ADN vrico. La bacteria prosigue sus funciones vitales sin que el virus realice ninguna accin, y cuando el ADN bacteriano se duplica tambin lo hace el ADN vrico, de manera que el genoma del virus pasa a las dos bacterias hijas. La multiplicacin bacteriana puede seguir durante generaciones sin que el virus se manifieste. Pero ante una alteracin de las condiciones ambientales, el ADN vrico se separa del bacteriano y prosigue entonces las restantes fases de ciclo infeccioso, produciendo la muerte de la bacteria y nuevos ejemplares del virus. Algunos virus que infectan clulas animales siguen tambin el ciclo lisognico, como los virus de las verrugas y algunos retrovirus que producen algunos tipos de cncer. En el caso de los retrovirus, conviene recordar que el cido nucleico es ARN monocatenario, por lo que la transcriptasa inversa ha de copiar el genoma vrico en forma de ADN antes de que pueda insertarse en el ADN celular. Modalidades de multiplicacin del virus La multiplicacin del virus consta de la replicacin de su material gentico, de la transcripcin de su mensaje en una molcula de mARN y de la traduccin del mensaje para producir protenas vricas, tanto las que formarn parte de la cpsida como las protenas enzimticas necesarias para el ensamblaje de las piezas del virin y para algunas de las funciones anteriores. Los ribosomas y la mayor parte de las enzimas que los cidos nucleicos vricos utilizan en estos procesos son los de la clula infectada. Los virus con ADN realizan la replicacin del material gentico de la misma manera que las clulas; en el caso de los virus con ADN monocatenario, previamente a la replicacin se sintetiza una cadena de ADN complementario para formar la doble hlice.

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 Los virus con ARN replican el material gentico sin necesidad de pasar por ADN, actuando cada cadena de ARN como molde para la sntesis de su complementaria. Los retrovirus constituyen una excepcin a lo dicho anteriormente, ya que su ARN sintetiza un ADN bicatenario, que ser el que posteriormente realice la sntesis de nuevos ejemplares de RNA vrico. Los virus con ADN y los retrovirus sintetizan el ARNm a partir de la cadena molde de ADN de forma similar a como lo hacen las clulas. Los virus con ARN, excepto los retrovirus, sintetiza en el ARNm copiando la cadena molde de ARN, sin necesidad de pasar por ADN. Posteriormente a estos procesos, tiene lugar el ensamblaje de las piezas para construir nuevos viriones. En muchos virus, como el del mosaico del tabaco, el ensamblaje es automtico y depende de la concentracin salina del medio. En otros virus, en el ensamblaje intervienen enzimas codificadas en el cido nucleico del virus Modalidades de liberacin de los nuevos virus Despus de la multiplicacin del virus tiene lugar la salida de los nuevos individuos, que saldrn con capacidad de infectar nuevas clulas. Las principales modalidades de liberacin dan nombre a nuevas variantes del ciclo vital de los virus Ciclo ltico y lisognico (Complemento al artculo de "Modalidades de fase de eclipse")

Estos dos ciclos configuran las etapas reproductoras de un virus bacterifago. En referencia al ciclo ltico, ste se inicia con el anclaje del cuerpo vrico a la superficie de la bacteria y la posterior inyeccin de parte de su material gentico en el interior de la bacteria. El paso posterior es el aprovechamiento del medio interno de la bacteria para sintetizar ms virus a partir de componentes citoplasmticos, tales como protenas. Cuando se han fabricado los suficientes cuerpos vricos, la bacteria se lisa (rompe) y se liberan. En cuanto al ciclo lisognico, el proceso se inicia con la inyeccin del material gentico del virus en la bacteria, del mismo modo del proceso anteriormente expuesto; los filamentos de ADN inyectados a presin del cuerpo vrico se combinan con el material gentico de la bacteria, denominndose ste proceso Recombinacin Gnica. Dicha combinacin da como resultado una secuencia de nucletidos bacteriana y vrica, con la cual se sintetizan nuevos virus. ste ciclo puede dar a su vez un nuevo ciclo ltico. Infeccin persistente Los nuevos virus no esperan a la muerte de la clula hospedadora para abandonarla, sino que van saliendo de la clula al mismo tiempo que se van produciendo, de manera 25

que la clula puede seguir viva y produciendo nuevas partculas vricas. La liberacin puede hacerse de dos maneras: Los virus sin envoltura lipoproteica salen directamente, sin arrastrar ningn resto de la membrana plasmtica, bien sea abriendo una brecha en la membrana, o bien aprovechando los mecanismos de exocitosis o salida de sustancias al exterior de la clula.

Los virus con envoltura lipoproteica salen por gemacin, es decir, se rodean de una porcin de membrana plasmtica que acaba separndose de la clula y constituye la cubierta lipoproteica del nuevo virus. Enfermedades virales Los virus son causantes de enfermedades infecciosas en el hombre como son : la viruela, la gripe, la hepatitis, las paperas, la rabia, la poliomielitis, el SIDA, el sarampin, la encefalitis, la rubola, el herpes, la fiebre amarilla sta ltima transmitida por un vector; en los animales originan el moquillo, la rabia, la influenza, la encefalitis, el clera; y en las plantas enfermedades como el virus del mosaico del tabaco y el virus del mosaico amarillo del nabo entre otras. Los mecanismos de transmisin son diversos algunos por va respiratoria cuando la persona enferma estornuda o tose; otros a travs de picaduras de insectos es el caso de la fiebre amarilla; o por mordedura de animales enfermos como en el caso de la rabia; los que causan trastornos digestivos por va oral-fecal y por inoculacin con jeringas u objetos infectados, por transfusin de sangre contaminada, por relaciones sexuales sin proteccin y por ltimo a travs de la madre al hijo durante el embarazo o en el momento del parto. En el caso de las plantas la transmisin se hace por insectos o nematodos. Los medios para prevenir la infeccin viral son las vacunas que causan inmunidad, evitar el contacto con personas infectadas, esterilizacin de objetos, uso de jeringas desechables. Importancia biolgica de los virus Los virus sirven para adelantar investigaciones biolgicas relacionadas con su mecanismo de replicacin y as poder encontrar mecanismos para controlar su multiplicacin. Algunos virus atacan bacterias e insectos perjudiciales ayudando a mantener el equilibrio ecolgico. Los virus permiten la elaboracin de vacunas, fueron de los primeros modelos para estudio del funcionamiento del genoma, los bilogos utilizan los virus para estudiar el mecanismo de control de la informacin gentica y extrapolarlo a organismos ms complejos. Los virus sirven como mediadores en el intercambio gentico entre individuos de una misma o diferentes especies proporcionando variabilidad de los organismos y por ende disminuyen la susceptibilidad a ser infectados. Por ejemplo, las bacterias que han sido 26

infectadas por virus -bacterifagos- pueden realizar funciones que en otras condiciones no podra realizar. Algunos virus se utilizan en medicina para introducir informacin a clulas animales que presenten defectos genticos o adquiridos y as lograr que funcionen normalmente. Se usan en la identificacin de bacterias peligrosas en alimentos o superficies, lo que facilita su rpida deteccin y la instauracin de medidas preventivas. Lectura http://www.consumaseguridad.com/web/es/investigacion/2003/11/18/9422.php Investigacin sobre la utilizacin de la capacidad de los virus de fagocitar bacterias para deteccin de patgenos alimentarios y su eventual eliminacin. 18 de noviembre de 2003 Jos Juan Rodrguez Jerez. Otras formas acelulares Viroides y priones Otras formas acelulares Viroides Son molculas de ARN circular que carecen de cubierta viral o cpsida, son de tamao menor que los virus. Su ARN est formado por muy pocas bases: 246-399 con un alto contenido en estructura secundaria que guarda la informacin para su propia sntesis en un hospedador adecuado al que causa, frecuentemente, una alteracin patolgica. Se encuentran en clulas vegetales donde causan enfermedades. Debido a que los viroides no codifican para ninguna protena deben necesariamente reclutar protenas y vas metablicas de la clula hospedera para completar su ciclo infeccioso. Se les considera como la etapa primitiva de los virus. Algunos producen enfermedades en plantas como las papas, el pepino, el tomate, la naranja, la vid, el coco entre otros, causando importantes prdidas econmicas. Se describieron por primera vez hace 30 aos y, aunque no est completamente descartado, se piensa que no afectan a los animales. El primero que se identific fue el de la papa, y ahora la lista es de 28 especies de viroides, dice Ricardo Flores del Instituto de Biologa Molecular y Celular de Plantas de la Universidad de Valencia. Algunos de ellos, como el viroide que afecta a los naranjos, hacen que la planta sea mucho ms pequea que un naranjo normal, pero las naranjas siguen siendo del mismo tamao, por lo que podran permitir plantar el doble de naranjos por hectrea. Priones Son protenas que se multiplican en la clula hospedadora donde generan graves alteraciones. Todas las enfermedades ocasionadas por priones son neurolgicas, por ejemplo el sndrome de las vacas locas. A continuacin se presenta una ampliacin tomada de: http://enfenix.webcindario.com/biologia/microbio/priones.phtml

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Los priones son agentes patgenos formados por una protena (protena del prin o PPr). Los priones, o las enfermedades producidas por priones, por un lado se transmiten verticalmente, como cualquier enfermedad hereditaria tpica, mientras que por otro lado se comportan de manera infectiva, transmitindose horizontalmente, mediante contagios que pueden darse entre individuos de distintas especies. La protena del prin (PrP) normal, tiene una secuencia de aminocidos, (estructura primaria) idntica a la protena del prin patgena. La diferencia entre las dos recae en la estructuras secundaria y terciaria. La protena normal es muy rica en hlices alfa, la protena patgena lo es en lminas beta.

Protena del prin normal

Protena del prin patgena

Protena patgena infectando a una normal

Estructura terciaria de la protena del prin

Estructura secundaria en hlice y lmina

Poder infectivo de los priones El cambio de configuracin de la protena del prin es crucial, ya que las protenas con lminas beta son muy resistentes a las enzimas proteolticas, al calor y no se disuelven en agua. Pero sobre todo, la protena alterada tiene una caracterstica nica: interacciona con una molcula de protena normal, le cambia la conformacin y la hace capaz de convertir las estructuras de ms protenas normales. Ah radica al parecer, el poder infectivo de los priones.

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Puede ocurrir que la protena patgena infecte individuos que producen protena normal (a), como ha ocurrido por ejemplo al consumir las vacas piensos elaborados a partir de ovejas enfermas. En este caso la protena patgena origina un cambio conformacional de la protena normal (b), transformando las hlices alfa de su estructura proteica en lminas beta. Las nuevas protenas patgenas inducen el cambio en otras normales, lo cual produce un efecto de "cascada". Profundizacin sobre virologa: http://www.medynet.com/usuarios/nnuneza/virologia/indexviral.html Curso muy completo sobre virologa de autora del Dr. Steve Dewhurst, Associate Professor of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center USA. Contiene las siguientes temticas: antivirales biologa de los virus casos y preguntas (HIV) Enf. de Borna glosario hepadnavirus hepatitis delta herpes: captulo 1 herpes: captulo 2 HIV: biologa molecular lentivirus, patogenia lentivirus, gestacin y recin nacido paramyxovirus parvovirus patognesis viral replicacin viral rhabdovirus virus oncognicos virus respiratorios virus del SNC virus del tracto GI Vacunas

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http://www.virology.net/ Virology Journal. Revista on line gratuita con temticas de actualidad en el campo microbiolgico

Capitulo 4: Microorganismos celulares procariotas Introduccin Se analizan las caractersticas de los dominios Arqueobacterias y Eubacterias, para conocer su estructura y funcin Objetivo especfico Identificar y describir con propiedad las caractersticas de los microorganismos que conforman los dominios Arquea y Eubacterias Identificar las enfermedades y las aplicaciones tiles o industriales de estos microorganismos Leccin 8: Dominio Arqueobacterias Leccin 9: Dominio Eubacterias - Grupo Cianobacterias Leccin 10: Dominio Eubacteria - Grupo Micoplasmas sobre la Conclusin Las bacterias pertenecientes al reino Procariota aportan un gran potencial para su utilizacin por parte del hombre, especialmente algunas del grupo de las cianobacterias. En otros casos como el grupo de los micoplasmas se destaca su gan incidencia en la generacin de enfermedades. Dominio: Las Arqueas caractersticas Carl Woese mediante la secuenciacin de la molcula de ARNr, comprob que los procariotas pertenecientes al reino Mnera se dividan en 2 grupos o dominios: al primero de ellos lo llam Eubacteria o bacterias verdaderas, al segundo grupo lo llam Arqueobacteria.

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Arqueas- Fuente: http://www.sapm.qc.ca/

Incluye las bacterias que pueden crecer en condiciones extremas como los hielos antrticos -psicrfilas-, o en fuentes termales (a veces a temperaturas superiores a las de la ebullicin del agua), como las que habitan en las aguas hirvientes del parque de Yellowstone o dentro de volcanes, son las arqueas llamadas termfilas extremas, otras habitan en medios anaerobios, con pH muy cido-acidofilas-, o en suelos y aguas altamente alcalinas son las llamadas alcalofilas, algunas arqueas son productoras de gas metano metangenas-, otras se desarrollan en medios salinos, o sea, las halobacterias o halfitas. Algunas arqueas son habitantes normales del intestino del hombre y animales. Forma y Estructura de las Arqueobacterias

Presentan formas similares a la de las bacterias verdaderas: esfricas, individuales o en grupo, bacilares, filamentosas, lobuladas. Estructura Pared Celular Formada por lpidos, protena o glicoprotena a diferencia de la pared celular de peptidoglucano de las eubacterias. La pared presenta simetra hexagonal y adquiere diferentes morfologas como respuesta a los diferentes ambientes en los cuales se desarrolla. Membrana Plasmtica Carece de cidos grasos y en su lugar tiene cadenas laterales compuestas de unidades repetitivas de isopreno unidas por enlaces ter al glicerol que constituyen el glicerolditer cuando se distribuyen a manera de bicapa y el gliceroltetrater cuando es a manera de monocapa, este ltimo arreglo es muy estable a temperaturas altas por lo tanto, no es una sorpresa que se encuentre principalmente en las arqueas termoacidfilas. ARN El ARN y enzimas de arqueobacterias son diferentes al de las bacterias verdaderas. Metabolismo Muchas especies de Arqueobacterias definen actualmente los lmites ms extremos de la tolerancia biolgica a factores fisicoqumicos. Algunas Arqueobacterias muestran 31

tambin propiedades bioqumicas poco comunes, como los metangenos, que son procariotas que producen metano (gas natural) como parte esencial de su metabolismo energtico. Las arqueas absorben CO2, N2 o H2S y eliminan CH4. Las arqueobacterias presentan adems mecanismos de defensa contra las condiciones extremas que podran afectarlas. Por ejemplo ellas fabrican una variedad de molculas y enzimas protectoras. Las arqueas que viven en medio ambiente altamente cidos, poseen en su superficie celular unas molculas cuya funcin es ponerse en contacto con el cido para evitar que penetre en la clula y as evitar que el ADN se destruya. Las arqueas halfilas toman del exterior sustancias como el cloruro de potasio para equilibrar el interior de la clula y evitar que el agua salada penetre y destruya la clula. Se pueden encontrar en algunos tipos de alimentos en los que se han utilizado altas concentraciones de sal (salmueras) para su preservacin como es el caso de pescados y carnes, en donde se reconoce su presencia porque forman manchas rojas. Las arqueas obtiene energa a partir de compuestos como hidrgeno, dixido de carbono y azufre. Algunas lo hacen a partir de la energa solar a travs de la bacteriorodopsina, un pigmento que reacciona con la luz y permite que la arqueobacteria fabrique el ATP. Dominio Bacterias o Eubacterias A las eubacterias tambin se les conoce como bacterias, microorganismos procariotas, unicelulares de organizacin muy sencilla, su tamao vara entre 1 y 10 micrmetros. (1 micrmetro equivale a 1/1000mm).

Cianobacteria Arthrospira platensis http://www-microb.isunet. edu/experiment.htm

Bacteria Micoplasma E. coli http://www.marcobueno.net/ http://pathmicro.med.sc. arquivos_estudo/arquivo_ edu/fox/protype.htm estudo.asp?txtIDArquivo=342

Dentro de Eubacteria se presentan varias ramas evolutivas, que incluyen a todos los procariotas causantes de enfermedades (patgenas) y a la mayor parte de las bacterias que se encuentran normalmente en el aire, suelo, aguas, tracto digestivo de animales y hombre. Comprende:

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 Las bacterias verdaderas o eubacterias, Los micoplasmas Las cianobacterias. Estructura y funcin de las Eubacterias A excepcin de los micoplasmas todas poseen pared celular de peptidoglucano.

Carecen de membrana que rodee el material gentico el cual se halla ms o menos disperso en el citoplasma. Presentan ADN de cadena doble circular cerrado. No poseen histonas en el ADN. Su citoplasma no posee estructuras membranosas. Presentan mesosomas. Los ribosomas son de menor tamao. No poseen citoesqueleto. No poseen organelos como mitocondrias, cloroplastos, retculo endoplasmtico, Aparato de Golgi, lisosomas. Poseen un solo cromosoma. Su reproduccin es asexual por gemacin, conjugacin o biparticin, no presentan mitosis ni meiosis. La movilidad no es universal, pero muchas bacterias se mueven en medios acuticos debido a unas estructuras llamadas flagelos, que nada tienen que ver con los flagelos eucariticos. Grupo 1 Cianobacterias
Adaptado de: http://www.biologie.uni-hamburg.de/b- online/ibc99/botanica/botanica/cyanophy.htm

Spirulina Maxima

Hormogonios en Spirulina

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Las cianobacterias, antiguamente conocidas como algas verdeazules, por su color verde-azulado (a veces rojizo, pardo o negro), son bacterias que han estado viviendo sobre nuestro planeta por ms de 3 mil millones de aos. Se caracterizan por que son procariotas (sin ncleo verdadero), auttrofos (fundamentalmente). Unicelulares, tamao entre 1 m hasta varios micrmetros. Las cianobacterias crecen en ambientes lnticos (lagos y lagunas), suelos hmedos, troncos muertos, cortezas de rboles, algunas en aguas salobres y otras en aguas termales. Hace miles de millones de aos las haba en tan gran nmero, que eran capaces de aadir, a travs de la fotosntesis, suficiente oxgeno a la primitiva atmsfera de la Tierra, como para que los animales que necesitaban oxgeno pudieran sobrevivir. Estructura Celular de Cianobacterias Presentan diversidad de formas: Unicelulares (como Gloeocapsa), pluricelulares filamentosas como Spirulina, filamentosas ramificadas (como Stigonema), no ramificadas (como Oscillatoria), con heterocistes (clulas vegetativas diferenciadas que se encuentran regularmente a lo largo de un filamento o en un extremo del mismo. Su pared celular es semejante a la pared celular de las bacterias gram negativas, no contiene celulosa pero es muy resistente debido a la presencia de polisacridos unidos a polipptidos. Adems secretan una sustancia mucilaginosa que les confiere la defensa contra predadores ya que puede ser txica. Por otra parte une grupos de clulas formando filamentos (cianobacterias filamentosas). Algunas especies forman clulas especiales con pared exterior engrosada (acinetos) que les permite permanecer latentes cuando las condiciones ambientales son desfavorables (sequa, oscuridad, congelacin). Estos acinetos se rompen durante la germinacin para dar paso a la formacin de nuevos filamentos vegetativos La membrana plasmtica puede presentar invaginaciones o mesosomas parecidos a los de las bacterias gram positivas, la membrana celular contiene cidos grasos con dos o ms enlaces dobles en la cadena hidrocarbonada a diferencia de los dems procariotes que poseen cidos grasos saturados. Protoplasma (citoplasma), separado en cromoplasma (perifrico y pigmentado) y centroplasma (central, granuloso e incoloro). Nucleoplasma contiene el ADN puede aparecer en forma de pequeos grnulos, pueden aparecer granos de volutina, cianoficina y ribosomas. Los pigmentos que se encuentran en el citoplasma son: clorofila a, c, carotenoides, ficoxantina, ficocianina C, de color azul, ficocianobilina, ficoeritrina C, de color rojo, ficoeritrobilina entre otros.

Reproduccin Asexual, por biparticin, o por fragmentacin de filamentos dando origen a hormogonios que se separan de los filamentos originales y se mueven deslizndose. Algunas experiencias parecen confirmar que existen fenmenos que implican la recombinacin de material gentico, al igual que en las bacterias.

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Nutricin Las cianobacterias son capaces de realizar fotosntesis. Algunas contienen pigmentos que les permiten usar la luz como fuente de energa mediante un proceso llamado fotosntesis, otras dependen de compuestos orgnicos como fuente de energa, y algunas pueden usar incluso compuestos qumicos inorgnicos como combustible para realizar los procesos celulares. Movilidad Los gneros Oscillatoria, Spirulina y Rivularia presentan movimiento. Las especies planctnicas, se caracterizan por poseer vesculas de gas en su citoplasma que son las encargadas de mantener el organismo en flotacin para ubicarse en la zona de mxima iluminacin. Algunas han adquirido estructuras especiales, como esporas, para mejorar la supervivencia. Tanto los ambientes aerobios (que contiene O2) como los anxicos o anaerobios pueden ser habitados por distintas especies de cianobacterias. Clic para ver Vdeo Spirulina http://video.conncoll.edu/f/pasiv/lucid/Spirulina-300.html Importancia biolgica de las cianobacterias http://www.eez.csic.es/~olivares/ciencia/fijacion/cianobacterias.htm Las cianobacterias son organismos antiguos que se caracterizan por conjugar el proceso de la fotosntesis oxgenica con una estructura celular tpicamente bacteriana. Al ser responsables de la primera acumulacin de oxgeno en la atmsfera, las cianobacterias han tenido una enorme relevancia en la evolucin de nuestro planeta y de la vida en l. En la actualidad presentan una amplia distribucin ecolgica, encontrndose en ambientes muy variados, tanto terrestres como martimos, e incluso en los ms extremos, siendo la fotoautotrofia, con fijacin de CO2 a travs del ciclo de Calvin, su principal forma de vida, y contribuyendo de manera importante a la productividad primaria global de la Tierra. Muchas cianobacterias son capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico, siendo, a su vez, capaces de hacerlo en condiciones de aerobiosis (de hecho, ciertas cianobacterias representan los mayores fijadores en amplias zonas ocenicas contribuyendo de forma importante a la cantidad total de nitrgeno fijado en vida libre). La existencia conjunta de la fotosntesis y de la fijacin de nitrgeno ha requerido el diseo de estrategias que hagan posible el funcionamiento de ambos procesos antagnicos desde el punto de vista de sus requerimientos ambientales. Entre tales estrategias la separacin en el tiempo o en el espacio de ambas funciones permite el desarrollo normal de la clula en condiciones de bajos niveles de nitrgeno combinado. En este sentido, merece particular mencin la capacidad de algunas 35

especies filamentosas de desarrollar unas clulas llamadas heterocistos, enormemente especializadas en la fijacin del nitrgeno en ambientes aerbicos. Heterocistos en cianobacterias Los heterocistos son clulas especializadas, distribuidas a lo largo o al final del filamento (cianobacterias multicelulares filamentosas), los cuales tienen conexiones intercelulares con las clulas vegetativas adyacentes, de tal manera que existe un continuo movimiento de los productos de la fijacin de nitrgeno desde los heterocistos hacia las clulas vegetativas y de los productos fotosintticos desde las clulas vegetativas hacia los heterocistos (Todar, 2004). Las bases moleculares del proceso de diferenciacin de los heterocistos y el establecimiento del patrn de distribucin de los mismos en el filamento cianobacteriano constituyen uno de los campos ms activos en el estudio actual de las cianobacterias y, asimismo, representa un modelo simple de establecimiento de patrones espaciales de diferenciacin cuyo estudio puede abordarse con la gran variedad de herramientas desarrolladas para el anlisis gentico-molecular de las cianobacterias, que incluyen la construccin de especies y la disponibilidad de la secuencia completa de los genomas de varias de ellas. Muchas cianobacterias, por ejemplo, Anabaena azollae juegan un papel importante en el desarrollo de cultivos como el arroz. Anabaena azollae, en simbiosis con helechos, proporciona hasta 50 Kg. de nitrgeno/ha siendo la utilizacin de este sistema fijador general en muchas regiones del sudeste asitico. (Con la contribucin de Antonia Herrero, Instituto de Biologa Vegetal y Fotosntesis, CSIC.). Grupo 2 de las Eubacterias: Los Micoplasmas caractersticas http://encuentro.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000024/lecciones/cap01/01_03_ 07.htm Son bacterias de gran inters evolutivo debido a la sencillez de su estructura celular y a su tamao que oscila entre 0,2 y 2 m. Poseen diversas formas debido a la carencia de una estructura rgida, lo que tambin ha generado inconvenientes al momento de medir su dimetro regular. Se pueden encontrar en un mismo cultivo formas cocoides (0.2 - 0.3 m), espiraladas, filamentosas con frecuencia ramificadas, "hinchadas", etc. http://www.marcobueno.net/ Estn delimitadas solamente por una membrana celular flexible resistente a la lisis osmtica. Carecen de pared celular y gracias a ello pueden pasar fcilmente por filtros bacteriolgicos. El nombre micoplasma se deriva de la propiedad de producir formas filamentosas, con aspecto de hongo. 36

Poseen menos de la mitad del ADN que la mayora de los otros procariotes y esta cantidad tan pequea es suficiente para codificar todas las propiedades esenciales de una clula. Los micoplasmas son aerobios o anaerobios. Algunas especies se encuentran en el suelo, otras en aguas residuales y otras ms viven sobre las membranas mucosas de los cuerpos de los animales o en las plantas, pero por lo general no son patgenas. Enfermedades causadas por micoplasmas

Dentro de las enfermedades causadas por micoplasmas se incluyen las infecciones del tracto urinario y algunas formas de neumona. Como presentan resistencia natural a la penicilina y a la cicloserina, se deben tratar con antibiticos que no acten sobre la sntesis de la pared celular, sino que inhiban la sntesis de protenas como por ejemplo con tetraciclina. En los vegetales la especie Spiroplasma citri causa la enfermedad conocida como "tristeza del naranjo" y en las plantas de maz el "raquitismo del maz". En los animales otras especies de Spiroplasma son responsables de enfermedades como la espiroplasmosis de la abeja melfera y las cataratas del ratn lactante. En medios protegidos osmticamente como son los organismos de los hospedadores (en los cuales hay cierta estabilidad o equilibrio), los micoplasmas suelen sobrevivir pues no existe para ellos la posibilidad de enfrentarse a lisis osmtica como sucedera con alguna otra clula carente de pared celular. Aunque no se tien con la coloracin de Gram, se clasifican como miembros de las bacterias Gram positivas, ya que genticamente se relacionan con las bacterias del tipo clostridios. Metabolismo de los micoplasmas Con respecto a su metabolismo, los micoplasmas usan como fuente de energa principalmente los carbohidratos y requieren factores de crecimiento como las vitaminas, los aminocidos y las bases nitrogenadas. Algunas especies son oxidativas y producen ATP por fosforilacin a travs de la cadena de transporte de electrones. Otras especies son fermentativas y utilizan azcar para obtener cido lctico. Para su reproduccin recurren al mecanismo de divisin por gemacin, as las clulas permanecen unidas entre s por medio de hifas. Grupo 3 de las Eubacterias: Las Bacterias verdaderas: Tamao El tamao microscpico de las bacterias est determinado genticamente, y depende de la cepa, de las condiciones ambientales (nutrientes, sales, temperatura, tensin superficial). La unidad de medida bacteriana es el micrmetro (m), que equivale a 1/1000 milmetros (10-3 mm = 1 micrmetro). Para darse una idea de su tamao se calcula que en un centmetro cbico cabe alrededor de un milln de billones de bacilos de tamao medio. 37

El rango en el tamao de las bacterias es muy variado, existen bacterias como las nanobacterias de aproximadamente un 0.05 mm, o bacterias de un tamao mayor como Epulopiscium, un comensal del intestino del pez cirujano que mide 0.5 mm.

http://www.meteored.com/RAM/numero31/nano.asp Algunos micoplasmas tienen tamaos que oscilan entre 0.2 a 0.3 micrmetros (m) de dimetro Escherichia coli habitante natural en el intestino humano mide aproximadamente 0.5 m de ancho por 2 m de largo. Forma y Composicin de las bacterias

Las bacterias difieren en la forma, las hay esfricas u ovales llamadas cocos, alargadas cilndricas en forma de bastn se les denomina bacilos, en forma de espiral o helicoidal, los espirilos, en forma de coma las llamadas vibrios y algunas en forma cuadrada con lados y esquinas en ngulo recto.

La forma de la bacteria puede ser modificada por las condiciones ambientales. Las bacterias estn constituidas por un 70% de agua y un 30% de materia seca, de esta materia seca el 70% corresponde a protenas, el 3% a ADN, el 12% a ARN, el 5% a azucares, el 6% lpidos y el 4% a minerales. La estructura celular se divide en dos grupos: la estructura externa que no se encuentra en todas las clulas y participa en funciones especializadas; y la estructura interna que se encuentra en todas las clulas procariotas y es probablemente esencial para su supervivencia. Dentro de las estructuras externas se encuentran: la pared celular, los flagelos, las esporas, las fimbrias o pelos y la cpsula. Estas estructuras no 38

siempre se encuentran en todas las bacterias, razn por la cual se estima que no son esenciales. * Pared celular Es una estructura rgida, se encuentra rodeando la membrana citoplasmtica de casi todas las bacterias, posee una gran rigidez lo cual le confiere gran resistencia. Se considera esencial para el desarrollo y divisin bacteriana; cumple con dos funciones importantes: mantener la forma de la clula y evitar que la clula colapse debido a las diferencias de presin osmtica por el constante intercambio de fluidos. El grosor de la pared oscila entre de 10 y 80 nanmetros. La pared celular constituye una porcin apreciable del peso seco total de la clula; dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo puede representar del 10 al 40 % del peso seco del organismo. En las Eubacterias la pared celular contiene peptidoglucano, compuesto que no se encuentra en las clulas eucariotas. En las bacterias Gram- positivas se halla inmerso en una matriz aninica de polmeros azucarados, mientras que en las bacterias Gramnegativas est rodeada por una membrana externa, e inmersa en un espacio periplsmico. El prefijo Gram proviene de la tcnica de coloracin que se utiliza para la diferenciacin primaria del tipo de bacteria. Adems de los compuestos anteriores, se encuentran el cido diaminopimlico y cido teicoico. Profundizacin sobre composicin de la pared celular * Membrana plasmtica la cual presenta invaginaciones, que son los mesosomas que contienen enzimas que participan en la duplicacin del ADN, en la membrana plasmtica se localizan tambin enzimas que intervienen en la produccin de energa (ATP), funcin que en la clula eucaritica cumple la mitocondria. Profundizacin sobre la membrana plasmtica * Flagelos presentes en la mayora de bacterias, generalmente son rgidos, implantados en la membrana celular mediante un corpsculo basal. Permiten a la mayora de bacterias la movilidad en medios lquidos, una excepcin son las bacterias deslizantes que se mueven por flexin de la pared celular. La movilidad, o sea, el movimiento de traslacin de un punto a otro en forma rpida y de zig zag permite alas bacterias responder a estmulos, por ejemplo, qumicos (quimiotactismo positivo), cuando las bacterias son atradas a determinados compuestos como la glucosa, la galactosa o por el contrario son repelidas de algunos compuestos como los antibiticos, (quimiotactismo negativo), luminosos (fototactismo positivo) en las bacterias fotosintticas La movilidad debe distinguirse del movimiento pasivo de las bacterias en una sola direccin como consecuencia de las corrientes en la preparacin, o del movimiento Browniano que es la constante vibracin de las bacterias en un punto fijo comportamiento que se presenta por estar suspendidas en medio lquido y por su pequeo tamao. * Fimbrias muy numerosas y cortas, no tienen funcin de motilidad, se encuentran relacionadas con diversas funciones como la de adherencia a las superficies de tejidos, 39

sitios de adsorcin para virus bacterianos y adems pueden servir como pelos sexuales para el paso de ADN de una clula a otra. * Cpsula es una estructura de material viscoso que rodea la pared celular de muchas bacterias que se encuentran en su ambiente natural. No cumple ninguna funcin metablica pero sirve a las bacterias para adherirse a sus sustratos, o para la formacin de colonias mediante la adhesin de bacterias hermanas. Cuando una bacteria encapsulada invade a un husped, la cpsula evita que los mecanismos de defensa del husped destruyan la bacteria. Profundizacin sobre flagelos - Profundizacin sobre cpsula

Estructuras internas * El Citoplasma Se encuentra delimitado por la membrana celular, presenta un aspecto viscoso constituido por agua y sustancias como iones, protenas, enzimas, lpidos, carbohidratos disueltas en agua , en l se encuentran: materiales de reserva , ARN , ribosomas, un nucleoide ubicado en su zona central donde se encuentra la mayor parte del ADN bacteriano en algunas bacterias se encuentran dispersos por el citoplasma fragmentos circulares de ADN con informacin gentica llamados plsmidos y pigmentos fotosintticos en el caso de bacterias fotosintticas. En el citoplasma se realizan los procesos metablicos de la clula bacteriana. * Los ribosomas son organelos con apariencia de grnulos, algunos se hallan dispersos en el citoplasma bacteriano y otros se agrupan en cadena y se les denomina polirribosomas; estn compuestos por cido ribonucleico - ARN (60%) y protena (40%). Su funcin es la sntesis de protena. * La regin nuclear esta localizada centralmente en la clula, se compone principalmente de ADN aunque tambin puede encontrarse ARN y protenas asociadas a ste. El ADN esta dispuesto en un cromosoma largo y circular, algunas veces llamado nucleoide, genforo o cuerpo cromatnico. * Los mesosomas son repliegues y extensiones de la membrana citoplasmtica, intervienen en procesos metablicos y de reproduccin de la clula bacteriana. * Los cuerpos de inclusin o grnulos son materiales de reserva como lpidos, hierro, azufre que se almacenan en el citoplasma, en los perodos de suficiente aporte nutricional para ser utilizados en pocas de inanicin. * Los plsmidos son pequeas molculas circulares de ADN extracromosmico, se encuentran en la regin nuclear de algunas bacterias. Las molculas de ADN plsmico a pesar de encontrarse fuera del cromosoma, toman una conformacin de doble hlice al igual que el ADN de los cromosomas. Los plsmidos se replican de manera independiente al cromosoma y contienen informacin gentica para la bacteria complementaria a la contenida en el nucleoide y que le es til para su supervivencia en condiciones desfavorables. Por ejemplo, el 40

cdigo que hace resistentes a las bacterias a los antibiticos, la capacidad de apareamiento, la resistencia y la tolerancia a los materiales txicos. Los plsmidos son muy utilizados en ingeniera gentica ya que por su tamao resulta fcil manipularlos; se pueden aislar, introducir en ellos informacin e introducirlos en otras clulas bacterianas viables en las cuales se expresa la informacin que ellos portan. * Las vesculas se encuentran en ciertas bacterias que habitan en lagos les sirven para flotar, contrarrestando la atraccin gravitatoria, y as lograr el ptimo de luz * Endosporas Son estructuras generalmente de forma esfrica que se forman en ciertas bacterias Gram positivas como respuesta a condiciones ambientales adversas (poca humedad, temperaturas extremas, agentes qumicos y fsicos etc.). Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables la endospora se transforma de nuevo a la forma vegetativa. Ciertas formas filamentosas pueden producir la endospora en el extremo del filamento y aparecen de manera libre, en otras bacterias como Clostridium se pueden observar en el interior de las bacterias a las que deforman de una manera caracterstica, lo que sirve para su identificacin Profundizacin citoplasma y sus organelos Reproduccin de bacterias Generalmente las bacterias se reproducen asexualmente por fisin binaria o biparticin, unas pocas por gemacin, algunas especies de bacterias filamentosas se reproducen por esporas que se forman en los extremos de los filamentos. Durante la biparticin la clula bacteriana origina dos clulas iguales o clones. El resultado de la fisin binaria son dos clulas hijas por cada clula madre, as, una clula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y as sucesivamente. La sntesis de la pared, el crecimiento bacteriano y la duplicacin del ADN regulan la divisin celular. Este mecanismo de divisin celular es ms rpido y menos organizado que la mitosis y la meiosis. El proceso de biparticin se inicia con el alargamiento de la clula bacteriana y la duplicacin del ADN, luego en el centro de la bacteria, la pared celular y la membrana plasmtica se invaginan con la consecuente formacin de un tabique transversal o mesosoma que divide la clula bacteriana en dos y separa las dos regiones de ADN cromosmico. La separacin de las dos clulas va acompaada de la segregacin en cada una de ellas de uno de los dos genomas que proviene de la duplicacin del ADN materno. El proceso de divisin ocurre en tres fases principales: 1. Elongacin o alargamiento de la clula y duplicacin del material gentico o ADN, 2. Separacin de ADN dentro de las clulas hijas formadas y 3. La citocinesis o separacin celular. 41

Grfica Representacin reproduccin de una bacteria fuente: Carmen Eugenia Pia Lpez

Intercambios genticos en bacterias Sin embargo en algunas bacterias ocurren intercambios genticos (intercambio de genes) como resultado de tres mecanismos: transformacin, conjugacin, transduccin e intercambio de plsmidos. Transformacin: Consiste en el intercambio gentico producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive. Animacin sobre proceso de conjugacin Conjugacin: En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a travs de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plsmido, adems del cromosoma bacteriano. Transduccin: En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra, se realiza a travs de un virus bacterifago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

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Profundizacin: http://www.fortunecity.com/victorian/rodin/667/biologia/microbio.html Clasificacin de las Bacterias * Por su forma y agrupacin Los modelos de agrupamiento celular de las bacterias son caractersticos de especies definidas y se utiliza como uno de los criterios de clasificacin. Cuando las clulas microbianas como los cocos se dividen, pueden permanecer unidas unas con otras, formando arreglos caractersticos. Los bacilos se dividen nicamente en un plano pero en algunas ocasiones pueden encontrarse clulas unidas por los extremos o por los lados debido a la etapa del desarrollo en que se encuentren o a las condiciones del cultivo. Las bacterias en espiral generalmente no se agrupan, crecen individuales y aisladas. En la siguiente tabla se resumen algunos de los aspectos fundamentales en la clasificacin de las bacterias Por composicin de la pared celular que reacciona a la tincin de Gram

Por forma Coco (esfrico)

Por ordenamiento

Representacin

Coco nico o micrococo Cuando los cocos se dividen en un solo plano vertical, se separan y conservan su individualidad.

Diplococo cuando las clulas hijas se presentan en parejas

Estreptococo en cadena Cuando las clulas hijas forman cadenas

Gram negativas no retienen el cristal violeta conservan el colorante rojo por ejemplo safranina son susceptibles a las cefalosporinas Diplococo en parejas Gram positivas absorben y conservan el colorante cristal

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Estafilococo las clulas permanecen unidas pero despus de una divisin celular en dos o ms planos y los cocos forman grupos irregulares en ocasiones de gran volumen similares a racimos de uvas. Sarcina grupo de ocho cocos La divisin celular se produce formando paquetes de ocho clulas Tetracoco La divisin celular se produce en dos o tres planos perpendiculares formando grupos de cuatro clulas.

violeta son susceptibles a la penicilina y estreptomicina

Espirilos

En forma de espiral

Bacilos

En forma de bastn Tabla: Fuente Carmen Eugenia Pia Lpez.............

* Por su requerimiento de oxigeno Otro aspecto a tener en cuenta en la clasificacin de bacterias es la necesidad de oxgeno para poder vivir. Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de perxidos y superxidos. Aerobias estrictas: Dependen de O2 para su crecimiento. Anaerobias estrictas: se desarrollan en ausencia total de O2, utilizan aceptores finales distintos del oxgeno: CO2, H2 y N2, o poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Anaerobias Facultativas: pueden desarrollarse en presencia o ausencia de O2, aunque predominan en medios anaerbicos. Microaerfilas: slo se pueden desarrollar en presencia de bajas tensiones de O2 (menor del 12% en lugar del 20% que es la atmosfrica) y altas tensiones de CO2. * Por su ptimo de temperatura Segn la temperatura ptima de crecimiento las bacterias se clasifican en:

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Termfilas: se desarrollan entre 25 y 80C, ptima 50 y60C Mesfilas: se desarrollan entre 10 y 45C, ptima 20 y 40C Psicrfilas: se desarrollan entre -5y 30C, ptima 10 y 20C. * Segn el pH en que se desarrollan Las bacterias se clasifican en: Acidfilas: Se desarrollan a pH entre 1.0 y 5.0 Neutrfilas: Se desarrollan a pH entre 5.5 y 8.5 Basfilas: Se desarrollan pH entre 9.0 y 10.0 * Por su forma de nutricin Segn su metabolismo interno, las bacterias presentan requerimientos nutricionales diversos y se clasifican en: Auttrofas quimiosintticas o fotosintticas, Las auttrofas fotosintticas utilizan la luz del sol y el bixido de carbono para fabricar su alimento. Las auttrofas quimiosintticas utilizan compuestos inorgnicos, por ejemplo, el azufre para fabricar su alimento y su fuente de energa es el CO2 Hetertrofas (por absorcin) pueden utilizar fuente de carbono orgnico para su alimentacin Las bacterias pueden vivir como parsitos afectando los organismos donde habitan, como simbiontes formando parte de la flora bacteriana normal de la piel, cavidades y tracto digestivo del hombre y de los animales y saprofitas la gran mayora, ayudando a la descomposicin de la materia orgnica muerta.

Identificacin de Bacterias por composicin de la pared celular que reacciona a la tincin de Gram Un mtodo de identificacin de las bacterias es la Tincin diferencial de Gram que permite identificar la morfologa de la clula bacteriana en cocos y bacilos gram positivos y gram negativos segn la estructura de su pared celular. Se puede discriminar entre dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas (se tien de color violeta) y Gram negativas (se tien de color rosado) debido a las diferencias en la composicin de su pared celular. Como se mencion anteriormente la pared celular esta formada por peptidoglucano, la diferencia consiste en que la pared de las bacterias gram positivas es gruesa y est formada por varias capas de peptidoglucano aproximadamente 80%-90% y algo de cido teicoico, mientras que la pared de las bacterias gram negativas est formada por 45

una sola capa delgada de peptidoglucano aproximadamente hasta un 20% la cual est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Hay otro grupo de bacterias denominadas bacilos cido alcohol resistentes que son diferenciados utilizando la coloracin de Ziehl Nielsen, stas bacterias son resistentes a la decoloracin cida permanaciendo teidos de fucsia. Profundizacin sobre tincin de Gram y otros tipos de tincin utilizados en microbiologa http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html Utilidad de las bacterias Las bacterias son tiles: Para fijar el nitrgeno atmosfrico que es tomado por las plantas y luego trasferido a los animales. En la descomposicin la materia orgnica muerta ayudando de esta manera a la fertilizacin del suelo. En la produccin de algunos antibiticos. En la produccin de determinadas enzimas. En la elaboracin de productos lcteos como: queso, yogur , mantequilla En la produccin de vinagre. En la produccin de encurtidos. En la depuracin de aguas residuales. En el curtido de cueros se utilizan enzimas producidas por bacterias. La Echerichia coli ha sido manipulada genticamente para producir insulina Las bacterias que consumen gas metano se utilizan para limpiar rellenos sanitarios, estas bacterias producen una enzima que descompone los contaminantes Para consumir vertidos de petrleo y otras sustancias txicas, tanto en el sitio del vertido como despus de que los materiales txicos hayan sido difundido por los suelos o alcanzado las aguas subterrneas. En la biorremediacin de hidrocarburos en el. agua y en el suelo. Las enzimas producidas por determinadas bacterias se emplean en la produccin de salsa de soya, vino, papel. detergentes. Mediante manipulacin gentica de bacterias, a las que se les insertan los genes productores de determinado frmaco se producen frmacos como la insulina. Estas bacterias tiles se cultivan e n grandes cantidades en contenedores llamados fermentadores.

Enfermedades de origen bacteriano Las bacterias pueden ocasionar enfermedades, entre las bacterias ms perjudiciales tenemos: La causante del ttano en caso de heridas contaminadas con Clostridium tetani, bacteria que afecta el sistema nervioso causando rigidez muscular y la muerte

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La gangrena gaseosa o putrefaccin de tejidos y rganos, especialmente de las extremidades del hombre y de los animales siendo necesaria su amputacin. La bacteria contaminante es un Clostridium que penetra en heridas o puede ser trasmitida por la ingestin de aguas contaminadas. El bacilo de Koch o Mycobacterium tuberculosis que causa la tuberculosis cuando la persona enferma tose y en su esputo se libera el bacilo. El bacilo Salmonella typhi causante del tifo a travs de alimentos contaminados con excretas. El bacilo Corynebacterium diphtheriae que produce una infeccin del sistema respiratorio, la difteria, que adems lesiona el corazn y el sistema nervioso ocasionando la muerte. La espiroqueta Treponema pallidum. que produce una enfermedad de trasmisin sexual denominada sfilis. La Brucella, bacteria que causa la brucelosis por contacto con ganado infectado, leche o carne contaminada y en la mujer provoca el aborto espontneo. Profundizacin sobre bacterias : http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/programa.htm

Dominio 3 Eucariota o EuKaria A este domino pertenecen los microorganismos de los reinos protisto y hongos, el reino plantas y el reino animal. Entre los eucariotas que son microorganismos, se encuentran las algas, los hongos y los protozoos. Las algas contienen clorofila, un pigmento verde que sirve como molcula captadora de luz y que hace posible que las algas realicen fotosntesis. Las algas son frecuentes en hbitats acuticos y se pueden encontrar tambin en suelos. Los hongos filamentosos o unicelulares, como las levaduras, carecen de clorofila y adquieren su energa de compuestos orgnicos en el suelo y en el agua. Se considera que los hongos juegan un papel importante en la degradacin de la materia orgnica muerta en estos y otros ambientes. Los protozoos son eucariotas incoloros y mviles que obtienen alimento por ingestin de otros organismos o partculas orgnicas. Los protozoos carecen de las paredes celulares que presentan las algas y los hongos y, en este sentido, parecen clulas animales. Muchos protozoos son microorganismos de vida libre, pero unos cuantos originan enfermedades en el hombre y otros animales. La distancia entre cada uno de los grupos incluidos en cada dominio indica el grado de parentesco entre ellos. Por ejemplo el parentesco entre plantas y animales es ms cercano que entre plantas y bacterias

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Captulo 5 Microorganismos celulares eucariotas Introduccin Este captulo analiza la estructura, funcin, importancia de los hongos , los protozoos y las microalgas. Objetivos Identificar y describir las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de los hongos, protozoos y microalgas. Sealar la importancia biolgica de estos microorganismos eucariotas. Leccin 14 - Grupo Hongos Leccin 15 - Grupo Protozoos Leccin 16 - Grupo Microalgas Conclusin Los hongos, protozoos y microalgas pertenecientes al reino Eucariota aportan un gran potencial para su utilizacin por parte del hombre. En otros casos como el se destaca su gran incidencia en la generacin de enfermedades. Grupo: Los Hongos Introduccin Los hongos pertenecen al dominio Eucarya o Eucariota, Reino Fungi. Su importancia se deduce fcilmente de la amplitud y diversidad de este tipo de seres vivos que cuentan con aproximadamente 100.000 especies, entre las cuales hay tanto benficas como perjudiciales para el entorno humano en el rea de la salud y la produccin. Una cucharadita de tierra contiene alrededor de 120.000 hongos. Presentan diferentes formas desde microorganismos unicelulares de forma redonda u ovalada como las levaduras hasta pluricelulares como los hongos filamentosos o mohos que pueden formar largas cadenas de clulas. Su tamao y complejidad son superiores al de las bacterias. Habitan en ambientes hmedos y oscuros, sobre el suelo, las frutas el pan, el queso, las plantas, el cuerpo del hombre y de los animales, en el agua dulce y salada. Se desarrollan mejor en ambientes ligeramente cidos (pH 5, siendo 7 neutral). La mayora son aerbicos aunque hay algunas especies facultativas. Su nutricin es hetertrofa, carecen de clorofila y adquieren su energa de compuestos orgnicos del suelo y del agua. Se considera que los hongos saprfitos juegan un papel importante

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en la degradacin de la materia orgnica muerta, y en el aumento de la fertilidad del suelo.

Levaduras caractersticas morfolgicas y fisiolgicas Las levaduras son hongos unicelulares de forma esfrica, alargada u ovalada, presentan diferentes colores: blanco, rosado, beige o rojo. Su tamao oscila entre 2,5 10 micras de ancho y 4,5 - 21 micras de largo. Son microorganismos anaerobios facultativos

La levadura aerbica produce dixido de carbono, agua y una produccin relativamente alta de nueva levadura, mientras que la levadura anaerobia fermenta el azcar en alcohol y dixido de carbono y tiene un crecimiento ms lento. La mayora se reproducen asexualmente por gemacin consistente en que a la clula madre le sale un botn o gema. Al mismo tiempo que el botn aumenta de tamao, el ncleo de la clula madre mediante el proceso de mitosis se divide en dos, transfirindole uno a la clula hija o botn. Poco a poco la gema se va desprendiendo dando origen a una levadura hija idntica a la madre. Una levadura puede producir hasta 24 clulas hijas. Las levaduras tambin pueden reproducirse por fisin binaria. Algunas no separan la clula hija o gema y forman pseudomicelio, caracterstica que se usa para identificar y clasificar la levadura. Por ejemplo Candida albicans forma pseudomicelio. Las levaduras pueden habitar en el suelo, sobre las mucosas, en la superficie de vegetales. La mayora son mesfilas, con una temperatura mxima de crecimiento entre. 24 y 48C. Se encuentran en un rango amplio de pH el cual esta comprendido entre 2,5 y 8.horas. Son incapaces de moverse por lo que nicamente pueden ser arrastrados a travs de corrientes de aire o en fluidos o por insectos. Condicin del hospedero para accin patgena de levaduras En el sentido ms estricto de la palabra, no existen levaduras patgenas por naturaleza; las que estn relacionadas con enfermedad en el hombre o animales, son incapaces de producir infeccin en un individuo sano. Se deben presentar algunas alteraciones en las defensas celulares del husped, en la fisiologa, o en la composicin de la flora normal para que pueda producirse la colonizacin, infeccin y la enfermedad por levaduras. Es el caso de las especies del gnero Candida que abarca ms de 160 especies, de las cuales se considera que slo 18 son patgenas. Un crecimiento excesivo del hongo Candida albicans puede causar lesiones en la piel, debajo de las uas o en las membranas mucosas de la boca, la vagina, los bronquios y los pulmones. Segn Lpez, C., Giro, L., Ramos, L. et al. Comparacin de diferentes mtodos para la identificacin de especies del gnero Candida. Rev. Argent. Microbiol., ene./mar. 2005, vol.37, no.1, p.16-21. ISSN 0325-7541. 49

Otra levadura capsulada que afecta a pacientes inmunosuprimidos es Cryptococcus neoformans, causante de la criptococosis o micosis sistmica, la principal fuente de infeccin de la variedad neoformans es el excremento de aves. La causa principal de patogenicidad de las levaduras est relacionada con alteraciones del sistema inmunolgico del husped, as como con otros factores predisponentes, que puedan interferir en el equilibrio del nicho biolgico que mantienen a estas levaduras en estado de comensal. Entre los factores desencadenantes podemos mencionar: embarazo, edades extremas (infancia y vejez), uso prolongado de antibiticos, antineoplsicos, glucocorticoides, drogas, uso de prtesis dentales, etc (Senet JM. Risk factors and physiopathology of candidiasis. Rev Iberoam Micol 1997; 14: 6-13). Importancia econmica y algunos efectos perjudiciales de las levaduras Las levaduras tienen importancia en la obtencin de productos y bebidas fermentables debido a su capacidad de realizar fermentacin alcohlica es el caso de Saccharomyces cervisiae. Tienen un papel importante en la fabricacin de pan y productos de pastelera. Tambin se utilizan en la produccin de antibiticos, son fuente de protena y de vitaminas del complejo B. Mediante tcnicas de ADN recombinante se utilizan como hospederos en la industria mdico farmacutica, para la produccin de vacunas, por ejemplo, Anti-hepatitis A, Anti-hepatitis B, inmunopotenciadores, la Hirudina indicada en la Trombocitopenia y para la prevencin de trombosis, protenas de la sangre, hormonas como la insulina y el glucagn e interferones. Sin embargo un pequeo porcentaje de levaduras aproxidamente un 25 % pueden alterar los alimentos causando su deterioro. La actividad contaminante de las levaduras sobre alimentos puede inhibirse por dos vas; mediante la aplicacin de mtodos fsicos con actividad bactericida, entre los que se destacan la esterilizacin por calor a presin y por filtracin y por la aplicacin de condiciones ambientales desfavorables con efecto bacteriosttico, tales como disminucin de la aw, bajos valores de pH y temperatura. Hongos Pluricelulares o Mohos Los hongos pluricelulares o mohos forman una serie de filamentos o tubos rgidos denominados hifas; dentro de las hifas se encuentra el citoplasma que contiene varios ncleos, y dems organelos: mitocondrias, ribosomas, vacuolas, aparato de Golgi, retculo endoplasmtico y lisosomas. Existen dos tipos de micelio: vegetativo que crece por toda la superficie del sustrato (suelo, alimento, tejido vegetal) y tiene como funcin absorber nutrientes del sustrato al penetrar en l y fijar el hongo al sustrato y micelio areo o reproductor que produce esporas sexuales y asexuales.

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Las hifas dan al moho un aspecto algodonoso o de pelusa y pueden ser septadas, es decir, presentar tabiques transversales que separan las clulas; o aseptadas o cenocticas con clulas multinucleadas. El conjunto de hifas forman un micelio.

Los hongos presentan pared celular compuesta de varias capas constituidas de estructuras amorfas como los mananos (polmeros ramificados de la manosa, los glucanos (polmeros de la glucosa) y por quitina que es un polisacrido estructural que tambin se encuentra en el exoesqueleto de los artrpodos. La pared celular da la rigidez al hongo y le permite la nutricin absortiva. Los hongos se pueden reproducir por procesos asexuales, sexuales o parasexuales. La forma de reproduccin se constituye en un criterio para su clasificacin. Los patgenos generalmente se reproducen de forma asexual, aunque algunas especies pueden tener reproduccin sexual y asexual, dependiendo de las condiciones ambientales.

Reproduccin

asexual

Los hongos imperfectos se reproducen asexualmente de tres formas: por fragmentacin o fisin, por gemacin y por la formacin de esporas. En la reproduccin asexual no hay conjugacin nuclear ni reduccin cromtica. La reproduccin asexual por fragmentacin del micelio es una de las formas ms sencillas y consiste en la fragmentacin, crecimiento y ramificacin de las hifas para dar origen una nueva colonia. Este mecanismo se usa en los subcultivos de laboratorio La Gemacin consiste en la formacin de una yema en un punto de la clula madre; a medida que la nueva clula hija aumenta de tamao, se separa de la madre y da lugar posteriormente a nuevas hijas por el mismo mecanismo. Por formacin de esporas se presenta con dos opciones: por doble fisin de las hifas que forman clulas unicelulares de forma cilndrica denominadas artrosporas las cuales se liberan cuando las hifas se separan para germinar en el medio adecuado; la segunda opcin consiste en la fragmentacin de las hifas que desarrollan esporas redondas cubiertas por paredes gruesas llamadas clamidosporas resistentes a condiciones adversas como el calor y la desecacin. Las esporas presentan diferente forma, tamao, color y nmero de clulas. Son las responsables de dispersar los nuevos individuos. Algunas esporas estn diseadas para resistir condiciones adversas de crecimiento o para proporcionar un periodo de latencia. Algunos hongos producen slo un tipo de esporas asexuales, mientras otros pueden producir diferentes tipos de esporas.

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Tipos de esporas asexuales

Reproduccin asexual del hongo del pan: Rhizopus nigricans modificado de: http://darwin.baruch.cuny.edu/bio1003/fungi.html

Conidios en Penicillium

Esporangiosporas: Son esporas que se producen dentro de de una envoltura denominada esporangio, al romperse el esporangio las esporas salen y al caer en el sustrato adecuado dan origen a nuevas hifas. En este tipo de reproduccin el ncleo de la clula madre se divide en varios ncleos, cada uno toma una parte del citoplasma de la clula madre que luego se rodea de una membrana celular, la clula madre se rompe y se liberan varias clulas hijas. Ejemplo: en Mucor o en Rhizopus nigricans Animacin: salida de esporangiosporas http://www.unex.es/botanica/LHB/anima/mucor1.htm Conidias: Son esporas desnudas que se forman en los extremos de las hifas mediante gemacin. Ejemplo: en el hongo Aspergillus flavus Reproduccin Sexual

La reproduccin sexual es otra forma de reproduccin de los hongos, e implica la unin de 2 ncleos uno donante y otro receptor para formar un ncleo cigtico diploide, que por meiosis origina 4 ncleos haploides. A los hongos con reproduccin sexual se los denomina perfectos. La reproduccin sexual comprende 3 fases:

http://darwin.baruch.cuny.edu/bio1003/fungi.html 1. Plasmogamia: en ella se unen los dos protoplastos de las hifas y los dos ncleos se renen en una sola clula.

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2. Cariogamia: fusin de los dos ncleos que se haban reunido en la plasmogamia 3. Meiosis: Se reduce el nmero de cromosomas, se forman gametos haploides. Despus de la fusin de los ncleos de las dos clulas: hifas o levaduras que comparten el ADN y de ocurrida la meiosis se forman las esporas con caractersticas heredadas de cada uno de sus progenitores. Cada espora tiene capacidad para desarrollar una nueva colonia. Tipos de esporas Sexuales Ascosporas: Son unicelulares, generalmente se desarrollan 4 a 8 dentro una clula denominada asca. Basidiosporas: Unicelulares, se forman en clulas llamadas basidios en nmero de 4 Zigosporas: Son de mayor tamao con pared celular gruesa se desarrollan al fusionarse dos hifas sexualmente compatibles. Oosporas se forman por la unin de dos clulas gamticas, oogonio y anteridio En condiciones ptimas para la germinacin, las oosporas dan origen a micelio y esporangios los cuales infectan las plantas. Reproduccin parasexual

La reproduccin parasexual es un mecanismo raro, en el que las hifas se unen sin fusin nuclear posterior y da lugar a una clula con ms de un ncleo funcional y de diferente procedencia gentica. En algunas ocasiones pueden conjugarse los ncleos y aparece un ncleo diploide heterocigtico. El hecho comprobado por primera vez en Aspergillus nidulans demuestra que la recombinacin gentica puede existir sin utilizar las clulas sexuales. Enfermedades causadas por hongos En los animales los hongos pueden producir enfermedades graves en la piel uas y cuero cabelludo, por ejemplo, la dermatomicosis o tia. Otros afectan los rganos del hombre y de los animales, es el caso del hongo Aspergillus causante de la aspergilosis que compromete los pulmones y el sistema nervioso. La especie ms comnmente patgena es Aspergillus fumigatus que se asocia tanto con las formas alrgicas como con las invasivas. La coccidiomicosis causada por un patgeno mictico llamado Coccidioides immitis ocasiona enfermedad en animales y en las personas inmunosuprimidas. El patgeno es normalmente inhalado, lo cual lleva a la infeccin pulmonar. Los sntomas incluyen fiebre, fatiga, prdida de peso, y tos. La coccidiomicosis tambin puede afectar a las membranas que rodean el cerebro (meningitis) y puede diseminarse por el cuerpo. La criptococosis es causada por un hongo parecido a la levadura, llamado Cryptococcus neoformans, el cual se encuentra en la tierra y en el excremento de las aves y afecta a las personas y algunas especies de animales. Se transmite a travs de 53

la inhalacin de polvo contaminado. Los sntomas incluyen fiebre, fatiga, nusea, malestar, dolor de cabeza y de cuello, confusin mental, prdida de memoria, trastornos de visin y de movimiento muscular, y cambios de personalidad; si no es tratada, la enfermedad puede derivar en coma y muerte. La criptococosis afecta reas del cuerpo incluyendo la piel, los pulmones (neumona criptococcal) y el cerebro (encefalitis). La enfermedad puede diseminarse. En el perro y el gato afecta los pulmones, el sistema nervioso central y las mucosas nasal y oral. En el bovino la lesin se localiza en el tejido mamario ganglios linfticos adyacentes, en el equino se presentan trastornos respiratorios asociados a granuloma nasal. La criptococosis se diagnostica a travs de anlisis del fluido cerebral y cerebroespinal Histoplasmosis - La histoplasmosis es ocasionada por la infeccin con el hongo Histoplasma capsulatum, el cual reside en la tierra y las heces de murcilago. La enfermedad afecta con mayor frecuencia a los pulmones. Tambin puede afectar a la piel, al sistema gastrointestinal y al sistema nervioso central. Los sntomas incluyen fiebre, prdida de peso, fatiga, tos seca, problemas respiratorios, salpullido, e inflamacin de los ndulos linfticos. Se diagnostica con anlisis del fluido pulmonar, de sangre u orina, o mediante biopsia. Es tratada con medicamentos antimicticos. Candida albicans afecta a las aves causndoles la muerte, en el hombre afecta las mucosas de la boca, garganta y tracto genitourinario. Los hongos txicos como (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) contaminan los alimentos o productos agricolas como cereales y concentrados al producir sustancias txicas las micotoxinas (aflatoxinas, ocratoxinas, fumonisinas o zearalenona, entre otras) que al ser consumidas por el hombre o los animales les causan enfermedades letales como la micotoxicosis. Muchas enfermedades de las plantas son debidas a la presencia de hongos, por ejemplo, la enfermedad de la Roya. El hongo Phytophtora infestans, caus en Irlanda un milln de muertes a contaminar la papa. Muchos hongos arruinan anualmente de un cuarto a la mitad de las cosechas de frutas y vegetales Importancia biolgica

Los hongos no solamente causan enfermedades, sino que tambin son utilizados en procesos industriales por ejemplo: del hongo Penicillium notatum se obtiene el antibitico penicilina. Algunos hongos como Penicillium roquefort son utilizados en la elaboracin de queso Roquefort. Las enzimas de algunos hongos producen fermentacin alcohlica en los jugos de frutas proceso que se utiliza por ejemplo, para la elaboracin de vino a partir de jugo de uva. El Saccharomyces cerevisae o levadura del pan se utiliza en la preparacin del pan y la cerveza. Los hongos son los principales descomponedores del ecosistema, digieren plantas y 54

animales muertos, contribuyendo a la descontaminacin ambiental. Otros hongos se usan como control biolgico contra insectos perjudiciales. Hay hongos que crecen en simbiosis con las races de algunas plantas formando las micorrizas. Clasificacin Las levaduras se identifican por el estudio de sus caractersticas metablicas; mientras que la clasificacin de los hongos filamentosos se basa en sus caractersticas morfolgicas. Los hongos se han clasificado con criterios muy diferentes segn el inters de los estudiosos (taxonmico, patognico, epidemiolgico). Desde el punto de vista taxonmico estricto, se clasifican segn el tipo de reproduccin sexual, en cuatro grupos: Zigomicetos, Ascomicetos, Basidiomicetos y los Deuteromicetos u hongos imperfectos que son los hongos superiores para los que se desconoce el tipo de reproduccin sexuada, porque sus estructuras sexuales no estn bien identificadas no se han descubierto o no existen. Los Zigomicetos son los hongos ms simples con hifas aseptadas, micelio cenocitico, es decir multinucleado y zigosporas. Ejemplos de este tipo de hongos son: el moho negro del pan, o muchos formadores de endomicorrizas. Ejemplo Rhizopus, Mucor, Penicillium Los Ascomicetos presentan ascas o estructuras semejantes a un saco el cual contiene las ascosporas o esporas sexuales. Su micelio es aseptado. Es el grupo con mayor nmero de especies. Entre ellas destacan muchos hongos fitopatgenos (odios, cornezuelo, grafiosis del olmo, etc.), parsitos en humanos Candida, Cryptococcus. Los Basidiomicetos presentan basidios en donde se encuentran las basidiosporas o esporas sexuales. Pertenecen a este grupo los hongos comestibles. Aqu pueden hallarse los hongos ms conocidos, como las tpicas setas, y algunos fitopatgenos de enorme importancia como royas y carbones. Los Deuteromicetos presentan hifas tabicadas. Profundizacin sobre hongos: http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/clados.htm Tambin puedes obtener muchos detalles acerca de los hongos y ver algunas imgenes interesantes en Microbial World (en ingls)

Los Protozoos caractersticas

Son organismos microscpicos mviles, incoloros, unicelulares, eucariticos, poseen ncleo, membrana nuclear, membrana celular, mitocondrias, aparato de Golgi, microtbulos y otros organelos, carecen de pared celular, algunos tienen vacuolas digestivas y excretoras, flagelos y cilios, pertenecen al reino Protisto. 55

Se encuentran en su mayora en medios acuticos, en el suelo hmedo aunque algunos son endoparsitos y otros ectoparsitos. Los protozoarios parsitos se pueden encontrar en sangre de humanos y animales y en lquidos tisulares de plantas. Algunos necesitan varios hospedadores para completar su ciclo de vida, presentando en cada uno de ellos una morfologa, metabolismo y tipo de reproduccin diferente. Durante su ciclo de vida pueden existir de dos formas trofozoto y quiste. En la fase de trofozoito los protozoarios realizan sus funciones de nutricin y crecimiento y es la forma que produce la enfermedad, mientras que la fase de quiste es la forma infectante que fuera del organismo puede resistir condiciones extremas como la desecacin, bajas temperaturas, y en medio Diseo : Carmen Eugenia Pia Lpez hmedo logra sobrevivir hasta aos.

Nutricin La mayora son hetertrofos, sin embargo algunos son auttrofos. Obtienen alimento por ingestin de otros organismos o partculas orgnicas. La alimentacin suele realizarse mediante la captura del alimento (algas, bacterias y otros protozoarios) que penetran en el citoplasma por mecanismos de difusin de transporte activo, en algunos a travs de aberturas de la membrana celular llamadas poros bucales, otros como las amebas rodean el alimento mediante pseudpodos (fagocitosis). Hay adems protozoarios que lo absorben a travs de su membrana celular, por ejemplo, el paramecio succiona el alimento produciendo un torbellino con los cilios. El alimento es digerido en las vacuolas nutritivas localizadas en el citoplasma, luego los residuos son expulsados por las vacuolas fecales. Respiracin La respiracin la realizan por difusin a travs de la membrana celular y por las partculas de agua absorbidas con el alimento. La expulsin del gas carbnico la hacen por las vesculas o vacuolas pulstiles. Cuando la vacuola pulstil est llena de agua, se abre y lo libera al exterior Reproduccin Se reproducen asexualmente por divisin binaria, por gemacin y por esporulacin

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(fragmentacin de la clula madre en esporas) del trofozoito o forma vegetativa del protozoo. Cuando sucede este ltimo caso, pueden permanecer mucho tiempo enquistados en una cpsula. Otro tipo de reproduccin asexual es la divisin mltiple caracterstica de las amebas. En algunos grupos la reproduccin asexual alterna con fases de reproduccin sexual la cual esta condicionada a cambios desfavorables del medio. La reproduccin sexual se inicia con la formacin de gametos, macrogametos y microgametos, por diferenciacin de las clulas del trofozoito. Su unin da lugar a la formacin del cigoto seguido de meiosis. La fusin celular puede ser total, dando lugar a un cigoto (singamia), como sucede en los esporozoos o parcial, por conjugacin, como sucede en algunos ciliados. Durante el apareamiento en la conjugacin, el macroncleo de un protozoario se degenera y el microncleo por meiosis da origen a cuatro microncleos con reduccin de su material gentico, uno de estos microncleos es transferido de un protozoo al otro para formar el cigoto, los otros tres microncleos degeneran. En este proceso se produce intercambio de informacin gentica entre dos individuos. El cigoto por divisin mltiple da lugar a numerosas clulas denominadas esporozoitos. Clasificacin Segn la forma como se desplazan los protozoos se clasifican en: sacordinos, ciliados, flagelados esporozoos.

Sacordinos Se desplazan por medio de pseudpodos, que son prolongaciones de la clula que les sirven adems para capturar el alimento, englobarlo (proceso de fagocitosis) y formar una vacuola digestiva, donde el alimento es digerido por accin de enzimas. La mayora son parsitos del hombre y habitan en el tracto gastro-intestinal y cavidad oral. Son representantes de este filo: la Entamoeba histolytica o ameba que produce la disentera, por la ingestin de aguas o alimentos contaminados con heces. Esta enfermedad es propia de los pases tropicales y produce unas diarreas muy intensas. La E. histolytica puede causar enfermedad invasora intestinal y extraintestinal.

Entamoeba histoltica.
http://hpd.botanic.hr/ bio/ odgovori/odgovor315.htm

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Los foraminferos componentes del plancton (con un caparazn por cuyos orificios salen los pseudpodos) Ciliados: Su forma es ovalada, se desplazan y capturan el alimento por medio de cilios, filamentos cortos, vibrtiles y numerosos que rodean su cuerpo. Poseen una hendidura bucal o boca en el citoplasma para la ingestin de alimentos al final se presenta el citostoma y la citofaringe que se continan, en el interior del citoplasma, con las vesculas alimenticias. El citoplasma realiza movimiento de ciclosis. Poseen vacuolas contrctiles que ayudan a expulsar el agua y residuos de la digestin a travs del poro anal o citopigio. Se caracterizan por ser los nicos organismos con dos ncleos un microncleo para la reproduccin y un macroncleo para la alimentacin. Se reproducen de dos formas: asexual por biparticin y sexual por conjugacin. Ejemplos de este filo son: el Paramecio, la Vorticela, el Balantidium coli este ltimo es un parsito del intestino del hombre cuyo reservorio natural es el cerdo. La infeccin humana, es causada por la ingestin de quistes eliminados con las heces del cerdo, ocasionando inflamacin del intestino o enteritis. Animacin proceso de conjugacin

Flagelados: Se desplazan por medio de flagelos, filamentos largos y poco numerosos Muchos son de vida libre y otros son parsitos, como el Tripanososma cruzi que causa la enfermedad de chagas. La forma principal de transmisin es a travs de vectores (insectos hematfagos- chinches-) que al picar a un animal o persona infectada se contagian, estos hematfagos infectados despus de que pican e ingieren la sangre defecan sobre la persona; las heces del insecto entran en la persona a travs de la picadura, de las sangre. mucosas o de las cortadas en la piel.

Tripanosomas en Tomada de Biodidac

El Tripanosoma brucei produce la enfermedad del sueo o tripanomiasis africana. El T. brucei es transportado por la saliva de la mosca ts-ts, que contagia al picar a otros seres vivos. Trichomonas vaginalis es un parsito de forma ovoide, mide de 10 a 20 micrmetros, posee cuatro flagelos en la parte anterior que junto con su membrana ondulante le permiten su movimiento. Causa la enfermedad de transmisin sexual conocida como tricomoniasis.

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Leishmania parsito intracelular que causa la enfermedad llamada Kala-azar o fiebre negra. Requiere para completar su ciclo de vida dos huspedes, un vertebrado y un artrpodo que acta como vector La Giardia lamblia es un parsito intestinal que ocasiona la giardasis una enfermedad diarreica infecciosa. La infeccin se produce al consumir alimentos o agua con quistes los cuales son activados por el cido gstrico, se liberan los trofozoitos que se se fijan a la mucosa del duodeno o del yeyuno proximal donde se reproducen. La formacin de los quistes ocurre a nivel del colon de donde pasan a las heces. http://www.inselhunde. de/ giardien.htm Esporozoos Carecen de rganos de locomocin todos son parsitos obligados de clulas del hombre y de los animales. Presentan una estructura apical adaptada a la penetracin intracelular. Se reproducen en dos fases una asexual y otra sexual, dependiendo de la fase pueden estar como: trofozoito, gameto o cigoto. E Un representante de este grupo es el Plasmodium que produce la malaria, tambin llamada paludismo. Hay cuatro especies de Plasmodium que provocan la malaria: P.vivax, P. ovale, P. malariae y P. falciparum, de las cuales slo la ltima es realmente una amenaza para la vida.

http://www.cdc.gov/malaria/ spotlights/ index_100504.htm

El vector que transmite la malaria es la hembra del mosquito Anofeles. En los glbulos rojos de la sangre de la persona los Plasmodium se diferencian en gametos que son ingeridos por el mosquito. En el tubo digestivo del mosquito los gametos se reproducen sexualmente dando como resultado los esporozoitos que luego son inoculados por picadura a las personas sanas. Los esporozoitos pasan al torrente sanguneo hasta que llegan a las clulas hepticas. All se reproducen asexualmente, luego las clulas hepticas se rompen, el plasmodio alcanza de nuevo al torrente sanguneo para parasitar los hemates. El Toxoplasma gondii, causante de la toxoplasmosis es otro parsito perteneciente a los esporozoos. Importancia Biolgica Los protozoos tienen importancia en las cadenas alimentarias como componentes del plancton.

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Son considerados como bioindicadores en el proceso de tratamiento de aguas residuales. Se utilizan para detectar vetas petrolferas. Debido a su fcil y rpida reproduccin en el laboratorio son utilizados en investigaciones sobre nutricin y crecimiento, por ejemplo, El protozoo ciliado Tetrahymena thermophila fue el primer microorganismo eucariota en el que se desarroll la induccin de cultivos sincrnicos, facilitando el anlisis de las diferentes fases del ciclo celular eucariota. Este protozoo tambin particip en el descubrimiento de los lisosomas y peroxisomas. Un equipo de investigadores argentinos logr convertir el colesterol presente en la leche y el huevo en pro vitamina D., a travs de la aplicacin directa del protozoo ciliado denominado Tetrahymena. Tambin se ha provocado parasitismo artificial con protozoos de vida libre con el fin de llegar a conocer los cambios que ocurren en la adaptacin a la vida parastica. Algunos de tienen la habilidad de concentrar sustancias radioactivas disueltas en el agua. Estas sustancias pueden pasar a travs de la cadena alimenticia hasta el hombre, producindole un incremento en las mutaciones, cncer y otras enfermedades. La mayor importancia de los protozoos para el hombre lo constituye las numerosas enfermedades que provocan los protozoos parsitos como se mencion anteriormente. Profundizacin: http://www.alaquairum.com/generalidades_protozoos.htm Algas principales caractersticas

Spirogyra Chlorella http://www.microscopyDunaliella salina http://www.microscopyuk.org.uk/ http://www.ibvf.cartuja.csic.es/ uk.org.uk/ mag/imagsmall/ chlorella.jpg Cultivos/micro-d-m.htm mag/imagsmall/ chlorella.jpg

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Eucariotas, auttrofas, pertenecientes al reino Protista. Presentan pared celular, clorofila, algunas poseen otros pigmentos como carotenos, ficoxantina o ficobilinas que pueden enmascarar la clorofila. La mayora son unicelulares como las algas doradas o diatomeas, otras como las algas verdes y las rojas son multicelulares. Su tamao vara desde algas microscpicas de 1 micrmetro hasta las que se observan a simple vista como las verdes que crecen en las charcas o las que se encuentran en los acuarios o en el mar. Su reproduccin puede asexual por fisin binaria longitudinal y sexual por produccin de esporas cuando las condiciones del medio son extremas. Pueden vivir solitarias o en colonias. Ejemplo de algas verdes tenemos: la Chlorella, la Dunaliella, el Volvox, y la Spirogyra. Algunas algas unicelulares se desplazan por medio de flagelos, tambin aparecen flagelos en los individuos que forman colonias. Las algas son frecuentes en hbitats acuticos constituyndose en un eslabn importante (fitoplancton), de las cadenas alimentarias de los organismos acuticos se pueden encontrar tambin en suelos, muchos gneros de algas tienen representantes que viven en simbiosis con hongos y forman los lquenes. Clasificacin Euglenofitas: unicelulares se encuentran en aguas dulces ricas en nutrientes. Carecen de pared celular. Tienen cloroplastos encerrados por una membrana triple. Poseen dos flagelos que les dan movilidad. Se reproducen sexualmente. Su presencia es un indicador de contenido mercurio en el agua. Diatomeas: la pared celular esta cubierta por un exoesqueleto de slice y pectina lo que las hace muy resistentes. Cuando se acumulan forman la tierra de diatomeas que, adems de su inters paleontolgico, se usa como abrasivo, en la fabricacin de pasta de dientes, como insecticida y como agente filtrante. Dinoflagelados. La mayora marinas, de color rojo, pueden producir toxinas que en grandes cantidades forman las mareas rojas, que causan intoxicacin en humanos y mortandad de peces. Clorofceas: Son llamadas tambin algas verdes con abundante clorofila no asociada a otros pigmentos, las unicelulares generalmente son de agua dulce y se reproducen asexualmente por biparticin, mientras que las pluricelulares tienen fase de reproduccin asexual y sexual. La mayora de agua dulce, aunque las hay marinas y de humedad, y a veces asociadas con los hongos en los lquenes (simbiontes). Pueden presentar vida libre o formar colonias. Tambin aparecen los sincitios, que son estructuras polinucleadas, formadas por fusin de varios individuos que comparten el citoplasma celular sin que exista membrana de separacin entre ellos. Importancia biolgica Representan un importante eslabn en la cadena alimentaria, formando parte del plancton (productores primarios). Son productoras de oxgeno. tiles en la elaboracin de frmacos Las algas rojas son importantes en la formacin de arrecifes de coral pues viven en simbiosis con los corales brindndoles carbonato de calcio y suministrndoles el color rojo brillante

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Algunos grupos de algas rojas se utilizan en la produccin de Agar que es un medio de cultivo microbiolgico. Las algas marinas son una importante fuente alimenticia. Se utilizan como indicadores biolgicos, en el control de acidificacin de las aguas En medicina y farmacia en la produccin de antioxidantes, antibiticos, cidos grasos polinsaturados. Profundizacin Algas usos y Biotecnologa En este link se pueden encontrar temas de inters y aplicacin para los programas de Ciencias Agrarias, Regencia de farmacia e Ingeniera de Alimentos, como se puede observar en el siguiente listado de contenidos que despliega el link mencionado. Usos de las algas Usos industriales: ficoloides Uso Alimentarios Usos farmacolgicos Usos cosmticos Usos en restauracin medioambiental y acuicultura http://danival.org/100%20biolomar/1500biomar/algae/alga_1.html Capitulo 6 Crecimiento microbiano Introduccin La dispersin tan amplia de los microorganismos en el suelo, aire, agua, sustratos biolgicos naturales y medios artificiales de cultivo, con velocidades de reproduccin y de crecimiento verdaderamente notables, han obligado a investigar y a aplicar tcnicas de manejo y bioseguridad microbiana. El conocimiento de las opciones de control de crecimiento bacteriano implica la identificacin de parmetros fsicos y qumicos que afectan el metabolismo y el crecimiento microbiano, para entender las estrategias y las tcnicas aplicadas como se describe en el presente capitulo Objetivos Reconocer los parmetros fsicos y qumicos que afectan el crecimiento y desarrollo de los microorganismos. Relacionar los efectos causados por el metabolismo propio de cada microorganismo con su capacidad para sobrevivir en un hbitat determinado. Establecer la importancia del conocimiento de los parmetros fsicos y qumicos para establecer prcticas de control orientadas a preservar la calidad de los

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productos industriales y a asegurar ambientes sanos o no contaminantes para organismos vegetales y animales. Leccin 17: Gentica bacteriana Leccin 18: Cintica de crecimiento Leccin 19: Control de crecimiento Conclusin No se podra manipular con seguridad las diferentes cepas de microorganismos sin conocer los parmetros que afectan la dinmica de su crecimiento.

Crecimiento Microbiano
El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamao de un microorganismo. El aumento del nmero de microorganismos permite la formacin de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiologa el crecimiento se estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales. Las bacterias se reproducen generalmente por fisin binaria. El resultado de la fisin binaria son dos clulas hijas por cada clula madre, as, una clula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y as sucesivamente. El intervalo de tiempo que transcurre para la formacin de dos clulas a partir de la clula madre se llama tiempo de generacin o tiempo generacional y al igual que la tasa de crecimiento o cambio en el nmero de clulas por unidad de tiempo, vara en dependencia de las condiciones genticas de las bacterias y de los factores nutricionales. Si partimos de una clula al cabo de una generacin habr duplicado su nmero y as sucesivamente en cada generacin. Como se puede observar el crecimiento se produce en progresin geomtrica y no aritmtica.

En algunas bacterias como en el caso la E. coli, en condiciones ptimas la duplicacin celular se realiza cada 20 minutos, es as como en 10 horas se habrn producido 30 generaciones, es decir mil millones de clulas bacterianas. A partir de una clula de E .coli, se obtiene al cabo de 10 horas o sea 600 minutos, 600/20=30 generaciones. El nmero de clulas entonces sera 230

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Aspectos para el clculo del crecimiento microbiano

Fases del crecimiento bacteriano El incremento en el nmero de las clulas en una poblacin se denomina como crecimiento exponencial o logartmico. Si se inoculan unas bacterias en un medio de cultivo fresco y se cuantifica la poblacin en intervalos de tiempo se puede obtener una curva que represente el crecimiento bacteriano.

Curva de crecimiento bacteriano La curva puede estar determinada por la comparacin del nmero total de los microorganismos vivos presentes en la poblacin en un perodo de tiempo. La curva de crecimiento de la poblacin tiene cuatro fases: 1) fase lag o fase de latencia es el periodo de adaptacin de los microorganismos a un nuevo ambiente, en este periodo el nmero de clulas no se incrementa, sino que se mantiene constante por un largo perodo que puede durar desde 1 hora hasta varios das. En esta fase las clulas presentan gran actividad metablica. Al final de la fase la 64

mayora de las clulas aumentan su tamao. 2) fase log. o logartmica o de crecimiento exponencial durante este periodo las clulas se empiezan a dividir en forma constante, la actividad metablica: respiracin celular, la sntesis de protenas es mxima. El nmero de clulas vivas en reproduccin es mucho mayor que las clulas vivas de la poblacin que comienzan a morir. El tiempo generacional es mnimo y constante. Las clulas muestran su morfologa: color agrupacin forma entre otras. En el momento final de esta fase y como resultado de la alta tasa de reproduccin, comienzan a escasear los nutrientes y el ambiente se torna txico por el exceso de productos de desecho. Es el momento en el cual las clulas son ms sensibles a los antimicrobianos o a las radiaciones que pueden intervenir negativamente en su crecimiento. Esta fase se representa por una lnea recta ascendente. 3) fase estacionaria, en este periodo se genera un factor limitante del crecimiento, razn por la cual se detiene el crecimiento de los microorganismos, generando una tasa reproductiva igual a la tasa de mortalidad. Si la poblacin no se reproduce ni muere, el nmero de clulas permanece constante y la longitud de la fase vara y depende del balance que logren las clulas con el medio ambiente. Es un periodo de equilibrio. 4) fase de muerte, o de declive logartmico, en esta fase las clulas no se reproducen, solo mueren y son destruidas por lisis en forma exponencial a causa del incremento en las cantidades de cido y otros desechos dainos en el ambiente. Parmetros fsicos y qumicos que afectan el crecimiento y desarrollo de los microorganismos Los aspectos fsicos que influyen de manera determinante en el crecimiento microbiano son: la temperatura, el pH y la presin osmtica. Los qumicos son: el agua, las fuentes de carbono y de nitrgeno, los minerales, el oxgeno y los factores orgnicos del propio microorganismo. Parmetros fsicos:

Temperatura: la supervivencia de los microorganismos se presenta normalmente en las temperaturas usuales para el desarrollo de los animales superiores, aunque se da el caso de algunas bacterias resistentes a extremos de fro o de calor. Se puede hablar por consiguiente de una taxonoma microorgnica referida a rangos ptimos de adaptacin a la temperatura. Esta clasificacin contempla los tres casos siguientes: Microorganismos psicrfilos adaptados a bajas temperaturas, en trminos generales se maneja un rango de 0C a 20C como lmites normales para su crecimiento. Mesfilos, viven en temperaturas moderadas, en un rango de 20C a 40C., los microorganismos mesfilos, son los ms comunes. Por ejemplo, la temperatura ptima para la mayora de las bacterias patgenas se aproxima a los 37C. Termfilos, soportan altas temperaturas, contemplan como rangos usuales de 65

tolerancia de 40C. a 80C. y por consiguiente sus endosporas son normalmente resistentes al calor y sobreviven a los tratamientos trmicos aplicados a conservas enlatadas aunque no crecen a las temperaturas normales de almacenamiento. De todas maneras, el crecimiento se da dentro de ciertos rangos de temperatura, que generalmente comprenden unos lmites de tolerancia de unos 30 C. pH Normalmente los pH (acidez o alcalinidad de una solucin o medio de crecimiento) de rango neutro (6,5 a 7,5) son los ms adecuados para el crecimiento bacteriano y muy pocas bacterias soportan pH inferiores a 4.0. Por esta razn el manejo de la acidez es un recurso para el control microorgnico. Como en el caso de las temperaturas existen algunas bacterias que soportan niveles extremos de acidez, razn por la cual se Las denomina acidfilas. Se conocen bacterias que sobreviven a pH de 1. Los rangos alcalinos generalmente inhiben el crecimiento microbiano. En los ensayos de laboratorio para el cultivo de bacterias se requiere neutralizar los cidos que producen las bacterias mediante sustancias qumicas denominadas tampones. Las sales de fosfato amortiguan la acidez y la mantienen en el rango usual de crecimiento para la mayora de las bacterias (de 6,5 a 7,5) y de paso aportan el fsforo que es un nutriente necesario. El intervalo ptimo de pH para mohos y levaduras esta entre 5,0 y 6,0. Una tabla de rangos de tolerancia a la acidez es la siguiente: Microorganismos Acidfilos Neutrfilos Alcalfilos Presin osmtica Los microorganismos estn formados por un 80-90% de agua y por consiguiente son fcilmente afectados por soluciones hipertnicas o sea con una concentracin de solutos mayor a la de la clula microbiana, razn por la cual esta pierde agua por el efecto conocido como plasmlisis. Por consiguiente la adicin de sales o de azcar produce una contraccin celular que evita el crecimiento bacteriano Sin embargo existen las bacterias llamadas halfilas extremas que requieren alta concentracin salina para supervivir (alrededor del 30% de sal). Otro caso es el de las halfilas facultativas que no necesitan altas concentraciones salinas pero pueden soportar concentraciones entre el 2 y el 15% de sal. Se comprende entonces la tcnica usada para solidificar los medios de cultivo microbiano con agar, con una concentracin del orden del 1,5%. pH 1,0 a 6,0 6,5 a 7,5 8,0 a 11,0

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Parmetros qumicos Las fuentes de carbono son necesarias para el crecimiento bacteriano ya que este elemento es una estructura bsica en todos los compuestos orgnicos que constituyen la clula viva. Por consiguiente los microorganismos obtienen su carbono a partir de compuestos orgnicos (microorganismos quimihetertrofos), o del bixido de Carbono (caso de los quimioauttrofos y fotoauttrofos). Nitrgeno, Azufre y Fsforo: en la sntesis de su material celular los microorganismos utilizan el nitrgeno principalmente para formar el grupo amino de los aminocidos constituyentes de las protenas. En algunos casos de simbiosis el nitrgeno fijado por bacterias se comparte con ciertas plantas (generalmente leguminosas), lo cual permite aumentar la fertilidad del suelo. El azufre se utiliza generalmente para sintetizar aminocidos y vitaminas como la timina y la biotina. El fsforo se utiliza en sntesis de cidos nucleicos y de los fosfolpidos de las membranas celulares. De manera similar los microorganismos necesitan otros elementos como potasio, magnesio, y calcio necesarios para su utilizacin como cofactores de las enzimas. Por otra parte los microorganismos requieren algunos elementos minerales en cantidades muy pequeas, como es el caso de los oligoelementos: hierro, cobre, molibdeno y zinc, los cuales son esenciales como cofactores en la actividad enzimtica Oxgeno: los microorganismos aerobios utilizan el oxgeno molecular con el cual producen ms energa a partir de los nutrientes. Sin embargo existen microorganismos anaerobios facultativos que utilizan el oxgeno disponible, pero si no lo hay pueden crecer mediante procesos de fermentacin o respiracin anaerbica. La bacteria Escherichia coli y muchas levaduras son anaerobios facultativos. Existen adems los anaerobios obligados para los cuales el oxgeno es perjudicial y por consiguiente no lo utilizan. En este caso los tomos de oxgeno de sus componentes celulares los obtiene normalmente del agua. Es comprensible entonces el uso del in perxido para el control bacteriano ya que en este caso es una forma txica de oxgeno. Agentes antimicrobianos que afectan el crecimiento A partir del descubrimiento de la penicilina se han observado reacciones de inhibicin del crecimiento microbiano en medios slidos por causa de sustancias producidas por otros microorganismos, sustancias que por tal motivo se llaman antibiticos. Algo ms de la mitad de los antibiticos de amplio uso son producidos por la bacteria Streptomyces. Otros antibiticos son producidos por bacterias del gnero Bacillus y algunos son generados por mohos de los gneros Penicillium y Cephalosporium. Espectro de actividad antimicrobiana Los antibiticos presentan cierta selectividad sobre los tipos de clulas microbianas que pueden afectar, por ejemplo, la penicilina es efectiva contra bacterias Gram Positivas, pero ataca a pocas bacterias Gram Negativas. Los antibiticos que atacan a un alto nmero de Gram Positivas y Gram Negativas se denominan de amplio espectro y se recurre a ellos cuando no es segura la identidad del patgeno. Desafortunadamente estos antibiticos destruyen gran parte de la flora normal del husped y aquellos 67

microorganismos patgenos que no son destruidos por el antibitico pueden atacar ms fuertemente al organismo husped por el desequilibrio de la flora.

Seleccin de frmacos antimicrobianos Los principales criterios para determinar el valor de un agente antimicrobiano o frmaco antibitico son los siguientes: Toxicidad selectiva: que ataque al microorganismo pero no al husped o si son ligeramente txicos, que no alcancen a interferir significativamente con las funciones normales del organismo . Que no produzca alergias o hipersensibilidad ante el sistema inmunitario. Que sea soluble en los fluidos corporales, con lenta degradacin y buen tiempo de permanencia en el organismo para lograr el efecto antibitico. Debe mantenerse en buenas condiciones mediante refrigeracin. Que no produzcan fcil resistencia en los microorganismos. Mecanismo de accin de los antibiticos o agentes antimicrobianos Los agentes bactericidas eliminan las bacterias y los agentes bacteriostticos solo impiden su crecimiento, contribuyendo a que las propias defensas del husped destruyan a los microorganismos patgenos. Los principales mecanismos antibiticos son los siguientes:

Inhibicin de la sntesis de la pared celular. Algunos antibiticos interfieren con las sntesis del peptidoglucano necesario para la construccin de la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram Negativas. De esta manera la pared celular de bacteria patgena se debilita y no puede crecer normalmente. Inhibicin de la sntesis de protenas. Algunos antibiticos como el cloranfenicol, la Eritromicina y las Tetraciclinas inhiben la sntesis de protenas en ciertos tipos de ribosomas de las bacterias patgenas y de esta manera se anula su actividad fisiolgica. Alteracin de la membrana citoplasmtica. Antibiticos como la polimixina B daan la permeabilidad de la membrana citoplasmtica y otros frmacos antifngicos como la Nistatina, Anfotericina B y Ketoconasol desorganizan la membrana citoplasmtica causando la destruccin celular al liberar el contenido citoplasmtico. Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos. Este tipo de accin evita el desarrollo normal del microorganismo, pero tiene un efecto txico en el ADN y ARN de los mamferos, como es el caso del antivrico idoxuridina. Son ms selectivamente txicos para las bacterias, afectando menos al husped la Rifampicina y el cido nalidixico. Inhibicin de la actividad enzimtica. Algunos antibiticos son antimetabolitos que 68

por su parecido al sustrato normal de una enzima necesaria en la produccin de cido flico interfieren con esta sntesis y detienen el crecimiento del microorganismo. Es el caso de la sulfanilamida. Otros agentes de accin similar son las sulfotas el Timetropin.

Lectura complementaria para estudiantes de Ingeniera de Alimentos. La conservacin de alimentos es un proceso que aprovecha los factores fsicos y qumicos para el control del crecimiento bacteriano en calidad de parmetros intrnsecos y extrnsecos que se tiene en cuenta para desarrollar tratamientos que previenen o inhiben la presencia y la reproduccin microbiana. Una vez un microorganismo se ha establecido en un sustrato, como por ejemplo en un alimento, pueden producirse cambios tanto en ste como en el microorganismo. Estos cambios generan diversas reacciones que afectan el crecimiento y desarrollo del microorganismo, ya sea aumentando o disminuyendo su tasa crecimiento, y algunas veces ocasionando su muerte. A partir de la siguiente grfica se desarrolla esta temtica con el enfoque especfico para Ingeniera de Alimentos

Parmetros que afectan la supervivencia de los microorganismos De todos los microorganismos presentes en un alimento slo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre ste. Los tejidos vegetales y animales, que constituyen la base de los alimentos, tienen bien desarrollados ciertos mecanismos de defensa frente a la invasin y proliferacin de los microorganismos. Si se tiene en cuenta este fenmeno natural, se puede prevenir o retardar la alteracin microbiolgica de todos sus productos derivados. Existen una serie de parmetros entre los cuales los ms importantes son los intrnsecos y extrnsecos que determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. 69

Parmetros intrnsecosEstos parmetros estn relacionados directamente con los constituyentes de los tejidos vegetales y animales. Actividad de agua (aw) Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponible, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas. Actualmente, las necesidades de los microorganismos en agua se expresan en trminos de actividad de agua del medio ambiente, que se define como la relacin entre la presin del vapor de agua del sustrato y la presin de vapor del agua pura a la misma temperatura. La aw de la mayora de alimentos frescos es superior a 0.99. Esta puede reducirse aumentando la concentracin de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extraccin del agua o mediante la adicin de solutos. Uno de los mtodos ms antiguos utilizados por el hombre para conservar los alimentos ha sido la desecacin basada en la reduccin de la aw, durante el curado y el salazonado. La conservacin es una consecuencia de la eliminacin del agua, sin la cual los microorganismos no pueden crecer. Igualmente ocurre en el almbar y otros alimentos azucarados, donde los solutos aadidos disminuyen la aw. Un pequeo descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la alteracin del alimento, siempre que esta reduccin vaya acompaada por otros factores antimicrobianos. La mayora de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a valores ms bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen, a la vez que la duracin de la fase de latencia aumenta hasta cesar el crecimiento. Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de alto contenido de sal (baja aw); cuando tienen la capacidad de supervivencia a baja aw, o sea, en medios hipertnicos se les denominan osmfilos, xerfilos si tienen capacidad de crecer en ambientes con baja humedad y halfilos si crecen en ambientes con alta concentracin de sales. La baja aw reduce tambin la tasa de mortalidad de las bacterias, ya que una baja aw puede protegerlas durante tratamientos trmicos. pH La mayora de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8 unidades, aunque en general los hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos que las bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms energa de mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se produce la muerte celular. En general, la presencia de cidos en el alimento produce una drstica reduccin de la supervivencia de los microorganismos. Los cidos fuertes (inorgnicos) producen una rpida disminucin del pH externo, aunque su presencia en la mayora de los alimentos es inaceptable.

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Los cidos orgnicos dbiles son ms efectivos que los inorgnicos en la acidificacin del medio intracelular debido a que es ms fcil su difusin a travs de la membrana celular en su forma no disociada (lipoflica); posteriormente se disocian en el interior de la clula inhibiendo el transporte celular y la actividad enzimtica. La actividad antimicrobiana de un cido orgnico o de su ster se debe a las molculas no disociadas de este compuesto por ser las formas moleculares ms solubles en las membranas celulares; es por esto que slo los cidos orgnicos lipoflicos tienen actividad antimicrobiana. Estos compuestos inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan por interferir con la permeabilidad de la membrana celular, al producir un desacoplamiento del transporte de substratos y del transporte de electrones de la fosforilacin oxidativa; como consecuencia de esto las bacterias no pueden obtener energa y mueren. La mayora de los cidos orgnicos resultan poco eficaces como inhibidores del crecimiento bacteriano a los valores de pH de 5.5 a 5.8 unidades y son ms eficaces a altas concentraciones y a pH ms bajos. De todos los cidos orgnicos el ms efectivo como agente antimicrobiano es el actico. Potencial redox Desde hace mucho tiempo se sabe que los microorganismos presentan diferentes grados de sensibilidad al potencial de oxido reduccin, hecho que se ha observado especialmente en los medios de cultivo. Se piensa que el potencial redox es un factor selectivo importante en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica las relaciones de oxgeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energa y sintetizar nuevas clulas sin recurrir al oxgeno molecular: los microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios negativos. Cada tipo de microorganismo slo puede vivir en un estrecho rango de valores redox. Entre las sustancia que ayudan a mantener en los alimentos condiciones de reduccin se encuentran los grupos SH presentes en las carnes y el cido ascrbico y los azcares reductores en las frutas y verduras. El potencial redox de un alimento se determina por: 1) el potencial caracterstico de xido reduccin del alimento original, 2) la capacidad de equilibrio, que es la resistencia del alimento a variar su potencial, 3) la tensin de oxgeno de la atmsfera que envuelve al alimento y 4) la posibilidad de acceso de la atmsfera al alimento.

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Nutrientes Los microorganismos requieren para su desarrollo los siguientes elementos: agua, fuentes de energa, fuente de nitrgeno, vitaminas y otros factores de crecimiento y minerales. Los hongos tienen las necesidades de agua ms reducidas, seguidos de las levaduras, bacterias gram negativas y bacterias gram positivas. Los microorganismos pueden utilizar azcares, alcoholes y aminocidos como fuente de energa. Algunos de ellos son capaces de emplear la energa de carbohidratos complejos, como almidones y celulosa, ya que tienen la capacidad de degradar estos compuestos hasta azcares sencillos. Tambin las grasas son utilizadas como fuentes de energa, aunque slo un nmero relativamente pequeo de los microorganismos de los alimentos son capaces de degradarlos. Los aminocidos constituyen la fuente primaria de nitrgeno para los organismos heterotrficos. Un gran nmero de otros compuestos nitrogenados tambin pueden cumplir esta funcin con relacin a las diversas clases de organismos. Por ejemplo, ciertos microorganismos son capaces de utilizar nucletidos y aminocidos libres, mientras que otros emplean pptidos y protenas. En general, la mayora de los microorganismos utilizan compuestos simples como los aminocidos, antes de tener que desdoblar compuestos ms complejos, como las protenas de alto peso molecular. Ocurre lo mismo con los polisacridos y grasas. Los microorganismos pueden requerir vitaminas del grupo B en pequeas cantidades. La mayor parte de los alimentos naturales las poseen en abundancia y se las facilitan a aquellos organismos incapaces de sintetizarlas. En general, las bacterias gram positivas tienen menor capacidad sintetizadora y por ello necesita de uno o varios de estos compuestos de los alimentos. Las bacterias gram negativas y los hongos pueden sintetizar la mayor parte de sus requerimientos, por lo cual estos dos grupos de organismos pueden proliferar en alimentos pobres en vitaminas del grupo B. Las frutas tienen un contenido en vitaminas del grupo B ms escaso que las carnes y este hecho, junto con su habitual pH bajo y su potencial redox positivo, explica que es ms frecuente la alteracin de las frutas por hongos que por bacterias. Componentes antimicrobianos La estabilidad de ciertos alimentos frente al ataque microbiano se debe a la presencia en los mismos de determinadas sustancias que poseen actividades antimicrobianas. Por ejemplo, el complejo de lactoperoxidasa de la leche cruda es activo frente a algunos estreptococos; la lisozima que est presente en la clara de huevo contienen cido benzoico, cido orgnico que poseen actividad antimicrobiana. Los lpidos y aceites esenciales, especialmente el eugenol del clavo y el aldehdo cinmico de la canela, poseen propiedades antimicrobianas.

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La cubierta natural de algunas materias primas y alimentos proporcionan una excelente proteccin contra la entrada y subsiguiente ataque de los organismos productores de alteraciones. Entre estas estructuras encontramos la membrana de las semillas, la cubierta externa de los frutos, la cscara de las nueces, la piel de los animales y la cscara de los huevos. En el caso de las nueces, la cscara o cubierta es suficiente para impedir la entrada de cualquier organismo. Por supuesto, una vez agrietada la cubierta, los hongos pueden atacar su contenido. Si la cscara externa y las membranas del huevo estn intactas, son capaces de impedir la entrada de casi todos los microorganismos, siempre y cuando se conserven en condiciones de humedad y temperaturas adecuadas. Las frutas y verduras con las cubiertas lesionadas se alteran mucho ms rpidamente que las sanas. El epitelio externo de los peces y el de otros animales como el cerdo y el buey, resiste la contaminacin y deterioro porque se desecan con ms rapidez que las superficies recientemente cortadas. Parmetros extrnsecos Estos parmetros constituyen todas aquellas propiedades del medio ambiente en el que se conservan los alimentos que pueden llegar a afectar, tanto a ste como a los microorganismos. Entre los ms relevantes para aquellos microorganismos que se transfieren a travs de los alimentos se encuentran: La temperatura de almacenamiento; Las Sales de curado y sustancias anlogas, La radiacin: ultravioleta, ionizante La presencia y concentracin de gases en el medio ambiente.

Temperatura Es uno de los factores ambientales que ms influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimticas hasta una cierta temperatura a la cual las protenas, DNA y otras macromolculas son sensibles y se desnaturalizan. Los microorganismos se desarrollan y crecen dentro de un amplio lmite de temperatura. Cada microorganismo tiene una temperatura mnima, ptima y mxima de crecimiento. La temperatura ptima siempre est ms cerca de la temperatura mxima que de la mnima. Segn su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser: termfilos, la temperatura ptima para su crecimiento es de 55-75 C; mnimas 40 45 C , mximas 60 - 90 C , mesfilos, la temperatura ptima para su crecimiento es de 30 - 45C , Mnimas 5 15 C , mximas 35 - 47 C psicrfilos, la temperatura ptima para su crecimiento es de 15-20 C Mnimas -5 +5 C , mximas 15 - 20 C.

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Entre las cepas de bacterias psicrfilas se encuentran: Alcaligenes, Corynebacterium, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas y Streptococcus. Estos microorganismos se reproducen a temperaturas de refrigeracin y causan alteraciones en carnes, aves, pescados, huevos y alimentos que se conservan a bajas temperaturas. Los recuentos en placa de microorganismos vivos en estos alimentos son por lo general superiores si se incuban a 7C por 7 das por lo menos, que cuando la incubacin se hace a 30C o ms. Los gneros de mesfilos se encuentran igualmente en alimentos que se conservan a temperaturas de refrigeracin. Aparentemente no crecen a bajas temperaturas, pero se pueden reproducir si se dan las condiciones adecuadas. La mayor parte de los termfilos, se encuentran en los gneros Bacillus y Clostridium. Son pocas las especies, pero tienen gran importancia por su gran incidencia en la industria de alimentos. Los hongos tambin son capaces de crecer dentro de los lmites ms extensos. Muchos proliferan a temperatura de refrigeracin, especialmente algunas cepas de Aspergillus, Cladosporium y Thanadium y pueden desarrollarse en los huevos, en la superficie de la carne y en las frutas. Las levaduras, por su parte, crecen a temperaturas similares a las de los psicrfilos y mesfilos, pero generalmente no lo hacen a la temperatura de los termfilos. Se debe tener en cuenta que la temperatura de refrigeracin no siempre es la ptima para la conservacin de alimentos. Para algunos alimentos, por ejemplo el pltano, la temperatura ptima de almacenamiento se encuentra entre los 13 y 17C. El xito al elegir la temperatura de almacenamiento para cada tipo de alimento depende tambin en gran parte de otros factores como la humedad relativa del medio y la presencia o ausencia de gases como el dixido de carbono y el ozono.

Sales de curado y sustancias anlogas Las sales de curado son bsicamente el cloruro sdico y los nitratos o nitritos de sodio y potasio. Estos productos se utilizan para modificar el color, aroma, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano de los alimentos. A las concentraciones y bajo las condiciones corrientemente utilizadas, los agentes de curado no causan una destruccin microbiana rpida, ms bien retrasan o previenen el desarrollo de los microorganismos perjudiciales de los productos sin tratar y el de los termotolerantes no esporulados, evitando el desarrollo de las esporas que sobreviven a los tratamientos trmicos drsticos que se aplican a ciertos productos curados. Se desconoce el mecanismo exacto de la inhibicin de las bacterias por el nitrito que, aunque no previene la germinacin de las esporas, evita su desarrollo.

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Radiacin La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas, segn el tiempo de irradiacin. Actualmente no existe mucha informacin referente a la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.; por ejemplo, diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta a este tipo de radiacin. El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en la purificacin del aire y del agua, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. Ionizante La radiacin ionizante o rayos beta es generada por una fuente de energa elctrica sin fuentes ni residuos radioactivos. La radiacin ionizante es altamente letal; su dosis puede ajustarse para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es uniforme. Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos sin produccin de calor, por lo que los alimentos tratados con radiacin ionizante se conservan frescos; acta principalmente a nivel de ADN. La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas no son considerables. Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas son an ms resistentes. En general, la resistencia de los hongos a la radiacin ionizante es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son an ms resistentes que las bacterias a esta radiacin. Gases como conservadores Diversos gases y microorganismos. vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los

El nitrgeno se usa con frecuencia en el envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la inhibicin de los microorganismos. La adicin de nitrgeno como gas inerte permite conservar las propiedades organolpticas de los alimentos al evitar su deterioro qumico. Al envasar el alimento con atmsferas protectoras de nitrgeno se evitan las alteraciones bacterianas en los alimentos, al evitar la proliferacin de las mismas. La inyeccin de nitrgeno el lquidos como jugos, jarabes, zumos, leche vinos y aceites elimina el oxgeno, de esta manera se consigue una atmsfera libre de oxgeno retardando la accin de hongos y bacterias El hidrgeno se utiliza en alimentos como aceites y cidos grasos para modificar propiedades fsico-qumicas como punto de fusin, olor y color. El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con mayor eficiencia cuanto menor es la temperatura. Este efecto se manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generacin durante la fase logartmica. Los hongos y las levaduras son ms resistentes al CO2 que las bacterias (las Gram-negativas ms sensibles que las Gram-positivas). 75

El dixido de azufre (SO2) se emplea como antifngico. Captulo 7 Bioseguridad Introduccin Las normas de bioseguridad son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud y seguridad de las personas que realizan actividades en el laboratorio frente a riesgos procedentes del manejo de agentes biolgicos, fsicos o qumicos. Objetivos Identificar mtodos y tcnicas para la observacin cuantitativa de poblaciones microbianas Aplicar criterios disciplinares para la intervencin segura en ambientes de laboratorio

Leccin 1 Bioseguridad Leccin 2 Esterilizacin y Desinfeccin Conclusin La bioseguridad en el manejo microbiolgico, adems de ser un requerimiento cientficamente fundamentado, constituye un compromiso tico para todo microbilogo.

Normas de Bioseguridad En el laboratorio de Microbiologa todas las reas deben estar debidamente marcadas con la seal de riesgo biolgico y su nivel de contencin. Se deben utilizar siempre elementos de barrera apropiados segn las necesidades: blusa blanca limpia y en buen estado, guantes, tapabocas, gorro y gafas protectoras. No se debe pipetear con la boca. El pipetear lquidos con la boca es una prctica inadecuada y altamente riesgosa. Deben utilizarse pipetas mecnicas para evitar cualquier riesgo de contaminacin oral. Todas las pipetas deben tener tapones de algodn para reducir la contaminacin de los dispositivos de pipeteo. Las pipetas contaminadas deben sumergirse en un recipiente irrompible con hipoclorito de sodio al 5% a 5000 ppm durante 18 24 horas. En la zona de trabajo del laboratorio no se debe comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosmticos. No se deben llevar a la boca lpices, etiquetas o cualquier otro material utilizado en el laboratorio. Para evitar esto acostumbre el uso de tapabocas. Se debe mantener el laboratorio limpio y aseado. Una vez concluida la prctica, se debe organizar el laboratorio, desinfectando la 76

superficie de trabajo con hipoclorito de sodio a 500 ppm o alcohol y dejando tanto el material como el equipo utilizado limpio y en el lugar adecuado. Se deben lavar las manos despus de haber manipulado material infeccioso, as como al abandonar el laboratorio. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados se deben descontaminar antes de eliminarlos o de limpiarlos para su reutilizacin. Se deben introducir en bolsas de plstico de cierre hermtico con cdigo de color, para esterilizar en autoclave o incinerar fuera del laboratorio. Slo se debe permitir el paso a la zona de trabajo del laboratorio a las personas autorizadas. Durante el trabajo se mantendrn cerradas las puertas del laboratorio. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los guantes deben ser desechados antes de salir del rea de trabajo. Jams se debe salir de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se debe coger el telfono. Si un cultivo lquido se voltea o salpica, se debe cubrir el rea con hipoclorito de sodio a 10.000 ppm y avisar al instructor. Posteriormente se debe enjuagar las manos con jabn y agua. Marque y rotule adecuadamente las lminas, cajas y tubos con las siembras realizadas. Estos deben llevar claramente escrito en un lugar visible, el nombre o identificacin del grupo de trabajo, el ensayo o experiencia realizada, el medio de cultivo, la temperatura de incubacin y la fecha. A la terminacin de cada prctica es indispensable que organice adecuadamente las cajas o tubos por incubar y los entregue segn instrucciones. Es importante conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio. de igual manera el manejo de cada uno de los equipos existentes en el laboratorio. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se debe realizar de tal manera que, en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas hermticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras deben ser rgidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fcil desinfeccin. Se deben etiquetar o identificar de forma oportuna y no deben ser utilizadas para otros fines. Bajo ningn concepto se pueden transportar las muestras a mano. En la nevera no deben almacenarse cultivos de microorganismos patgenos por inhalacin en recipientes que no estn convenientemente cerrados. No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos voltiles inflamables (ter etlico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de proteccin antideflagracin. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, 77

se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Observar Vdeos Normas de bioseguridad parte 1 y parte 2

Nivel de Contencin Al hablar de contencin, se hace referencia a las medidas de seguridad (protocolos y mtodos) que se deben tener en cuenta en el laboratorio al manejar materiales o agentes biolgicos (determinadas bacterias, hongos, virus, Rickettsias, Chlamidias, parsitos, productos recombinantes, alrgenos, cultivos de clulas humanas y animales y los agentes infecciosos potenciales que contengan estas clulas, viroides, priones) potencialmente infecciosos, con el fin de eliminar o reducir el riesgo que estos podran ocasionar tanto a las personas que estn expuestas a ellos como al medio ambiente. Para el manejo de agentes biolgicos existen cuatro niveles de contencin o protocolos a seguir segn el nivel de riesgo de infeccin, y la funcin del laboratorio. Nivel 1. Es el nivel bsico en el cual los agentes biolgicos no causan enfermedades en los seres humanos, pero se deben tener precauciones en el manejo de estos agentes para evitar la contaminacin del medio ambiente. Este nivel hace referencia a los laboratorios para prcticas estudiantiles y deben seguir protocolos para el diseo, construccin de laboratorios y equipos. En este nivel es importante tener cuidado con las personas inmunodeprimidas debido a que microorganismos no causantes de enfermedades en personas sanas, pueden convertirse en patgenos al ser manipulados por personas inmunodeprimidas. Nivel 2. Este nivel hace referencia a agentes biolgicos de riesgo moderado que pueden causar enfermedades en las personas que los manipulan si no siguen los protocolos de seguridad. Generalmente aplica en laboratorios clnicos y diagnsticos, y algunos laboratorios de enseanza donde se manipulan sangre, fluidos corporales (lquido cefalorraqudeo, secrecin vaginal), tejidos o clulas humanas. La contaminacin puede ser ocasionada por cortes accidentales, por salpicaduras o ingestin del material contaminante, motivo por el cual ha de tenerse extremo cuidado con agujas o instrumentos contaminados. El uso de tapabocas, guantes, el cuidado en el manejo de objetos corto punzantes, entre otros, son medidas de prevencin tiles. Entre las posibles enfermedades ocasionadas en este nivel estn las causadas por virus como son. el sida, la hepatitis y la toxoplasmosis. Nivel 3. Es el nivel relacionado con estudios clnicos, diagnstico, de enseanza e investigacin donde se manipulan agentes biolgicos que no son autctonos y pueden transmitirse por va respiratoria originando enfermedades graves como es el caso de la tuberculosis causada, por la bacteria Mycobacterium tuberculosis. Este nivel exige un mayor y estricto grado de cumplimiento en las medidas de seguridad como colocacin de la seal de riesgo biolgico, acceso restringido al personal, instalaciones con ventilacin que eviten la liberacin de aerosoles infecciosos a otras zonas, tratamiento del aire mediante filtros. En este nivel se pone especial nfasis en evitar la autoinoculacin.

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Nivel 4. Es el nivel de mayor riesgo de contaminacin, para el que no existe ningn tratamiento clnico. Razn por la cual el diseo de la construccin y el equipo de seguridad debern estar en un lugar totalmente aislado, con sistemas de ventilacin y manejo de desechos que impidan la salida de los agentes contaminantes. Ejemplos de agentes contaminantes en este nivel seran Ebola y otros virus que producen fiebre hemorrgica. Equipos y materiales para manejo microbiolgico con bioseguridad El autoclave es un recipiente utilizado para esterilizar: medios de cultivo, agua destilada, tierra etc. mediante calor hmedo. El material a esterilizar se expone a temperaturas superiores a la de ebullicin del agua, gracias al aumento de la presin.

El vapor de agua difunde por smosis a travs de las esporas coagulando su protoplasma Generalmente se esteriliza a temperaturas que van entre 107-126C por un tiempo de 5-20 minutos con presiones que varan entre 5 y 20 libras por pulgada cuadrada (p.s.i). Horno Pasteur o estufa

Se utiliza para esterilizar material de vidrio, por ejemplo, cajas de Petri, matraces, tubos de ensayo, pipetas a travs de circulacin de aire caliente (calor seco) a temperaturas que varan entre 120 y 180C por un lapso de tiempo de 20 minutos a 8 horas

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Destilador de agua

Permite la obtencin de agua destilada, es decir, agua a la que se le han eliminado iones e impurezas. Mediante el proceso de destilacin el agua es sometida al calor hasta su ebullicin para separar sus componentes lquidos, luego sus vapores son recogidos y condensados. Cmara de flujo laminar Es un receptculo con una nica cara libre (la frontal) que permite el acceso a su interior, donde se localiza la superficie de trabajo. Permite realizar, aislar, manipular cultivos en condiciones de esterilidad. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace circular a travs del interior de la cmara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada o tratada con luz ultravioleta para eliminar todo agente contaminante. Incubadora Permite obtener temperaturas de incubacin constante, en procesos como el cultivo de microorganismos y de tejidos, para determinaciones microbiolgicas. La limpieza y la desinfeccin, peridicas y sistemticas, son recomendables para reducir los riesgos derivados de la contaminacin accidental del personal del laboratorio.

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Neveras Es necesario un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfeccin para reducir los riesgos asociados a su utilizacin. Sin embargo, an en estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente: No deben almacenarse cultivos de microorganismos patgenos por inhalacin, en recipientes que no estn convenientemente cerrados. No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos voltiles inflamables (ter etlico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de proteccin antideflagracin. En los aparatos de tipo domstico que se utilizan en el laboratorio debe anularse la lmpara de la luz. Congeladores La congelacin es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, generando un riesgo potencial. Al respecto conviene seguir las siguientes recomendaciones: Identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales. El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes hermticamente cerrados. No deben llenarse completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelacin. Es necesario descongelar peridicamente, limpiar y desinfectar si fuese procedente. Utilizar guantes para manipular el contenido. Centrfugas Cuando se centrifugue material biolgico potencialmente infeccioso deben utilizarse tubos con tapa rosca o de goma hermtica. Se debe esperar a que la centrfuga deje de girar nunca se debe detener manualmente. La tapa se debe abrir solamente cuando la centrfuga haya dejado de girar. Si accidentalmente se rompe un tubo y se genera aerosol se debe contener la respiracin y desalojar el laboratorio luego la persona responsable deber efectuar la desinfeccin inmediata de la centrfuga. Si el material es potencialmente infeccioso la centrifugacin deber hacerse bajo campana. Al terminar el trabajo limpiar con solucin descontaminante por dentro y por fuera del aparato Microscopio El manejo del microscopio es un conocimiento previo que debe recordarse del estudio

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anterior en el curso de biologa. El estudioso debe ubicar este tema en el curso mencionado de biologa, pgina Web de la UNAD, en las siguientes direcciones:

Video: el Microscopio parte 1 Vdeo: El microscopio parte 2 Manual de Prcticas de Biologa: Microscopia Pginas 15 a 43 Esterilizacin, desinfeccin y manejo de equipos Ver vdeos: Esterilizacin parte 1 y parte 2 Se define esterilidad a la condicin de ausencia de cualquier microorganismo. Significa destruccin de toda forma de vida microbiana incluyendo esporas. Los mtodos de esterilizacin ms usados en el laboratorio son calor seco, calor hmedo, flameado, utilizacin de soluciones qumicas. La desinfeccin se refiere a la reduccin de los organismos patgenos (organismos que ocasionan enfermedades). Los desinfectantes de acuerdo a su composicin qumica se clasifican en: Fenoles, Hipocloritos (cloro), Yodoformos (yodo Povidona), Amonio Cuaternario, Formaldehdos, Perxidos. Los desinfectantes pueden ser de bajo nivel, de nivel intermedio o de alto nivel. Los desinfectantes de bajo nivel (Fenoles, amonio cuaternario) pueden destruir la mayor parte de las formas vegetativas bacterianas, tanto grampositivas como gramnegativas, algunos virus (virus con envoltura lpidica) y hongos (levaduras), pero no Mycobacterium spp, ni las esporas bacterianas. Los desinfectantes de nivel intermedio consiguen inactivar todas las formas bacterianas vegetativas, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, la mayora de los virus (virus con y sin envoltura) y hongos filamentosos, pero no destruyen necesariamente las esporas bacterianas. En cambio, los desinfectantes de alto nivel (formaldehdos, perxidos, hipocloritos) consiguen destruir todos los microorganismos, excepto algunas esporas bacterianas. Calor seco que se efecta en estufas de aire seco u hornos Pasteur y se manejan temperaturas entre 160 180C, por un espacio de dos horas aproximadamente. Este mtodo se utiliza para esterilizar el material de vidrio generalmente: tubos, cajas de Petri, pipetas y erlenmeyers. No se debe emplear para esterilizar medios de cultivo o agua pues se evaporan hasta secarse. Previo al horneado el material de vidrio se recubre con papel Kraft y se sella con cinta indicadora de esterilidad, una vez realizado el proceso de esterilizacin se revisa la cinta la cual debe tornarse de color caf oscuro lo que indica una correcta esterilizacin. El calor seco tambin se utiliza para secar material de vidrio como tubos y pipetas, este material se deja en el horno por dos horas a 60C. Las lminas y laminillas se secan con un trapo suave. Los dems materiales se secan a temperatura ambiente. Calor hmedo en autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo preparados, escobillones, gasas entre otros. Adicionalmente se tiene otra autoclave 82

para descontaminar cultivos antes de ser desechados. El autoclave es un recipiente en el que se consigue exponer el material a esterilizar a temperaturas superiores a la de ebullicin del agua, gracias al aumento de la presin. El autoclave se opera a presin de 15 lb. y a 121C. El tiempo de exposicin depende del material y volumen que se esterilice, pero en general esta comprendido entre 15 y 30 minutos. Manejo de la autoclave o Verificar que la autoclave este apagada (off). Retirar la olla de aluminio y la rejilla del recipiente de esterilizacin. o Llenar el tanque de agua hasta el nivel indicado (aproximadamente hasta una altura de 2 pulgadas) cubriendo la resistencia. Usar agua destilada para evitar que los sistemas de abastecimiento de agua se obstruyan. o Llenar la olla de aluminio con el material a esterilizar de tal manera que el aire pueda circular durante el proceso de esterilizacin. Cubrir los elementos con toalla de papel para absorban la humedad que pueda caer de la cubierta. o Colocar la rejilla, luego la olla de aluminio con el material a esterilizar en el interior de la autoclave. o Colocar la tapa sobre el contenedor de la autoclave de manera que la flecha de la cubierta y el contenedor coincidan, luego insertar el tubo flexible de salida de aire en el canal que est situado en el interior de olla de aluminio. o Ajustar y cerrar los pernos para evitar desajustes. Nota: siempre que se cierre un perno debe cerrarse luego el opuesto al cerrada. o Colocar el botn de control del termostato en alto y el interruptor en encendido (on). o Abrir la vlvula de control por 5 minutos para que el vapor que se genere en el fondo del recipiente sea expulsado y la presin aumente. Verificar en el manmetro o Cuando la presin este en 18 a 20 lb/pulg2 (p.s.i) controle la temperatura con el botn del termostato mantenindolo en la posicin bajo (low) o Encender la autoclave (on). o Mantener el tiempo de esterilizacin requerido) mnimo 15 minutos). Cuando el reloj llegue a cero el ciclo de esterilizacin habr finalizado. Apagar la autoclave y finalmente abrir la vlvula para igualar presiones. El desecho de material de cultivo se realiza diariamente previo al lavado del material, autoclavando todos los desechos biolgicos y los recipientes que los contengan a 121C por una hora. Posteriormente el contenido lquido de estos recipientes se descarta en la tubera, dejando caer abundante agua. El contenido slido se coloca en bolsa roja la cual debe ser sitio de almacenamiento temporal por un mximo de 5 das.

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Flameado usado principalmente para asas, es otro mtodo de esterilizacin comn usado en el laboratorio. Consiste en poner el asa con la cual se va a hacer el cultivo, durante unos minutos en la llama del mechero. Empleo de soluciones qumicas: para superficies, equipos, mesas y lavamanos se debe preparar hipoclorito de sodio al 5% a 500 ppm. Para obtener esta solucin se mezclan 10 ml de hipoclorito con 990 ml de agua y se obtiene un total de 1 litro de dilucin. El lavado del material de laboratorio se debe realizar a diario, utilizando hipoclorito de sodio a 5.000 ppm. y extran alcalino o neutro dependiendo de la clase de material. El material se debe dejar en esta solucin durante 2 o 3 horas. Posteriormente se procede al lavado por separado y en diferentes condiciones de acuerdo al material, todo realizado con los elementos de aseo y proteccin personal requeridos. Lminas y laminillas se limpian con un cepillo. Tubos y pipetas se deben limpiar con churrusco. Cada elemento se enjuaga con agua fra. El material lavado se sumerge en un recipiente con agua destilada y posteriormente se pone a escurrir. Despus de lavado el material se realiza la prueba de Azul de Bromotimol. Esta prueba consiste en seleccionar al azar diferentes elementos lavados y agregar 3 gotas de azul de Bromotimol 0.1% y observar si se desarrolla un cambio de color. El viraje a color azul indica la presencia de detergente residual, en cuyo caso se vuelve a lavar el material y se realiza nuevamente la prueba. El no desarrollo de color indica que el material ha sido lavado correctamente. Captulo 9 Tcnicas de cultivo microbiolgico Introduccin La diversidad microbiana implica la utilizacin de medios de cultivo apropiados para identificar y observar el ciclo de crecimiento y reproduccin de cada tipo de microorganismo. Adems se requiere una estandarizacin de los mtodos de siembra en cada medio de cultivo y de las tcnicas de recuento microbiolgico para lograr sistemas efectivos de manejo y control del crecimiento bacteriano. Objetivos Describir los medios de cultivo slidos, lquidos y semislidos. Describir los mtodos de siembra apropiados para cada tipo de microorganismo en el respectivo medio de cultivo. Adquirir destreza en el recuento de microorganismos segn la tcnica seleccionada para el conteo.

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Conclusin Existen metodologas estandarizadas para el cultivo de microorganismos, los cuales constituyen protocolos especializados segn el tipo de microorganismo y permiten el avance del conocimiento socializado en comunidad acadmica de investigadores. Tcnicas de cultivo microbiolgico Adaptado de http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioMedios.htm Lic. Eric Caballero Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial ste debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.

Tipos bsicos de medios de cultivo por consistencia El tipo de medio de cultivo a utilizar depende del microorganismo de inters y de la necesidad de realizar ese cultivo. Los medios se pueden utilizar para el crecimiento de una especie o para diferenciar entre cepas o especies. Segn su consistencia o estado fsico pueden ser: o Lquidos o caldos: se emplean fundamentalmente para cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitos especficos, estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas. o Semislidos Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda.

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o Slidos o Agares Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. A diferencia de los lquidos se les agrega Agar. El agar es un polisacrido acdico producido por ciertas algas rojas, es un elemento solidificante que se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. El agar Se usa a una concentracin del 1,5%. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. Tipos de medios de cultivo por utilidad prctica: No selectivos o generales: permiten el cultivo y crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, Caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Soya Tripticasa (TSA), Agar marino 2216 o Zobell. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, Factor X, Factor V, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.) Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) permiten el aislamiento y crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos de inters, para lo cual se manipulan factores ya sean de tipo nutricional o de tipo ambiental. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto qumico, como la azida sdca, el telurito potsico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. En el caso de factores nutricionales se aaden al medio sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos, permitiendo a la vez el crecimiento de otros. Los antibiticos, el cloruro sdico en altas concentraciones, colorantes y algunas sustancias qumicas son ejemplos de agentes selectivos que se aaden a los medios para inhibir el crecimiento de otros microorganismos diferentes al de inters.El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicacin alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. Por ejemplo, los colorantes, que se aaden al Agar, inhiben selectivamente determinados microorganismos, es el caso del verde brillante (Agar verde brillante) utilizado para determinar la presencia de Salmonella en heces fecales ya que inhibe las bacterias Gram positivas, y la mayora de las bacterias intestinales. Para el caso de factores ambientales se manipula la temperatura, el grado de humedad, el pH, la concentracin de oxgeno o la intensidad de la luz. As el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias. Son ejemplo de este tipo de medios: Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) para cultivo de Vibrio y Agar Cetrimida para cultivo de Pseudomonas.

Enriquecidos: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

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Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de microorganismos, ayudando a su identificacin (Lowenstein). En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Diferenciales: permiten distinguir unos microorganismos de otros por las caractersticas que presentan las colonias. Se elaboran con base en las caractersticas fisiolgicas especficas de los microorganismos, por ejemplo, nutricin, respiracin entre otras. Algunos medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradacin de un nutriente especfico (generalmente un azcar) por el cambio de color que se origina cuando ste es metabolizado, como en el caso del medio CLED. Los colorantes que se aaden a estos medios actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido. Un ejemplo es el Rojo Fenol es de color rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. A travs del cultivo en medio diferencial se puede distinguir las bacterias que fermentan la lactosa (con produccin de cido) de las no fermentadoras. Otros colorantes actan como inhibidores del crecimiento de unos microorganismos y no de otros, por ejemplo la Violeta de Genciana inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas). Algunos medios pueden ser a la vez selectivos y diferenciales. El agar Mac Conkey es un ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entricas (accin selectiva); la fermentacin de lactosa con liberacin de productos cidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio (accin diferencial). El agar sangre es un agar que contiene hemates y permite reconocer los microorganismos que producen hemlisis por ejemplo para aislar la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre. Las colonias de esta bacteria producen hemlisis, es decir, muerte y lisis de los hemates generando una zona transparente a su alrededor. El Agar eosina-azul de metileno (EAM) permite identificar el crecimiento de coliformes y E. coli. Este medio contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las coliformes (stas desarrollan colonias tpicas). E. coli muestra colonias grandes, oscuras, negroazuladas, centro casi negro, con brillo metlico verdoso causado por la luz reflejada. La presencia de coliformes como Enterobacter se manifiesta en colonias grandes, de color rosado plido, mucosas, con centro oscuro y sin brillo metlico. Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metablicos cidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin).

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Condiciones generales para el cultivo de microorganismos. El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbono ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de 88

los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertermfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprfitos tienen rangos ms amplios. Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante) Cmo se realiza el cultivo? Sembrar es colocar una muestra de inculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han aadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se aaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podran contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con lquidos nutritivos para los microorganismos. A continuacin se procede a la "incubacin" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presin de oxgeno, temperatura, agitacin, duracin, etc. Muchas de las bacterias patgenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37C habituales de nuestro organismo. Si el cultivo bacteriano tiene xito, crecern "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas colonias tienen caractersticas de color, forma, tamao etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. Tambin se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioqumicas o de otro tipo para lograr su identificacin. Algunas bacterias son muy difciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar. Sistemas de Siembra Antes de iniciar la siembra se deben cumplir determinadas condiciones: Esterilizacin de los instrumentos de trabajo y de los medios de cultivo. Los medios de cultivo se esterilizan con calor hmedo en la autoclave y los materiales de vidrio se esterilizan con calor seco en el horno Pasteur. En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilizacin, se mantienen en la 89

llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso. Que el inculo no se contamine, modifique o destruya para lo cual se utiliza calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, la pipeta y dems elementos antes y despus de su utilizacin. Esterilizacin del rea de trabajo para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Se utilizan la cmara de flujo laminar. Si no se dispone de ella, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semisteril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente. Siembra de medio slido a medio lquido Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y djela enfriar Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tapelo y dejelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida.Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero despus de usarla. Incube los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente Siembra de medio lquido a slido Se procede en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja de Petri puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra de medio slido a slido Se realiza de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla 90

Realice una estra que atraviese el centro del agar. Luego realice estras en ngulo recto con respecto a la estra inicial. Voltee el agar en ngulo de 90 grados y realice estra hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estras y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas. Siembra por estras

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/docum en/uni_02/56/cap309.htm Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto numero uno, realice estras hasta el numero 2. Esterilice el asa, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 3, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 4 y as sucesivamente hasta llegar al numero 6. Siembra masiva Tome un hisopo estril e introdzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluacin del crecimiento en las placas de agar se hace a travs de la observacin de colonias en la superficie. Siembra en agar inclinado Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el

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mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de colonias en la superficie. Siembra en profundidad Marque la caja de petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas. Entregue al coordinador del laboratorio los cultivos bacterianos usados Cmo se realiza el cultivo? Observar vdeos: Mtodos de siembra parte 1 , parte 2 y parte 3 Sembrar es colocar una muestra de inculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al que se han aadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo llamamos medio de cultivo. A veces se aaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podran contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con lquidos nutritivos para los microorganismos. A continuacin se procede a la "incubacin" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en condiciones particulares de presin de oxgeno, temperatura, agitacin, duracin, etc. Muchas de las bacterias patgenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37C habituales de nuestro organismo. Si el cultivo bacteriano tiene xito, crecern "colonias" de bacterias en el medio cultivo. Estas colonias tienen caractersticas de color, forma, tamao etc. propias cada bacteria y esto nos ayuda a identificarlas. Tambin se puede someter a bacterias de las colonias a pruebas bioqumicas o de otro tipo para lograr de de las su 92

identificacin. Algunas bacterias son muy difciles de cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar. Sistemas de Siembra Antes de iniciar la siembra se deben cumplir determinadas condiciones:

Esterilizacin de los instrumentos de trabajo y de los medios de cultivo. Los medios de cultivo se esterilizan con calor hmedo en la autoclave y los materiales de vidrio se esterilizan con calor seco en el horno Pasteur. En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso. Que el inculo no se contamine, modifique o destruya para lo cual se utiliza calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, la pipeta y dems elementos antes y despus de su utilizacin. Esterilizacin del rea de trabajo para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Se utilizan la cmara de flujo laminar. Si no se dispone de ella, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semisteril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente. Siembra de medio slido a medio lquido Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y djela enfriar Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tpelo y djelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en el cual va a colocar la muestra, destpelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero despus de usarla. Incube los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente.

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Siembra de medio lquido a slido Se procede en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja de Petri puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra de medio slido a slido Se realiza de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla Realice una estra que atraviese el centro del agar. Luego realice estras en ngulo recto con respecto a la estra inicial. Voltee el agar en ngulo de 90 grados y realice estra hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estras y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas. Siembra por estras

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap309.htm

Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto numero uno, realice estras hasta el numero 2. Esterilice el asa, tome las dos ultimas estras y extindalas

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hasta el numero 3, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 4 y as sucesivamente hasta llegar al numero 6. Siembra masiva Tome un hisopo estril e introdzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluacin del crecimiento en las placas de agar se hace a travs de la observacin de colonias en la superficie. Siembra en agar inclinado Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de colonias en la superficie. Siembra en profundidad Marque la caja de petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas. Entregue al coordinador del laboratorio los cultivos bacterianos usados Tcnica del microcultivo

Esta tcnica se utiliza en micologa para el estudio de estructuras de los hongos (conidias, ascas, hifas, conidioforos, entre otras) que son muy frgiles y se deterioran fcilmente, al ser obtenidas para su observacin a partir de un macrocultivo comn y corriente.

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La tcnica consiste en colocar en el interior de una caja de Petri estril unas varillas de vidrio estriles y sobre ellas una lmina portaobjetos. Las varillas evitan que la lmina portaobjetos haga contacto con el fondo de la caja de Petri. Luego sobre el portaobjetos se coloca el medio de cultivo slido. Con un asa previamente flameada se siembra el hongo a analizar en el medio de cultivo, despus se cubre con la laminilla cubreobjetos, y se adiciona en el fondo de la caja de Petri agua destilada estril para mantener una atmsfera hmeda. Despus se procede a la incubacin a la temperatura requerida y por el tiempo necesario. Luego de incubado se retira con cuidado la laminilla cubreobjetos teniendo en cuenta que en ella se encuentra adherido el hongo. Se monta la laminilla con el hongo a estudiar sobre un portaobjeto y se procede a su observacin en fresco, o se prepara un frotis con una preparacin permanente. Observacin de microorganismos La observacin microscpica se constituye en una tcnica de gran importancia para el estudio de los microorganismos ya que permite conocer algunas de sus caractersticas, como son: forma, disposicin o agrupacin, presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, entre otras. Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los microorganismos, de las cuales en el laboratorio son fciles de realizar las siguientes: 1. Observacin de microorganismos vivos en fresco con fondo oscuro gota pendiente 2. Observacin de microorganismos muertos Tcnica de fijacin Tincin simple Tincin diferencial Tincin especial

3. Tcnica de Microcultivo 1. Preparacin de Frotis y observacin de microorganismos vivos Observacin en fresco sin tincin. Este mtodo de examen permite observar el microorganismo vivo y conocer sus caractersticas, morfologa, color, tamao real, movimiento, evita las deformaciones de su morfologa producidas por que las tcnicas de coloracin y fijacin.

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Consiste en tomar con un asa previamente flameada una muestra del microorganismo a observar y colocarla en una gota de lquido o suspensin sobre un portaobjeto sobre el cual a la vez se coloca suavemente un cubreobjeto, luego se procede a la observacin microscpica. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica estril. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia entamoeba, huevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, Candida sp. etc.
http://sisbib.unmsm.edu. pe/BVRevistas/anales/v64_n4/ images_paradigmas2.htm

En la foto se observa el protozoo Blastocystis hominis causante de una enteroparasitosis en pacientes con compromiso inmunolgico.

Gota pendiente Se utiliza un portaobjeto con un rea de depresin (excavacin) en

el centro. En el borde de la excavacin se deposita una fina pelcula de vaselina; en la laminilla cubreobjetos se coloca una pequea gota de la suspensin que contiene los microorganismos, luego se coloca la laminilla invertida con la suspensin sobre la depresin de la lmina portaobjetos teniendo cuidado que no haga contacto con los bordes o el fondo de la excavacin. La vaselina impide la penetracin de corrientes de aire y permite la adhesin del cubreobjeto al portaobjeto. Observacin microscpica en fondo oscuro. Se utiliza para observar microorganismos vivos, en movimiento y sin teir, y para visualizar para el contorno de bacterias muy pequeas que no son posibles de observar en campo claro por su falta de contraste con el medio. Los microorganismos se ven intensamente iluminados sobre un fondo oscuro. Para este tipo de observacin se utiliza el microscopio ptico al que se le sustituye el condensador de Abb por un condensador de fondo oscuro que debe ubicarse muy cerca de la preparacin.
Enterobius vermicularis: huevos en fondo oscuro http://sisbib.unmsm.edu.pe/ BVRevistas/anales/v64_n4/ images_paradigmas2.htm

Se basa en el fenmeno de Tyndall, de reflexin luminosa. Se ilumina la preparacin en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. 97

2. Observacin de microorganismos muertos Preparaciones fijas La tcnica de fijacin permite coagular el protoplasma de las clulas antes de su coloracin. Se procede de manera similar a las preparaciones en fresco, pero en vez de utilizar agua se utiliza lactofenol, formaldehdo, cidos u otro producto qumico para fijar la preparacin. Posteriormente, si es necesario, se procede a sellar con esmalte los bordes del cubreobjeto y se observa al microscopio. Esta tcnica permite conservar por un largo tiempo las preparaciones en el laboratorio. El procedimiento es el siguiente: primeramente se procede a realizar un frotis o extendido que consiste en tomar con un asa previamente flameada una pequea muestra del cultivo de microorganismos y extenderlo sobre el portaobjetos con el fin de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Luego se procede a la fijacin por medios qumicos o fsicos. La fijacin por medio qumico se basa en poner en contacto el extendido con sustancias qumicas como alcohol metlico o ter. La fijacin por medio fsico consiste en exponer el extendido al aire libre o al calor. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme. Una vez extendida y fijada la muestra, se realiza la tincin que consiste en dejar actuar sobre ella colorantes de uso microbiolgico. El usar esta ltima tcnica tiene la ventaja que permite que las clulas bacterianas se observen ms claramente despus de teidas y adems, puede proporcionar informacin de propiedades qumicas de stas. Tcnicas de tincin: Fundamentos Adaptado de: http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html La tincin es una tcnica que utiliza colorantes para aumentar el contraste entre los microorganismos y el medio que los rodea. Se utiliza para diferenciar los tipos de clulas, los constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, ncleo, mitocondria, etc. Generalmente se realiza la fijacin del microorganismo antes de su coloracin para evitar cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que realmente son de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos son molculas cargadas positivamente y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, como muchas protenas. Esos 98

colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otros colorantes son sustancias liposolubles; este grupo se combina con los materiales lipdicos de la clula, usndose para revelar la localizacin de depsitos de grasa. Ejemplo el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que el colorante pueda actuar. Los mtodos de tincin deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tincin Simple Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactfenol). El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes encapsuladas Cryptococcus, sobre todo en lquido cefalorraqudeo (LCR). Los polisacridos capsulares Cryptococcus rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro neoformans alrededor de los microorganismos. tincin con tinta china. El azul de metileno es un buen colorante que acta rpidamente sobre todas las clulas bacterianas y no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. El azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. Mediante la tincin negativa las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). Su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas Examen microscpico de las muestras muy modificadas: Tincin Diferencial Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos seran la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen

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Tincin de GRAM La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes. Se utiliza para diferenciar la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos.). Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844.

Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano. Procedimiento para realizar la tincin de Gram El frotis fijado con calor se tie durante 1 min. con Cristal Violeta, se lava suavemente con agua para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas, estn teidas de azul o violeta oscuro. Luego se aplica durante 1 minuto una solucin de lugol (yodo-yoduro potsico). El ingrediente activo es aqu el I2; el yoduro potsico (KI) simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas Gram-positivas como las Gram-negativas se encuentran en la misma situacin. Se lava de nuevo con agua, se aplica una mezcla de alcohol etlico/acetona por partes iguales, el complejo I2-cristal violeta es soluble en esta mezcla motivo por el cual los microorganismos (Gram-positivos) no se decoloran, mientras que los (Gramnegativos) lo hacen. Se deja escurrir la mezcla y se cubre con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Los microorganismos Gram negativos toman la coloracin roja de la Safranina. Lavar y secar. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.

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Las clulas Gram-positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram-positivas son todava azules, pero las Gram-negativas son incoloras. Diferencias en la composicin de la pared celular de Gram positivos y Gram negativos Pared de las Bacterias Gram Positivas Pared de las Bacterias Gram Negativas

Otras tinciones de uso habitual Rodamina - Auramina

Mycobacterium tuberculosis http://www.geocities.com/ hmiguelito/diagn.htm Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramina es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de 101

Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomices (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles. El frotis se tie durante unos 5 min. con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg. con Azul de Metileno.

Tincin de esporas (WIRTZ-CONKLIN) Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters. Tcnicas de Recuento Bacteriano Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire, alimento, cultivos, entre otros, existen diferentes mtodos o tcnicas: Algunas tcnicas son directas y permiten un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las muertas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrnico, el recuento en placa, o el clculo del nmero ms probable (NMP). 102

Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las clulas como son la turbidez, el peso seco, o una actividad metablica. Recuento de colonias o recuento estndar en placa se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan despus de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el nmero de clulas aisladas o microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, tambin se utiliza para el conteo de esporas fngicas presentes en la muestra. La muestra a inocular debe ser homognea y no contener conglomerados de clulas. Despus de la incubacin cada microorganismo o clula viable formar una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el nmero de colonias permitir a su vez determinar el nmero de organismos viables en la muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad. Generalmente la muestra original se diluye para que el nmero de colonias desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y as permitir un ptimo crecimiento y facilitar la lectura. Cuando la muestra se diluye el clculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el factor de dilucin. Los resultados se expresan en colonias por ml. Los resultados tambin pueden expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el nmero relativo de microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de muestra. En el caso de alimentos el resultado se considera como un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento

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Recuento en placa dilucin de la muestra

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/ documen/uni_02/58/texthtml/cap804.htm

Equipo para conteo de colonias Para el recuento de colonias se emplean equipos que consiste en una pantalla iluminada la cual posee una gran lente de aumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales la caja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajo y al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamao del objeto..

Contador de Colonias Tambin existe un contador electrnico de colonias en el cual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego se presiona la varilla de cuenta y el nmero exacto de colonias se proyecta instantneamente en una pantalla digital 104

Conteo celular directo Recuento celular microscpico directo: Se basa en colocar un volumen determinado de clulas sin fijar y realizar el conteo utilizando microscopa de fase. Para ello se utiliza la cmara de recuento de Petroff-Hauser o de Neubauer consistente en un portaobjetos con una excavacin de 0.02 mm de profundidad en un rea de 1 milmetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25 cuadrados grandes los cuales a su vez se subdividen en 16 cuadrados de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400 celdillas.

www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index. php?module=Book&func=displayarticle&art_id=108

La muestra, se coloca en la excavacin del portaobjeto y se cubre con el cubreobjetos se deja reposar sobre la platina del microscopio durante unos minutos, y se procede a contar el nmero de clulas en varias celdillas (generalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas en esas 16 celdillas. El recuento celular se calcula: n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml. Es un mtodo muy rpido y sencillo pero no permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas muertas. Se utiliza en suspensiones concentradas Recuento de clulas bacterianas utilizando sistemas electrnicos del tipo Coulter Counter. El mtodo consiste en colocar en una cmara del contador un volumen determinado del cultivo (suspensin bacteriana) luego se hace pasar a travs un tubo capilar entre dos polos de una corriente elctrica a otra cmara. El poro un pequeo orificio de unos 15 m de dimetro forma parte de un circuito elctrico, de manera que cada vez que pasa una clula a travs del mismo, la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la clula es detectada electrnicamente en el contador. Turbidez Se basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las clulas en suspensin y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un espectrofotmetro que mide la cantidad de luz que transmite una solucin o un cultivo lquido de clulas microbianas. A mayor masa de clulas en un cultivo, mayor ser su turbidez, y menor la cantidad de luz que se transmitir de manera que la lectura en el 105

espectrofotmetro ser mayor. Se utiliza en cultivos densos. Permite medir crecimiento de poblaciones. Para medir la masa o el nmero de clulas con espectrofotmetro, se debe preparar una curva patrn, o grfica en la que relacionan las medidas del espectrofotmetro con la masa celular o el nmero clulas en un cultivo de un determinado y se expresa en unidades de absorbancia. Clculo del nmero ms probable (NMP), Se tratar aplicado a microbiologa del agua. Recuento de Coliformes totales con filtros de membrana Tema aplicado a microbiologa del agua

el un se de

UNIDAD 3 AMBIENTE DE DESARROLLO MICROBIOLGICO

Capitulo 9 Microbiologa del agua Introduccin La microbiologa del agua estudia los microorganismos y las transformaciones que estos producen en las aguas donde habitan: aguas naturales, lagos, ros, estuarios o mar. En la naturaleza el agua pura casi no existe, durante su ciclo biolgico el agua absorbe gases, materiales orgnicos e inorgnicos e incluso sustancias radioactivas. La incorporacin de materias extraas como microorganismos, productos qumicos, residuos industriales o aguas residuales deterioran la calidad del agua. Los microorganismos son transportados al agua por aire (lluvias), suelo, desechos orgnicos y su tipo vara de acuerdo con los factores fsicos y qumicos existentes en el agua: temperatura, luz, pH y nutrientes. Las caractersticas propias de cada fuente de agua permiten su clasificacin: agua potable, agua servida, agua residual industrial, aguas negras y determinan su uso: para consumo, riego, refrigeracin, produccin de vapor, como disolvente. Objetivos o Describir los mtodos para toma de muestras de agua con el fin de realizar las pruebas presuntivas y confirmativas de la presencia de microorganismos contaminantes en el agua. o Describir las tcnicas de prueba, el uso de equipos y medios y las formas de interpretacin de resultados como base para establecer tratamientos al agua de bebida y a las aguas residuales. o Distinguir las enfermedades de origen microbiano trasmitidas por el agua, su propagacin y la forma de prevenirlas.

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o Conocer la legislacin vigente referente sobre criterios y normas para la calidad microbiolgica del agua Leccin 1 Calidad microbiolgica del agua Leccin 2 Contaminacin del agua Leccin 3 Toma de Muestras Conclusin: Los seres vivos en su mayor proporcin estn constituidos por agua y por tal razn la calidad biolgica del agua en el planeta, es de importancia estratgica para el futuro de toda la biodiversidad. En este aspecto, la accin microbiolgica en el agua es un factor determinante del equilibrio entre ambientes de salud y ambientes de enfermedad. De aqu nace la importancia de estudiar y aplicar mtodos para controlar la calidad microbiolgica del agua. Microorganismos y calidad del agua: Cianobacterias El agua es un sistema vivo y dinmico en cuya superficie se encuentran una serie de microorganismos no patgenos que por el contrario permiten el desarrollo de los ciclos biolgicos y qumicos y el mantenimiento del equilibrio biolgico. La presencia de los microorganismos en concentraciones y condiciones normales en las fuentes de agua es beneficiosa; pero cuando se incrementa su concentracin se altera la calidad del agua dificultando el tratamiento de esta y su uso. Los microorganismos que en forma normal se encuentran en aguas superficiales son los siguientes: Cianobacterias: pueden causar efectos txicos si su biomasa se incrementa por el efecto llamado floracin, producido por un aumento de nutrientes como N y P aportados por el vertido de aguas residuales, de aguas provenientes de reas fertilizadas o de ganaderas. Durante la floracin se producen cianotoxinas que afectan al sistema nervioso y digestivo adems de provocar efectos nocivos sobre mucosas y piel. La cianobacteria Oscillatoria causa problemas de corrosin en los tubos de acero. Sin embargo otras cianobacterias como la Spirulina son utilizadas en el biotratamiento de aguas residuales con el fin de lograr la biorremocin o biabsorcin de metales pesados como el Bario, Cadmio. Microalgas fotosintticas o productores primarios: Cuando se incrementan los nutrientes se produce un aumento anormal de algas con la consecuente eutrofizacin de la fuente de agua. El exceso de algas verdes (Chlorophytas) causa alteraciones en el color del agua tornndose verde y con olor y sabor desagradables. Por ejemplo el incremento de Scenedesmus originan un olor a pescado. Microalgas diatomeas, Son unicelulares o coloniales, de plastos marrones o amarillos. Las clulas se encuentran impregnadas en slice formando valvas que suelen situarse a modo de caja, y que pueden presentar una ornamentacin caracterstica de cada especie, el aumento de su concentracin pueden causar obstruccin de los filtros. Bacterias Pseudomona aeruginosa se utiliza como indicador de la calidad del agua, su presencia en aguas potables se constituye en un riesgo para la salud del hombre y los 107

animales ya que pueden ocasionar enfermedades a personas cuyos mecanismos de defensa esten disminudos. Bacillus como Serratia marcescens una bacteria de las denominadas oportunistas porque normalmente no es patgena, pero pueden causar enfermedades en personas con ciertas deficiencias orgnicas que facilitan la infeccin Coliformes como Escherichia coli , Streptococcus faecalis, Clostridium perfringens son habitantes normales del tracto digestivo de animales y del hombre y se los considera como indicadores de la calidad del agua Clostridium spp indicadores de contaminacin de alto riesgo del agua, son anaerobios sulfito-reductores, su representante ms caracterstico es Clostridium perfringens su presencia en las aguas naturales produce malos olores y, con mucha frecuencia, ennegrecimiento del producto cuando ste tiene hierro, formando un precipitado oscuro de sulfuro de hierro (Merck, 2000). Los Clostridium adems de las aguas superficiales pueden provenir de fuentes ambientales como suelo, sedimentos marinos, vegetacin en descomposicin, heridas infectadas de hombre y animales, alimentos, La mayor parte de bacterias que se encuentran en el agua son beneficiosas permitiendo transformaciones orgnicas y la autodepuracin de los cuerpos de agua. Sin embargo existe otro grupo de bacterias que son patgenas y pueden causar enfermedades graves en el hombre y en los animales. Protozoos: La mayora son beneficiosos, pues contribuyen a preservar el equilibrio de los ecosistemas acuticos al formar parte del zooplancton; sin embargo su incremento disminuye el oxgeno disuelto, altera el pH y el olor del agua. Otros protozoarios presentes en el agua son parsitos y pueden causar enfermedades en el hombre y en los animales como es el caso de la Ameba, de la Giardia lamblia y Cryptosporidium Contaminacin del Agua por microorganismos y transmisin de enfermedades El agua se puede contaminar por fenmenos naturales y por la accin del hombre principalmente sobre las fuentes de agua superficiales. Una de las principales causas de contaminacin del agua por microorganismos es el vertimiento de aguas residuales sin ningn tratamiento o mal tratadas, por desechos industriales, por aguas provenientes de plantas de procesamiento de carnes, por aguas de desecho de ganadera, por heces de humanos y de animales. Entre los microorganismos presentes en el agua contaminada y causantes de enfermedades se pueden citar los siguientes: o Bacterias: Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni. o Virus: Enterovirus, rotavirus, El rotavirus es un virus ARN, tiene como husped o reservorio al hombre, primales, caballo, cerdo, perro, gato, conejo, ratn, vaca, pjaros, etc. y ocasiona gastroenteritis viral en el hombre. El adenovirus es un virus 108

ADN, se transmite mediante el contacto directo, por transmisin fecal-oral, y ocasionalmente mediante transmisin por agua, causa enfermedad respiratoria; sin embargo, tambin pueden causar otras enfermedades como gastroenteritis, conjuntivitis, cistitis, y sarpullidos, dependiendo del serotipo de adenovirus que cause la infeccin. o Protozoos: Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba histolytica, Balantidium coli. A continuacin se sealan las enfermedades microorganismos patgenos del agua. ms frecuentes trasmitidas por

Tabla: Principales enfermedades causadas por microorganismos del agua sus sntomas y la fuente de contaminacin Enfermedad Fiebre tifoidea Microorganismo Salmonela typhi Sntoma Fuente de Contaminacin

Fiebre, dolor de cabeza, Agua y alimentos molestia general, prdida contaminados del apetito, tos seca. Los latidos del corazn se hacen lentos, aumento del bazo Algunas personas desarrollan manchas rosadas en el tronco del cuerpo. Diarrea, clicos Agua contaminada, productos de granja, aves contaminadas por portadores infectados. Alimentos contaminados Agua de mar o ro contaminada y alimentos provenientes de estas fuentes Agua o alimentos contaminados

Disentera bacilar

Shigella

Clera

Vibrio cholerae Produce txinas Entamoeba histolytica Virus de la hepatitis A Giardia lamblia

Diarrea, deshidratacin, show y hasta la muerte.

Disentera amebiana Hepatitis A Giardiasis

Diarrea, dolor abdominal

Nauseas , vmito, anorexia, Aguas negras fiebre, ictericia Mala higiene Diarrea, eruptos, flatulencia Agua no tratada (gases) y clicos intestinales Diarrea lquida, malestar estomacal o fiebre leve. Agua contaminada

Criptosporidiosis Cryptosporidium

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Anlisis bacteriolgico del agua potable Para prevenir la transmisin de microorganismos patgenos se debe: Purificar el agua de consumo (Potabilizacin) Tratar las aguas residuales (Depuracin) Realizar control microbiolgico de las aguas de consumo

Los controles microbiolgicos rutinarios para determinar la potabilidad del agua (agua exenta de microorganismos patgenos y sustancias qumicas peligrosas para la salud), se basan en la bsqueda de microorganismos indicadores cuya presencia nos aporte informacin sobre la posibilidad de encontrar microorganismos patgenos. Los microorganismos indicadores son microorganismos que generalmente se encuentran en la materia fecal del hombre y los animales, su presencia en el agua es una evidencia de que el agua est contaminada con materia fecal de humanos u otros animales de sangre caliente y por consiguiente con el microorganismo patgeno. Entre los microorganismos indicadores de la calidad del agua se encuentran los coliformes totales. Del grupo coliforme forman parte los coliformes fecales como Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, entre otros. El microorganismo utilizado como indicador es Escherichia coli y su deteccin se puede hacer mediante pruebas sencillas como: cultivo en caldo lactosado y determinacin del nmero ms probable (NMP) de coliformes totales y fecales o mediante filtracin en membrana usando medios selectivos y diferenciales . Toma de la Muestra
http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/es/ sistemas/microacua/Demo2/toma_muestra/toma_muestras.html

La muestra debe ser recogida en condiciones de esterilidad, el recipiente debe ser plstico o de vidrio, estril y de boca ancha. Los frascos ms adecuados son los de vidrio neutro con tapn esmerilado o roscado, muy limpios y esterilizados en autoclave a 120C durante treinta minutos o en horno de Pasteur a 180C durante dos horas. Tambin pueden utilizarse frascos de material macromolecular con tapn roscado, esterilizados mediante etileno xido, radiaciones gamma u otros sistemas adecuados. El tapn y el cuello del frasco se protegern con una cubierta de papel, papel de aluminio u otro similar. El volumen a tomar debe ser el adecuado para que en una sola muestra se puedan efectuar simultneamente la totalidad de los anlisis microbiolgicos y estar en funcin de la tcnica analtica a utilizar. Para los anlisis que utilicen la tcnica del NMP se tomarn, como mnimo, 250 ml y para los que empleen la de membranas filtrantes, como mnimo, 500 ml. La muestra debe ser representativa en relacin con su lugar de procedencia. Las muestras se cerrarn convenientemente de formas que quede garantizada su inviolabilidad. Rotulada con datos como: lugar de procedencia, fecha de recoleccin, hora, temperatura, direccin, presencia cercana de contaminantes: basureros , salidas de aguas negras, establos vertederos, mtodos de purificacin si 110

los hay, nombre del recolector Una vez tomada la muestra se acondicionar de modo que quede en la oscuridad, debiendo remitirse cuanto antes al laboratorio. Es conveniente iniciar el anlisis antes de que transcurran seis horas desde la toma de la muestra. Sin embargo, podr demorarse su anlisis hasta veinticuatro horas cuando haya sido conservada en refrigeracin a 4C (2C). De Grifo Una vez retirados filtros u otros accesorios se proceder a una cuidadosa limpieza con agua o alcohol. Con el grifo cerrado se flamear el extremo del mismo, mediante la llama obtenida con un poco de algodn empapado de alcohol y sostenido con unas pinzas o bien una lmpara de soldar. Se abrir el grifo para que el agua fluya abundantemente y se renueve la contenida en la tubera que la alimenta. Se destapar el frasco esterilizado sin tocar la boca del mismo ni el interior del tapn. Todos los movimientos debern realizarse sin interrupciones, al abrigo de corrientes de aire y con las mximas precauciones de asepsia. De pozos y depsitos Si se dispone de bomba de captacin se opera como se ha indicado en el caso del grifo. Si no existe sistema de bombeo, no es posible obtener una muestra representativa. Con esta salvedad se introducir en la masa de agua el frasco de muestreo o un cubo lo ms limpio posible, sostenidos con una cuerda y tomando la muestra tras haber agitado la superficie del agua con el mismo recipiente. Tambin podrn utilizarse aparatos especiales lastrados que permiten introducir el frasco esterilizado y destaparlo a la profundidad deseada. En estos casos debern utilizarse frascos con tapn a presin. Lagos, ros y lagunas En ros o cursos de agua ser preciso considerar diversos factores, tales como: profundidad, caudal, distancia a la orilla, etc. La muestra se tomar lo ms lejos posible de la orilla, procurando no remover el fondo y evitando los remansos o zonas de estancamiento. Para tomar una muestra del agua de un lago o de un ro se sujetar el frasco por el fondo en posicin invertida, sumergindolo completamente y dndole la vuelta en sentido contrario a la corriente (ro) o desplazndolo horizontalmente en la direccin de la boca del frasco (lago). En manantiales naturales, o fuentes de caudal continuo, sin dispositivos de intermitencia, se tomar la muestra directamente sin adoptar medidas especiales. Prueba del nmero ms probable (NMP) para recuento de coliformes totales http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/es/index_online.htm La tcnica se basa en la determinacin del nmero de Coliformes mediante siembra de distintos volmenes del agua a analizar en series de tubos con caldo lactosado y resiembra en medios de cultivo selectivos incubando a temperaturas adecuadas. El procedimiento comprende las pruebas: 1. presuntiva, de confirmacin de coliformes totales y 2. de confirmacin de Coliformes fecales. Esta prueba se utiliza en muestras con baja densidad de microorganismos.

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Prueba presuntiva para Coliformes totales En una gradilla se colocan 9 tubos (tres series de tres tubos) con caldo verde bilis brillante simple, con su respectiva campana de Durhan. Los tubos se marcan con las iniciales del grupo, el agua tratada o no tratada y la dilucin correspondiente (100, 101, 10-2). En la primera serie de tubos se distribuye diez ml de medio de cultivo en cada uno de los tubos y se siembra con una pipeta estril 10 ml de la muestra de agua agitada, marcar 100 En la segunda serie se siembra en 10 ml de medio de cultivo 1 ml de la muestra de agua, marcar 10-1 En la tercera se siembra en 10 ml de medio de cultivo, 0,1 ml de la muestra de agua, marcar 10-2 Se coloca en cada tubo una campana Durham para recoger el gas producido y al medio de cultivo se le habr aadido un indicador cido-base. Homogeneizar los tubos sembrados. Incubar a 37C durante 48 h.

Lectura e interpretacin Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observa enturbiamiento, acidez detectada por el indicador colocado en el medio que vira a color amarillo y por la aparicin de gas en la campana de Durhan, independientemente de su cantidad.

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http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/es/index_online.htm Demo de la universidad de Salamanca

Los Coliformes son enterobacterias lactosa positiva, es decir, son capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C. Se cuentan los tubos positivos y se consulta la tabla del NMP. Los resultados se presentan como ufc/100 ml de muestra (NMP) La ausencia del gas al cabo de 48 h se considera como prueba negativa.

Prueba confirmativa de Coliformes totales Se resiembran en placa de Petri con medio Agar EMB solidificado de los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva 0,1 ml de medio lquido. El EMB contiene eosina y azul de metileno que inhiben parcialmente el crecimiento de los microorganismos Gram negativos, adems la combinacin de azul de metileno y eosina permitirn diferenciar los microorganismos lactosa positiva de los negativos. Luego se incuban en estufa a 37C las placas invertidas durante 48 horas. Lectura e interpretacin de resultados

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http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/es/index_online.htm Demo de la universidad de Salamanca Sobre este medio las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias caractersticas opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta oscuro con o sin reflejo metlico. Las colonias no fermentadoras de la lactosa aparecern como colonias incoloras Para el clculo del NMP de Coliformes totales se contabilizarn como positivos aquellos tubos de la serie elegida que hayan dado una prueba de confirmacin positiva Prueba confirmativa para coliformes fecales Es un procedimiento mediante el cual una reaccin negativa excluye la presencia de coliformes fecales, mientras que una reaccin positiva indica su presencia inequvoca. Deben someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva. Esta prueba debe llevarse a cabo simultneamente a la de confirmacin de coliformes totales.

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http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/ es/index_online.htm

Se debe resembrar cada tubo positivo de la presuntiva en medio EC mediante un asa o dos gotas de pipeta Pasteur. Llevar a estufa o bao mara antes de transcurrir 30 minutos. Incubar a 44C durante 24 h. Lectura e interpretacin de resultados

Si se observa crecimiento bacteriano con produccin de gas a las 24 h o antes, la presencia de bacterias coliformes fecales se considerar confirmada. Para el clculo del NMP de coliformes fecales se contabilizarn como positivos aquellos tubos de la serie que hayan dado prueba de confirmacin positiva.

Recuento de coliformes totales con filtros de membrana

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Fundamentacin Una de las ventajas del mtodo de filtracin a travs de membrana es la prontitud con que pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden llevar a cabo rpidamente acciones correctivas y operar en la planta de agua de nuevo en forma normal. Esta tcnica puede aplicarse en el anlisis de casi todos los tipos de agua, tambin se utiliza en el anlisis de leche y otros alimentos lquidos. El nmero de coliformes totales presentes en el agua se determina mediante la filtracin de volmenes especficos de la muestra a travs de filtros de membrana con una estructura microporosa precisa, que permite retener los coliformes totales y otras clases de bacterias presentes en la muestra. Despus se incuban las membranas vueltas hacia arriba en un medio selectivo. Equipo de filtracin

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El aparato de filtracin consiste de un portafiltros sostenido por un soporte de goma o caucho y que se ajusta a una base donde puede fijarse un embudo graduado. El portafiltros sostiene el filtro de membrana de 0,45 m de tamao de poro. El portafiltros se coloca encima de un soporte de filtracin bien sea nico o colector mltiple (rampas de filtracin para varias muestras a la vez) conectado a un sistema de vaco. Volumen de agua a analizar El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de orientacin:

Tipos de agua Potable de consumo pblico Envasadas

Coliformes totales 100 ml 250 ml

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Manantiales Lagos, depsitos Acometidas De playas De ros Residuales cloradas Residuales sin tratar

15; 60; 100 ml 4; 15; 60; 100 ml 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml 0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente aadindolas al embudo de filtracin. Para muestras entre 1 y 30 ml, se aaden primero al embudo 20-30 ml de solucin taponada estril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar. Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solucin tamponada Preparacin de diluciones

Para realizar una dilucin 1/10 (10-1), se pipetea aspticamente 1 ml de muestra en un tubo con 9 ml de solucin tamponada estril y se agita. Para realizar una dilucin 1/100 (10-2), se pipetea 1 ml de la dilucin 1/10 en otro tubo con 9 ml de solucin tamponada estril y se agita.

Muestra Diluyente Dilucin + = 1 ml 9 ml 1/10 (10-1)

Dilucin Dilucin Diluyente 1/100 (101/10 (10- + = 9 ml 2) 1)

As sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del

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grado de contaminacin esperado de la muestra. Medio de cultivo selectivo para recuento de Coliformes Totales Caldo Endo, MF Caldo Endo, MF - Composicin Peptona de carne Extracto de levadura Lactosa Cloruro sdico Fosfato potsico Lauril sulfato sdico Desoxicolato sdico Sulfito sdico Fuscina bsica Agua destilada pH: 7,2 aproximadamente a 25 C Este es un medio para el aislamiento selectivo de los Coliformes totales. El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la frmula del medio permite crecer a los Coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de bacterias acompaantes. Las colonias lactosa positivo se colorean de rojo por la liberacin de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de E. coli y de los Coliformes muestran generalmente un brillo metlico. Se utiliza este medio para la identificacin y recuento de Coliformes en agua, leche y otros lquidos mediante filtracin sobre membrana y esta incluido en las recomendaciones de la APHA "American Water Works Association and Water Pollution Control Federation: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2004 ". Procedimiento Se deposita aproximadamente 2 ml del Medio lquido selectivo Endo-MF en cada caja de cultivo la cual lleva una almohadilla absorbente. 10,0 g 1,5 g 12,5 g 5,0 g 5,75 g 0,05 g 0,10 g 2,10 g 1,05 g 1L

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Se desenvuelve el filtro de membrana de la envoltura con la que se ha esterilizado. Se separa el embudo de la base del filtro. Se coloca la membrana filtrante de 0,45 m de tamao de poro sobre el portafiltros de las base del mismo.

El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta plana o guantes de goma para no lesionarlas. Se coloca el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y que esta quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situada entre el embudo y la base-soporte del filtro.

Se Filtra 100 mL de la muestra de agua a travs del filtro. Poner en marcha el sistema de vaco. Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vaco y separar el embudo de la base del filtro. Se retira con pinzas estriles o flameadas la membrana filtrante.

Se coloca la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el caldo Endo, de forma progresiva para evitar que queden burbujas entre la membrana y el medio y que quede asegurado el contacto entre la membrana y el medio. Se coloca la tapa de la caja de Petri, invertir la placa e incubar en estufa a 37C durante 24 horas.

En este medio todos los coliformes crecen formando colonias de color rojo oscuro con el caracterstico brillo metlico de Escherichia coli de color verde-azulado aunque en los gneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter no es tan intenso como en Escherichia y puede pasar desapercibido. 120

Expresin de los resultados Los resultados se expresan en UFC/100 mL.

Cuando se obtienen recuentos de ms de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar resultados errneos debido a la superpoblacin, ya que lo que aparece como una colonia puede ser originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. En estos casos debemos volver a muestrear el agua y analizar muestras ms diluidas. Por otra parte, un nmero de colonias inferior a 10 20 por membrana es poco fiable como base para establecer cuantitativamente la concentracin bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la obtencin de 2 colonias a partir del anlisis de 1 ml de un agua, no nos permite afirmar que esa agua contena 200 colonias en 100 ml. En estos casos conviene repetir el anlisis filtrando un volumen de muestra mayor. Cuando el recuento de colonias est entre 20-200, los resultados se expresan de la siguiente manera: Si hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento de colonias = UFC / volumen de muestra filtrada. Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento de colonias x Factor de dilucin = UFC/ volumen de muestra filtrada. Ejercicios de entrenamiento con respuesta para verificar los logros en la interpretacin de resultados

Entrenamiento en la interpretacin de los resultados y los clculos en recuento de colonias de Colifomes totales http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo2/i mag/coliT20.jpg Los siguientes ejemplos del supuesto prctico, le servirn de entrenamiento para la interpretacin de resultados. Para comprobar su correcta interpretacin haga clic en comprobar respuesta.

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En cada muestra, interprete la fotografa de la caja de Petri con muestras de diferentes fuentes de agua filtrada. Conteste a la pregunta, teniendo en cuenta el volumen de agua filtrado, y el nmero de las colonias . Ejemplo #1 Agua de una fuente 100 mL filtrados El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) 2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema c) 20 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema rta d) 200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta

Ejemplo #2 Agua embotellada 250 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c) 4 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema, para cuantificar, repetir el anlisis filtrando un volumen mayor d) 4 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema, para cuantificar, repetir el anlisis filtrando un volumen mayor e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c) 2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 2 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta Ejemplo #3 Agua embotellada 250 mL filtrados

Ejemplo # 4 Agua de piscina 100 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c) 15 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 15 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta

En tres muestras de agua, se han filtrado diferentes cantidades de agua. En cada muestra, interprete la fotografia de la placa y conteste a la pregunta, teniendo en cuenta el volumen de agua filtrado, y el nmero y tipicidad de las colonias Muestra #1 Agua de una fuente 100 mL filtrados El resultado del anlisis de esta muestra es de : a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) 12 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema c) 120 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 1200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta

Muestra #2 Agua de balneario 10 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de: a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL b) 29 UFC de coliformes totales por 100 mL c) 290 UFC de coliformes totales por 100 mL d) 2.900 UFC de coliformes totales por 100 mL e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta El resultado del anlisis de esta muestra es de: a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b) 50 UFC de coliformes totales por 1.000 mL de agua problema c) 50 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 50 UFC de coliformes totales por 10 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua Fotografa de la placa Clic para comprobar respuesta

Muestra #3 Agua residual 10 mL filtrados

Entrenamiento en la interpretacin de los resultados y los clculos para recuento de colonias de coliformes totales http://universitas.usal.es/web/fundacion/universitas/es/sistemas/microacua/Demo2/i mag/coliT20.jpg Respuestas correctas para la interpretacin de fotografias de cajas de Petri con muestras de determinado volumen de diferentes fuentes de agua filtrada. 125

Ejemplo #1 Agua de una fuente 100 mL filtrados

El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) 2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema c) 20 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema (Respuesta correcta) d) 200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor

Ejemplo #2 Agua embotellada 250 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c) 4 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema, para cuantificar, repetir el anlisis filtrando un volumen mayor d) 4 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema, para cuantificar, repetir el anlisis filtrando un volumen mayor (Respuesta correcta) e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua.

Ejemplo #3 Agua embotellada 250 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema (Respuesta correcta) c) 2 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 2 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua

Ejemplo # 4 Agua de piscina 100 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) ausencia de UFC de coliformes totales en 250 mL de agua problema c) 15 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 15 UFC de coliformes totales por 250 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua ( Respuesta correcta)

En tres muestras de agua, se han filtrado diferentes cantidades de agua. En cada muestra, interprete la fotografia de la placa y conteste a la pregunta, teniendo en cuenta el volumen de agua filtrado, y el nmero y tipicidad de las colonias Muestra #1 Agua de una fuente 100 mL filtrados

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El resultado del anlisis de esta muestra es de : a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL de agua problema b) 12 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema (Respuesta correcta) c) 120 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 1200 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua

Muestra #2 Agua de balneario 10 mL filtrados El resultado del anlisis de esta muestra es de: a) ausencia de UFC de coliformes totales en 100 mL b) 29 UFC de coliformes totales por 100 mL c) 290 UFC de coliformes totales por 100 mL (respuesta correcta) d) 2.900 UFC de coliformes totales por 100 mL e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua

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Muestra #3 Agua residual 10 mL filtrados El resultado del anlisis de esta muestra es de: a) ausencia de UFC de coliformes totales en 1.000 mL de agua problema b) 50 UFC de coliformes totales por 1.000 mL de agua problema c) 50 UFC de coliformes totales por 100 mL de agua problema d) 50 UFC de coliformes totales por 10 mL de agua problema e) ms de 100 colonias. Repetir la filtracin con menor volumen de agua ( Respuesta correcta)

Tratamiento

de

aguas

de

bebida

El agua proveniente de arroyos y ros consta de tres tipos principales de impurezas: fsicas, qumicas y biolgicas por lo cual requiere de un tratamiento previo de purificacin antes de ser liberada para el consumo o para su utilizacin en actividades domsticas, industriales o agrcolas. Mediante la purificacin se logra eliminar las bacterias patgenas y los sedimentos que afectaran el sabor, color y olor del agua . El tratamiento o purificacin del agua puede subdividirse en cuatro etapas: clarificacin, desinfeccin, acondicionamiento qumico y acondicionamiento organolptico.

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La etapa de clarificacin consiste en la eliminacin de partculas finas y se subdivide en coagulacin, floculacin y sedimentacin y/o filtracin. El agua contiene slidos totales que son impurezas que se pueden clasificar como partculas no filtrables o en suspensin, filtrables o disueltas y una tercera posibilidad es el caso intermedio que corresponde a los coloides. Un material coloidal puede tardar 755 das en sedimentar por tanto es importante cambiar esta condicin. Al agregar un coagulante al agua las partculas coloidales se desestabilizan y forman un material insoluble- etapa de coagulacin-. Los coagulantes ms utilizados son el sulfato ferroso y el sulfato alumnico. Despus el agua pasa por el proceso de floculacin llamado floculante para producir la aglomeracin de pequeas masas llamadas flocs que tienen un peso pueden precipitar. Gran nmero de bacterias y virus que es la adicin de otro reactivo las partculas desestabilizadas en especfico superior al del agua y se eliminan con este tratamiento.

Despus del tratamiento de floculacin el agua se pasa a travs de filtros de arena o tierra de diatomeas para realizar el proceso de filtracin. Los filtros de arena son cada vez ms apretados por el empleo de arenas ms finas, capaces de retener todas las partculas que se encuentran en suspensin. Mediante este tratamiento son eliminados los quistes de protozoos como la Giardia lamblia. La arena de estos filtros, debe removerse y lavarse a menudo, debido a la cantidad de material que retiene. En algunos pases se complementa este proceso con filtros de carbn activo que elimina adems de la materia orgnica algunos contaminantes disueltos. El agua, una vez que ha sido filtrada, es tratada con sustancias bactericidas; la ms usada es el hipoclorito de sodio, que destruye las bacterias y el cloro libre luego desaparece. En muchos pases se usa uno u otro sistema, es decir, el filtrado por arena o el clorado, pero la combinacin de ambos es lo ideal. La cloracin puede sustituirse por ozono. Tratamiento de aguas residuales

Se denominan aguas residuales a las procedentes de hogares o de la industria que se recogen y se transportan por el sistema de alcantarillado (tuberas o tneles). El muchos pases el agua lluvia entra en las alcantarillas y se une al las aguas residuales lo cual provoca mayores problemas de contaminacin porque acelera la distribucin de aguas negras a lugares no previstos para ello. Los contaminantes de las aguas residuales son normalmente una mezcla compleja de compuestos orgnicos e inorgnicos: excretas, residuos domsticos, gran nmero de organismos vivos que son los que mantienen la actividad biolgica, produciendo fermentaciones y descomposicin y degradacin de la materia orgnica e inorgnica. Entre los principales Mohos: microorganismos Mucor, de aguas residuales se encuentran: etc. 132

Hongos:

Oidium,

Aspergilus,

Penicillium,

Bacterias parsitas: son las que han tenido como husped al hombre o a los animales; suelen ser patgenas y producir graves enfermedades (tifus, clera, disentera, etc.). Bacterias saprfitas Son las que se nutren de los slidos orgnicos residuales y provocan descomposiciones fundamentales en los procesos de depuracin. Virus su accin nociva como agentes productores de enfermedades - Adenovirus. Enterovirus. Poliovirus. Echovirus. Coxsackievirus.- Hepatitis A. - Reovirus.- Rotavirus. Protozoarios. Amibas, Paramecium, Colpidium, Vorticela Metazoarios. El uso de aguas residuales no tratadas puede derivar en situaciones de riesgo, tanto para el medio ambiente como para las personas, cuando se incorporan al ciclo del agua. Tratamiento Primario La sedimentacin primaria que consiste en dejar el agua de un tanque en reposo, para que los slidos o sedimento que posee se separen y se dirijan al fondo. Mientras mayor sea el tiempo de reposo mayor ser el asentamiento y consecuentemente la turbidez ser menor, haciendo el agua ms transparente. El sedimento ms pesado o lodo que contiene materia orgnica y microorganismos se desagua del fondo del tanque con el fin de separar el sobrenadante que an contiene materia orgnica en descomposicin. El tratamiento primario elimina aproximadamente el 30% de la demanda biolgica de oxgeno (DBO) de las aguas residuales.

Tratamiento secundario El tratamiento secundario es biolgico y consiste en airear las aguas residuales o lodos mediante tanques de aireacin con el fin de permitir el crecimiento de microorganismos aerobios que oxidan la materia orgnica convirtindola en dixido de carbono y agua. El tratamiento secundario elimina hasta el 95% de la DBO. Despus se dejan sedimentar los lodos secundarios El sedimento obtenido se bombea a tanques de anaerobiosis para su fermentacin y obtencin de gas metano. Cuando las aguas residuales se depuran en las plantas de tratamiento, el producto residual es un lodo que puede ser usado como fertilizante (bajo ciertas condiciones) o ser depositado en vertederos. Tratamiento terciario

El tratamiento terciario emplea filtracin fsica y la precipitacin qumica para eliminar toda la DBO, nitrgeno y fsforo.

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Agua Potable DECRETO NMERO 475 DE 1998 (marzo 10) Por el cual se expiden normas tcnicas de calidad del agua potable. El Presidente de la Repblica de Colombia, en ejercicio de las facultades conferidas por el numeral 11 del artculo 189 de la Constitucin Poltica y, en desarrollo de las Leyes 09 de 1979 y 142 de 1994 Normas microbiolgicas Artculo 24. Los mtodos aceptados para anlisis microbiolgico del agua son los siguientes: Para Escherichia Coli: Filtracin por membrana y sustrato definido. Para Coliformes Totales: Filtracin por membrana y sustrato definido. Artculo 25. El agua para consumo humano debe cumplir con los siguientes valores admisibles desde el punto de vista microbiolgico: Tcnica Utilizada MICROORGANISMOS INDICADORES Coliformes totales Escherichia coli 0 UFC/100 0 microorganismos/100 centmetros cbicos centmetros cbicos 0 UFC/100 0 microorganismos/100 centmetros cbicos centmetros cbicos FILTRACIN MEMBRANA POR SUSTRATO DEFINIDO

Pargrafo primero. Los resultados de los anlisis microbiolgicos se deben reportar en las unidades de NMP/100 centmetros cbicos (nmero ms probable), si se utiliza la tcnica del nmero ms probable o la tcnica enzimtica de sustrato definido y en UFC/100 centmetros cbicos (unidades formadoras de colonia), si se utiliza la tcnica de filtracin por membrana. Pargrafo segundo. Se recomienda un valor mximo admisible de 100 Unidades Formadoras de Colonias (U.F.C.) por 100 centmetros cbicos (cm3), para microorganismos mesfilos, como prueba complementaria de la calidad del agua desde el punto de vista microbiolgico. Artculo 26. Ninguna muestra de agua potable debe contener E. coli en 100 cm3 de agua, independientemente del mtodo de anlisis utilizado.

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Artculo 27. El nmero de muestras para el control de la calidad del agua en anlisis microbiolgico que deben tomarse en la red de distribucin de todo Sistema de Suministro de Agua, deber corresponder a la poblacin servida, tal como se establece a continuacin: NMERO MNIMO INTERVALO MXIMO POBLACIN SERVIDA DE MUESTRAS MUESTRAS CONSECUTIVAS POR MES 25 a 1.000 1.001 a 2.500 2.501 a 3.300 3.301 a 4.100 4.101 a 5.800 5.801 a 7.600 7.6001 a 12.900 12.901 a 17.200 17.201 a 33.000 33.001 a 59.000 59.001 a 96.000 96.001a 220.000 220.001 a 320.000 320.001 a 450.000 450.001 a 600.000 600.001 a 780.000 780.001 a 970.000 970.001 a 1.230.000 1.230.001 a 1.520.000 1.520.001 a 1.850.000 1.850.001 a 2.270.000 2.270.001 a 3.020.000 3.020.001 a 3.960.000 3.960.001 ms 390 420 450 480 1 2 3 4 6 8 10 15 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 12 por da 13 por da 14 por da 15 por da 16 por da Mensual Quincena cada 10 das 1 semanal cada 5 das cada 4 das cada 3 das cada 2 das cada da 2 por da 3 por da 4 por da 5 por da 6 por da 7 por da 8 por da 9 por da 10 por da 11 por da ENTRE

Artculo 28. El nmero mnimo de muestras exigidas en el artculo anterior, deben ser analizadas considerando el intervalo estipulado entre muestras consecutivas. Las muestras adicionales que se realicen por incumplimiento de las normas de calidad microbiolgica, se consignarn en el libro o registro de control de calidad y sern tenidas en cuenta para evaluar la calidad del agua, por las personas encargadas de la prestacin del servicio pblico de acueducto.

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Artculo 29. Para los efectos del control de la calidad microbiolgica del agua potable en lo que se refiere a coliformes totales, las personas encargadas de la prestacin del servicio pblico de acueducto, obtendrn los porcentajes del total de los resultados de las muestras consignadas en el libro o registro de control de calidad; para este efecto los porcentajes se calcularn de la siguiente manera: % Aceptablidad = (Na x 100)/ Nt Na = Nmero de muestras Aceptables: Son todas aquellas muestras que cumplen con lo sealado en el artculo 25 del presente decreto. Nt = Nmero Total de muestras por mes: Es el total de muestras analizadas y registradas en el libro de control por mes. Pargrafo. Cuando el porcentaje de aceptabilidad se encuentra entre el 95% y 100%, se considera que el agua es apta para consumo humano; pero si dicho porcentaje es menor del 95% se considera que el agua no es apta para consumo humano. Captulo Introduccin El estudio microbiolgico del suelo se orienta, para fines prcticos, hacia la generacin de conocimiento que permita desarrollar la biotecnologa de microorganismos simbiticos y saprfitos importantes para controles en ecosistemas y en agroecosistemas por sus interacciones en la rizosfera. Entre los organismos simbiontes se destaca el Rhizobium en su interaccin con las leguminosas, as como los hongos que participan en la formacin de micorrizas arbusculares, las cuales mejoran la productividad de hortalizas y frutales y facilitan la revegetalizacin de ecosistemas deteriorados. En cuanto a los saprfitos, se estudian con mayor nfasis mundial, tanto hongos como rizobacterias, los cuales al interactuar con las micorrizas aseguran para las plantas, efectos nutricionales y de proteccin frente a condiciones de estrs biticas y abiticas. Leccin 1: Sostenibilidad microbiolgica del suelo Leccin 2: Ciclos biogeoqumicos Objetivos o Identificar las caractersticas y las funciones de los microorganismos en la rizosfera o Describir los ciclos biogeoqumicos con nfasis en el rol microbiano para su sostenibilidad, como base a su vez de la sostenibilidad productiva del suelo y de los agroecosistemas en general. 10 Microbiologa del suelo

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Conclusin: El anlisis aportado por este captulo permite comprender que la base de la biosfera es en realidad la dimensin oculta de la accin microbiana en la rizosfera. Sin esto no habra futuro para la produccin agrcola y por consiguiente para la humanidad

El futuro de la microbiologa del suelo Al respecto, es importante la reflexin del profesor Ral Zapata de la Universidad Nacional de Colombia, quien en su artculo: El futuro de la microbiologa del suelo (ver: http://personales.ya.com/casanchi/ref/divisoria01.htm), dice: Si pensamos en la gran cantidad de energa y en el desorden que se crea para producir un kilogramo de N en forma de rea y en la misma cantidad de N fijado por un microorganismo sin generar tanto desorden, vemos que el futuro de la humanidad para superar el caos ecosistmico, est en la microbiologa del suelo. En estudios comparativos entre agricultura qumica, con altos flujos de energa, y la agricultura que la pudiramos llamar biolgica, una agricultura de bajo flujo de energa, los costos de produccin son de un 66% menores en la segunda, con los mismos rendimientos por unidad de energa invertida en el proceso agrcola. Cuando se hace esta misma comparacin, a la luz de la termodinmica, la agricultura biolgica resulta ms eficiente que la agricultura qumica. Un campesino con un buey y un arado y la ayuda de microorganismos es capaz de producir 10 caloras por cada calora gastada. Un granjero de un pas desarrollado es capaz de producir 6000 caloras por cada calora de trabajo humano. Esta eficacia aparente queda completamente desmentida cuando se calcula la gran cantidad de energa invertida en: mover los implementos agrcolas, en la fabricacin de los abonos qumicos y pesticidas; y adems, aumenta la cantidad de desechos generados por la produccin de gases que irn a incrementar el efecto invernadero. Lgicamente las magnitudes de los flujos de energa en cada caso sern diferentes. Pero son situaciones a los que la sociedad deber habituarse.

Ciclo

del

nitrgeno

El nitrgeno (N) es indispensable para la sntesis de protenas y de cidos nucleicos de todos los seres vivos. A pesar de su abundancia en la atmsfera 78%, son muy pocos los organismos capaces de absorberlo directamente para utilizarlo en sus procesos vitales. Es as como el nitrgeno para ser absorbido debe ser fijado por las bacterias del suelo. Este proceso de fijacin consiste en la combinacin del N con otros elementos como el oxgeno, el carbono o el hidrgeno para formar compuestos. 137

La fijacin del Nitrgeno en la biosfera puede ocurrir por tres procesos: 1. mediante la energa contenida los relmpagos, la cual rompe las molculas de nitrgeno y permite que se combine con el oxgeno del aire, 2. a travs de reacciones qumicas entre el hidrgeno y el nitrgeno con la formacin de amoniaco (NH3), proceso utilizado en la produccin de fertilizantes qumicos.3. por accin de las bacterias nitrificantes y algunas cianobacterias capaces de fijar el nitrgeno atmosfrico. La fijacin puede ser no simbitica cuando las bacterias incorporan el nitrgeno atmosfrico en su protoplasma de manera que quede accesible para la planta, y simbitica cuando las bacterias deben establecer una relacin de simbiosis con la planta. La fijacin no simbitica se realiza por accin de microorganismos libres como las bacterias del gnero Clostridium y Azotobacter que fijan en el suelo el nitrgeno en forma de amonaco, proceso denominado amonificacin. Algunas cianobacterias fijan el nitrgeno en unas clulas especiales denominadas heterocistes, las cuales pasan luego el nitrgeno fijado a las dems clulas. Es asi como estas bacterias puedan sustituir al nitrgeno qumico (amoniaco, urea) a un menor costo, sin ningn tipo de reduccin en la produccin y sin los efectos indeseables que causan los fertilizantes qumicos como son el aumento de los niveles de nitratos y nitritos en el agua y la eutrofizacin de lagos y lagunas. Fijacin simbitica Rhizobium leguminosarum es una bacteria simbitica que se encuentra en unos ndulos que hay en las races de las leguminosas como el frijol , la arveja, el trebol, la alfalfa y el lupinus entre otros; Bradyrhizobium forma ndulos en tallos y raices de la soya. Esta bacterias combinan el nitrgeno atmosfrico con hidrgeno para formar sustancias esenciales para el crecimiento tanto de la bacteria como de la planta. La cantidad de nitrgeno fijado por simbiosis es mayor a la fijada por organismos libres. No obstante el nitrgeno fijado por microorganismos libres como las Cianobacterias alcanzan mayores rendimientos que el de las dems bacterias libres. Procesos en el ciclo del nitrgeno

Descomposicin: los animales obtienen nitrgeno al ingerir vegetales, en forma de protenas. En cada nivel trfico se libera al ambiente nitrgeno en forma de excreciones, que son utilizadas por los organismos descomponedores para realizar sus funciones vitales. Nitrificacin: Casi todo el amoniaco que llega al suelo es pasado a ion nitrato (NO3-) por la accin de bacterias. Esto ocurre primero por la intervencin de las bacterias del gnero Nitrosomonas, que oxidan el amoniaco a nitrito (NH3 a NO2-). Luego los nitritos son oxidados a nitratos (NO2- a NO3-) mediante bacterias del gnero Nitrobacter. El nitrato constituye la fuente principal de nitrgeno disponible en el suelo para las plantas superiores.

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Desnitrificacin: por accin de las bacterias desnitrificantes, como las del gnero Pseudomonas, el nitrato se transforma en nitrito y este en nitrgeno molecular, que vuelve a la atmsfera cerrndose as el ciclo. Sntesis de los procesos fundamentales en el ciclo del nitrgeno El nitrgeno atmosfrico es fijado mediante las bacterias simbiticas en los ndulos radiculares de las leguminosas, para que lo puedan absorber las plantas. Los residuos vegetales, componen la materia orgnica, que por accin microbiolgica se transforman en amonaco, y luego por accin de las bacterias Nitrosomonas el amoniaco (NH3) se oxida a nitritos (NO2) y las bacterias Nitrobacter a su vez transforman los nitritos en nitratos donde el nitrgeno vuelve a quedar disponible para las plantas. Esquema ciclo del nitrgeno

http://www.lenntech.com/espanol/ciclo-nitrogeno.htm

Ciclo del Adaptado de: http://www.lenntech.com/espanol/ciclo-nitrogeno.htm

carbono

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Un 18% de la materia orgnica viva est constituida por carbono, la capacidad de dichos tomos de unirse unos con otros proporciona la base de la diversidad molecular as como el tamao molecular. Por tanto el carbono es un elemento esencial en todos los seres vivientes. A parte de la materia orgnica, el carbono se combina con el oxgeno para formar monxido de carbono (CO), dixido de carbono (CO2), tambin forma sales como el carbonato de sodio (Na2CO3), carbonato clcico (en rocas carbonatadas, como calizas y estructuras de corales). Los organismos productores terrestres obtienen el dixido de carbono de la atmsfera durante el proceso de la fotosntesis para transformarlo en compuestos orgnicos como la glucosa, y los productores acuticos lo utilizan disuelto en el agua en forma de bicarbonato (HCO3-). Los consumidores se alimentan de las plantas, as el carbono pasa a formar parte de ellos, en forma de protenas, grasas, hidratos de carbono, etc. En el proceso de la respiracin aerbica, se utiliza la glucosa como combustible y es degradada, liberndose el carbono en forma de CO2 a la atmsfera. Por tanto en cada nivel trfico de la cadena alimentara, el carbono regresa a la atmsfera o al agua como resultado de la respiracin. Los desechos del metabolismo de las plantas y animales, as como los restos de organismos muertos, se descomponen por la accin de ciertos hongos y bacterias, durante dicho proceso de descomposicin tambin se desprende CO2. Las erupciones volcnicas son una fuente de carbono, durante dichos procesos el carbono de la corteza terrestre que forma parte de las rocas y minerales es liberado a la atmsfera. En capas profundas de la corteza continental as como en la corteza ocenica el carbono contribuye a la formacin de combustibles fsiles, como es el caso del petrleo. Este compuesto se ha formado por la acumulacin de restos de organismos que vivieron hace miles de aos Esquema ciclo del carbono

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http://www.lenntech.com/espanol/ciclo-nitrogeno.htm Ciclo del Fsforo El fsforo se encuentra en el suelo en forma insoluble, fijado en los minerales y por tanto no puede ser absorbido por las plantas. Las bacterias solubilizadoras de fosfato producen agentes disolventes como el cido carbnico, cidos inorgnicos como el sulfrico y el ntrico para volver solubles los fosfatos y as puedan ser utilizados por las plantas. Las bacteriras solubilizadoras de fosfato que se han aislado de distintos suelos pertenecen a los gneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Agrobacterium, Burkholderia, Achromobacter, Microccocus, Aerobacter, Flavobacterium y Erwinia (Nahas 1996; Kumar et al. 2001). La solubilizacin de distintas rocas fosfatadas y de otras fuentes de fsforo inorgnico por los microorganismos del suelo es una alternativa fundamental para incrementar la cantidad de nutriente disponible para las plantas (Illmer & Schinner 1992).

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El fsforo regresa al suelo por medio de adicin de fertilizantes minerales, retorno de residuos de animales y plantas y por deposicin atmosfrica. Ciclo del azufre

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http://platea.pntic.mec.es/~cmarti3/CTMA/BIOSFERA/ciclos.htm El azufre es un elemento requerido por plantas y animales para realizar diversas funciones, por ser componente esencial de algunos aminocidos. El azufre se encuentra en los suelos por accin de la descomposicin de la materia orgnica y por la adicin de fertilizantes, en el agua en forma de compuestos en las rocas; circula a travs de la atmsfera con las precipitaciones en forma de gases como sulfuro de hidrgeno (H2S) o dixido de azufre (SO2), productos de la combustin. Entre los microorganismos que participan en la transformacin del azufre se encuentran: el Thiobacillus thioxidans, Thiobacillus nitrificans que realizan la reaccin de oxidacin del azufre elemental a sulfato que puede ser absorbido por las plantas; Capitulo 11 Microbiologa de Alimentos Introduccin Los microorganismos desarrollan dos acciones bsicas en los alimentos: En unos casos se aprovechan sus cualidades de induccin a la fermentacin, para obtener transformaciones resultantes en alimentos de caractersticas especficas deseadas para el mercado, por ejemplo, el kumis, la cerveza, el vino, el pan, el queso, el vinagre. En otros casos la accin de los microorganismos es antagnica a la anterior ya que pueden producir descomposicin de los alimentos convirtindolos en fuentes de toxicidad o infeccin 143

Objetivos Identificar los grupos bacterianos importantes en la produccin de alimentos. Reconocer las diferencias bsicas entre los diferentes grupos de bacterias. Comprender los procesos llevados a cabo por las bacterias tanto en la produccin como en la contaminacin de alimentos. Distinguir los mecanismos utilizados por las bacterias en los diferentes procesos o Identificar las alteraciones que se producen en los alimentos por los diversos tipos de accin microbiana. o Describir las enfermedades generadas por la contaminacin microbiana de los alimentos. o Analizar procesos microbiolgicos aplicados a la produccin de alimentos.

Las Bacterias y su importancia en la produccin de alimentos

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Algunos gneros bacterianos importantes en alimentos

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Las bacterias se han utilizado desde los tiempos histricos ms remotos para producir alimentos. Los procesos bacterianos pueden darle a los alimentos ms resistencia al deterioro o caractersticas organolpticas ms agradables (sabor, textura, etc.). Existe un amplio rango de bacterias involucradas en la produccin, conservacin y alteracin de productos alimenticios. Bacterias lcticas o productoras de cido lctico Su caracterstica ms importante es la capacidad de fermentar los azcares para dar cido lctico. Debido a la rpida produccin de cido son capaces de eliminar a muchos microorganismos competitivos. La mayora de las bacterias pertenecientes a este grupo crecen en el rango de los termfilos. En este grupo se incluyen: Lactobacillus bacilos Gram positivos, forman cadenas en la mayora de las especies, no esporulados y generalmente no mviles. Son microaerfilos, aunque existen algunos anaerbios estrictos; son catalasa negativos y fermentadores. Son benficas en la elaboracin de quesos y fermentacin de vegetales. Pero pueden producir gases que perjudican los quesos y vinos. Streptococcus cocos Gram positivos, dispuestos caractersticamente en pares o cadenas. Las especies importantes en alimentos se dividen en: pigenos y estreptococos. Los pigenos comprenden especies patgenas, entre las que se encuentran S. agalactiae, que ocasiona mastitis en las vacas, y S. pyogenes, muy patgeno en humanos, el cual causa la faringitis sptica, escarlatina y otras enfermedades. Se puede encontrar en la leche cruda. Los pigenos crecen en rangos de temperaturas caractersticos de animales de sangre caliente (37C). Los pertenecientes al grupo de los otros estreptococos crecen exclusivamente a 45C. incluyen el S. thermophilus, importante en la elaboracin de quesos y en ciertas leches fermentadas como el yoghurt. Enterococcus Cocos Gram positivos, no esporulados, hemolticos. Crecen tanto a 10C como a 45 C. Resisten las temperaturas de pasterizacin de la leche e incluso mayores.; toleran un porcentaje de sal del 6.5% o superior; crecen a un pH alcalino de 9,6 unidades. En este grupo se encuentran E. faecalis, resistente al calor, proveniente de los humanos y E. faecium. Lactococcus Cocos Gram positivos, no esporulados. Crecen a 10. Se emplean como fermentadores para la produccin del queso y la mantequilla de varios tipos. Comprenden bacterias importantes en la leche, como L. lactis y L. cremoris. Leuconostoc Son cocos Gram positivos, organizados en pares o cadenas. Son importantes en los alimentos por: producir diacetilo y otras sustancias aromticas; tolerar las concentraciones salinas de ciertas salmueras, como las de la fermentacin de encurtidos hortcolas.; algunas especies toleran altas concentraciones de azcares (55-60%), lo que les permite crecer en jarabes, caramelo lquido, crema de helados, etc.; producir cantidades considerables de dixido de carbono a partir de los azcares, ocasionado la aparicin de ojos en ciertos quesos, alteraciones en alimentos con alto contenido de azcar y la fermentacin de algunas clases de pan; producir muclago en medios que contienen sacarosa, proceso ptimo en la produccin de dextrano, pero

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representa un riesgo en alimentos ricos en dicho disacrido, como en la produccin de azcar a partir de caa o remolacha. Pediococcus Son cocos aislados, en parejas, en cadenas cortas o en ttradas: Gram positivos, catalasa positivo y microaerfilos. Se han encontrado en las salmueras de los encurtidos en fase fermentativa, siendo los responsables de ciertas alteraciones en las bebidas alcohlicas. Bacterias acticas o productoras de cido actico La mayor parte de las bacterias acticas pertenecen a uno de los dos gneros, Acetobacter y Gluconobacter. Acetobacter Son formas bacilares, Gram negativas, aerbicas estrictas y mviles. Oxidan el alcohol etlico a cido actico y se encuentran en masa fermentada de granos de cereales, frutas, hortalizas y bebidas alcohlicas y constituyen un problema en estas ltimas, ya que causa una alteracin de las mismas. Algunas especies como A. aceti oxidan el etanol convirtindolo en cido actico para producir vinagre, lo que constituye su ms importante aplicacin industrial. Gluconobacter Este gnero pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Las bacterias pertenecientes a este grupo oxidan el etanol a cido actico. La especie G. oxydans produce viscosidad en la cerveza y ms adelante una proliferacin viscosa que afecta la infusin de malta. Bacterias Butiricas Las bacterias de este grupo, en su mayora, son anaerobias esporuladas del gnero Clostridium. Clostridium Son bacilos anaerobios o microaerfilos, Gram negativos, catalasanegativos, formadores de endosporas resistentes a altas temperaturas. Muchas especies fermentan activamente los carbohidratos, con produccin de cidos, entre los que se encuentra el butrico, y gases, usualmente dixido de carbono e hidrgeno. C. thermosaccharolyticum determina la alteracin gaseosa de las conservas vegetales. La putrefaccin de los alimentos es a menudo ocasionada por especies mesfilas proteolticas tales como C. lentoputrescens y C. putrefaciens. El rompimiento violento de la cuajada de la leche es ocasionado por C. perfringens o especies semejantes y da lugar a una fermentacin tumultuosa de la leche; C. butyricum, que fermenta los lactatos, determina la produccin tarda de gas en los quesos curados. Bacterias Propinicas Son bacterias pequeas, inmviles, Gram positivas, no esporuladas, catalasa-positivas de carcter anaerbico o aerotolerante y de forma bacilar. Fermentan el cido lctico, los carbohidratos y los polialcoholes para producir grandes cantidades de cidos propinico y actico y a menudo dixido de carbono. Ciertas especies, como Propionibacterium freudenreichii, proliferan en el queso suizo fermentando los lactatos con produccin de gas, que da lugar a la formacin de ojos

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y contribuyen a la obtencin de su tpico sabor. Las propionibacterias pigmentadas pueden causar modificaciones del color del queso Bacterias Proteolticas tienen la capacidad de descomponer la estructura de las protenas. Muchas especies de Clostridium, Bacillus, Pseudomonas y Proteus son proteolticas. Las bacterias de la putrefaccin son capaces de descomponer anaerbicamente las protenas y producir compuestos malolientes, como cido sulfhdrico, mercaptanos, aminas, indol y cidos grasos. La mayor parte de las especies proteolticas de Clostridium son putrefactivas, as como ciertas especies de Proteus, Pseudomonas y otros gneros no esporulados. Bacillus cereus En la industria alimentaria ha sido de inters y objeto de estudio la destruccin de las esporas de B. cereus por su termorresistencia. Produce graves intoxicaciones debido a que genera una enterotoxina diarreica, un factor emtico y hemolisinas. Pseudomonas diversas especies de Pseudomonas son capaces de efectuar alteraciones en los alimentos. Pueden desarrollarse a bajas temperaturas (refrigeracin). En aerobiosis, crecen rpidamente y originan productos de oxidacin y muclago en las superficies de los alimentos, donde es ms probable una contaminacin abundante. Ciertas especies producen pigmentos como la fluorescencia verdosa producida por la pioverdina de Pseudomonas fluorescens y el color blanco, cremoso, rojizo, castao o incluso negro producido por P. nigrilaciens. Proteus las bacterias de este gnero son responsables de la alteracin de carnes, productos pesqueros y huevos. La presencia de estas bacterias en muchos alimentos no refrigerados las ha hecho sospechosas de ser causantes de toxiinfecciones alimentarias, o sea infecciones causadas por endotxinas o exotoxinas producidas por microorganismos. Se hallan en el intestino humano y de animales. Bacteria lipolticas Corresponde a un grupo heterogneo de bacterias que producen lipasas, enzimas que catalizan la hidrlisis de las grasas a cidos grasos y glicerol. Muchas bacterias aerbicas y proteolticas son tambin lipolticas. Pseudomonas fluorocescens es una de las especies fuertemente lipoltica. Los gneros Pseudomonas, Alcaligenes, Serratia y Micrococcus tienen especies lipolticas. Serratia, enterobacteria gram negativa, mvil, en forma de bacilo, fermenta butanodiol. Muchas de sus especies producen un pigmento rosceo o magenta y dan lugar a coloraciones rojizas en la superficie de los alimentos. S. marcescens es la especie ms comn. Micrococcus son Gram positivos, aerobios y catalasa-positivos. A menudo se encuentran en utensilios y equipo usados en alimentacin que no han sido adecuadamente limpiados e higienizados. Son importantes en los alimentos debido a las siguientes caractersticas: son capaces de utilizar las sales amnicas y otros compuestos nitrogenados simples como nica fuente de nitrgeno, la mayora

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fermentan los azcares, produciendo cantidades moderadas de cido, otros toleran gran cantidad de sal, creciendo por lo tanto a niveles de humedad bajos; estas especies se desarrollan en salmueras del curado de carnes, tanques de salmuera, muchos resisten la pasterizacin comercial de la leche ( M. varians), otros son pigmentados y dan coloracin anormal a las superficies de los alimentos sobre los que crecen; M. luteus, por ejemplo, es amarillo y M. roseus, rosa. Bacterias Sacarolticas Hidrolizan los disacridos o polisacridos a azcares sencillos. Bacillus subtilis y Clostridium butyricum son amilolticos. Pocas especies bacterianas son capaces de hidrolizar la celulosa. Bacterias Pectolticas Las pectinas son carbohidratos complejos que forman parte de hortalizas y frutas. Las pectinasas, compuestas de varias enzimas pectolticas, pueden dar lugar al ablandamiento de los tejidos vegetales o a la prdida de la capacidad de gelificacin de los zumos de frutas. Se comportan como pectolticas especies de Erwinia, Bacillus y Clostridium, as como ciertos mohos. Las especies del gnero Erwinia son patgenas y saprofitos de vegetales, en los que causan necrosis, agallas, marchitamientos y podredumbre, lesionando frutas, hortalizas y otros productos vegetales. Puede presentarse directamente en el campo o durante el almacenamiento de los frutos. Es de inters econmico ya que las bacterias se pueden diseminar rpidamente por los exudados producidos en los tejidos y daar un lote de produccin. Bacterias termfilas Estas bacterias tienen una temperatura ptima por encima de 45 C, en muchos casos de 55C o superior y son importantes en el caso de alimentos mantenidos a elevadas temperaturas. Bacillus spp. causan la fermentacin cida de algunos alimentos enlatados y Clostridium thermosaccharolyticum da lugar a una alteracin gaseosa. Lactobacillus thermophilus es un microorganismo cido lctico y termfilo obligado. Bacterias psicotrfas Estas bacterias se pueden desarrollar a temperaturas no muy por encima de las de congelacin y tienen importancia en alimentos refrigerados. Las bacterias psicrotrficas se encuentran principalmente en los gneros Pseudomonas, Flavobacterium y Alcaligenes, aunque tambin hay especies psicrotrficas de los gneros Micrococcus, Lactobacillus, Enterobacter; Arthrobacter y otros. Flavobacterium especies de este gnero, amarillas o anaranjadas, determinan coloraciones anormales superficiales en las carnes y toma parte en el deterioro de mariscos, aves, huevos, mantequilla y leche. Algunos miembros son psicrtrofos, habindose observado su crecimiento, tras la descongelacin, en hortalizas congeladas. 149

Bacterias halfitas Necesitan para su crecimiento determinadas concentraciones de cloruro sdico. Pertenecen a los gneros Halobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio, Pediococcus y Alcaligenes. Halobacterium normalmente aparecen en los pecados salados y en pieles adobadas debido a que la sal utilizada es portadora de este grupo de bacterias, produciendo manchas coloreadas. Vibrio son patgenos importantes para el hombre. V. cholerae es el agente causante del colera y V. parahaemolyticus produce gastroenteritis en humanos por el consumo de comida de mar contaminada. V. anguillarum y otras especies, son responsables de enfermedades en peces. Bacterias formadoras de viscosidad Pertenecientes a este tipo de bacterias se pueden citar: Alcaligenes viscolatis (viscosus) y Enterobacter aerogenes, que producen la alteracin viscosa de la leche, especies de Leuconostoc, que originan mucosidad en las soluciones de sacarosa y el crecimiento viscoso superficial de ciertas bacterias presentes en los alimentos. Algunas especies de Streptococcus y Lactobacillus poseen variedades que determinan la viscosidad o mucosidad de la leche; se conoce un micrococo que hace viscosas las soluciones de curado de las carnes. Hay cepas de Lactobacillus plantarum y de otros lactobacilos que pueden causar viscosidad en varios productos derivados de las frutas, hortalizas y cereales, por ejemplo, en la sidra y cerveza. Bacterias Coliformes Son bacilos que han sido definidos como aerbicos o anaerbicos facultativos, Gram negativos y no esporulados, que fermentan la lactosa con formacin de gas. Las principales especies de bacterias coliformes son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. E. aerogenes produce menor cantidad de cido, forma acetona pero no indol, da lugar a dixido de carbono e hidrgeno en la proporcin 2:1 y utiliza el citrato como nica fuente de carbono. Produce ms gas que E. coli y por lo tanto, es ms peligroso como microorganismo, ya que puede originar gas en quesos, leche y otros alimentos. Ambas especies fermentan los azcares con formacin de cido lctico, etanol, cidos actico y succnico, dixido de carbono e hidrgeno. Los recuentos de coliformes, Coliformes fecales y de E. coli se emplean en los alimentos con carcter indicador. En general, no se admite la presencia de bacterias coliformes en los alimentos y en algunos casos, como el agua o las ostras, es ndice de contaminacin con materiales cloacales y, por lo tanto, con posibles patgenos entricos Adems pueden dar lugar a la alteracin de los alimentos por multiplicacin en los mismos Otras bacterias importantes en alimentos

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Salmonella las bacterias de este gnero son intestinales. A este grupo pertenecen los agentes productores de fiebre tifoidea y paratifoidea, as como los causantes de Salmonelosis humanas transmitidas por alimentos. Su presencia en alimentos es totalmente inadmisible. Staphylococcus la mayora de las cepas de S. aureus producen un pigmento dorado y coagulan el plasma sanguneo mientras que S. epidermis no produce ni coagulasa ni pigmentos. Se asocian con la piel, membranas mucosas del hombre y animales. S. aureus causa abscesos, forunculosis, neumona infecciones en heridas y un importante sndrome de toxoinfeccin alimenticia en el hombre. Algunas cepas han presentado ltimamente mltiple resistencia a los medicamentos. El S. epidermis se encuentra comnmente en la piel y es el responsable de endocarditis e infecciones en pacientes con baja resistencia. Hongos fundamentales en la industria alimenticia Las levaduras forman parte de la poblacin mictica unicelular, que por su capacidad de degradar azcares puede producir efectos importantes en la industrializacin de alimentos. Al respecto, en la pgina: http://www.food-info.net/es/qa/qa-wi8.htm se presenta una sntesis adecuada sobre las levaduras. Las levaduras son un grupo particular de hongos unicelulares (constituidos por una sola clula) y caracterizados por su capacidad de transformar los azcares. Hay muchas especies de levaduras. La ms comnmente conocida es Saccharomyces cerevisiae la cual es utilizada en la industria panadera y en la elaboracin de la cerveza. Las levaduras tambin juegan un papel importante en la produccin de otros productos como el vino y el kefir. La mayora de las levaduras usadas en la industria alimentaria son de forma redonda y se dividen produciendo pequeos brotes. Esta produccin de brotes es una caracterstica utilizada para reconocerlas a travs del microscopio, ya que, durante el brote, las clulas poseen una forma de ocho (8). Las levaduras necesitan azcares para crecer y los fermentan produciendo alcohol y dixido de carbono (CO2). Esta reaccin y sus productos derivados hacen que la levadura posea una funcin muy importante en la industria alimentaria. As mismo, las levaduras tambin producen componentes de aroma agradable, los cuales juegan un papel muy importante en el aroma del producto final. Por ejemplo, en la cerveza, la levadura se necesita para producir el alcohol y el dixido de carbono que forma la espuma. Por otro lado, en la industria panadera el alcohol producido durante la fermentacin se evapora durante el horneado. Las levaduras pueden encontrarse en todas partes en la naturaleza, especialmente en plantas y frutas. Una vez que las frutas caen del rbol, la actividad de los hongos har que stas se pudran. Durante este proceso se forman alcohol y dixido de carbono a partir de los azcares presentes en las frutas. En algunas ocasiones aparecen en los 151

informativos animales deteriorados.

embriagados

debido

que

han

comido

estos

frutos

En la industria alimentaria, grandes tanques con agua azucarada en presencia de oxgeno son utilizados para hacer crecer las levaduras. Cuando se alcanza la cantidad de levadura deseada, el lquido es evacuado por medio de una bomba y la levadura es extrada, la que posteriormente podr ser secada. Ningn otro requerimiento es necesario para producir levadura. Alteraciones microbianas en los alimentos Una vez que los microorganismos colonizan los alimentos, estos microorganismos se pueden multiplicar puesto que encuentran los nutrientes necesarios para su desarrollo y como resultado del metabolismo microbiano estos alimentos se alteran. No obstante, solamente una parte de esta microbiota inicial llega a proliferar suficientemente como para producir la alteracin de los alimentos. El que solamente una parte de la microbiota inicial sea capaz de desarrollarse masivamente, en un alimento concreto, viene condicionado por una serie de factores intrnsecos del propio alimento as como de factores extrnsecos del medio ambiente que le rodea: pH, humedad, temperatura de conservacin. Consecuencias del desarrollo de microorganismos en los alimentos Los efectos que produce el desarrollo de microorganismos en los alimentos, tanto beneficiosos como perjudiciales, se sumarizan a continuacin: 1.- Alteracin de los alimentos (microorganismos alterantes) Los microorganismos al crecer y utilizar los alimentos como fuente de nutrientes producen cambios en la apariencia, sabor, olor y otras cualidades del alimento. Estos procesos de degradacin son: a. Putrefaccin Protenas alimentos + Microorganismos proteolticos ------> Aminocidos + Aminas + NH3 + SH2 b. Fermentacin Carbohidratos alimentos + Microorganismos sacarolticos ------> Acidos + Alcoholes + Gases c. Enranciamiento Grasas alimentos + Microorganismos lipolticos ------> Acidos grasos+ Glicerol 2. Enfermedades de origen microbiano (microorganismos patgenos) a.- Infeccin alimentaria: Salmonelosis b.- Intoxicacin alimentaria: Botulismo

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3.- Alimentos producidos por microorganismos (microorganismos industriales) a.- Vegetales: vino, aceitunas b.- Lcteos: yogurt, queso c.- Protena de origen unicelular (SCP): clulas de bacterias, levaduras, algas y hongos filamentosos.

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ANEXO Tareas y Actividades

Unidad 1: Perspectivas y Tendencias Fases de profundizacin y transferencia Situacin de salida/ Metas para competencia: El estudiante identifica, describe y analiza con propiedad las funciones de de los organelos celulares y sus interacciones. Aspectos Situacin didctica procedimentales Situacin Actividades de entrada: Producto Actividad propuesta Seleccione y desarrolle una Mapas conceptuales conjuntamente entre la de las dos actividades socializado en el aula tutora Victoria E. Vence , propuestas. Despus de leda Virtual. Microbiloga Industrial de la y estudiada la Unidad 1. Universidad Javeriana Y Carmen Eugenia Pia Lpez 1. Realice un escrito de no M.Sc. Ciencias Biolgicas menos 1 pgina; es decir 1 hoja, lado y lado en donde Carcter de la actividad: usted: Analice los individual o grupo diferentes campos de colaborativo mximo de 3 aplicacin y las ventajas personas. de la microbiologa en su carrera, y las consecuencias de la falta Sistema de de aplicacin de esta rama interactividades: Acompaamiento Tutorial en de la ciencia. Grupo de curso virtual asincrnico 2. Elabore una reflexin sobre la importancia de de los Recurso tecnolgico : aula alguno descubrimientos virtual microbiolgicos en la historia. En su trabajo Formato de objetivacin/ exprese su opinin sobre productos: Informe con las consecuencias en la mapas conceptuales sociedad actual, si ese descubrimiento no se Sistema de evaluacin: hubiera realizado Sumativa: Heteroevaluacin. Los resultados de la actividad se publicarn en el aula Seguimiento: atencin a Virtual para socializacin y consulta de los estudiantes realimentacin con el tutor y 154

por parte del tutor y sistematizacin enviada al director nacional para seguimiento y realimentacin

dems compaeros.

Elaboracin de mapa conceptual, sobre temticas de la unidad 2 para analizar relaciones entre conceptos Unidad 2: Diversidad Microbiana FASE DE PROFUNDIZACIN Situacin de salida/ Metas para competencia: El estudiante identifica, describe y analiza con propiedad las funciones de de los organelos celulares y sus interacciones. Aspectos Situacin didctica procedimentales Situacin Actividades de entrada: Producto Aporte de la tutora Victoria E. Vence , Microbiloga Industrial de la Universidad Javeriana Elabore mapas Mapas conceptuales socialcelos en conceptuales pequeo grupo colaborativo socializado en el aula a travs del aula Virtual y Virtual. luego incorpore ajustes Carcter de la actividad: basados en la realimentacin resultante de la socializacin. individual o grupo colaborativo mximo de 3 personas. Las temticas de los mapas son: los virus, bacterias, hongos, protozoos, algas, Sistema de sus caractersticas ms interactividades: relevantes, su reproduccin Acompaamiento Tutorial y su uso industrial. en Grupo de curso virtual asincrnico Los resultados de la actividad se publicarn en el Recurso tecnolgico : aula Virtual para aula virtual socializacin y realimentacin con el tutor y Formato de objetivacin/ dems compaeros. productos: Informe con mapas conceptuales

Sistema de evaluacin: Sumativa: Heteroevaluacin. Seguimiento: atencin a consulta de los estudiantes por parte del tutor y 155

sistematizacin enviada al director nacional para seguimiento y realimentacin

Unidad 3: Crecimiento, Cultivos, Bioseguridad FASE DE PROFUNDIZACIN Situacin de salida/ Metas para competencia: El estudiante identifica, describe y analiza con propiedad las funciones de de los organelos celulares y sus interacciones. Aspectos procedimentales Situacin didctica Situacin Actividades de entrada: Producto Actividad planteada Elabore un mapa conceptual Mapa conjuntamente entre la tutora sobre una de las dos lecturas conceptual Victoria E. Vence, Microbiloga presentadas en la unidad: 1. socializado en el Industrial de la Universidad "Esterilizacin del suelo aula Javeriana y Carmen Eugenia Pia por calor", como ejemplo de Lpez M.Sc. Ciencias Biolgicas. una de las aplicaciones de la temperatura como mtodo de Carcter de la actividad: desinfeccin del suelo. individual o grupo colaborativo mximo de 3 personas. 2. "Nuevos frmacos basados en productos Sistema de interactividades: naturales de origen microbiano". Socialcelo en Acompaamiento Tutorial en Grupo de curso virtual asincrnico pequeo grupo colaborativo a travs del aula Virtual y luego incorpore ajustes basados en Recurso tecnolgico : aula la realimentacin resultante virtual de la socializacin. Formato de objetivacin/ productos: Informe con mapas conceptuales Sistema de evaluacin: Sumativa: Heteroevaluacin. Seguimiento: atencin a consulta de los estudiantes por parte del tutor y sistematizacin enviada al director nacional para seguimiento y realimentacin Los resultados de la actividad se publicarn en el aula Virtual en el Foro socializacin de productos para socializacin y realimentacin con el tutor y dems compaeros.

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Practicas de laboratorio El desarrollo de todos los laboratorios y la presentacin de los respectivos informes es obligatorio para la aprobacin del curso. Los horarios de desarrollo se programan en cada CEAD de acuerdo con la planeacin del tutor Desarrollo de laboratorios para aplicacin de conceptos del curso Fase de transferencia Situacin de salida/ Metas para competencia: El estudiante aplica con propiedad protocolos estandarizados para el manejo seguro de los microorganismos, con objetivos especficos de observacin o de experimentacin. Aspectos procedimentales Situacin: Tiempo previsto de desarrollo: 24 h Carcter de la actividad: pequeo grupo colaborativo Sistema de interactividades: Tutora individual Recurso tecnolgico: Dotacin de laboratorio Formato de objetivacin/ productos: Informe Sistema de evaluacin: Sumativa: Heteroevaluacin. Informes y PDP Situacin didctica Actividades de entrada: Producto Informes en el Portafolio de desarrollo personal (PDP) para realimentacin tutorial y su socializacin

Desarrolle las actividades prcticas de laboratorio de Microbiologa, apoyadas en la observacin de los vdeos incluidos en el curso y en la gua de laboratorios Clic para acceder a la gua de la Prctica 1 : Normas Generales de Bioseguridad- Esterilizacin, Desinfeccin y Manejo de Equipos de Laboratorio Prctica 2: Medios de Cultivo, Mtodos de Siembra de microorganismos Prctica 3: Observacin de microorganismos y tcnicas de tincin Prctica 4 : Determinacin de flora ambiental, humana y de superficie Prctica 5: Recuento de Colonias de las cajas de Agar Nutritivo de la Prctica de Flora ambiental y Flora Humana

Seguimiento: PDP por parte del tutor y sistematizacin enviada Prctica 6: Factores que afectan el al director nacional para crecimiento de los microorganismos. seguimiento y realimentacin Prctica 7: Metabolismo microbiano, reacciones bioqumicas de algunas

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bacterias. Prctica 8: Efecto de los desinfectantes sobre microorganismos. Coordine con el tutor del curso en su Centro Regional la programacin, y las condiciones para el desarrollo de las prcticas mencionadas. Realizadas las prcticas presente un informe y sustente los resultados observados con base en la teora estudiada en el curso.

Universidad Nacional Abierta y a Distancia -UNADCiencias Bsicas Guas de Laboratorio de Microbiologa Autoras: Anglica Yara, Roco Gmez Bacterilogas, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca Adaptacin: Carmen Eugenia Pia lpez Lista de materiales para las prcticas Bata blanca Gorro Tapabocas Fsforos Decol o Clorox Papel absorbente Pauelos desechables triple hoja Cinta de enmascarar Marcador de vidrio Tijeras Frasco de boca ancha Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Asas bacteriolgicas: curva y recta Toalla para manos Jabn desinfectante para manos Hisopos (copitos con palo de madera) Alcohol antisptico Bolsas para la basura. 158

 Churrusco para tubos de ensayo Un alimento contaminado con hongos para la primera prctica El gorro, la bata y el tapabocas son de uso individual y son indispensables para el ingreso al laboratorio. El resto de materiales se utilizan por grupos de 3 personas, cada grupo debe tener todo el material

Laboratorio No. 1 Normas generales de Bioseguridad- Esterilizacin desinfeccin y manejo de equipos de laboratorio Cuestionario de entrada 1. Que es bioseguridad? 2. Cules seran para usted las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa? 3. Cmo puede usted evitar en el laboratorio daos a su salud? 4. Mencione las clases de esterilizacin, cuales son los agentes de esterilizacin con ms uso en el laboratorio; en que consiste cada uno de ellos y para qu materiales se utilizan. Objetivos 1. Establecer normas y principios bsicos de comportamiento en el laboratorio. 2. Aprender y utilizar los mtodos de esterilizacin disponibles en el laboratorio. 3. Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio de microbiologa. Recomendaciones Lea atentamente las recomendaciones y normas de bioseguridad y adems tenga en cuenta: No debe salir con la bata fuera del laboratorio Debe tener especial cuidado con el mechero y el material de vidrio (evitar quemaduras y cortadas) Debe trabajar muy concentrado pues un pequeo error o descuido, puede daar todo su trabajo en el laboratorio y tener el riesgo de contaminarse con bacterias patgenas.

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Materiales: Pipetas, cajas Petri, tubos tapa rosca, equipos del laboratorio de microbiologa, autoclave, incubadora, horno, campana de anaerobiosis, destilador, cmara de flujo laminar, cuenta -colonias, plancha de calentamiento. Procedimiento: Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Bioseguridad, Equipos y materiales para manejo microbiolgico con bioseguridad , Esterilizacin, agentes esterilizantes. y observar los vdeos correspondientes: Normas de Bioseguridad parte 1 - Normas de Bioseguridda parte 2 - Vdeo Esterilizacin y desinfeccin parte 1 - Vdeo Esterilizacin y desinfeccin parte 2 Establezca las diferencias entre esterilizacin y desinfeccin. Llene el siguiente cuadro: Agente de Temperatura Equipo esterilizacin de uso (si se utilizado aplica) Esterilizacin con calor seco Esterilizacin con calor hmedo Material que se puede esterilizar por este mtodo.

Radiaciones

Filtracin

Dibuje el autoclave del laboratorio con sus partes y su funcin. Realice una descripcin e indique la utilidad de todos los equipos que le ensee el coordinador de laboratorio: Incubadora, Horno, Campana de anaerobiosis, autoclave, destilador, cmara de flujo laminar, cuenta -colonias, plancha de calentamiento. Observe el material de vidrio y pida al Tutor y coordinador que le ensee su adecuada manipulacin. (cajas de petri, pipetas diferentes volmenes, pipetas de Pasteur). 160

 El material de vidrio en microbiologa siempre debe ser utilizado estril por lo que debe ser empacado con papel kraft antes de ser sometido a un proceso de esterilizacin, se debe tener especial cuidado en la manipulacin del material ya que se puede contaminar con microorganismos provenientes de las manos, etc. Identifique las asas de platino y reciba las indicaciones de uso por parte del Tutor o coordinador de laboratorio. Prepare el material (vidriera) para hornear, recubralo con papel Kraft, y sellelo con cinta indicadoora de esterilidad. Proceda a esterilizarlo en el Horno a temperatura de 160 - 180 C, durante 2 horas. Esterilice los medios de cultivo que el tutor le suministre en el autoclave a presin de 15 lb y 121 C durante 20 minutos. Tenga en cuenta las instrucciones de manejo de la autoclave. Teniendo en cuenta lo observado en el vdeo sobre esterilizacin realice el lavado del material de laboratorio suministrado, realice la prueba de azul de bromotimol y verifique si el material fue lavado correctamente.

Laboratorio No. 2 Preparacin de Medios de cultivo - Metodos de Siembra de Microorganismos Cuestionario de entrada 1. Qu es un medio de cultivo; de qu estn compuestos principalmente; cmo se clasifican segn su proporcin de agar y segn su suministro de nutrientes? 2. Cul es la utilidad de los medios de cultivo y qu diferencia un caldo de un medio slido? Objetivos 1. Aprender la preparacin y manipulacin de los medios de cultivo. Materiales: frasco con medio de cultivo deshidratado, medio lquido y slido, matraz o erlenmeyer de 500 mililitros , balanza, probeta, esptula, papel kraft, plancha de calentamiento, varilla de vidrio, agar nutritivo y cinta indicadora de pH. Procedimiento: Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Medios de Cultivo y los vdeos: Preparacin y medios de cultivo parte 1 y parte 2 .

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Preparacin de medio de cultivo Revise la etiqueta de los medios de cultivo, anote el nombre, la composicin y forma de preparacin. Realice los clculos para preparar los siguientes volmenes de medio de cultivo tanto lquido como slido: 325, 356 ml, 1567 ml, 131 ml y 24 ml Prepare en un erlenmeyer 325 mililitros de agar. De acuerdo a las indicaciones de preparacin se utilizan 20 gramos de medio deshidratado por litro de agua. Recuerde para el clculo se realiza una regla de tres: 20 gr....... 1000 ml X= (20 gr.x 325ml)/1000= 6.5 gr. X gr......... 325ml Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe ser de volumen superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua contenida en el erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el agitador. A continuacin lleve la preparacin a disolver en la plancha de calentamiento, agite constantemente con ayuda de la varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolucin total del Agar. Mida el pH con ayuda de cinta indicadora de pH. El rango de pH en este medio es de 7.0 a 7.5. Si se hace necesario la correccin del pH, aada al medio de cultivo preparado la cantidad adecuada de solucin de cido clorhdrico o de hidrxido sdico segn el caso. Tape la boca del erlenmeyer con un tapn de papel kraft y selle con cinta de enmascarar. Si las normas de preparacin no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centgrados, durante 15 minutos. Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45C. Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de petri, previamente esterilizadas. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique. A continuacin realice la prueba de esterilidad que consiste en llevar los medios a incubar a 37 grados centgrados durante 12 o 24 horas. Esta prueba se evala por la presencia o ausencia de crecimiento posterior a la incubacin. Las placas con medio de cultivo y el caldo preparado son claros e incoloros hasta con una tonalidad amarillenta. Prepare caldo nutritivo para tal fin solamente se emplean 8 gramos de Agar deshidratado por litro de agua. Realice la preparacin de la misma manera. Dispense el caldo directamente en los tubos con tapa rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. No olvide que cuando se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada. Finalmente tenga en 162

cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo, solo cambia el momento en que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se forme el pico de agar inclinado. Siembra de Microorganismos Materiales y equipos: Asas Cepa Tubos Tubos Cajas Mechero Cinta Fsforos Agar Cajas Incubadora bacteriolgicas microorganismo nutritivo inclinado nutritivo bunsen enmascarar fundido estriles

pura con con con de de nutritivo petri agar

de caldo nutritivo agar

Procedimiento Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Sistemas de siembra y los vdeos: Mtodos de siembra parte 1, parte 2 y parte 3 Siembra de medio slido a medio lquido Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y djela enfriar.

Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tapelo y dejelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice Incube el los asa en tubos el a mechero 37C despus por de 24 usarla. horas.

Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimieto el caldo queda transparente

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Siembra de medio lquido a slido Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra de medio slido a slido Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla

Realice una estra que atraviese el centro del agar. Luego realice estras en ngulo recto con respecto a la estra inicial. Voltee el agar en ngulo de 90 grados y realice estra hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento

Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estras y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas. Siembra por estras

Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto numero uno, realice estras hasta el numero 2. Esterilice el asa, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 3, tome las dos ultimas estras y extindalas hasta el numero 4 y as sucesivamente hasta llegar al numero 6. Siembra masiva

Tome un hisopo estril e introdzcalo en el tubo que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluacin del crecimiento en las placas de agar se hace a travs de la observacin de colonias en la superficie . Siembra en agar inclinado Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el crecimiento de 164

colonias Siembra en profundidad

en

la

superficie.

Marque la caja de petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas. Entregue al coordinador del laboratorio los cultivos bacterianos usados

Laboratorio No. 3 Caractersticas de la morfologa microbiana y fundamentos de tincin Cuestionario de entrada 1. Segn su morfologa, como se clasifican las bacterias? 2. Cmo se diferencia una tincin simple de una tincin diferencial? Escriba algunos ejemplos de cada una de las tinciones 3. Cul es el fundamento de la coloracin de Gram? 4. Qu diferencias encuentra entre bacterias Gram positivas de Gram negativas? 5. Como se realiza el frotis bacteriolgico y en que consiste el proceso de fijacin? Objetivos 1. Conocer y estudiar la morfologa de bacterias, mohos y levaduras. 2. Conocer y aplicar diferentes mtodos de tincin para la identificacin de los microorganismos

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3. Determinar las caractersticas morfolgicas microscpicas como forma y agrupacin.

4. Aprender a diferenciar los microorganismos Gram positivos de los Gram negativos. Materiales: Cepas de microorganismos, un alimento contaminado con hongos, Azul de lactofenol. Azul de metileno, Colorantes de Gram: Cristal violeta, Lugol, Alcohol acetona, Fucsina. Soporte para tincin, Solucin salina fisiolgica estril, Lminas portaobjetos, Lminas cubreobjetos, Mechero de Bunsen, Cinta pegante, Asas bacteriolgicas, Papel absorbente, Frasco de boca ancha, Microscopio Procedimiento: Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Observacin de microorganismos y tcnicas de tincin A. Tincin Simple Realice 2 extendidos con cepas bacterianas diferentes Encienda el mechero y esterilice el asa, (curva para el cultivo l quido y recta para el cultivo slido). Djela enfriar cerca del mechero. Recoja con el asa estril cultivo de la bacteria, al lado del mechero. En una lmina portaobjetos limpia, desengrasada y marcada, coloque una pequea gota de solucin salina estril y realice una suspensin homognea del cultivo, (si el cultivo es slido). Si el cultivo bacteriano es lquido coloque una pequea gota de ste en la lmina portaobjetos y extindala. Dej que es frotis se seque a temperatura ambiente. Luego pase la l mina portaobjetos por el mechero 3 veces (con el frotis en la parte de arriba) con el fin de fijar el extendido. Coloque la lmina en el soporte de coloracin y cubra el frotis con azul de metileno durante 2 minutos. Lave suavemente el frotis con agua con un frasco de boca ancha y deje escurrir sobre papel absorbente hasta que seque. Observe al microscopio con el Objetivo 100 x (de inmersin) colocando una gota de aceite de inmersin sobre el frotis. Recuerde colocar el condensador arriba y el diafragma abierto. Dibuje sus observaciones. Para hongos y levaduras

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 Coloque cerca al mechero el alimento con hongos y con ayuda de cinta pegante, recoja muestra de la superficie. Marque la lmina con cinta de enmascarar: nmero del grupo y coloracin. Coloque en el centro de la lmina portaobjetos una pequea gota de azul de Lactofenol, y luego pegue la cinta a la lmina. Presione ligeramente para eliminar burbujas de aire. Observe en el microscopio en los objetivos de 10x y 40x. Realice una posible identificacin del hongo con los diagramas que encuentra en el laboratorio. Dibuje sus observaciones B. Coloracin de Gram Realice 2 extendidos con cepas bacterianas diferentes Realice Deje 2 frotis al como aire se indic libre y para la coloracin fije el simple. frotis.

secar

luego

Marque la lmina con cinta de enmascarar: nmero del grupo y coloracin. Coloque la lmina en el soporte de coloracin.

Coloque sobre el frotis una pequea cantidad de Cristal Violeta durante 1 minuto Lave con el frasco la el frasco de boca ancha de ancha ancha y y escurra Lugol escurra el por el exceso 1 exceso 30 exceso 1 de de agua. minuto. agua.

Aplique Lave con

solucin de boca

Decolore Lave con

aplicando el el frasco

Alcohol de boca de

acetona y

durante el

segundos de agua. minuto.

escurra Safranina

Aplique

colorante

contraste

durante

Por ltimo lave con agua y deje escurrir sobre papel absorvente a temperatura ambiente. Observe al microscopio con el Objetivo 100 x (de inmersin) c olocando una gota de aceite de inmersin sobre el frotis. Dibuje sus observaciones.

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Una vez terminada sta actividad, coloque las lminas portaobjetos usadas dentro del frasco de boca ancha con agua y Clorox. Deseche en la basura los alimentos analizados. Desconecte el microscopio, limpie sus lentes con Xilol y pauelos desechables triple hoja (nicamente), las dems superficies del microscopio puede limpiarlas con los paos absorbentes y alcohol antisptico. Por ltimo realice la entrega del microscopio al coordinador del laboratorio. Laboratorio No. 4 Determinacin de Flora Ambiental, de Superficie y Humana Cuestionario de entrada 1. Cules son las diferencias entre flora residente y flora transitoria? Objetivos 1. Realizar la determinacin de flora humana, ambiental y de superficies

2 . Revisar el grado de contaminacin por bacterias, mohos y levaduras de las muestras de ambientes y superficies. 3. Verificar la efectividad en el proceso de limpieza y desinfeccin Materiales: 5 cajas Petri con Agar nutritivo (para crecimiento de bacterias), 3 cajas Petri con Agar Sabouraud (para crecimiento de mohos y levaduras), frasco de boca ancha con agua y decol, tubos con agua destilada estril, hisopos estriles con palo de madera, gradilla, cinta de enmascarar, mechero de Bunsen, fsforos, plantilla en cartulina de 4 x4 cm. Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Sistemas de siembra y los vdeos. determinacin de flora ambiental humana y de superficies parte 1 , parte 2 y parte 3 Determinacin de Flora Ambiental Procedimiento: Marque una caja de Agar nutritivo y otra de Agar Sabouraud con cinta en la base, con los siguientes datos: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y flora ambiental. Escoja un sitio seguro en el laboratorio o en la Universidad. Recuerde: No salir con la bata del laboratorio Abra las cajas y exponga al aire por 15 a 30 minutos.

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 Pasado el tiempo, Reunir todas las cajas de Agar nutritivo con la tapa hacia arriba, envulvalas con cinta de enmascarar y mrquelas con el nmero del grupo. Incubar a 37 c por 24 a 48 horas. Reunir todas las cajas de Agar Sabouraud con la tapa hacia arriba, envulvalas con cinta de enmascarar y mrquelas con el nmero del grupo. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das Determinacin Flora de Superficie El anlisis de la superficie se realiza antes de hacer la limpieza y despus Antes de Limpiar Marque una caja de agar nutritivo y otra de agar sabouraud con cinta en la base, con los siguientes datos: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y superficie antes de limpiar. Escoja una superficie en el laboratorio (mesones, pisos, pared) Delimite con la plantilla de cartulina (4x4 cm. aproximadamente) el sitio a muestrear Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estril, introduzca el hisopo para humedecer el algodn. Coloque el tubo en la gradilla. Pase el hisopo humedecido sobre toda la superficie delimitada Encienda el mechero de Bunsen Abra la caja de agar nutritivo marcada cerca del mechero y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja. Abra la caja de agar Sabouraud marcada cerca del mechero y realice el mismo procedimiento que realiz con el Agar nutritivo. Cierre la caja. Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox. Deje las cajas utilizadas en un sitio determinado del mesn de trabajo. Procedimiento de Limpieza Limpie la zona delimitada con agua y jabn. Enjuague, seque y luego desinfecte con alcohol, agua mezclada con clorox o algn desinfectante de su inters. Deje secar. Despus de Limpiar

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 Marque una caja de agar nutritivo y otra de Agar Sabouraud con cinta en la base, con los siguientes datos: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y superficie despus de limpiar. Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estril, intro duzca el hisopo para humedecer el algodn. Coloque el tubo en la gradilla. Pase el hisopo humedecido sobre toda la superficie delimitada y limpia. Abra la caja de agar nutritivo marcada cerca del mechero y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja. Abra la caja de agar sabouraud marcada cerca del mechero y realice el mismo procedimiento que con el agar nutritivo. Cierre la caja. Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox. Deje las cajas utilizadas en un sitio determinado del mesn de trabajo. Reunir todas las cajas de Agar Sabouraud con la tapa hacia arriba, envulvalas con cinta de enmascarar y mrquelas con el nmero del grupo. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das

Determinacin de Flora Humana Procedimiento Antes de Limpiar Marque una caja de Agar nutritivo con cinta en la base, con los siguientes datos: No. de grupo, fecha, medio de cultivo y flora humana antes de limpiar. Escoja un rea en el cuerpo de un compaero de grupo. Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estril, introduzca el hisopo para humedecer el algodn. Coloque el tubo en la gradilla. Pase suavemente el hisopo humedecido sobre el rea escogida. Abra la caja de agar nutritivo marcada cer ca del mechero y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja. Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox. Deje las cajas utilizadas en un sitio determinado del mesn de trabajo. Procedimiento de Limpieza 170

 Limpie el rea elegida con agua y jabn. Enjuague y seque. No aplique alcohol ni clorox. Despus de Limpiar Marque una caja de agar nutritivo con cinta en la base, con los siguientes datos: No. De grupo, fecha, medio de cultivo y flora humana despus de limpiar. Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estril, introduzca el hisopo para humedecer el algodn. Coloque el tubo en la gradilla. Pase suavemente el hisopo humedecido sobre el rea escogida, limpia. Abra la caja de agar nutritivo marcada cerca del mechero y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja. Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox. Deje las cajas utilizadas en un sitio determinado del mesn de trabajo. Reunir todas las cajas de Agar Sabouraud con la tapa hacia arriba, envulvalas con cinta de enmascarar y mrquelas con el nmero del grupo. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das Laboratorio No. 5 Observacin y recuento de colonias de las cajas de Agar Nutritivo de la Prctica de Flora ambiental y Flora Humana Materiales y equipos:

Mechero, microscopio, estereoscopio, lminas portaobjetos y cubreobjetos, cuentacolonias, papel carbn, cajas de Petri y tubos con cultivos realizados en el laboratorio No 2: Mtodos de siembra de microorganismos y en el laboratorio 4: Flora ambiental humana y de superficie, Azul de lactofenol, aguja de diseccin. Objetivos 1. Diferenciar las formas de crecimiento bacteriano en los diferentes medios de cultivo utilizados. 2. Realizar el recuento de las diferentes colonias. Procedimiento Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Recuento microbiano 171

 Solicite al coordinador del laboratorio las cajas sembradas en la prctica: Mtodos de siembra de microorganismos y "Determinacin de flora ambiental, humana y de superficie" Al lado del mechero abra las cajas correspondientes a flora humana y ambiental y observe la presencia de colonias. Preferiblemente utilice el estereoscopio colocando debajo de la caja un fondo negro. El crecimiento se observa como puntos de diferentes colores y formas sobre la superficie del agar. Realice el recuento de colonias en cada una de las cajas. Cuente las colonias de bacterias presentes en la superficie del Agar. Exprese el recuento en unidades UFC. Revise el grado de contaminacin bacteriana de las cajas sembradas. Un nmero de colonias superior a 15 indica alto grado de contaminacin, por lo tanto deben revisasrse las medidas de limpieza Verifique la efectividad de la limpieza y desinfeccin que realiz. A cada tipo de colonia que se observa, se le debe hacer el estudio macroscpico teniendo en cuenta las siguientes caractersticas: Tamao: puntiforme, pequea, mediana, grande, extendida Forma: Redonda, ovalada, irregular, filamentosa, rizoide Elevacin: Plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada Borde: Entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado Superficie: Brillante o mate. Consistencia: dura, blanda Aspecto: hmedo, seco, cremoso, mucoso, granuloso, algodonoso. Color: blanco, crema, gris, transparente. Crecimiento: Abundante, moderado, escaso Caractersticas especiales: pigmentos, hemlisis. Anote y dibuje sus observaciones. Observe el crecimiento de mohos y levaduras. Los primeros se observan algodonosos, de diferentes colores; y las levaduras como colonias opacas de color crema, amarillo o rosado.

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 Realice el recuento y recuerde: cuando se obtiene un recuento mayor a 15 colonias indica un ambiente muy contaminado. Qu nivel de contaminacin tiene el ambiente que usted eligi? Analice los resultados de los recuentos antes y despus de limpiar, escriba algunas sugerencias en cuanto a las metodologas de limpieza utilizadas. Observe el crecimiento bacteriano en los caldos nutritivos y en las cajas de agar. Anote las diferencias. Realice una evaluacin objetiva de sus aislamientos y siembras, escriba algunas recomendaciones para sus prximas siembras. Preguntas Observa diferencias en el crecimiento y cantidad de colonias en las cajas de antes de limpiar y despus de limpiar tanto para flora humana como para flora de superficies? A qu se deben esas diferencias? Anote sus conclusiones. Una vez terminada esta seccin de la prctica, envuelva las cajas Petri con cinta de enmascarar. Marque en la cinta el nmero del grupo. Entregue el material al grupo encargado de la esterilizacin. Despus del proceso de esterilizacin, espere que el material este fro para proceder con el lavado de la siguiente manera: 1. Retire los restos de agar y cinta de enmascarar y depostelos en una bolsa para basura. No deje residuos en los vertederos !!! 2. Enjabone las cajas y dems material utilizado. 3. Enjuague bien, deje escurrir y seque el material. 4. Entregue todo el material al coordinador del laboratorio. Recuerde dejar el laboratorio en perfecto estado de limpieza Laboratorio No. 6 Factores que afectan el crecimiento de los microorganismos Materiales y equipos:

Tubos con caldo nutritivo estril, tubo con Tioglicolato, 1 tubo con caldo nutritivo pH 3.0, 1 tubo con caldo nutritivo pH 7.0, 1 tubo con caldo nutritivo pH 11.0, aceite

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mineral estril, asas bacteriolgicas, pipeta estril, gradilla, incubadora, nevera, tubo con cepa bacteriana, mechero Bunsen. Objetivos 1. Evaluar el efecto de los factores intrnsecos y extrnsecos sobre el crecimiento bacteriano. 2. Conocer tcnicas de identificacin de microorganismos basados en su capacidad metablica. Procedimiento Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Control del crecimiento microbiano y observar los vdeos: Factores que afectan el crecimiento de los microorganismos parte 1 y parte 2 A. Influencia de la temperatura Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos: Tubo 1: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 4C Nevera Tubo 2: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 20C Ambiente Tubo 3: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 37C Incubadora Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Separe los tubos de nevera y temperatura ambiente, entrguelos al coordinador del laboratorio para que los incube a 4c y 18c. Los otros tubos envulvalos en cinta de enmascarar, mrquelos con el numero del grupo y entrguelos al coordinador para incubarlos a 37C Cumplido el tiempo de incubacin observe en cada tubo la presencia de crecimiento en este caso la bacteria. Establezca que tipo de bacteria es de acuerdo a sus rangos ptimos de adaptacin a la temperatura B. Influencia del pH Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos: Tubo 1 pH 3.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 3.0 Tubo 2 pH 7.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 7.0 Tubo 3 pH 11.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 11.0 174

 Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar. Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Incube los tres tubos a temperatura de 37 C por 24 a 48 horas. Cumplido el tiempo de incubacin observe la presencia de turbidez en los tubos, lo cual indica que hay crecimiento. Cul fue el pH ptimo para el crecimiento de la bacteria en estudio. C. Influencia de la Tensin de oxgeno Marque los tubos de la siguiente manera Tubo de Tioglicolato: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y tioglicolato y microaerofilo (recuerde que el tioglicolato se usa para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos de microorganismos microaerofilos Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y aerobio. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y anaerobio. Esterilice el asa recta o curva y djela enfriar Recoja con el asa estril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados. Esterilice el asa. Adicione 2 ml de aceite mineral estril a los tubos de tioglico lato y a el anaerobio para crear un ambiente de anaerobiosis. Incube los tubos a 37C por 24 a 48 horas. Cumplido el tiempo de incubacin observe la presencia de crecimiento en los tubos. Determine en que ambiente creci la bacteria. Procedimiento para la lectura Solicite los tubos de temperatura ambiente, nevera e incubadora al coordinador de laboratorio. Colquelos en orden por temperatura, pH, y disponibilidad de oxgeno. Observe si se presenta crecimiento (turbidez) y si el crecimiento es escaso , moderado o abundante.

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 Anote sus observaciones y si el crecimiento microbiano es igual o diferente para las diversas condiciones de pH, temperatura y Tensin de oxgeno. De acuerdo con lo analizado clasifique el microorganismo segn su necesidad de oxgeno en aerobio, anaerobio, micro aeroflico, anaerobio facultativo. Segn la temperatura ptima de crecimiento en psicrfilo, mesfilo o termfilo y cual es el pH ideal para su ptimo desarrollo. Cul es la utilidad de la anterior evaluacin? Qu factores microorganismos? intrnsecos y extrnsecos afectan el crecimiento de los

Una vez termine sus observaciones, envuelva los tubos en cinta de enmascarar, entrguelos al grupo encargado de la esterilizacin Laboratorio No. 7 Metabolismo microbiano, reacciones bioqumicas de algunas bacterias Materiales y equipos: Tubos con los siguientes medios de cultivo inclinados estriles Lisina Hierro Agar LIA Triple azcar hierro TSI Citrato CIT SIM

Tubos con los siguientes medios lquidos estriles Caldo lactosado BRILLA con campana de Durham Caldo nutritivo CN Cajas de petri con los siguientes medios estriles Agar nutritivo AN Eosina azul de metileno agar EMB S.S. agar SS Microscopio, asas bacteriolgicas, mechero de bunsen, incubadora, bacteria Objetivo 1. Conocer tcnicas de identificacin de microorganismos basados en su capacidad metablica Procedimiento

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Para iniciar el desarrollo de la prctica debe previamente realizar un estudio atento de la teora sobre: Medios de cultivo, realice una revisin de los fundamentos, forma de actuacin e interpretacin de los siguientes medios de cultivo: Lisina hierro agar, Triple azcar hierro, Citrato de Simmons agar, SIM, Caldo Lactosado bilis verde brillante, Eosina azul de Metileno agar, Agar Salmonella Shigella, sus componentes, inhibidores, indicadores de pH. Observe los vdeos: Metabolismo microbiano parte 1 , parte 2 Realice una descripcin de todos los medios de cultivo antes de ser inoculados. Para iniciar el proceso de identificacin de cultivo que le correspondi, realice una tincin de Gram de la bacteria entregada, observe al microscopio e identifique la morfologa bacteriana Marque muy bien todos los medios con el No. de la cepa, No. del grupo y nombre del medio de cultivo, luego proceda a inocular todos los medios como se describe a continuacin: Esterilice el asa, djela enfriar para luego tome un poco de la muestra de bacterias y luego inocule los medios de la siguiente manera: Tubos con agar inclinado TSI, LIA, CIT realice una puncin en el fondo del tubo y una estra en la superficie. Tubo con medio semislido agar SIM: se inocula con una puncin hasta el fondo del tubo. Tubos con medio lquido BRILLA, CN: tome un poco de la muestra y suspndala directamente en elcaldo, homogenice. Cajas de agar nutritivo AN, EMB, SS: utilice el sistema de siembra de rejilla para obtener unidades formadoras e colonias individuales. . Una los tubos y cajas con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero del grupo y llvelas a incubar a 37 C durante 24 a 48 horas. Cumplido el tiempo de incubacin observe los resultados obtenidos, interprete los resultados. El agar LIA se debe leer en la superficie y el fondo del tubo. En el medio se evala la decarboxilacin de lisina que se evidencia en el fondo del tubo por el viraje a violeta del indicador prpura de metacresol. Tambin se evala la deaminacin de la lisina la cual ocurre en la parte superior del tubo y se evidencia con un color violeta-rojizo. La Fermentacin de la glucosa produce acidificacin del medio y un cambio de color del indicador de violeta a amarillo. Eventualmente se puede observar la Produccin de cido sulfhdrico (H2S) por la presencia de color negro. El agar Citrato Si se utiliza el citrato como fuente de carbono, se incrementa el pH del medio y el indicador vira de verde a azul. Cuando no se utiliza el citrato, el indicador de ph azul de bromotimol permanece de color verde 177

El agar TSI En el tubo TSI debe leerse siempre la superficie y el fondo. La fermentacin de glucosa se observa en el fondo del tubo por el cambio de color del indicador de rojo a amarillo. Tambin puede observarse la fermentacin de lactosa y sacarosa en la superficie del tubo, por el cambio del indicador de rojo a amarillo. La produccin de H2S se observa por la aparicin de un precipitado negro, debido a las sales de hierro presentes Agar Sim La motilidad se observa por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicho canal. En este medio tambin puede observarse la formacin de H2S por el ennegrecimiento del medio. Caldo Brila Se observa la fermentacin de la lactosa con formacin de gas, en las campanas de Durham. Para la determinacin del Nmero Ms Probable de microorganismos, se observan cada uno de los tubos que tienen presencia de gas y el nmero de estos se relaciona en la tabla del Nmero Ms Probable. En el caldo nutritivo se realiza la prueba de Indol la cual determina la produccin de Triptofanasa por el microorganismo. Cumplido el tiempo de incubacin agregar 1 ml del reactivo de Kovacs sobre el caldo de cultivo. Cuando hay molculas de Indol libre se produce un anillo de color rojo en la superficie del medio de cultivo. En el Agar McConkey las bacterias que degradan lactosa producen cidos orgnicos, formando colonias color rojo con un halo turbio debido al descenso de ph provocado por los cidos biliares.Las bacterias que no fermentan lactosa, no bajan el ph, por lo tanto se observan colonias incoloras. En el Agar Eosina azul de metileno- lactosa-sacarosa, Las bacterias fermentadoras forman colonias de color rojo o negras brillantes.Las bacterias No fermentadoras producen colonias incoloras. Las bacterias Gram positivas, especialmente, resultan inhibidas en su crecimiento, por los colorantes presentes en el medio EMB. En el agar SS (Salmonella - Shiguella) . Las colonias de grmenes Lactosa positivos son rosadas hasta rojas las colonias de grmenes lactosa negativos son incoloras. Las colonias de microorganismos formadores de H2S presentan un centro negro Laboratorio No. 8 Efecto de los desinfectantes sobre microorganismos Objetivo Evaluar la eficacia de algunos desinfectantes sobre algunos microorganismos Cuestionario 1. Cuales agentes qumicos son ms efectivos en el control de microorganismos?

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2. Con que criterios se selecciona un agente qumico para desinfectar: superficies, ambientes, objetos contaminados, la piel? 3. Que pruebas se utilizan para probar la efectividad de un desinfectante? Materiales Hisopos estriles, Discos de papel filtro estriles, Pinzas estriles, Hipoclorito de sodio al 5%, Isodine solucin, Jabn desinfectante, Timsen, Creolina, Alcohol antisptico, 4 cajas de petri con agar nutritivo, 2 cajas con agar sabouraud, Cepas bacterianas en caldo nutritivo, Frasco de boca ancha, cuenta colonias, regla. Procedimiento Marque las 2 cajas de agar nutritivo con: el nmero. del grupo, fecha y microorganismo en la tapa de la caja. Codifique los desinfectantes a emplear con un cdigo. Ejemplo Hipoclorito 01, CTmanos 02, CT industrial 03, Creoloina 04, Glutaraldehido 06. Coloque en la base de la caja en forma equitativa, los cdigos de los desinfectantes con un marcador de vidrio. Encienda el mechero. Humedezca un hisopo estril en el tubo de microorganismo a sembrar. Escurra el exceso con las paredes internas del tubo. Siembre masivamente cada una de las bacterias en la caja de agar nutritivo que le corresponde. Tenga en cuenta que las levaduras y el hongo se siembran en agar sabouraud. Descarte los hisopos en el frasco de boca ancha con solucin de hipoclorito. Con las pinzas estriles tome un disco de papel de filtro y sumrjalo en la solucin de desinfectante y colquelo sobre el nmero que le corresponde segn la codificacin de la base de la caja. Repita lo mismo con cada uno de los desinfectantes utilizados en cada una de las cajas. Coloque las pinzas dentro del frasco de boca ancha.

Envuelva las cajas de agar nutritivo con cinta y mrquelas con el nmero del grupo. Leve las cajas a incubar a temperatura de 37 C. por 24 horas. Cumplido el tiempo de incubacin tome las cajas y con ayuda del cuenta colonias observe la formacin de halos de inhibicin del crecimiento, que aparecen como zonas transparentes alrededor del crecimeinto bacteriano.

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Mida el tamao de los halos de inhibicin con una regla. Segn sus observaciones indique cul sustancia es mejor en el control de cada microorganismo de prueba Una vez terminada la prctica, descarte los escobillones desinfectados en una bolsa para este fin, envuelva las cajas en cinta de enmascarar, mrquelas con el nmero del grupo y entrguelas al grupo encargado de la esterilizacin. Una vez esterilizado el material, proceda al lavado como se ha indicado en prcticas anteriores Lecturas Lectura 1. El microbilogo como investigador Dra. Ana Lilia Garca Prez. Biotica y Microbiologa Rev Cubana Angiol y Cir Vasc 2003; 4 Instituto Nacional de Angiologa y Ciruga Vascular Debe participar en la investigacin de accidentes y posibles enfermedades profesionales causadas por posibles fugas de material parcialmente infeccioso o txico de origen biolgico, participar en la confeccin de proyectos, protocolos y temas relacionados con el diagnstico y desarrollo de productos que involucren agentes biolgicos y organismos modificados genticamente, as como de nuevas instalaciones, recomendaciones o ampliaciones, desde el punto de vista de la seguridad biolgica; velar por la descontaminacin del material usado y tratamiento en condiciones de seguridad, de los desechos infecciosos, as como establecer un registro para la recepcin, desplazamiento y eliminacin del material de carcter infeccioso reconocido o sospechoso, para la desinfeccin de los equipos. Debe participar en la elaboracin de la documentacin relacionada con la seguridad biolgica. Atrs ha quedado la imagen del cientfico aislado, que actuaba por sus propios medios en su laboratorio, han aparecido entonces como parte del desarrollo cientfico-tcnico otros modelos de investigacin con un fundamento claramente establecido de la metodologa del conocimiento cientfico donde la ciencia supone la bsqueda de la verdad, y antepone produccin, difusin y aplicacin del conocimiento y esto lo distingue y lo califica en el sistema de la calidad humana y lo vincula tanto a la relacin sujeto-objeto como sujeto-sujeto. Toda actividad humana supone el establecimiento de un sistema de relaciones que hace posible el trabajo cientfico, cuya esencia es la produccin cientfica que a su vez est integrada por diferentes colectivos de personas -relacionadas para desempear tareas especficas- que han seguido un proceso de perfeccionamiento y especializacin que las distingue de otros procesos sociales.

Relacin entre tica y ciencia La relacin entre tica y ciencia es uno de los principales problemas que enfrenta hoy

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la tica aplicada; aqu la ciencia aparece, podra decirse, por lo menos en 3 roles diversos: 1. Como proporcionadora de informacin para la reflexin moral. 2. Como campo en el que hay que tomar decisiones de significacin moral. 3. Como objeto de enjuiciamiento moral, en el caso de conductas cientficas morales "aprobadas o impugnables".16 La ciencia, dotada de una racionalidad operativa, depende ms que nunca de la tecnologa que hace posible los avances. Pero el fundamento que pretende liberar a la tecnociencia de todo control tico no debe hacernos olvidar el otro fundamentalismo, la pretensin de poner lmites al progreso tecnolgico desde una visin intangible de lo humano y de la naturaleza, ya que no podemos saber de antemano los resultados positivos o negativos de procesos que en su gran medida son impredecibles. No hay conocimiento proftico de la historia humana y toda pretensin de predecir el futuro est saturada de nuestros intereses y temores presentes.16 Cuando la microbiologa y la biotica no establecen una relacin armoniosa y s de conflicto, pueden ocasionar la manipulacin del cientfico y convertir un adelanto cientfico en un desastre para la humanidad.18 Como ejemplo de esto tenemos distintas etapas de conflictos blicos en la humanidad que han puesto en peligro la existencia de comunidades humanas, estos procedimientos se conocen actualmente como guerras biolgicas y tienen como objetivo utilizar las potencialidades que tienen los microorganismos para afectar al ser humano. Cuba ha sido escenario de esas contiendas y enfermedades como el dengue y la fiebre porcina han sido agentes biolgicos procedentes de campaas de EE.UU. contra nuestro pas. Con motivo de los sucesos ocurridos en EE.UU. se habla de la reaparicin del ntrax o carbunco, enfermedad provocada por el Bacillus anthracis, que cumple con los requisitos indispensables para que los agentes biolgicos sean eficaces como arma biolgica: alta capacidad infecciosa, facilidad de reproduccin, suficiente viabilidad y estabilidad para las necesidades militares, lo que hace pensar en su manipulacin en el laboratorio. Este agente patgeno ha sido amplia y cuidadosamente estudiado por los ejrcitos imperialistas desde la Segunda Guerra Mundial y sigue representando un importante objeto de produccin y almacenamiento.19 Lo que el imperialismo olvid es que los microorganismos viajan sin pasaporte y no piden visa para entrar en un pas o en un cuerpo y que los fenmenos de "patologa social", por ejemplo, la violencia, son contagiosos a travs de fronteras como las infecciones; con el agravante de que para ellos no se han creado vacunas Entre otras tareas del microbilogo est el inters de investigar, porque el sistema cientfico actual se caracteriza por la complejidad de su dinmica derivada de los cambios profundos ocurridos durante los ltimos 20 aos dentro del propio campo de la ciencia y del medio socioeconmico circundante.

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Lectura 2 Fagos contra bacterias http://www.consumaseguridad.com/web/es/investigacion/2003/11/18/94 22.php La fagotipia o capacidad de los virus para infectar bacterias se est ensayando para la deteccin de patgenos alimentarios y su eventual eliminacin 1 8 de noviembre de 2003 | Bibliografa JOS JUAN RODRGUEZ JEREZ Los fagos, virus que infectan bacterias, son elementos biolgicos de gran potencial, sobre todo en la deteccin de patgenos en alimentos, superficies y medio ambiente. Su uso puede permitir, sin necesidad de cultivo, poner de manifiesto los patgenos, disear estrategias para su inactivacin y poder aplicarlas a la produccin normal. Y todo en tiempo prcticamente real. Los virus son organismos que no pueden sobrevivir si no es en presencia de clulas metablicamente activas. Cuando las clulas que infectan son bacterias, hablamos de fagos. stos pueden ser especficos de algunos microorganismos, hasta el punto que para la identificacin o la caracterizacin de una bacteria se emplean con frecuencia fagos concretos. La capacidad que tienen virus concretos para infectar bacterias especficas recibe el nombre de fagotipia. Este mecanismo, que va mucho ms all de las infecciones que puedan provocar en animales y personas, est abriendo diversas vas de trabajo en el mbito alimentario. Una de ellas, de carcter ms terico, es la eliminacin de patgenos en alimentos. Otra, ms real, es su uso en la identificacin de bacterias peligrosas en alimentos o superficies, lo que facilita su rpida deteccin y la instauracin de medidas preventivas. Fagos y control Los mecanismos por los que se rige el proceso de fagotipia son conocidos desde hace aos. En esencia, comprende cuatro etapas que suelen repetirse en la mayor parte de los casos y que arrancan en la infeccin de la bacteria por el fago para culminar en la destruccin de las bacterias que actan como hospedadoras. Previamente, se da la destruccin de los fagos inservibles y la amplificacin de los que resultan tiles para el proceso en el interior de las bacterias. El proceso se inicia cuando el se aproxima a una bacteria, contacta con su pared, se adhiere a ella y le inyecta su material gentico. Como todos los virus, los fagos son partculas que slo mantienen actividad vital mientras infectan una clula. En su interior, se apoderan de su capacidad metablica, usndola para su propia reproduccin. Cuando el proceso ha concluido, se rompe la clula, con lo que se liberan copias del virus listas para infectar nuevas clulas. De esta forma, el proceso avanza hasta que se destruyen todas las clulas por las que el fago muestra afinidad. Este mecanismo de 182

accin, al menos en teora, determina que el proceso sea en s mismo autolimitado, puesto que finaliza una vez se han destruido las bacterias especficas. Cuando se llega al final, las partculas vricas quedan latentes en la matriz sin mostrar actividad infectiva aparente. Aplicacin en la descontaminacin de alimentos La aplicacin de este mecanismo a la descontaminacin de alimentos est siendo valorada desde hace unos aos. Una de las propuestas en las que mayor esfuerzo se est dedicando es aadir fagos a las superficies de trabajo en las que se manipulan alimentos. En este caso, si los fagos se encontrasen con las bacterias a infectar, las atacaran y destruiran, eliminando el peligro de contaminacin hacia los alimentos. De la misma forma, en algunos alimentos se podra eliminar un patgeno por simple competencia. La gran ventaja de un sistema de estas caractersticas viene dado por la alta especificidad de los fagos para con bacterias especficas. Debido a ello, es razonable pensar que se eliminaran los microorganismos sin afectar a las clulas que componen los alimentos o su composicin nutritiva. No obstante, existen algunos inconvenientes importantes. El primero de ellos es de carcter biolgico. Hoy por hoy existen dudas acerca del potencial de los fagos para provocar alteraciones en otros microorganismos considerados en principio beneficiosos para los alimentos o la industria de transformacin. En particular, este extremo podra perjudicar los alimentos que vayan a ser fermentados, como yogures, quesos o embutidos. Asimismo, est por ver el grado de mutacin de los fagos y sus efectos. El fago, como cualquier virus, tiene altas tasas de mutacin de su cdigo gentico. En la medida que nuevas copias se liberan al medio tras replicarse e infectan otras clulas, hay que extremar las precauciones ante la aparicin sbita de desviaciones en el objetivo del mecanismo de accin. El segundo inconveniente, tanto o ms importante que el primero, es de tipo normativo. Las normas actualmente vigentes en la Unin Europea no permiten el empleo de fagos para este fin. Desde importantes sectores se entiende que su uso puede llevar a una relajacin en las medidas higinicas que deben imperar en las buenas prcticas de fabricacin. Si se emplease un sistema de lucha biolgica eficaz, y adems fuese barato, se considerara mucho ms efectivo y econmicamente ms rentable que la aplicacin de los actuales sistemas de descontaminacin. Por tanto, extremar las condiciones de limpieza, desinfeccin o control de materias primas, podran pasar a ser considerados objetivos secundarios, con el riesgo que ello implica. La Deteccin De Patgenos La aplicacin de fagos en la deteccin de patgenos es vista desde diversos sectores como mucho ms factible y realista a medio plazo que su uso para la eliminacin de microorganismos. En este caso, de lo que se tratara es de crear las condiciones adecuadas para permitir el crecimiento de los microorganismos que se quieran detectar. Cuando las bacterias patgenas se encuentran en fase de crecimiento, se procede a la deteccin por diferentes sistemas. 183

El ms sencillo es mediante un cultivo comparado. Es decir, a una muestra se le aaden los fagos especficos y a otra no. Las cultivamos en medios especficos y se lee la diferencia, de forma que si el resultado es idntico, no existe el patgeno, mientras que si es superior en la muestra inoculada se puede confirmar la existencia del peligro. Este protocolo es sencillo de hacer, pero requiere mucho tiempo (mnimo 48-72 horas) y trabajo. Para solucionarlo, se est trabajando sobre diferentes protocolos. Uno de ellos, desarrollado por el Ministerio de Defensa britnico, se basa en hacer una muestra por duplicado. Una de ellas queda como control y a la otra se le aaden los fagos especficos. Tras cuatro horas de incubacin, se realiza un anlisis de vitalidad celular (control de ATP). Si la muestra con fagos es menos vital que la de referencia el resultado es positivo. Bibliografa

Mosier-Boss PA, Lieberman SH, Andrews JM, Rohwer FL, Wegley LE, Breitbart M. 2003. Use of fluorescently labeled phage in the detection and identification of bacterial species. Appl Spectrosc. 57(9):1138-44 Stewart GS, Jassim SA, Denyer SP, Newby P, Linley K, Dhir VK. 1998. The specific and sensitive detection of bacterial pathogens within 4 h using bacteriophage amplification. J Appl Microbiol. 84(5):777-83 Lectura 3 Rumen y biogs Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. http://www.unsa.edu.ar/matbib/micragri/micagricap5.pdf La combinacin del reciclado de residuos animales con el cultivo de abonos verdes pueden proporcionar el nitrgeno necesario para la tierra agrcola. El reciclado puede hacerse mediante digestin anaerbica, pues el contenido relativo de nitrgeno es mayor en el estircol digerido que en el fresco. El lodo remanente en el digestor es una alternativa para mejorar los suelos hortcolas (1). Adems este proceso permite obtener metano, un combustible gaseoso. La metanognesis ocurre naturalmente en el rumen de los herbvoros. El aumento del inters popular para contrarrestar la polucin ambiental hace de la digestin anaerbica el medio conveniente para tratar tanto los efluentes lquidos como los desechos slidos, adems de constituir una fuente alternativa de energa. Metanognesis El dixido de carbono es comn en la naturaleza y es un producto importante del metabolismo energtico de los organismos quimioorganotrficos. Los procariotas reductores de CO2 ms importantes son los metangenos, un grupo de arqueobacterias anaerbicas estrictas que emplean generalmente el H2 como donante de electrones (2). Hay por lo menos diez substratos que se convierten en metano por la accin de uno u otro metangeno, todos los cuales liberan energa adecuada para la sntesis de ATP,

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incluyendo formiato, acetato, metanol, metilmercaptano y metilamina (3). Se los divide en tres clases: Substratos del tipo CO2 4 H2+ CO2 a CH4 + 2 H2O 4 HCOO- + 4 H + a CH4 + 3 CO2 + 2 H2O 4 CO + 2 H2O a CH2 + 3 CO2 Sustratos con grupo metilo 4 CH3OH a 3CH2+ CO2 + 2 H2O CH3OH + H2 a CH2 + H2O 4 CH3NH3Cl + 2 H2O a 3 CH2 + CO2 +4 NH2Cl Substrato de acetotrficas CH3COO- + H2O a CH2 + HCO3La conversin de acetato a metano aparece como un proceso ecolgico muy importante en digestores de residuos y en medios anxicos de agua dulce, donde no hay una competencia excesiva por el acetato con otras bacterias. A pesar de que la produccin de metano est muy extendida, son pocos los compuestos de carbono que sirven como precursores directos de la metanognesis. Por lo tanto, es un proceso que depende de la produccin de esos compuestos por otros organismos, a partir de la materia orgnica compleja (2). En muchos ambientes anxicos los precursores inmediatos del metano son el H 2 y el CO2 que se generan por las actividades de los organismos fermentadores. En el proceso general de produccin de metano a partir de la fermentacin de un polisacrido, como la celulosa, pueden intervenir hasta cinco grupos fisiolgicos de procariotas (3). Las bacterias celulolticas rompen la molcula de celulosa, de peso molecular elevado, en celobiosa y glucosa libre. Por accin de los fermentadores primarios, la glucosa origina cidos orgnicos, alcoholes, H2 y CO2. Todo el hidrgeno producido es consumido inmediatamente por las bacterias metanognicas, las acetognicas o las reductoras de sulfato si ste se halla en alta concentracin. Adems el acetato puede ser convertido en metano por otros metangenos (2). Etapas de la digestin anaerbica Hidrlisis de los polmeros complejos Acidognesis por fermentacin de los monmeros produciendo acetato, propionato, butirato, succinato, alcoholes, H2 y CO2 Acetognesis por fermentacin secundaria generando acetato, H 2, CO2 Metanognesis a partir de H2, CO2, acetato Los organismos clave en la conversin de compuestos orgnicos complejos a metano son los fermentadores secundarios, especialmente las bacterias oxidantes de cidos grasos o alcoholes que producen H2,. pues utilizan estos compuestos como fuente de 185

energa en cultivos mixtos con un consumidor de H2 a travs de una relacin sintrfica (sintrofia = comiendo juntos). La energa libre asociada a las conversiones de los cidos grasos es positiva, pero si la concentracin de H2 se mantiene muy baja debido al consumo constante por los metangenos pasa a tener signo negativo lo que determina su factibilidad. En la mayora de los ecosistemas anxicos, la acetognesis limita el proceso global porque la velocidad de crecimiento de los microorganismos intervinientes es generalmente muy lenta (3). Los metangenos estn muy extendidos en la tierra a pesar de su metabolismo especializado. Aunque la produccin de metano se produce en gran cantidad en los ambientes claramente anaerbicos como pantanos, zonas encharcadas o rumen, el proceso tambin se lleva a cabo en lugares como los suelos de bosques o praderas que podran ser considerados aerobios, debido a la formacin de microambientes anxicos en el interior de las partculas de suelo (4). La magnitud de la produccin de metano por las arqueobacterias es superior a la obtenida anualmente de los pozos de gas natural. Las principales fuentes son los eructos de los rumiantes y el gas liberado en las zonas pantanosas. Tambin se lleva a cabo la metanognesis en el intestino de los vertebrados y de los insectos que comen madera como las termitas. Se han encontrado metangenos viviendo como endosimbiontes de amebas y flagelados de vida libre acutica o albergados en el tubo digestivo de invertebrados (3). La metanognesis se observa con ms frecuencia en los ambientes terrestres y las aguas continentales que en el mar, debido a las proporciones ms bien altas de sulfato presentes en aguas y sedimentos marinos donde las bacterias reductoras de sulfato compiten con las poblaciones metanognicas por el acetato y el H2 disponibles (4). En el ocano los principales precursores de metano son las metilaminas apenas utilizadas por los reductores de sulfato, como la trimetilamina que es un producto importante de excrecin en los animales marinos (3). Arqueobacterias metanognicasSe clasifica a las metanobacterias en siete grupos principales que comprenden un total de 17 gneros. Hay bacilos cortos y largos, cocos con variada ordenacin, clulas en forma de placas y metangenos filamentosos. Unos son Gram positivos, otros Gram negativos (5). Cuando los metangenos crecen de forma autotrfica, el CO2 es la principal fuente de carbono, sin embargo el crecimiento de casi todos ellos es estimulado por el acetato y en algunas especies por ciertos aminocidos. En cultivos de laboratorio algunos metangenos del rumen necesitan de una mezcla de cidos grasos (3). Todos los metangenos utilizan NH+ como fuente de nitrgeno y algunas especies fijan N2 (Methanosarcina, Methanococcus). El nquel es un componente de una coenzima metanognica y est adems presente en las enzimas hidrogenasa y CO deshidrogenasa. Estos organismos tambin requieren hierro y cobalto para su crecimiento. Tienen algunas coenzimas exclusivas que son portadoras de C1 o intervienen en las reacciones de xido-reduccin como donadores de electrones (2).

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La reduccin del CO2 por lo general depende del H2, pero el formiato, el CO e incluso el Fe sirven como donadores de electrones. El Fe es oxidado a Fe++ y los electrones liberados se combinan con los protones para formar H 2, que es el donador inmediato en la metanognesis. Tambin los alcoholes pueden aportar electrones en unos pocos casos (2). En condiciones normales la variacin de energa libre durante la reduccin de CO 2 a metano con H2 es -131 kJ/mol, pero debido a la influencia de la concentracin de los reactantes en los ambientes naturales baja a cerca de -30 kJ/mol. La concentracin de H2 en las zonas metanognicas no es mayor a 10 mM (3). La etapa terminal de la metanognesis es la de conservacin de la energa. La reduccin est asociada con la extrusin de protones a travs de la membrana, creando una fuerza motriz de protones. La utilizacin del gradiente de protones mediante una ATPasa integrada a la membrana, impulsa la sntesis de ATP (2). Las metanobacterias autotrficas convierten el CO2 en material celular a travs de la va del acetil-CoA utilizada tambin por las bacterias homoacetognicas y las reductoras de sulfato, pero a diferencia de estas ltimas los metangenos integran las vas biosinttica y bioenergtica porque comparten intermediarios comunes. Las reacciones de la va del acetil-CoA tambin estn estrechamente relacionadas con la produccin de metano a partir de compuestos de metilo o acetato. El crecimiento de metanobacterias sobre compuestos de metilo tambin est ligado a la bomba de protones para la sntesis de ATP, pero en ausencia de H2 la generacin de los electrones necesarios requiere que alguno de los substratos se oxide. Esto se produce por una bomba de sodio ligada a la membrana citoplasmtica, que establece un gradiente de sodio a travs de la misma y conduce a la oxidacin de grupos metilo a CO2 (3). Rumen Los rumiantes son mamferos herbvoros que poseen un rgano especial en cuyo interior se lleva a cabo la digestin de celulosa y otros polisacridos mediante la actividad microbiana, porque estos animales carecen de las enzimas necesarias para digerirlos. El rumen tiene un tamao relativamente grande, con una capacidad de 100 a 150 litros en una vaca o 6 litros en una oveja, y se encuentra a una temperatura y acidez constantes (39C, pH 6,5). La naturaleza anxica del rumen es un factor significativo para su funcionamiento (2). El forraje llega al rumen o panza, mezclado con la saliva que contiene bicarbonato y all es sometido a un movimiento rotatorio durante el cual ocurren las fermentaciones. Esta accin peristltica facilita la adherencia microbiana al material celulsico suspendido (3). Figura 5.1. Digestin anaerbica en el rumen (3) El alimento permanece en el rumen de nueve a doce horas. El fluido ruminal contiene gran cantidad de clulas, entre ellas 1010 a 1011 bacterias /mL. Las bacterias y los 187

hongos celulolticos actan produciendo el disacrido celobiosa y glucosa. sta experimenta una accin bacteriana en la que se forman principalmente los cidos actico, propinico y butrico, dixido de carbono y metano (figura 1). Los cidos grasos atraviesan la pared del rumen y pasan a la sangre. Desde all van a los tejidos donde son utilizados como la principal fuente de energa. Adems los microorganismos del rumen sintetizan aminocidos y vitaminas esenciales para el animal (3). La masa de forraje pasa gradualmente a la redecilla donde se forman unas porciones llamadas rumias que regresan a la boca y son masticadas otra vez. Cuando esta masa slida queda bien fragmentada es engullida de nuevo pero pasa directamente al libro y termina en el cuajar, donde las condiciones son cidas y all se inicia un proceso digestivo que continua en el intestino. Muchas de las clulas microbianas formadas en el rumen son digeridas y constituyen la principal fuente de protenas y vitaminas del animal, dado que la pastura es un alimento deficiente en protenas (3) . Las reacciones qumicas que ocurren en el rumen requieren la actividad combinada de una variedad de microorganismos entre los que predominan las bacterias anerobias estrictas, dado que el potencial de reduccin es de -0,4 V. La concentracin de O2 a ese potencial es 10-22 M. Fibrobacter y Ruminococcus son las bacterias celulolticas ms abundantes del rumen, pero tambin degradan xilano. Fibrobacter posee una celulasa periplsmica (entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa) por lo que debe permanecer adherido a la fibrilla de celulosa mientras la digiere, en cambio Ruminococcus produce una celulasa que es secretada. Los Ruminobacter y Succinomonas amilolticos se encuentran en minora, as como Lachnospira que digiere pectinas. Los productos de fermentacin de estas y otras bacterias son utilizados por otros microorganismos. El succinato se convierte en propionato y CO2, y el lactato es fermentado a acetato y otros cidos por Megasphera y Selenomonas (3). El H2 producido en el rumen durante los procesos fermentativos nunca se acumula, ya que es utilizado rpidamente por los metangenos ( Methanobrevibacter, Methanomicrobium) para reducir CO2 a CH4. Otra fuente de H2 y CO2 es el formiato. La composicin media de los gases acumulados en el rumen es aproximadamente 65% CO2 y 35% CH4, y se expulsan al exterior por los eructos del animal. El acetato no de retencin acetotrficos abundan. Los llega a convertirse en metano dentro del rumen debido a que el tiempo es demasiado corto para que puedan desarrollarse los organismos y adems las bacterias sintrficas degradadoras de cidos grasos no cidos atraviesan la pared del rumen hacia la sangre del animal (2).

El contenido ruminal posee aproximadamente 106 protozoos /mL, principalmente ciliados. Muchos son anaerobios obligados, una caracterstica poco frecuente entre los organismos eucariticos. Los protozoos comen bacterias y ejercen algn control sobre densidad de las mismas en el rumen. Tambin hay hongos anaerbicos que alternan una forma flagelada y otra inmvil. Degradan celulosa, hemicelulosas, pectinas y parcialmente lignina (2). Las condiciones ambientales del rumen son constantes para cada tipo de

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alimentacin. El cambio brusco de pasturas a cereales conduce a un desequilibrio en la composicin microbiana que causa enfermedad o an la muerte del animal, por el crecimiento explosivo de Streptococcus bovis que hidroliza almidn produciendo abundante cido lctico y acidificando el rumen. Esta acidosis causa la eliminacin de la microbiota normal (5). Digestores anaerbicos Para producir biogas se pueden emplearse diversos materiales orgnicos tales como residuos vegetales, estircol, basura domstica, camalotes, algas, efluentes de las industrias de alimentos, bebidas, pulpado y papel, y qumicas (6). Durante la bioconversin de materiales orgnicos a metano las distintas etapas tienen distinta velocidad: la degradacin de la celulosa ocurre en semanas, la de las hemicelulosas y protenas en das y la de las molculas pequeas, como azcares, cidos grasos y alcoholes, en horas, pero la lignina no es degradada en la mayora de los sistemas de digestin anaerbica (7). El proceso en un digestor difiere de otros tipos de fermentaciones en que no es necesario utilizar cultivos puros de microorganismos. Las diversas bacterias capaces de descomponer las sustancias orgnicas y producir biogs estn ampliamente distribudas en la naturaleza. Se encuentran, por ejemplo en los excrementos animales y humanos. Estas bacterias pueden activarse y mantenerse indefinidamente con un manejo adecuado (8). El tamao del digestor est determinado por el contenido de slidos y el tiempo de retencin del residuo para un tipo de carga dado. Los materiales insolubles, tales como papel, paja y otros lignocelulsicos, pueden requerir un tratamiento de das (o an aos en ciertos rellenos sanitarios) mientras que puede lograrse hasta una reduccin del 95% con una carga diaria de 20 kg / m3 de digestor cuando el residuo es soluble (5). Hay una amplia variedad de diseos pero los digestores de una sola etapa con campana fija o flotante (figuras 2 y 3) son los ms usados en ambientes rurales. El estircol digerido es recuperado como un lodo con 10 a 12% de slidos y un sobrenadante con 2 a 3% de slidos. La digestin ruminal est estratificada en dos sub-fases una lquida, y otra con alto contenido en slidos donde es mayor la actividad metablica y la concentracin de intermediarios. Similarmente los digestores de dos fases tienen un mejor rendimiento en metano que los de una sola (9). El digestor de campana fija cuyo esquema se muestra en la figura 3, tiene la cubierta inmvil y cuenta con la presin hidrosttica autogenerada para distribuir el biogs. Como se colecta el gas en el mismo digestor, parte de la suspensin digerida es desplazada hacia un tanque de almacenamiento cuyo nivel sube con la produccin y baja con el uso del gas. La ventaja de este modelo consiste la ausencia de partes mviles corrobles (10).

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En la figura 2 se da el esquema de un digestor con campana colectora de gas flotante, que puede estar directamente sumergida en la suspensin o bien en el aceite retenido entre las dos paredes concntricas del tanque para lograr el sellado. La descarga del lquido se hace por rebalse a travs de un cao y la de slidos por una abertura de inspeccin. La presin del gas depende del peso de la campana, por lo que suele colocarse bolsas de arena sobre la misma (6). El digestor tipo bolsa que se muestra en la figura 4, es til en las regiones subtropicales y tropicales (11). Otros tipos de reactores permiten el manejo de grandes cantidades de residuos por unidad de volumen generando biogas a mayor velocidad, como el de contacto anaerbico (figura5) (12). Residuos Los materiales que se pueden usar para la generacin de metano son muy variados, por ejemplo: residuos de cosechas: maloja de caa de azcar, malezas, paja, rastrojo de maz y otros cultivos; residuos de origen animal: desechos de establos (estircol, orina, paja de camas), camas de gallinas ponedoras, boigas de cabras y ovejas, desperdicios de matadero (sangre, vsceras), desperdicios de pesca, restos de lana y cuero; residuos de origen humano: basura, heces, orina; residuos agroindustriales: tortas de oleaginosas, bagazo, salvado de arroz, desechos de tabaco y semillas, desperdicios del procesamiento de hortalizas y frutas, limos de prensas de ingenios azucareros, residuos de t, polvo de las desmotadoras e industria textil; mantillo forestal: ramitas, hojas, cortezas; plantas acuticas: camalote, algas marinas (14). La DQO es la cantidad total de oxgeno (en mg) necesaria para oxidar completamente las substancias orgnicas e inorgnicas contenidas en un litro de suspensin y se emplea como medida indirecta de la cantidad de substrato transformable. Otra manera de expresar la cantidad de substrato disponible es mediante los valores de slidos totales (ST) que es el material remanente despus de evaporar a 103-105C o de slidos voltiles (SV) que es el material orgnico descompuesto a 550 + 50C (13). Otro parmetro de la digestibilidad de los residuos es la demanda biolgica de oxgeno (DBO) que es el consumo de oxgeno, en mg/L de suspensin, durante la degradacin por microorganismos durante 5 das a 20C. Tanto la DBO como la DQO son proporcionales al contenido de materia orgnica en la suspensin a degradar, pero la primera es ms representativa de la degradabilidad de la misma. Tambin puede usarse el valor de carbono orgnico total (COT) que se obtiene midiendo el CO 2 formado en la combustin (8) . En el cuadro siguiente se muestra la digestibilidad de algunos vegetales expresada como el % de slidos voltiles desaparecidos luego de una incubacin de 48 hs con lquido ruminal diludo en buffer fosfato-bicarbonato a 39C y otras 48 hs con pepsinaHCl, a igual temperatura para hidrolizar parcialmente las protenas de los microorganismos y del sustrato (7). Material Slidos voltiles totales Slidos voltiles digeridos % peso seco % SVT 190

Gramneas 43,3 - 99,3 15,0 - 87,0 Brassica sp. 54,6 89,8 33,5 93,8 Batatas 69,0 97,7 41,0 98,7 Camalotes 69,7 88,1 12,0 80,1 Algas marinas 19,7 74,5 21,0 83,4 La digestin anaerbica de madera no es tcnicamente factible sin algn tipo de pretratamiento que aumente su biodegradabilidad (5). En el recuadro siguiente se muestra la relacin C/N de varios materiales residuales. Contenido de nitrgeno y relacin C/N en varios residuos (14) animales C/N %N vegetales C/N %N Desperdicios Heno 12 4 de pescado 5,1 6,5-10 Amaranto 11 3,6 de matadero 2 7-10 Alfalfa 16-20 2,4-3 Orina 0,8 15-18 Paja 48 1,1 Sangre 3 10-14 Algas marinas 19 1,9 Estircol equino 25 2,3 Restos de lino 58 1,0 Estircol vacuno 18 1,7 Paja de trigo 128 0,3 Estircol de corral 14 2,15 Aserrn 511 0,1 Heces humanas 6-10 5,5-6,5 domsticos basura 25 2,2 peladura papas 25 1,5 Una relacin carbono/nitrgeno de 16/1 se considera ptima para una buena produccin de gas y para una fermentacin estable de los excrementos animales (8), aunque puede obtenerse biogs a valores mayores no se debe superar la relacin 30/1 (14). A continuacin se indican algunas caractersticas de las deyecciones animales. Caractersticas de excrementos animales Kg/100kg peso vivo/da Peso Slidos Slidos N total hmedo totales voltiles Bovinos de carne 4,6 0,70 0,65 0,055 Cerdos 5,1 0,69 0,57 0,039 Gallinas ponedoras 6,6 1,67 1,22 0,099 Ovinos 3,6 1,07 0,91 0,043 Vacas lecheras 9,4 0,89 0,72 0,036 Los volmenes de gas producido suelen expresarse como m3 biogas/m3 digestor o como m3 biogas/kg DQO o DBO y difieren segn el tipo de residuo, la concentracin de slidos voltiles, la relacin carga/volumen del digestor, el tiempo de retencin de los residuos dentro del digestor y el diseo del mismo. En general la produccin oscila entre 1 y 5 m3 biogas/m3 digestor, o dicho de otra manera entre 0,3 y 0,5 m3/kg SV (6). Caractersticas del biogas El cuadro siguiente resume la composicin promedio del biogas segn la fuente. El valor calorfico vara entre 17 y 34 MJ/m3 segn el contenido de metano. Composicin del biogas derivado de diversas fuentes (6). Desechos Lodos Desechos Rellenos Gases agrcolas cloacales industriales sanitarios Propiedades Metano 50 - 80% 50 - 80% 50 - 70% 45 - 65% combustible 191

CO2 30 - 50% 20 - 50% 30 - 50% 34 - 55% cido, asfixiante Vapor agua saturacin saturacin saturacin saturacin corrosivo Hidrgeno 0 - 2% 0 - 5% 0 - 2% 0 - 1% combustible H2S 100 - 7000ppm 0 - 1% 0 - 8% 0,5 - 100ppm corrosivo,olor,txico Amonaco trazas trazas trazas trazas corrosivo CO 0 - 1% 0 - 1% 0 - 1% trazas txico Nitrgeno 0 - 1% 0 - 3% 0 - 1% 0 - 20% inerte Oxgeno 0 - 1% 0 - 1% 0 - 1% 0 - 5% corrosivo Orgnicos trazas trazas trazas 5ppm corrosivos, olores La condensacin del vapor es con frecuencia un problema debido a que el biogas est generalmente ms tibio que las caeras por donde pasa. Es esencial una trampa de agua y puntos de drenaje en la tubera (14). El hidrgeno es un intermediario en el metabolismo anaerbico y algunas bacterias pueden producir trazas de CO. La presencia de nitrgeno y/u oxgeno puede indicar una entrada accidental de aire y esto constituye un grave peligro debido al riesgo de explosiones. El oxgeno es consumido por los microorganismos facultativos dejando el nitrgeno residual (6). Tanto el azufre orgnico, presente por ejemplo en algunos aminocidos, y el inorgnico pueden ser reducidos a H2S, un gas muy txico y altamente reactivo con los metales tales como hierro y cobre, originando la corrosin. Esta reactividad hace que su contenido sea muy bajo en el gas de los rellenos sanitarios. Por otra parte el amonio liberado por ejemplo durante la desaminacin de las protenas, permanece en solucin (14). Factores ambientales Entre los factores ambientales importantes para el funcionamiento de los digestores figuran: la temperatura, la concentracin de slidos, la concentracin de cidos voltiles, la formacin de espuma, la concentracin de nutrientes esenciales, las substancias txicas y el pH (8). Las metanobacterias slo pueden multiplicarse cuando est avanzada la fermentacin de los substratos primarios por accin de las bacterias anaerobias facultativas (por ejemplo Escherichia, Enterobacter, Klebsiella o Bacillus spp.) y se haya consumido todo el oxgeno disuelto, de manera que el potencial redox haya alcanzado en un valor menor que -200 mV. Adems, el pH no debe bajar demasiado, debido a los cidos producidos por los Clostridium, para no inhibir el crecimiento de los metangenos (15). Comnmente la concentracin de cidos grasos voltiles no supera los 2 a 3 g/L, expresados como cido actico. Si se sobrepasa este nivel, la digestin cesar en dos o tres das debido a que los metangenos no pueden utilizar los cidos a la misma velocidad con que se producen (8). El pH ptimo para la digestin est entre 7,0 y 7,2, aunque el rango satisfactorio va de 6,6 a 7,6. La digestin comienza a inhibirse a pH 6,5 (14). Una vez que se ha estabilizado un digestor el lodo est bien amortiguado, es decir la concentracin de protones no vara an cuando se aadan cantidades relativamente grandes de cido o lcali. Si esta capacidad de amortiguacin se destruye y el pH disminuye cesa la metanognesis (8). El CO2 es soluble en agua y reacciona con los iones hidroxilo para formar bicarbonato. 192

La concentracin de HCO3-- es afectada por la temperatura, el pH y la presencia de otros materiales en la fase lquida. Las condiciones que favorecen la produccin de bicarbonato aumentarn a su vez el porcentaje de metano en la fase gaseosa (14). La gama de temperatura para la digestin anaerbica tiene dos zonas ptimas una mesfila (30 - 40C) y otra termfila (45 - 60C). Casi todos los digestores funcionan dentro de los lmites de temperaturas mesfilas y la digestin ptima se obtiene a unos 35C. La velocidad de digestin a temperaturas superiores a 45C es mayor que a temperaturas ms bajas, sin embargo las bacterias son sumamente sensibles a los cambios ambientales especialmente una disminucin repentina de slo unos pocos grados (8). En la figura 6 se ven las relaciones tpicas que existen entre la produccin de gas y la temperatura con diferentes tiempos de retencin. Por ejemplo, en un digestor donde los residuos permanecen 12 das, la produccin de gas por unidad de slidos voltiles totales aadidos diariamente, es 20% mayor a 45C que a 35C. En los climas clidos, donde no existen temperaturas de congelacin, los digestores pueden funcionar sin aadir calor pero hay que aumentar en cambio el tiempo de retencin. La regulacin de la temperatura puede lograrse haciendo circular agua caliente a travs del tanque por medio de termointercambiadores (8). Las causas principales de una excesiva produccin de cidos voltiles son la elevada velocidad de carga, una baja temperatura y la formacin de espuma que constituye una zona favorable para los acetgenos. La sedimentacin de los materiales fibrosos y la espuma se puede evitar mezclando el contenido del digestor (14). Para una digestin ptima, tienen que estar presentes todos los elementos esenciales en forma fcil de asimilar por las bacterias. Se han logrado resultados satisfactorios con concentraciones mayores a 15% de slidos, sin embargo en la prctica la gama es de 3 a 10% (8). Los requerimientos nutritivos de DBO: nitrgeno : fsforo en la digestin anaerbica estn en la relacin 700 : 5 : 1. Solo los estircoles estn nutricionalmente balanceadas. Adems para el crecimiento ptimo de los metangenos es necesario la presencia de cuatro elementos en concentraciones muy bajas: Fe 2nM, Co 10 nM, Ni 100 nM y Mo 10 nM (6). Los antibiticos empleados en las explotaciones pecuarias llegan a los excrementos pero, como ocurre tambin con los antihelmnticos, no suelen afectar mayormente la digestin debido a la dilucin con materiales no txicos. Los metangenos son sensibles a los antibiticos que afectan la sntesis de protenas o lpidos y a los interfieren con la funcin de la membrana citoplasmtica. La concentracin de nitrgeno amoniacal debe ser inferior a 1,5 g/L si es mayor, como suele ocurrir con la gallinaza, resulta txico. Si bien es un amortiguador, su aumento puede llegar a impedir el proceso de digestin. Tambin son txicas las sales de zinc, cobre y nquel, aunque este ltimo es necesario en nfimas cantidades. Las sales de los elementos alcalinos y alcalino-trreos pueden se estimulantes o inhibitorias segn la concentracin como se observa en el cuadro siguiente (14). Efecto de la concentracin de algunos cationes (14) Concentracin g/L Catin estimulante inhibitoria muy inhibitoria Sodio 0,1 0,2 3,5 5,5 8,0 Potasio 0,2 0,4 2,5 4,5 12,0 Calcio 0,1 0,2 2,5 4,5 8,0 193

Magnesio 0,075 0,15 1,0 1,5 3,0 Los desinfectantes clorados son muy txicos an a bajas concentraciones (<1 mg/L) pero son rpidamente absorbidos por los slidos e inactivados. La mayora de los detergentes sintticos son degradados fcilmente pero si la concentracin es mayor que 20 mg/L pueden afectar la digestin. Los compuestos de amonio cuaternario son persistentes y txicos a bajas concentraciones (1mg/L). Los solventes clorados y derivados son txicos en concentraciones de 1 mg/L. La toxicidad de los sulfatos se manifiesta a concentraciones mayores que 1 g/L y la inhibicin total ocurre por sobre 4,5 g/L (6). Criterios de diseo y construccin El principal objetivo del diseo de un digestor es alcanzar un alto contenido de biomasa dentro del mismo que permita una alta produccin de biogas y una alta reduccin de la materia orgnica por unidad de volumen del digestor. Antes de comenzar la construccin de cualquier modelo, se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: La instalacin y mantenimiento debe ser socialmente aconsejable, tcnicamente posible y econmicamente justificable. El biogas substituir a la lea, el carbn o algn derivado del petrleo y la digestin contribuir a reducir la polucin, proveyendo adems un biofertilizante. El modelo elegido debe ser el conveniente para las condiciones climticas locales. El proyecto debe ser elaborado segn la materia prima disponible y la demanda de biogas diaria. Tambin hay que tener en cuenta la existencia de otras fuentes alternativas de energa en la propiedad. La localizacin ser la apropiada segn la distancia de los puntos de consumo, la ubicacin de los residuos y la fuente de agua, la topografa del terreno, la textura del suelo y el nivel fretico (16). Las consideraciones dependientes del tamao para el diseo de una planta de biogs en reas rurales incluyen: la cantidad y el tipo de desperdicios disponibles, las dimensiones de los trozos o partculas, el requerimiento de calefaccin, la necesidad de agitacin, la disponibilidad de materiales de construccin (14). Bajo condiciones ambientales ptimas para la digestin, la cantidad de gas producido es proporcional a la cantidad de residuos agregados. Los materiales que pueden ser degradados fcilmente se estabilizarn ms rpido que los resistentes, necesitando un tiempo de retencin ms corto y un digestor de menor tamao. Las partculas pequeas son mejor fermentadas que los trozos gruesos, por lo que se debe picar bien los materiales tales como paja, virutas, hojas, bagazo antes de agregarlos, para que la suspensin fluya uniformemente evitando el taponamiento de las caeras de carga y descarga, y reduciendo la formacin de espuma (8). Cuando las condiciones climticas lo exigen, se debe calentar el digestor para reducir el tiempo de retencin y a su vez el tamao del mismo. Pero este paso requiere emplear parte del gas producido, disminuyendo la cantidad aprovechable para uso domstico, y aadiendo un costo de instalacin y operacin (14). El volumen del digestor est dado por el volumen de la suspensin de los desperdicios agregados multiplicado por el tiempo de retencin conveniente segn el tipo y el tamao de los desperdicios y la temperatura de operacin. El volumen de un digestor de campana flotante est dado por la siguiente frmula V = [C * R (1+D) tF ]/(Y * d) donde: C es la capacidad deseada en biogas por da, 194

R es la relacin estircol hmedo/estircol seco, commnente 5, D es el peso de agua aadida a cada unidad de peso de estircol, tF es el tiempo de fermentacin en das, Y es el gas producido por unidad de peso de estircol seco, d es la densidad de la mezcla estircol-agua. El volumen del digestor V es proporcional a la relacin tF/Y, por lo que un aumento en la temperatura de fermentacin, dentro de cierto rango, aumenta el rendimiento del gas Y, permitiendo reducir el tiempo de retencin tF o disminuir V (11). Por ejemplo, si C=2,8 m3/da, R=5, D=1,25; tF=30 das, Y=0,2 m3/kg, d=1102 kg/m3, el volumen del digestor sera 4,3 m3. Sin embargo, suele ser sobredimensionado en un 40% (17). El mezclado influye tanto como el tamao de las partculas, pues expone nuevas superficies a la accin bacteriana y previene la disminucin de sta por agotamiento puntual de los nutrientes o acumulacin de metabolitos. Generalmente no es necesario agitar el contenido de los digestores domsticos cuando el tiempo de digestin es largo (50-60 das), aunque suele ser conveniente incorporar un agitador (18). La provisin de agua para los digestores es otro punto a tener en cuenta, por ejemplo sobre la base de una relacin estircol hmedo/estircol seco de 5 : 1 y de una relacin estircol hmedo/agua de 4 : 5, se necesita 62,5 litros de agua diarios cada 10 kg de estircol seco. Pero, la fraccin lquida podra ser reciclada en aquellos casos en que el agua es escasa. Por otra parte, la reduccin de la relacin agua/estircol a la mitad ocasiona una disminucin del 40% en la produccin de gas. Sin embargo, cuando la temperatura de operacin se eleva, por ejemplo de 15 a 27C, aumenta la cantidad de gas en 100%, por lo que es posible disminuir la cantidad de agua en los climas clidos permitiendo un rendimiento aceptable del biogs (17). Se puede estimar la demanda mxima de biogas suponiendo las necesidades durante cada hora del da para planificar el tamao de la campana flotante, pero en general se considera conveniente no sobrepasar el volumen del gas producido diariamente. La corrosin es un problema serio por la exposicin constante de las partes metlicas al sulfuro de hidrgeno y los cidos orgnicos, que ya estn en el material o se forman durante la fermentacin, por lo tanto se deben cubrir con una pintura resistente (15). La ubicacin de la zona de operacin del digestor debe ser tal que no contamine la napa de agua, debido a la permeabilidad del suelo. Las plantas de biogas con alimentacin discontnua se construyen cuando es difcil de obtener los materiales diariamente, por ejemplo se utilizan para fermentar material vegetal grueso, tal como tallos de maz o bagazo de caa de azcar. A las dos semanas de carga comienza la produccin de biogas y contina por unos tres meses. Cuando cesa, se abre el digestor y se limpia. La suspensin remanente se extiende sobre tierras de cultivo como fertilizante. En los casos que se usa este sistema suele haber al menos dos digestores, de modo que al menos uno est en operacin (8). En los digestores con excrementos animales es necesario remover peridicamente la capa de espuma. Por otra parte, en los modelos en que la carga es horizontal (tipo flujotapn) como el de bolsa, suele haber menos problemas de formacin de espuma que cuando es vertical (9). Para establecer el potencial en biogas de un pequeo pueblo rural es necesario tener informacin exacta sobre el nmero de habitantes, la cantidad de ganado, la produccin diaria de estircol y heces, la eficiencia en la recoleccin de los desechos, la 195

disponibilidad de agua, el rendimiento terico de gas por unidad de peso de estircol y heces, la disponibilidad de residuos celulsicos fermentables, etc. (17). La produccin diaria posible de biogas se calcula mediante la siguiente frmula: P = NA* XA* YA + NP* XP* YP + PR* YR donde: NA es la cantidad de animales, NP la poblacin humana, XA y XP el promedio diario de estircol y heces por animal y por persona, YA y YP el rendimiento de gas por unidad de peso de estircol y heces, PR el peso total diario de otros residuos disponibles, YR el rendimiento de gas por unidad de peso de los otros residuos disponibles (17). Algunos parmetros en la ecuacin anterior varan drsticamente de una regin a otra, por ejemplo XA depende del tamao promedio del ganado y PR es siempre diferente. Estos detalles son vitales para tomar las decisiones econmicas y hacer el diseo de la planta de biogas. Se supone un pueblo rural de 500 habitantes con 100 casas y 250 vacunos. Se considera que el valor promedio de estircol seco es de 3,2 kg por animal por da, por lo que se espera un rendimiento de 800 kg de estircol seco por da. Es razonable pensar que el 75% de este material puede ser recogido o sea 600 kg. El rendimiento de biogas a partir de la fermentacin del estircol es de 0,187 m3/kg a 15C y 0,374 m3/kg a 27C, por lo tanto en el pueblo se puede generar en invierno 112 m3 de biogas por da. Dado que las casas estn ms o menos alejadas una de otra, conviene que cada una tenga su propio digestor al que se conecta la letrina. Se producir en total 14 m3 de biogas por da sobre la base de 0,028 m3/persona/da. La produccin total de biogas en el pueblo proveniente de estircol vacuno y heces suma 126 m3/da, sin contar el que se puede obtener de residuos celulsicos, gallinaza, desechos de criaderos de cerdos y conejos, restos de matadero, etc. (17). Operacin Cantidades de diversos materiales para cargar un digestor (17, 19) kg/da necesarios para producir 1,0 3,5 m3 biogas/da pasto seco 1,6 5,6 paja de maz seca 1,2 4,3 cscarillade arroz seca 1,6 5,6 camalote seco 5,3 18,6 camalote hmedo 106 372 estircol de cerdos 13 44 estircol de gallinas 16 56 estircol de vacunos (25C) 28 98 (verano, aire a 30C) 12 41 (invierno, aire a 14C) 31 110 Caractersticas de la suspensin de estircol para cargar el digestor (20) Estircol de Vacas Lecheras Cerdos Promedio (rango) Unidades Promedio (mg/L) Slidos totales 15,4 (12,9 19,8) % estircol 1700 Slidos voltiles 86,1 (76,7 91,8) % slidos totales 1000 DQO total 149 (81 284) g/L 1400 DBO5 total 16,1 (8,6 21,5) g/L 725 196

DBO5 soluble 9,3 (4,6 14,4) g/L COT 680 pH 6,2 (5,2 6,8) unidades Nitrgeno total 2,8 (2,6 2,9) % slidos totales 200 Amonio 100 Nitrato 1 Fsforo soluble 0,25 (0,17 0,32) % slidos totales Fosfato total 85 Potasio total (0,5 5) % slidos totales En los recuadros anteriores se indican los requerimientos diarios de algunos residuos para alimentar al digestor y las caractersticas del estircol diludo de vacas lecheras y de cerdos. La carga inicial requiere una gran cantidad de materia prima que conviene reunirla mientras se esta construyendo el digestor. Dado que ya sufre una transformacin antes de ser introducida se debe controlar el pH, as como asegurar el agregado de estircol vacuno fresco u otro material que contenga los microorganismos necesarios, por ejemplo lodo de un diges tor de aguas cloacales. El xito de un digestor depende de la radicacin y mantenimiento de los organismos acidificantes y metanognicos en forma equilibrada. Si el digestor acumula cidos voltiles como resultado de una sobrecarga, la situacin puede corregirse por la resiembra de organismos, la suspensin temporaria de la alimentacin o el agregado de cal (16). La temperatura tiene un significativo efecto sobre la digestin anaerbica de los materiales orgnicos. Los digestores enterrados aprovechan las propiedades aislantes del suelo que los rodea. Pero en caso de los construdos sobre el suelo deben estar rodeados de anillos de hojas, aserrn o paja, los que generarn calor durante el compostaje. Una vez transformados los materiales de estos anillos deben ser cambiados por residuos frescos. El material compostado an podra contribuir a la mezcla de alimentacin del digestor (14). El rendimiento promedio en China, durante el verano, es de 0,2 m3 de gas por da por m3 del digestor mientras que en Sri Lanka aumenta a 0,5 m3 de biogs diarios por m3 del digestor (19). El operario que maneje diariamente el digestor deber estar adiestrado en la tarea y poseer las instrucciones escritas. Entre las actividades diarias estarn las de tomar la temperatura ambiente y del agua, reunir y homogeneizar el material de la carga, reciclar el efluente, apreciar el olor y la presencia de insectos, y semanalmente controlar y corregir el pH. Tambin controlar la seguridad en el uso del biogas. Identificar prdidas, registrar la presin del gas, examinar los puntos de consumo, drenar el agua del tubo de gas, verificar el nivel de lquido del manmetro (16). Pueden usarse varios mtodos para el mezclado de los diversos materiales que se usan para cargar un digestor: mediante la carga diaria, por manipulacin de los dispositivos de entrada y salida de manera que las operaciones de alimentacin y descarga favorezcan el mezclado, por instalacin de dispositivos de mezclado que puedan ser operados manualmente, introduciendo la suspensin como un chorro, haciendo entrar la suspensin como un chorro tangencial al contenido del digestor. Si no se hace agitacin se puede reducir la estratificacin usando un digestor de desplazamiento horizontal (14) . El efluente se retira con baldes o por drenaje en un terreno desnivelado. Puede ser usado directamente como fertilizante o bien secado para tener un abono slido (16). 197

La velocidad de la degradacin de un material orgnico refleja la interaccin de la cantidad de biomasa microbiana activa por unidad de volumen y dicho material disponible para los microorganismos. La carga diaria para un digestor de estircol vacuno es de alrededor de 6,5 kg slidos voltiles por m3 (9). De la frmula empleada para el clculo del volumen del digestor, puede obtenerse la velocidad de carga L: L = d/[R (1+D) tF] = C / (Y * V) En el ejemplo dado, L=3,25 kg/m3 * da, o sea se agregara en total 14 kg de estircol seco por da (17). Los digestores cargados a razn de 0,2-0,5 kg SVT/m3 por da, generalmente sin agitacin, corresponden a las pequeas instalaciones para granjas cuyo tamao medio es de 10 m3. Cuando la carga es mayor que 0,5 kg SVT/m3 da se requiere un mezclado al menos intermitente y una supervisin mayor que los anteriores (8). Seguridad Adems de gas, la digestin anaerbica genera un efluente que, segn los slidos residuales y el contenido en nitrgeno o en agua, puede ser usado como abono o para riego. Por otra parte juega un papel importante en el control de los olores de los residuos en las granjas o las tierras de relleno. La digestin mesoflica mata organismos patgenos tales como Salmonella y ciertos enterovirus durante un tiempo de retencin de 20-30 das. Sin embargo, algunos parvovirus sobreviven an en el rango termoflico. Tambin la infectividad de los huevos de Taenia saginata es reducida en gran medida pero sobreviven los huevos de Ancylostoma sp. y Ascaris suum, aunque stos desaparecen en el rango termoflico (6). Desaparicin de microorganismos entricos durante la digestin anaerbica Organismos Temperatura Tiempo de residencia desaparicin C das % Salmonella spp. 22 37 6 20 82 96 Salmonella typhi 22 37 6 99 Mycobacterium bovis 30 100 Poliovirus 35 2 98,5 Quistes de protozoos 30 10 100 Ascaris sp. 29 15 90 Independientemente del tamao del digestor, es necesario colocar un manmetro de agua. Si la presin es negativa por haberse retirado ms efluente que la alimentacin agregada, no se debe abrir los puntos de consumo de gas para evitar la llegada de aire al interior. Adems se debe intercalar un arrestallamas en la caera. Como el metano es explosivo cuando est mezclado con 5-15% v/v de aire, la primera cantidad de gas producido debe ser venteada pues generalmente est mezclada con aire. Luego slo habr biogs en la cpula fija o campana mvil del digestor. Por otra parte cuando se detiene un digestor para retirar los lodos se debe ventilar bien el interior pues el biogs es asfixiante (18). El cierre de agua de la cubierta mvil se puede romper cuando la alimentacin del digestor es excesiva o la extraccin del gas es demasiado lenta. El vaco se crea cuando la extraccin del gas es muy rpida. La vlvula de seguridad consta de

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arandelas de peso calibrado que debe igualar a la presin proyectada para el digestor. La presin del gas se establece normalmente entre 15 y 30 cm de columna de agua. El arrestallamas es una caja de placas de metal corrugado con agujeros. Si se produjera alguna llama en la tubera del gas, ste se enfriar por debajo del punto de ignicin, pero podra seguir pasando (13). La eliminacin del sulfuro de hidrgeno se hace principalmente para prevenir la corrosin por los residuos de la combustin. En el ambiente rural se suele usar el proceso cataltico seco con Fe(OH)3, y el catalizador se puede regenerar varias veces. El CO2 puede ser removido en parte con agua fra (14). Referencias 1. Smil V. Abonos nitrogenados. Investigacin y Ciencia 252: 64 70, 1997 2. Schlegel HG, Zaborosch C. General Microbiology. 2 edicin. Cambridge University Press, UK, 1993 3. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Brock Biology of Microorganisms. 10 ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, 2003 4. Fredrickson JK, Onstott TC. Vida en las profundidades de la Tierra. Investigacin y Ciencia 243: 22-28, 1996 5. Smith PH, Bordeaux FM, Wilkie A, Yang J, Boone D, Mah RA, Chynoweth D, Jerger D. Microbial aspects of biogas production. En: Methane from biomass: a systems approach. Smith WH, Frank JR, Abelson PH, eds. Elsevier Applied Science Publishers, Barking, Essex, 1988 6. Wheatley A, editor. Anaerobic Digestion: A Waste Treatment Technology. Elsevier Science Publishers Ltd, Barking, Essex, 1990. cap. 1, 5 7. Bjorndal KA, Moore JE. Chemical characteristics and their relation to fermentability of potential biomass feedstocks. En: Methane from biomass: a systems approach. Smith WH, Frank JR, Abelson PH, eds. Elsevier Applied Science Publishers, Barking, Essex, 1988 8. Taiganides EP. Biogas: recuperacin de energa de los excrementos animales. Zootecnia 35: 2-12, 1980 9. Van Buren JCL, Frijns JAG, Lettinga G. Wastewater treatment and reuse in developing countries. Wageningen Agricultural University, 1995 10. Van Buren A. A Chinese Biogas Manual. Intermediate Technology Publications, London, 1979 11. BOSTID Report. Food, Fuel, and Fertilizar from Organic Wastes. National Academy Press, Washington, 1981, pp. 64-92. 12. FAO/RAP. Rural energy: Medium and large scale biogas systems in the Asia -Pacific Region. RAP Bulletin, 1995 13. Hernndez Muoz A. Depuracin de Aguas Residuales. 3 edicin. Colegio de Ingenieros de Caminos, Canales y Puertos, Madrid, 1988, 14. BOSTID Report. Methane Generation from Human, Animal, and Agricultural Wastes. National Academy of Sciences, Washington, 1977 15. Jagnow G, Dawid W. Biotecnologa. Acribia, Zaragoza, 1991 16. da Silva NA. Construao e operaao de biodigestor modelo chins. Energia. Fontes Alternativas. 3 (14): 31-56, 1981 17. Prasad CR, Krishna Prasad K, Reddy AKN. Biogas plants: prospects, problems and tasks. Economic and Political Weekly, special number august 1974, 1347-1364

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sido productos naturales producidos por bacterias del grupo de los actinomicetos. La evolucin de la terapia antibacteriana a lo largo de estos aos ha sido intensa, al tener que responder cada vez ms rpidamente al creciente problema de la aparicin de resistencias frente a los nuevos compuestos en los patgenos ms importantes. Otros criterios como el aumento del espectro, la eficacia, el margen de seguridad y la estabilidad de los nuevos frmacos han impulsado tambin el desarrollo de una amplia coleccin de compuestos semi-sintticos a partir de molculas de origen microbiano. Dentro de los antibiticos de origen natural destacan dos grandes grupos de compuestos definidos por su mecanismo de accin, los inhibidores de la sntesis de la pared bacteriana y los que actan a nivel de la sntesis de protenas. Pared celular La sntesis de los componentes de la pared celular es una diana clave en las bacterias. El peptidoglicano en concreto es un componente esencial de la pared bacteriana, que determina su rigidez y resistencia frente a las diferencias de presin osmtica, y es un polisacrido donde se alternan, unidos mediante enlaces -1,4, monmeros de Nacetilglucosamina y N-acetilmurmico. A este ltimo se une una cadena lateral pentapeptdica entre cuyos residuos se establecen enlaces amida que confieren rigidez a la estructura. Su sntesis es un proceso complejo con mltiples etapas que se llevan a cabo a ambos lados de la membrana citoplasmtica. El nmero de inhibidores especficos para cada una de las etapas de su sntesis, descritos a lo largo de las ltimas dcadas, es interminable, por lo que nos ocuparemos aqu slo de aquellos compuestos desarrollados ms recientemente que han llegado a tener aplicacin clnica. Los inhibidores de la sntesis de la pared bacteriana tienen sus mejores representantes en dos grandes grupos de compuestos, los -lactmicos y los glicopptidos de la clase de la vancomicina. Los antibiticos - lactmicos estn representados por las penicilinas, las mltiples generaciones de cefalosporinas, los carbapenems como la tienamicina (imipenem) y las monobactamas (nocardicinas y aztreonam), y son inhibidores de las transpeptidasas del peptidoglicano. Durante dcadas se ha generado una larga coleccin de nuevos antibiticos de esta familia, tanto naturales como semisintticos o puramente de sntesis, que a travs de sus diferentes espectros de accin y resistencia a -lactamasas han buscado contrarrestar la aparicin de resistencias, sobre todo en patgenos Gram positivos (estafilococos meticilin-resistentes, enterococos ampicilin- resistentes y pneumococos penicilin-resistentes). Dada la naturaleza mayoritariamente sinttica de los compuestos ms recientes de este grupo comercializados o en desarrollo, no nos detendremos en su discusin. An as, es importante recalcar que an en nuestros das muchos de estos compuestos son antibiticos de primera eleccin en muchos tipos de infecciones comunitarias, dado su amplio espectro de accin (Bush y cols., 2000). Los antibiticos glicopeptdicos vancomicina y teicoplanina surgieron en su momento como alternativa teraputica a la rpida difusin de resistencias a los -lactmicos en microorganismos Gram positivos. Esta familia de compuestos acta mediante su unin a precursores de la pared bacteriana, en concreto al dipptido D-Ala-D-Ala terminal del glicosilpentapptido, por lo que inhibe tanto los procesos de transglicosilacin como de transpeptidacin (Walsh, 2003). 201

La vancomicina, descubierta en 1955, es un glicopptido soluble producido por una cepa de Amycolatopsis orientalis que sigue siendo utilizada en el mbito hospitalario, sin aparicin de resistencias cruzadas con otros antibiticos, representado el antibitico de primera eleccin para el tratamiento de infecciones severas por Staphylococcus aureus meticilin-resistente (MRSA) as como por otros Gram-positivos multiresistentes. La resistencia a vancomicina se identific por primera vez en 1986 en cepas de Enterococcus faecium, que sintetizaban un precursor D-Ala-D-Lac resistente al antibitico (VRE). Desde entonces la incidencia de VRE se est extendiendo en el medio hospitalario, sobre todo en casos de inmunodeficiencia por SIDA, quimioterapia y estados postoperatorios. La teicoplanina se descubri en 1984, y est producida por una cepa de Actinoplanes teichomyceticus. Este glicopptido presenta el mismo espectro antimicrobiano que la vancomicina, y es ampliamente utilizado en Europa aunque todava no ha sido aprobado en USA. Se diferencia por su carcter ms lipoflico, por lo que consigue una buena penetracin tisular, y dada su larga vida media permite una nica administracin diaria (Khare y Keady, 2003; Zhu, 1999). Ms recientemente, se han desarrollado derivados semi-sintticos de los glicopptidos naturales, con el fin de combatir las resistencias emergentes a stos. Entre ellos destacan la oritavancina (Fig. 1) y la dalbavancina . La oritavancina (LY 333328), desarrollada por Elli Lilly, es un derivado del compuesto natural cloroeremomicina, que difiere de la vancomicina solo en la presencia de dos epi-vancosaminas. A diferencia de otros glicopptidos, la oritavancina no se une con gran afinidad al dipptido precursor de la pared, y su actividad parece estar relacionada con la facilidad con que esta molcula dimeriza. La formacin de estos dmeros le permitira actuar por un segundo mecanismo de accin, inhibiendo tambin la etapa de transglicosilacin. Esta inhibicin es la que le confiere su eficacia frente a VRE, siendo activa en un modelo animal de ratn. Este compuesto se encuentra en fase III de desarrollo y durante estos ensayos clnicos no se ha observado la aparicin de resistencias (Khare y Keady, 2003; Woodford, 2003; Zhu, 1999). La dalbavancina (BI-397) fue desarrollada por Biosearch Italia a partir del anlogo de teicoplanina A-40926, que carece del residuo de acetilglucosamina presente en la teicoplanina, producido por una cepa de Nonomurea sp. Este compuesto, actualmente en fase II de desarrollo clnico, destaca por su gran eficacia in vivo frente a Gram positivos. La dalbavancina presenta buena actividad frente a cepas de S. aureus susceptibles y meticilin resistentes y a enterococos sensibles a glicopptidos, pero no sobre cepas vanA. Por el contrario, la oritavancina es activa frente a enterococos vanA y vanB. sto ha determinado que la dalbavancina se desarrolle esencialmente para combatir infecciones por MRSA y la oritavancina para infecciones por VRE (Abbanat y cols., 2003; Khare y Keady, 2003; Zhu, 1999; Woodford, 2003). El glico-lipo-depsipptido ramoplanina (Mc Cafferty y cols., 2002) es otro candidato clnico prometedor para el tratamiento de las infecciones por Gram positivos aerobios y anaerobios resistentes a glicopptidos, macrlidos y -lactmicos. Desde su descubrimiento por Biosearch Italia a partir de una cepa de Actinoplanes sp. en 1984, 202

no se ha detectado la aparicin de resistencias, tanto en laboratorio como en la clnica. Algo ms tarde se descubri un compuesto anlogo, la ramoplanosa, tambin producido por otra cepa de Actinoplanes. Este compuesto actuara a nivel del la fase 2 de la sntesis del peptidoglicano, secuestrando el intermediario lipdico II e impidiendo la accin de la translocasa MurG y de las transglicosilasas. A diferencia de otros glicopptidos, la ramoplanina se une a la zona MurNAc- (GlcNAc)-Ala-g-D-Glu pirofosfato del Lpido II y no existe resistencia cruzada con ningn otro glicopptido. Este antibitico presenta un amplio espectro frente a Gram positivos tanto in vitro como in vivo, incluyendo enterococos, estafilococos, bacilos, estreptococos, Listeria monocytogenes y anaerobios tales como Clostridrium difficile. Sin embargo, no tiene actividad frente a Gram negativos. Actualmente se encuentra en fase III de ensayos clnicos, dada su buena tolerancia y eficacia demostrada en los ensayos de fase II frente a infecciones intestinales por VRE. Sin embargo, su uso est limitado por su mala absorcin sistmica. Actualmente hay en ensayos de fase III nuevos derivados con aplicacin en infecciones gastrointestinales por enterococos resistentes a glicopptidos (GRE) (Woodford, 2003). La amplia difusin de las resistencias ya mencionada tambin ha conducido a reevaluar viejos compuestos. Este es el caso de las manopeptimicinas, una mezcla de antibiticos glicopptidicos cclicos producidos por una cepa de Streptomyces hygroscopicus aislada a finales de los 50, con actividad frente a bacterias Gram positivas. Recientemente, se ha visto que el complejo de antibiticos (manopeptimicinas a ) tiene actividad in vitro frente a MRSA y VRE por inhibicin de la sntesis de la pared bacteriana. Por no presentar resistencia cruzada con otros antibiticos que actan sobre la pared celular, se supone que actuara sobre otra etapa de la sntesis del peptidoglicano (Singh y cols., 2003). Otra diana que tambin se ha estudiado en la sntesis de la pared celular es la translocasa MraY, enzima responsable de la adicin del UDPN- acetil-muramico pentapptido para formar el intermediario Lpido I. Para investigar la inhibicin de esta protena integral de membrana se estn utilizando como modelos qumicos los inhibidores de origen natural liposidomicinas, mureidomicinas y pacidamicinas, tambin denominados uridil-pptidos. Estos compuestos presentan limitaciones, tales como un espectro antimicrobiano muy pequeo y una alta frecuencia de resistencias, pero dada su baja toxicidad se han examinado otros derivados (Woodford, 2003). Aventis est investigando anlogos modificados de liposidomicinas (riburamicinas) y entre ellos el compuesto RU75411 que inhibe varios tipos de Gram positivos, incluyendo MRSA y GRE, aunque algunas cepas de S. aureus son resistentes (Woodford, 2003). Sntesis de protenas El otro gran grupo de antibiticos lo componen los inhibidores de la sntesis de protenas. Dentro del grupo de inhibidores que actuan a nivel de la subunidad 30S se encuentran los aminoglicsidos y las tetraciclinas, antibiticos descubiertos hace dcadas a partir de distintos actinomicetos.

203

Dada la facilidad de generacin de resistencias, no se ha dedicado un excesivo esfuerzo al desarrollo de nuevos derivados de aminoglicsidos, mientras que recientemente se han descrito las glicilciclinas, derivados semisintticos de la tetraciclina con el mismo mecanismo de accin y diseados para evitar el reflujo y la proteccin ribosomal, dos mecanismos de resistencia comunes a tetraciclinas. Dentro de este nuevo grupo de antibiticos cabe destacar la tigeciclina (GAR-936), un derivado semi-sinttico de minociclina que bloquea la entrada del aminoacyl-tRNA al sitio A, deteniendo la elongacin de cadena peptdica. Este compuesto se encuentra en fase III, y presenta ms eficacia que la vancomicina en modelos MRSA y MSSA, sin resistencia cruzada con tetraciclinas. Presenta un amplio espectro frente a Gram positivos y muchos Gram negativos. Su eficacia in vivo ha sido demostrada en diferentes modelos animales, aunque presenta los mismos efectos secundarios que otras tetraciclinas (Abbanat y cols., 2003; Bush, 2000; Woodford, 2003). Los macrlidos se introdujeron en el campo de los anti-infecciosos con la eritromicina A, una lactona macrocclica producida por una cepa de Saccharopolyspora erythraea, descubierta en 1952. Este compuesto se une especficamente al 23S rRNA y bloquea la traduccin por liberacin del peptidil-tRNA e impidiendo la aproximacin del pptido en crecimiento (Walsh, 2003). La rpida aparicin de resistencias y los problemas de inestabilidad del compuesto en medio cido, poca absorcin por va oral y problemas gastrointestinales asociados han llevado a la aparicin de una generacin de anlogos semi-sintticos, como la azitromicina (Zitromax) y claritromicina (Biaxin), ambos con mayor estabilidad y mejor farmacocintica, pero al igual que la eritromicina con poca actividad frente a bacterias resistentes a macrlidos por metilacin del rRNA 23S (Chopra, 1998). Esto ha conducido al desarrollo de los ketlidos, un nueva clase de macrlidos con buen espectro de actividad frente a Gram positivos, como una alternativa a los lactmicos para infecciones del tracto respiratorio, otitis media e infecciones cutneas. La cetromicina y la telitromicina (HMR 3647, Ketek) son dos de los compuestos con actividad frente a Gram positivos resistentes a macrlidos que estn siendo desarrollados para infecciones respiratorias. Actan sobre la subunidad 50S, unindose reversiblemente al dominio V del 23S rRNA, provocando la liberacin prematura del pptido naciente. Aunque estos compuestos son mucho ms potentes que otros macrlidos sobre S. pneumoniae, tambin se han observando efectos adversos e interacciones con otros compuestos. La telitromicina desarrollada por Aventis, es hasta el momento el nico ketlido aprobado en Europa, y est pendiente su aprobacin en USA. El futuro de la cetromicina es incierto, dado que Abbott no ha seguido con los estudios de fase III (Abbanat y cols., 2003; Ackermann y Rodloff, 2003; Bush y cols., 2000). Las estreptograminas constituyen otra familia de antibiticos naturales aislados de cepas de Streptomyces. Existen dos grupos, A y B, no relacionados estructuralmente, y actan sinrgicamente inhibiendo la sntesis de protenas bacterianas. El grupo A est compuesto por una serie de macrolactonas de 23 eslabones del tipo de la virginiamicina, madumicina y griseoviridina. Uno de estos compuestos, la pristinamicina (mezcla de pristinamicina IA y IIA), producido por S. pristinaespiralis, se ha utilizado durante algunos aos en Europa como antibitico oral. El grupo B se

204

compone de hexadepsipptidos cclicos del tipo de la etamicina. microorganismos que producen estos compuestos lo hacen en forma

Todos

los

de mezclas. La virginiamicina, producida por S. virginiae, difiere ligeramente de la pristinamicina. A partir de estos compuestos Aventis ha desarrollado el Synercid (RP59500), una estreptogramina inyectable compuesta de dos macrociclos, dalfopristina y quinupristina (Fig. 4) en relacin 70/30 (v/v). Ambos son derivados semisintticos de componentes de los grupos A y B respectivamente y su mecanismo de accin es el mismo que el de la familia de pristinamicinas. La quinupristina acta bloqueando el sitio de la peptidil transferasa en el ribosoma, mientras que la dalfopristina estimula la disociacin del peptidil-tRNA del ribosoma. El efecto sinrgico se debe a que los cambios conformacionales inducidos por un compuesto favorecen la unin estable del otro. Por separado ambos compuestos son solo bacteriostticos, mientras que combinados presentan potente actividad frente a S. aureus, S. pneumoniae y E. faecium, aunque son poco efectivos frente a E. faecalis (Bonfiglio y Furneri, 2003; Bush y cols, 2000; Chopra, 1998; Khare y Keady, 2003). Las everninomicinas son un grupo de antibiticos oligosacridos producidos por una cepa de Micromonospora carbonacea var. africana, que han dado lugar al desarrollo por Schering-Plough del SCH-27899 No obstante, estos compuestos presentan excelente actividad frente a Gram positivos, incluyendo S. pneumoniae, MRSA, VRE y E. faecalis. Se ha propuesto que estos compuestos inhiben la sntesis de protenas actuando sobre la protena ribosomal L16, en la subunidad 30S del ribosoma. Dado su mejor perfil de tolerancia y toxicidad, pueden suponer una alternativa a la vancomicina. No obstante, el uso extendido en Europa de la avilamicina, un oligosacrido relacionado, como estimulante del crecimiento en animales, ha podido crear un reservorio de resistencias frente a este nuevo compuesto. Dentro del grupo de los inhibidores de la sntesis de protenas tambin se encuentran los tiopptidos, entre los que destaca el tiazolil pptido GE2270A, aislado de una cepa de Planobispora rosea, que al igual que otros antibiticos de la misma familia (GE37468 y amythiamicin), acta sobre el 23S rRNA, bloqueando el factor de elongacin EF-Tu. ste es tambin la diana de los antibiticos de la clase de la kirromicina y la pulvomicina, aunque difieren en su mecanismo de accin. El GE2270A carece de actividad frente a Gram negativos, por no penetrar en la clula, mientras que presenta una potente actividad frente a Gram positivos, incluidas cepas resistentes, en modelos experimentales de endocarditis por estreptococos en ratn (Lociuro y cols., 1997). Otras dianas Los lipopptidos son compuestos naturales con actividad antibitica descubiertos en los aos 80 por cientficos de Lilly. Entre ellos se encuentra la daptomicina, que no rebas los ensayos de fase II dados sus problemas potenciales de toxicidad. Sin embargo, recientemente se ha reevaluado la utilizacin de la daptomicina como agente de amplio espectro para Gram positivos, y en especial para cepas multi-resistentes. Este compuesto es producido por una cepa de Streptomyces roseosporus y consiste en una cadena de cido decanoico unido al triptfano de un pptido cclico de 13 residuos Cubist, que adquiri los derechos sobre este compuesto para desarrollarlo, espera 205

lanzar una formulacin intravenosa (Cinedin) en 2003. Su mecanismo de accin no est del todo claro y su efecto puede deberse a mltiples causas, incluyendo la inhibicin de la sntesis del peptidoglicano y del acido lipoteicoico y la disipacin del potencial de membrana. No penetra la membrana citoplasmtica y mata las clulas Gram positivas alterando la funcionalidad de la membrana celular a diferentes niveles, alterando el transporte y despolarizando la membrana. Tiene actividad in vitro frente a la mayora de los Gram positivos, incluyendo MRSA, VRE. Es ms efectivo que la vancomicina en modelos de infecciones sistmicas de ratn con MRSA y MSSA, pero requiere niveles plasmticos de calcio superiores a los fisiolgicos. Los primeros ensayos clnicos comenzaron en 1999, con resultados prometedores en los ensayos de fase I y II. Los ensayos de fase III estn en desarrollo para el tratamiento de endocarditis, bacteremia e infecciones por VRE, y hasta la fecha no se han reseado casos de resistencia en aislados clnicos (Tally y cols., 1999; Abbanat y cols., 2003; Woodford, 2003). ANTIFNGICOS Las infecciones fngicas en el hombre varan desde las afecciones superficiales de la piel y uas hasta las infecciones sistmicas con altos porcentajes de mortalidad. Las infecciones fngicas invasivas causadas por especies de Candida, Aspergillus, Cryptococcus neoformans y otros patgenos representan una creciente amenaza para la salud pblica. La prevalencia de estas infecciones ha aumentado significativamente durante la pasada dcada, principalmente a causa del aumento de la poblacin inmunosuprimida (enfermos de SIDA, pacientes oncolgicos recibiendo quimioterapia, pacientes con transplantes de rganos), el uso de catteres centrales y una poblacin en creciente envejecimiento, entre otros factores. Slo un nmero limitado de agentes antifngicos (polienos y azoles, bsicamente) han estado disponibles hasta hace poco tiempo para el tratamiento de este tipo de enfermedades. Estos agentes muestran importantes limitaciones, tales como la nefrotoxicidad de la anfotericina B, y la creciente incidencia de resistencia a los azoles. Aunque las formulaciones lipdicas de los polienos y las nuevas generaciones de azoles han mejorado los frmacos originales, el desarrollo de nuevos agentes antifngicos, preferiblemente con nuevos mecanismos de accin, es an una urgente necesidad mdica (Vicente y cols., 2003). En las ltimas dcadas se handescrito un elevado nmero de metabolitos microbianos con actividad antifngica. La gran mayora de estos compuestos antifngicos han sido descubiertos usando ensayos sin modo de accin especfico, sto es, buscando compuestos capaces de inhibir el crecimiento de una levadura u hongo filamentoso escogido como diana. Comparativamente hablando, el nmero de agentes antifngicos para los cuales se conoce el mecanismo de accin es pequeo. Estos frmacos sern el tema del resto de esta seccin. Pared celular Una de las dianas de nuevos antifngicos ms activamente investigadas en los ltimos aos es la pared celular fngica. Los agentes que acten a este nivel deberan ser inherentemente selectivos y tener propiedades fungicidas, lo que resulta particularmente atractivo para el desarrollo clnico. 206

Hasta el presente, la sntesis de glucano es el nico proceso en la sntesis de la pared celular que ha sido usado con xito para desarrollar nuevos frmacos en esta rea. El glucano es un polisacrido compuesto por monmeros de glucosa unidos por enlaces -1,3 o -1,6, y es un componente esencial de la pared celular, que garantiza muchas de sus propiedades fsicas. Los inhibidores de sntesis de glucano pose en actividad antifngica in vitro e in vivo en diferentes modelos animales. Los ms clsicos inhibidores de sntesis de glucano son las equinocandinas, hexapptidos cclicos N-acetilados con una cadena aliftica de variable longitud. Los diferentes miembros de la familia de las equinocandinas se distinguen en los sustituyentes del anillo hexapeptdico o en la cadena de cido graso lateral. Desde que la primera equinocandina fue descubierta a principios de los 70, se han descrito numerosos miembros de esta familia, siempre procedentes de hongos (Vicente y cols., 2003). Las pneumocandinas, un tipo de equinocandinas producidas por el hongo Glarea lozoyensis, han sido utilizadas con xito por Merck para desarrollar un antifngico que se ha lanzado recientemente al mercado. La equinocandina semisinttica acetato de caspofungin (Cancidas) es un aza-derivado de la pneumocandina B0 (Fig. 6). Los ensayos clnicos han demostrado que este frmaco es bien tolerado y resulta eficaz en el tratamiento de la aspergilosis invasiva y las candidiasis esofgica e invasiva (Villanueva y cols.,2002; Mora-Duarte y cols., 2002). Este frmaco ha sido aprobado en el 2001 en Europa y USA para su uso contra la aspergilosis invasiva en pacientes refractarios o intolerantes a otras terapias. Ms recientemente se ha aadido una indicacin para candidiasis invasiva y esofgica. Otro agente antifngico de la misma familia es la micafungina (Funguard), una equinocandina con un grupo sulfato en uno de los radicales del ncleo hexapeptdico, comercializado recientemente en Japn por Fujisawa para el tratamiento de las infecciones por Aspergillus y Candida. En ensayos clnicos muy avanzados se encuentra igualmente la anidulafungina, otra equinocandina con un grupo terfenilo en la posicin del cido graso (Vicente y cols., 2003). El xito obtenido con estos lipopptidos inhibidores de la sntesis de glucano ha impulsado el inters de la industria en la bsqueda de otros tipos estructurales con ventajas respecto a las equinocandinas (especialmente debido a la falta de absorcin oral de stas). As, otra clase de inhibidores de sntesis de glucano descubiertos recientemente son un grupo de triterpenos con un radical polar glicosdico (enfumafungina,) o de otro tipo (Vicente y cols., 2003). Aunque estos compuestos son inactivos o slo dbilmente activos in vivo en modelos animales, representan un nuevo paradigma en la bsqueda de nuevos antifngicos con este mecanismo de accin, y podran ser tiles como base para desarrollar frmacos antifngicos superiores a las equinocandinas. Sntesis de esfingolpidos

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Aunque solo estn presentes en pequea proporcin en la membrana plasmtica fngica, los esfingolpidos son esenciales para un buen nmero de funciones celulares en hongos, y la inhibicin de su sntesis resulta en la inhibicin del crecimiento y muerte celular (Mandala y Harris, 2001). Aunque la mayora de las etapas en la ruta de sntesis de esfingolpidos en hongos y mamferos son similares, existen algunas enzimas que se encuentran slo en hongos, lo que hace que sta sea una potencial diana para la bsqueda de nuevos antifngicos. Tres enzimas clave en esta ruta se han usado como diana para buscar nuevos antifngicos: la serina-palmitoil transferasa, la ceramida sintasa y la inositol fosfoceramida sintasa. Se han aislado inhibidores de estos tres enzimas tanto a partir de hongos como de actinomicetos (Vicente y cols., 2003; Mandala y Harris, 2001). Las esfingofunginas, viridiofunginas y otros compuestos son inhibidores de la serinapalmitoil transferasa. La fumonisina B1 y la australifungina inhiben la ceramida sintasa, mientras que las aureobasidinas, la khafrefungina y la rustmicina inhiben la inositol ceramida sintasa. Aunque algunos de estos compuestos mostraron una elevada potencia, ninguno de ellos ha sido desarrollado como un frmaco, debido a problemas de solubilidad, dbil actividad in vivo o toxicidad en modelos animales. Sntesis de protenas La sntesis de protenas ha sido tradicionalmente una atractiva diana para el desarrollo de agentes antimicrobianos. Aunque la aplicacin de esta idea a la bsqueda de antifngicos se ve dificultada debido a la similitud entre las maquinarias implicadas en la sntesis de protenas en hongos y mamferos, el factor de elongacin 2 (EF2) ha sido identificado como una diana adecuada, ya que es funcionalmente distinto de su homlogo en mamferos. La ms importante familia de agentes antifngicos que actan a este nivel son las sordarinas. La sordarina fue aislada en los aos 60 por Sandoz a partir de fermentaciones de Sordaria araenosa. Las sordarinas son inhibidores selectivos y potentes de la transduccin, que actan desestabilizando el complejo EF2-ribosoma. Los compuestos de esta familia inhiben la transduccin in vitro en Candida albicans, C. tropicalis, C. kefyr y Cryptococcus neoformans en grado variable, aunque son ineficaces en otras especies de Candida. Varios compuestos relacionados estructuralmente se han aislado de diversas especies de hongos (Vicente y cols., 2003). La potente actividad in vitro y su amplio espectro, as como el hecho de que algunos derivados semi-sintticos desarrollados por Glaxo hayan mostrado eficacia en modelos animales y presenten favorables caractersticas farmacocinticas y toxicolgicas han hecho de estos compuestos candidatos prometedores a su evaluacin en la clnica. ANTITUMORALES Los compuestos de origen microbiano se encuentran entre los agentes anticancergenos quimioteraputicos ms utilizados desde hace dcadas en la clnica. Tradicionalmente, se ha tratado de agentes citotxicos que actan sobre el ADN, bien como agentes intercalantes o alquilantes que provocan su rotura, o por interaccin con el proceso de replicacin. Estos compuestos, descubiertos en la dcada de los 60, incluyen a miembros de las familias de la antraciclina, bleomicina, actinomicina, 208

mitomicina y del cido aurelico (mitramicina), todos ellos producidos por diferentes cepas de Streptomyces. Los agentes ms importantes con aplicacin en clnica son las antraciclinas daunomicina y su derivado doxorubicina, utilizadas para el tratamiento de leucemias, linfomas no Hodking y cncer de mama; la aclarubicina (o aclacinomicina A) presenta actividad frente a leucemias y tumores slidos y representa una nueva clase de compuestos inhibidores de las topoisomerasa I y II; las bleomicinas glicopeptdicas A2 y B2 (Blenoxane) utilizadas para el tratamiento de carcinomas de clulas escamosas y linfomas; los peptlidos como la D-actinomicina; los mitosanos como la mitomicina C; y la mitramicina, otro compuesto extremadamente citotxico utilizado en la clnica slo de manera muy restringida, por sus efectos secundarios, para el tratamiento de ciertos tumores como el carcinoma de testculo o la enfermedad de Pager (Cragg y Newman, 2000). Sin embargo, dada la falta de tratamientos eficaces para ciertos tipos de tumores, y por los numerosos efectos secundarios producidos por los existentes, es sta un rea en la que se ha seguido investigando activamente en las ltimas dcadas. As, en los ltimos aos se ha desarrollado un gran nmero de compuestos naturales o semi-sintticos con actividad antitumoral, algunos de los cuales han llegado a ensayos clnicos. Algunos de los ms relevantes se describen a continuacin. La equinomicina es un pptido cclico de la familia de las quinoxalinas, producido por una cepa de Streptomyces echinatus, que acta como agente bis-intercalante del ADN. Este compuesto, que presenta citotoxicidad sobre lneas celulares de cncer de colon, se ha incluido en estudios de fase II sobre sarcomas metastticos de tejidos blandos, aunque sin xito (Gradishar y cols., 1995). Todava en desarrollo est la tiocoralina, un nuevo agente anticancergeno derivado de una cepa de Micromonospora marina con actividad sobre lneas celulares de cncer de colon. Este compuesto acta deteniendo el ciclo celular en la fase G1 como consecuencia de su accin sobre la replicacin del ADN y ms especficamente a nivel de la fase de elongacin, actuando sobre la ADN polimerasa alfa (Erba y cols., 1999). Las enediinas naturales fueron descubiertas en 1987 y tienen como representantes dos nuevas clases de compuestos antitumorales, las esperamicinas y las calicheamicinas, producidas respectivamente por cepas de Actinomadura verrucosospora y Micromonospora echinospora. Estos compuestos presentan un mecanismo de accin singular, dado que contienen una unidad de (Z)1,5-diin-3-eno que se ha propuesto se intercala en el surco menor del ADN de las clulas, iniciando una serie de reacciones de cicloaromatizacin y la formacin transitoria de bencenos biradicales que producen roturas en ambas hebras del ADN. La neocarzinostatina es otro compuesto relacionado, descubierto en 1965, que se ha vuelto a estudiar dada su similitud con las eneiidinas. En los ltimos aos, han surgido otras clases de eneiidinas (dinemicinas, kedarcidina, C-1027 y maduropeptina) producidas por diferentes cepas de actinomicetos. Todos estos compuestos son potentes citotoxinas, con IC50 en ensayos de inhibicin de crecimiento de tumores del orden picomolar, que actan tambin rompiendo la doble hlice, induciendo la inhibicin de la replicacin y la activacin de la protena quinasa dependiente de ADN (Thorson y cols., 2000).

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Recientemente se ha utilizado otra aproximacin, acoplando estos anticancergenos a anticuerpos especficos de eptopos tumorales. El primer producto de este tipo aprobado por la FDA en el 2000, Mylotarg, es un conjugado de la calicheamicina con un anticuerpo recombinante humanizado con especificidad por el antgeno CD33, comunmente expresado en clulas de leucemia mieloide (Hamann y cols., 2002). Los ciclopropilindoles son otros compuestos citotxicos que actan como agentes alquilantes, entre los que destacan las duocarmicinas y el CC-1065, ambos producidos por especies de Streptomyces. Estas molculas se encuentran entre los antitumorales ms potentes, aunque no han llegado todava a la clnica. Estos compuestos son muy estables hasta que se unen al surco menor del ADN, alquilndolo especficamente tras ser activados por un ataque nuclefilo. Todos los compuestos naturales presentan citotoxicidad frente a lneas celulares de leucemia L1210 en el rango picomolar, mientras que el CC-1065 presenta incluso mejores actividades antitumorales en un modelo in vivo. El CC-1065 no puede ser utilizado en humanos por sus efectos txicos, pero ha servido para reenfocar las investigaciones en la obtencin de nuevos compuestos de esta clase con mejor perfil en modelos in vivo (Searcey, 2002; Cacciari y cols., 2000). La leinamicina es un compuesto producido por una cepa de Streptomyces atroolivaceus, descubierto en 1989 y con un amplio espectro de actividad antibacteriana y antitumoral, sobre todo en tumores resistentes a los frmacos antitumorales utilizadas en la clnica. Este compuesto es un hbrido de tiazolilpptidopoliqutido con una estructura no observada anteriormente en productos naturales, en forma de macrolactona de 18 eslabones unida a un grupo 1,3-dioxo-1,2 ditiolano. La leinamicina acta alquilando el ADN en presencia de grupos tiol como agentes reductores, lo que determina la rotura de una de las hebras (Gates, 2000). Presenta una potente actividad antitumoral en modelos in vivo de tumores en ratn resistentes a otros agentes. Se ha descrito la sntesis de nuevos derivados tioster de leinamicina ms estables con actividad antiproliferativa en el rango nanomolar en ensayos in vitro y actividad antitumoral in vivo. Entre ellos se encuentra el KF22678, con actividad superior al cisplatino y un amplio espectro de actividad frente a modelos de carcinoma de pulmn, colon, ovario y prstata (Ashizawa y cols., 1999). La rebecamicina (Fig. 7) es un alcaloide indolocarbazol, producido por el actinomiceto Lechevalieria aerocolonigenes, que inhibe la ADN topoisomerasa I con un IC50 del orden micromolar, y que in vivo inhibe el crecimiento de clulas tumorales de adenocarcinoma de pulmn. Existen otros indolocarbazoles relacionados, como la staurosporina o el K252a, tambin producidos por especies de actinomicetos. Se han desarrollado anlogos de rebecamicina semi-sintticos que en funcin de sus estructuras actan inhibiendo la topoisomerasa I y/o las protena quinasas. Algunos de estos compuestos presentan actividad antiproliferativa en el rango micromolar y son ms especficos que la rebecamicina. Uno de los derivados ms avanzados, el NSC 655649, demostr actividad antineoplsica frente a carcinoma de colon, pero no ha superado los estudios de fase II (Prudhomme, 2003; Goel y cols., 2003).

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Las epotilonas A y B (Fig. 7) son una nueva clase de productos naturales con actividad antiproliferativa de amplio espectro frente a diferentes lneas celulares cancerosas. Actan por un mecanismo distinto los anteriormente descritos, induciendo, al igual que el paclitaxel, la polimerizacin de los heterodmeros de tubulina y estabilizando los microtbulos. Se describieron en 1993, producidas por la myxobacteria Sorangium cellulosum, junto con otros variantes. Las epotilonas C y D son tan potentes en la induccin de la polimerizacin de tubulina in vitro como las A y B, aunque son menos activas in vivo. Las epotilonas son potentes inhibidores del crecimiento de clulas cancerosas in vitro en el orden nanomolar o subnanomolar, siendo la epotilona B de 5 a 25 veces ms potente que la A o el paclitaxel, e inhibiendo el crecimiento de lneas celulares tumorales humanas de pulmn, colon, prstata y otras. Al contrario que el paclitaxel, son tambin activos frente a lneas tumorales resistentes a multiples frmacos, y en lneas celulares resistentes a paclitaxel por mutaciones en la tubulina. Su perfil preclnico las ha convertido en importantes cabezas de serie en la bsqueda de nuevos antitumorales, y estn sirviendo de modelos para la preparacin de anlogos no naturales. Se estn llevando a cabo ensayos clnicos con dos compuestos, la epotilona B, ahora en fase II, y el BMS247550, su anlogo lactmico (Florsheimer y Altmann, 2001; Borzilleri y Vite, 2002). Otro compuesto de origen natural que acta interaccionando con la tubulina es la rhizoxina (Fig. 7), una lactona macrocclica producida por el hongo Rhizopus chinensis. Este compuesto es un antimittico que, al contrario que las epotilonas o el paclitaxel, inhibe la polimerizacin de la tubulina unindose al mismo sitio de unin que los alcaloides de la vinca (Hamel, 1992). La rhizoxina mostr una buena actividad in vivo contra varios modelos de cncer en ratones, incluyendo leucemias y tumores de rgano slido, as como lneas de leucemia resistentes a vincristina y doxorrubicina. El compuesto ha sido ensayado en fase II en cncer de pecho, melanoma y otros tipos con resultados poco prometedores, aunque mostr alguna actividad en cncer de pulmn de clulas no pequeas (Kaplan y cols., 1996). Estudios ms recientes en humanos han evaluado el uso de este candidato a dosis prolongadas, para chequear la hiptesis de que la falta de eficacia puede deberse en parte a una exposicin inadecuada al frmaco (Tolcher y cols., 2000). Se han descrito otros compuestos derivados de hongos con el mismo mecanismo de accin, tales como la phomopsina A (Hamel, 1992), pero stos an no se han probado en humanos. La geldanamicina (Fig. 8) es otro antitumoral, producido por una cepa de Streptomyces hygroscopicus var. geldanus, perteneciente al grupo de las benzoquinonas conocidas tambin como ansamicinas (herbimicina A, macbecinas y ansatrieninas, entre otras). Inicialmente se pens que la geldanamicina actuaba interfiriendo con los mecanismos de transduccin de seales de las clulas tumorales por inhibicin de una protein tirosina quinasa oncognica. Posteriormente, se ha demostrado que inhibe la actividad ATPasa de la Hsp90 (chaperone heat shock protein), que mantiene la conformacin, estabilidad y la funcin de protenas quinasas oncognicas implicadas en la transduccin de seales que conducen a la proliferacin y

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progresin del ciclo celular y a apoptosis. Las Hsp90 son hiperproducidas en varios tipos de cncer, lo que ha llevado a considerar su potencial como una nueva diana antitumoral, y el de la geldanamicina como frmaco anticancergeno. Su derivado 17-alil-amino,17-demeto-xigeldamicina present buenos perfiles de actividad y selectividad en modelos preclnicos de ratn y ha progresado a fase I con resultados esperanzadores (Maloney y Workman, 2002). Las illudinas son un grupo de antibiticos sesquiterpnicos que han sido descritos como agentes antibacterianos y antitumorales, y estn producidos por basidiomicetos de los gneros Omphalotus y Coprinus. Un derivado de la illudina S, el irofulveno (6hidroximetilacilfulveno, MGcncer, bien solo o en combinacin con otros agentes antitumorales. Este compuesto fue ensayado en ensayos clnicos en fase II en varios modelos de cncer, pero los resultados publicados no han sido muy esperanzadores (Pierson y cols., 2002). Aunque su modo de accin no est claro, se ha demostrado que el irofulveno promueve la apoptosis mediada por caspasas en clulas tumorales por un mecanismo que implica la activacin de las quinasas Erk 1/2 y JNK 1 (Wang y cols., 2002). Las hipocrelinas (Fig. 8) son pigmentos derivados de Hypocrella bambusae y Shiraia bambusicola, dos hongos usados en medicina tradicional en China, y que han sido estudiados intensivamente por su capacidad de sensibilizar clulas a la luz y a los ultrasonidos. Aparentemente, el efecto de estas quinonas policclicas se debe a la formacin de perxido de hidrgeno en las clulas tras la fotoactivacin, lo cual desemboca en la apoptosis por activacin de la caspasa-3 (Ali y cols., 2002). Derivados de las hipocrelinas se han estudiado para el tratamiento potencial de cncer de colon y de pecho, as como en enfermedades no relacionadas, tales como psoriasis, acn y otras. Aunque la mayora de los compuestos utilizados contra el cncer fueron descubiertos como citotxicos, se han realizado grandes esfuerzos en identificar agentes antitumorales usando ensayos basados en los procesos bioqumicos relacionados con la cascada de acontecimientos que median la proliferacin celular. Una de las etapas enzimticas ms tempranamente identificada como esencial en la malignidad celular fue la prenilacin de la protena Ras. Las protenas Ras sufren una modificacin post-transduccional consistente en la unin de un grupo farnesilo que permite su anclaje a la superficie interior de la membrana plasmtica. Se sabe que inhibidores de la farnesil protena transferasa (FPTasa), la enzima que cataliza esta prenilacin, pueden inhibir el crecimiento de clulas tumorales. En nuestro propio programa de screening de productos naturales de origen microbiano hemos identificado al menos nueve familias distintas de inhibidores de FPTasa (Vilella y cols., 2000). El ms interesante de los compuestos descubiertos es el cido clavrico (Fig. 8), producido por el basidiomiceto Hypholoma sublateritium. Este es uno de los pocos inhibidores reversibles naturales de la FPTasa que es competitivo con respecto a la protena Ras, e inhibe su procesamiento en clulas NIH3T3 transformadas con ras, sin indicios de toxicidad. El cido clavrico se ha utilizado como modelo apara obtener inhibidores ms efectivos en un programa de qumica mdica (Vilella y cols., 2000). Hay otros inhibidores interesantes de la FPTasa descritos por otros grupos, tales como el TAN-1813, producido por una especie no determinada de Phoma, que induce la reversin morfolgica de clulas NIH3T3 212

transformadas con K-ras, con actividad en modelos de ratones (Ishii y cols., 2000). Tambin es activa en modelos de ratones y en otros sistemas, la manumicina, un inhibidor de FPTasa competitivo con farnesil pirofosfato, aislado a partir de una cepa de Streptomyces sp. (Vilella y cols., 2000). Una de las dianas ms prometedoras para el desarrollo de agentes antitumorales estudiadas en los ltimos aos es la histona deacetilasa (HDAC). Los inhibidores de la HDAC (InHDAC) son capaces de inducir la reversin morfolgica de las clulas transformadas con un oncogn al fenotipo normal. Existen numerosas lneas tumorales susceptibles a los InHDAC, y los estudios realizados en modelos de roedores han demostrado que estos compuestos reducen el crecimiento de tumores y la metstasis in vivo (Kramer y cols., 2001). La acetilacin y des-acetilacin de las histonas es crtica en la regulacin de la transcripcin en clulas eucariticas, de forma que la inhibicin de la HDAC produce como resultado en un aumento en la expresin de algunos genes y la inhibicin de otros. La sntesis de p21WAF1 (un inhibidor de las quinasas dependientes de ciclina) es el efecto que se observa ms consistentemente, lo que explicara el bloqueo del ciclo celular descrito en clulas tratadas con InHDAC (Kramer y cols., 2001). Adems, tambin se ha descrito que estos compuestos inhiben la angiognesis en modelos de carcinoma en ratn, aumentando la expresin del p53 y de otros supresores de tumores y reduciendo la expresin de factores angiognicos, por lo que los InHDAC podran ser tiles como agentes antitumorales tambin por sus propiedades antiangiognicas (Kim y cols., 2001). Se han descrito varios metabolitos microbianos que son potentes inhibidores de la HDAC. Los ms caractersticos son los tetrapptidos cclicos conteniendo un radical epoxicetona producidos por hongos, tales como trapoxinas, chlamidocina y HC-toxina, y cidos hidroxmicos como la tricostatina A, aislada de Streptomyces hygroscopicus (Kramer y cols., 2001; Darkin-Rattray y cols., 1996). Los primeros son inhibidores irreversibles de la HDAC con eficacia a niveles del orden nanomolar, y se unen covalentemente a la enzima a travs del grupo epxido (Kramer y cols., 2001). Otros tetrapptidos relacionados, pero sin el radical epoxicetona, han sido tambin identificados como inhibidores de la HDAC, tales como la apicidina, de la que se habla posteriormente como agente antiparasitario (Darkin-Rattray y cols., 1996). La tricostatina A y otros compuestos estructuralmente relacionados, tales como el SAHA (suberoyl anillide hydroxamic acid, Fig. 8), son inhibidores reversibles de la enzima. Adems, se han sintetizado compuestos hbridos combinando el tetrapptido de la trapoxina y radicales similares al cido hidroxmico de la tricostatina A, que son inhibidores reversibles con potencias en el rango de subnanomolar (Furumai y cols., 2001). El potencial de algunos inhibidores de la HDAC como agentes teraputicos se est evaluando en la actualidad en ensayos clnicos (Kramer y cols., 2001). En concreto, el SAHA ha demostrado buenos resultados, tanto en monoterapia como en combinacin, para el tratamiento de varios tipos de cncer, en ensayos de fase II. Tambien ha mostrado resultados prometedores en fase II el depsipptido FK228 (FR-901228), otro inhibidor irreversible de la HDAC producido por Chromobacterium violaceum. La fumagilina, un viejo antibitico que se ha utilizado con xito como

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agente antiparasitario, como se describe ms adelante, se ha usado para desarrollar un agente antitumoral. En concreto, su derivado semi-sinttico TNP-70 ha sido estudiado en modelos de varios tipos de cncer. Estos compuestos son potentes agentes anti-angiognicos, que inhiben la neovascularizacin bloqueando el ciclo celular en las clulas endoteliales en fase G1 tarda. La diana de la fumagilina y sus derivados es la metionina aminopeptidasa-2 (MetAP-2) (Sin y cols., 1997). El papel fisiolgico de esta enzima, que elimina los residuos metionina terminales de los pptidos, es todava oscuro. Su expresin se correlaciona con el crecimiento celular, pero se expresa tanto en clulas endoteliales como de otros tipos, de modo que la selectividad de estos compuestos para inhibir el ciclo celular en clulas endoteliales puede implicar otros factores. Trabajos recientes han mostrado que en clulas endoteliales, el TNP- 470 produce la acumulacin de p21CIP/WAF, lo que lleva al bloqueo del ciclo celular en la transicin entre las fases G1 y S. Este compuesto se encuentra en fase de investigacin clnica para el tratamiento del sarcoma de Kaposi, cncer de rin, cerebro, pecho y de otros tipos (Kruger y cols., 2000). ANTIPARASITARIOS Las avermectinas descubiertas en Merck en 1976 a partir de una cepa de Streptomyces avermitilis, son lactonas macrocclicas con actividad antiparasitaria. Estos productos naturales de extraordinaria potencia sirvieron de base para el desarrollo de la ivermectina (Ivomec), un derivado semi-sinttico que se introdujo en el mercado en 1981. Este compuesto revolucion el rea de los antiparasitarios dado su amplio espectro frente no solo a parsitos intestinales y sistmicos, sino tambin sobre insectos ectoparsitos en diferentes tipos de ganado, as como por su aplicacin en la prevencin de la oncocercosis humana (Mectizan). Posteriormente, se han desarrollado un buen nmero de anlogos sintticos, como la doramectina, con un perfil muy similar. Las avermectinas estn estructuralmente relacionadas con las milbemicinas, descubiertas anteriormente como acaricidas y que difieren en la ausencia de disacridos unidos al macrociclo. Estos compuestos comparten el mismo mecanismo de accin sobre los canales de cloro de las membranas neuronales y del msculo de los invertebrados. Este efecto sobre el flujo de iones cloruro inducira la parlisis en artrpodos y nemtodos, mientras que en invertebrados se ha visto que las avermectinas potencian el aumento de la permeabilidad a iones cloruro mediada por GABA (Meinke, 2001). Numerosas enfermedades infecciosas en hombres y animales, incluyendo la malaria, cryptosporidiosis, toxoplasmosis y coccidiosis, son producidas por protozoos del subphyllum Apicomplexa. El tetrapptido cclico apicidina , producido por especies de Fusarium, fue descubierto en Merck como un agente eficaz frente a un amplio rango de parsitos de este grupo (Darkin-Rattray y cols., 1996). Este compuesto es un potente inhibidor, en el rango nanomolar, de la HDAC del parsito, y muestra un amplio espectro de actividad in vitro contra miembros de los Apicomplexa, as como actividad in vivo en un modelo de malaria por Plasmodium berghei en ratn. Se han descrito tambin derivados semisintticos con potencias en el rango picomolar. Otros tetrapptidos relacionados de origen fngico que inhiben la HDAC de mamferos, como la HC-toxina, tienen tambin potente actividad antiprotozoica, comparable a la 214

apicidina, e inhiben la HDAC de los parsitos (Darkin-Rattray y cols., 1996). Como se ha discutido previamente, estos inhibidores de la HDAC se han estudiado extensamente por su inters como posibles agentes antitumorales. La fumagilina fue descubierta como antibitico en los 50. Este compuesto ha sido usado para el tratamiento de la microsporidiosis, con buenos resultados en ensayos clnicos (Molina y cols., 2002). La microsporidiosis, enfermedad para la que no existe tratamiento satisfactorio en la actualidad, est producida por Enterocytozoon bieneusi, y cursa con diarrea crnica, mala absorcin y debilitacin en pacientes inmunosuprimidos. Adems de sus propiedades como agente antiparasitario, la fumagilina tiene actividad anti-angiognica, y algunos derivados han sido llevados a ensayos clnicos como antitumorales, como se ha discutido con anterioridad. ATEROSCLEROSIS Gran parte del prestigio que los microorganimos, y en concreto los hongos, puedan haber merecido como una fuente importante de compuestos tiles para la industria farmacutica, hay que atribuirla a las estatinas, inhibidores de la 3-hidroximetilglutaril-CoA reductasa que son los frmacos hipolipemiantes ms utilizados. La primera estatina natural introducida en la clnica, la lovastatina (Mevacor, Fig. 10) fue descubierta por el grupo de Merck a finales de los aos 70 (Shu, 1998; Patchett, 2002). Un derivado semisinttico, la simvastatina (Zocor), le sigui rpidamente, y en aos siguientes otras estatinas naturales (pravastatina) o totalmente sintticas (atorvastatina, fluvastatina) de otras compaas alcanzaron el mercado. Numerosos ensayos clnicos han demostrado los beneficios de las estatinas en la prevencin de las enfermedades coronarias, en sujetos con ndices de colesterol elevados o incluso normales. As, las estatinas han tenido un impacto enorme en la vida de millones de pacientes con riesgo cardiovascular (Best y Jenkins, 2001). Adems, se est evaluando el potencial de las estatinas para el tratamiento de otras dolencias, tales como la enfermedad de Alzheimer. Resulta por tanto poco sorprendente que sta haya sido un rea en la que se han realizado extensos esfuerzos por parte de numerosos grupos, habindose identificado numerosas dianas que han sido usadas en procesos de screening para identificar nuevos agentes tiles para tratar la ateresclerosis. Uno de los descubrimientos ms interesantes de la ltima dcada en este terreno fue el de los cidos zaragzicos o escualestatinas. Estos compuestos son potentes inhibidores de la escualeno sintasa, una enzima clave en la biosntesis de esteroles, con IC50s en el rango picomolar. La escualeno sintasa cataliza la primera etapa exclusiva en la sntesis de colesterol, la condensacin de dos molculas de farnesildifosfato. Los cidos zaragzicos fueron descubiertos simultneamente por los grupos de Merck y Glaxo (Bergstom y cols., 1995). Un gran nmero de anlogos naturales fueron aislados directamente de diversas especies de hongos o producidos por biosntesis dirigida con precursores, y estos compuestos han sido sometidos a estudios extensivos de qumica mdica.

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Los cidos zaragzicos mostraron actividad en modelos animales, pero a pesar de las expectativas surgidas, problemas de toxicidad malograron su desarrollo como frmacos de uso clnico (Shu, 1998). Otros inhibidores naturales de la escualeno sintasa han sido descritos posteriormente, pero ninguno mostraba caractersticas que hayan permitido su desarrollo como futuros candidatos a frmacos. INMUNOSUPRESORES Sin lugar a dudas, uno de los mayores xitos de la medicina moderna es el desarrollo de las tcnicas de transplante de rganos, xito posible slo tras el desarrollo de agentes inmunosupresores eficaces. En este campo, el descubrimiento de la ciclosporina A (Sandimmune) por cientficos de Sandoz y su aplicacin para el transplante de rin en 1978 representa un punto de inflexin, y la ciclosporina pronto fue el frmaco inmunosupresor ms usado en la clnica (Plosker y Barradell, 1996). La ciclosporina A, un metabolito producido por Tolypocladium inflatum y otros hongos, suprime la respuesta inmune bloqueando la cascada de transduccin dependiente de calcio que media la activacin de los receptores de clulas T, inhibiendo la produccin de interleukina-2 (IL-2). Para una revisin de su mecanismo de accin ver Kunz y Hall (1993). Tras la ciclosporina, se introdujo en el mercado otro inmunosupresor con un mecanismo de accin similar, producido por una cepa de Streptomyces tsukubaensis, el FK506 o tacrolimo (Prograf), desarrollado por Fujisawa, aprobado su uso en 1994 para el transplante de hgado y en 1997 para el transaplante renal. Adems, el tacrolimo ha sido recientemente aprobado para el tratamiento de la dermatitis atpica (Protopic), y est siendo ensayado en fase II y III para el tratamiento de la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes. En cuanto a su mecanismo de accin, el FK506 se une a la FKBP (FK506 binding protein), mientras que la ciclosporina lo hace a otra protena, la ciclofilina, pero tras unirse a sus receptores ambos inhiben la calcineurina, una fosfatasa dependiente de calcio implicada en la cascada de sealizacin celular mencionada (Kunz y Hall, 1993). A pesar de la indudable utilidad de estos frmacos, los importantes efectos secundarios que presentan, especialmente su nefrotoxicidad, han impulsado la bsqueda de otros agentes inmunosupresores con diferentes mecanismos de accin. La rapamicina (sirolimus, Rapamune), un metabolito producido por una cepa de Streptomyces hygroscopicus, ha sido introducido en la prctica clnica recientemente (desde 1999 en USA y desde el 2001 en Europa). La rapamicina , al igual que el tacrolimo, es un macrlido y tambin se une a la FKBP, pero no inhibe la calcineurina, sino que suprime la proliferacin celular de los linfocitos y la produccin de IL-2 a travs de la inhibicin de una fosfatidilinositol 3-quinasa denominada TOR (target of rapamycin), que resulta en el bloqueo del ciclo celular en la transicin G1/S por inhibicin de las ciclinas que regulan la divisin celular (Crespo & Hall, 2002). La espergualina es un compuesto inmunosupresor y antitumoral, aislado en 1982 del Bacillus laterosporus, a partir del cual se ha desarrollado el derivado 15deoxiespergualina , utilizado en la clnica para el tratamiento del rechazo agudo de transplante de rin (Amemiya, 1996). Este compuesto inhibe la maduracin de

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linfocitos T estimulada por IL-2 por interaccin con Hsc70, un miembro de la familia de las Hsp70, inhibiendo su localizacin en el ncleo. En ensayos clnicos se ha observado que revierte el rechazo agudo en un 60-70%, obtenindose una supervivencia del implante en el 90% de los casos. Otro inmunosupresor de origen natural es el cido micofenlico (Bentley, 2000). Este compuesto (Fig. 11), producido por especies de Penicillium y otros hongos, fue descubierto como antibitico a principio del siglo XX, y muestra una amplia gama de actividades biolgicas, incluyendo ntibacteriana, antifngica, antiviral y antitumoral. La bsqueda de derivados del compuesto natural con mayor disponibilidad oral llev al descubrimiento del profrmaco 2-morfolino-etil ster (micofenolato mofetilo, CellCept), aprobado por la FDA para la prevencin del rechazo en transplante renal en 1995, y para el transplante de corazn en 1998. Este frmaco, habitualmente coadministrado con otros agentes inmunosupresores y menos txico que aquellos, ha sido tambin usado experimentalmente para el tratamiento de la artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes, tales como lupus y psoriasis. El cido micofenlico es un inhibidor de la inosina 5-monofosfato deshidrogenasa, enzima involucrada en la biosntesis de novo de guanina, lo cual resulta en una inhibicin de la sntesis de ADN. Los linfocitos T y B son particularmente sensibles al cido micofenlico porque, a diferencia de otros tipos celulares, dependen totalmente de la ruta de sntesis de guanina de novo, y prcticamente carecen de la capacidad de reutilizar las purinas libres liberadas en procesos catablicos. Posiblemente, como consecuencia de la disminucin de los niveles de GTP, el compuesto tambin previene la glicosilacin de las molculas de adhesin implicadas en la infiltracin de linfocitos y monolitos en los lugares de rechazo del rgano. La mizoribina o verdina (Fig. 11) es otro metabolito de origen fngico con igual mecanismo de accin que el cido micofenlico, aunque estructuralmente no relacionado. Este compuesto, producido por Eupenicillium brefeldianum, se est usando en la clnica en Japn para el transplante de rin y varias enfermedades autoinmunes (Tsuzuki, 2002). En los ltimos aos, ha aparecido un buen nmero de publicaciones describiendo compuestos de origen microbiano con actividad inmunosupresora. El ms interesante de ellos ha sido el denominado ISP-I. Este compuesto, producido por el hongo Isaria sinclairii, fue descubierto como un potente inmunosupresor en 1994, aunque haba sido ya aislado de otros hongos como agente antifngico. El compuesto era ms potente que la ciclosporina en varios modelos, pero a diferencia de sta, no inhiba la produccin de IL-2. Posteriormente, se descubri que el ISPI es un potente inhibidor (en el rango picomolar) de la serina palmitoiltransferasa, bloqueando la sntesis de esfingolpidos e induciendo apoptosis en una lnea de linfocitos T citotxicos dependiente de IL-2 (Nakamura y cols., 1996). Aunque el producto no es directamente utilizable como candidato clnico, debido a problemas de solubilidad y toxicidad, se han descrito varios anlogos sintticos con mejores propiedades. Uno de estos derivados, el FTY720 (Fig. 11), mostr eficacia en modelos animales de transplante y de varias enfermedades autoinmunes, y se ha ensayado con xito en ensayos clnicos de transplante de rin (Brinkmann y Lynch, 2002). El mecanismo de accin del FTY720 parece ser diferente al del ISP-I, ya que no es un inhibidor de la sntesis de esfingolpidos, sino que acta a travs de los receptores S1P (edg), receptores que tienen a la esfingosina 1 fosfato como ligando natural. 217

Aunque el FTY720 es un dbil ligando de estos receptores, el metabolito ster fosfato que se forma de manera natural tras su administracin en ratas y ratones, tiene una alta afinidad por varios miembros de esta familia de receptores. La activacin de los receptores S1P se ha relacionado con la induccin de linfopenia en animales. La retencin de los linfocitos en los nodos linfticos inhibira la infiltracin de linfocitos en los rganos transplantados (Mandala y cols., 2002). INFLAMACIN Se ha descrito recientemente que el cido terreico es un inhibidor de la tirosina quinasa de Bruton (Btk) en mastocitos. La Btk es activada por interaccin con el receptor de IgE de alta afinidad, y est implicada en las cascadas de sealizacin que llevan a la exocitosis de citoquinas proinflamatorias en la respuesta alrgica. El cido terreico fue aislado originalmente en 1942 como antibitico a partir de Aspergillus terreus, e inhibe la sntesis de protenas bloqueando la formacin de leucil-tRNA en bacterias sensibles. Sin embargo, tambin se ha demostrado que es un inhibidor especfico de la interaccin entre Btk y PKC, lo que resulta en una recapitulacin del fenotipo de las mutaciones de Btk, sin bloquear muchas otras funciones celulares. Aunque este compuesto no puede ser usado en la clnica debido a su citotoxicidad, podra ser usado como cabeza de serie para generar inhibidores de Btk con mejor perfil teraputico (Kawakami y cols., 1999). An ms recientemente se han descrito unos nuevos macrlidos denominados efomicinas, producidos por una cepa de Streptomyces sp., que inhiben la adhesin de leucocitos al endotelio mediada por selectina, tanto in vitro como en modelos de ratones. La adhesin mediada por selectina iniciador del reclutamiento de leucocitos parece ser relevante en diversas patologas, desde psoriasis y artritis reumatoide hasta infarto de miocardio. Adems, la efomicina M, un derivado semisinttico de estos compuestos, demostr eficacia en la disminucin de la inflamacin cutnea en dos modelos de psoriasis en ratones, mostrando buenas propiedades farmacocinticas y baja toxicidad. Aparentemente, el efecto de las efomicinas estara mediado por la inhibicin especfica de la selectina (Schn y cols., 2002). SISTEMA NERVIOSO Los compuestos de origen microbiano ms relevantes clnicamente en esta rea son los alcaloides del ergot. La ergotamina, el alcaloide del hongo Claviceps purpurea, fue la causa de envenenamientos masivos en Europa en la Edad Media, debido a la ingestin de pan de centeno contaminado con esclerocios del hongo (Tfelt-Hansen y cols., 2000). El compuesto, aislado en 1918, ha sido usado para el tratamiento de la migraa desde 1926, sin alternativas especficas durante varias dcadas. La ergotamina es capaz de unirse a varios receptores de neurotransmisores, pero a las concentraciones teraputicas parece actuar principalmente como agonista de los receptores de serotonina 1B/1D, de dopamina D2 y de los -adrenoceptores. El efecto farmacolgico ms evidente de la ergotamina es la vasoconstriccin, particularmente acusada en la cartida, lo cual se pensaba constitua la base de sus propiedades anti-migraa, pero hay investigaciones que apuntan que tal efecto puede ser ms debido a la inhibicin de la inflamacin neurognica y la transmisin neuronal. Aunque este frmaco ha sido usado durante dcadas (Cafergot, Ergostat), su utilidad es todava sujeto de controversia (Tfelt-Hansen y cols., 2000). Adems, debido 218

a su escasa selectividad, produce numerosos efectos secundarios que limitan su aplicabilidad, y con la introduccin de los triptanes, mucho ms especficos, la ergotamina ha dejado de ser el frmaco de elccin para mdicos y pacientes. Otros alcaloides del ergot estructuralmente similares usados en la clnica incluyen la ergotoxina (Hydergine), un vasodilatador para tratar anomalas en la circulacin perifrica, y la bromocriptina (2-bromo-ergocriptina), un derivado semisinttico que es un potente agonista de los receptores D2 de dopamina, y que se ha utilizado para tratar la enfermedad de Parkinson desde los aos 70 (Samuelson, 1999). Este ltimo compuesto tambin reduce la secrecin de prolactina y de hormona del crecimiento, por lo que se ha usado tambin para detener la produccin de leche y para el tratamiento de la acromegalia (Samuelson, 1999) y de la hiperprolactinemia debida a prolactinomas. Otros anlogos desarrollados ms recientemente, como la cabergolina o el terguride, son tambin agonistas utilizando para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y de las hiperprolactinemias (Shu, 1998). DIABETES Uno de los descubrimientos ms interesantes de la ltima dcada en el campo de los metabolitos microbianos de inters teraputico fue el de la bis-desmetil-asterriquinona B1, DMAQ-B1 (Fig. 13). Este compuesto fue descubierto como un agente mimtico de insulina con disponibilidad oral mediante un proceso de screening diseado para detectar molculas que activaran la tirosina quinasa del receptor de insulina en humanos (Zhang y cols., 1999). El compuesto, producido por un hongo del gnero Pseudomassaria, era selectivo para el receptor de insulina frente a otros receptores con tirosina quinasa asociada, tales como los de IGF-1 o EGF. El compuesto reproduce la actividad de la insulina en varios ensayos bioqumicos y celulares, incluyendo la estimulacin del transporte de glucosa en clulas completas. Lo que es ms interesante, la administracin de la DMAQ-B1 por va oral en dos modelos de diabetes de tipo II en ratones produjo una disminucin significativa de los niveles de glucosa y la supresin de los altos niveles de insulina asociados con estos mode los animales. El descubrimiento fue saludado como un avance importante en el desarrollo de nuevos agentes antidiabticos orales. Posteriormente, se han descrito derivados semi-sintticos con mejores caractersticas que la DMAQ-B1 y con potencial como agentes anorexignicos. La administracin de estos compuestos via intracerebroventricular resulta en una reduccin de la ingesta de comida y el peso corporal en ratas. Adems, en un modelo de obesidad inducida por una dieta rica en grasas en ratones, estos compuestos produjeron una disminucin del aumento de peso, la adiposidad y la resistencia a insulina (El Air y cols., 2002). OBESIDAD El orlistat o tetrahidrolipstatina (Xenical) es el primero de una nueva clase de compuestos desarrollado por Roche para combatir la obesidad severa, cuyo mecanismo de accin es la inhibicin de las lipasas. Este frmaco es un derivado de la lipstatina , un compuesto producido por una cepa de Streptomyces toxytricini. Este compuesto, que no es absorbido, ejerce su accin en el lumen del intestino delgado y reduce la absorcin de grasa en casi el 30% por inhibicin de las lipasas gstricas

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y pancreticas. El orlistat se est utilizando tanto para la reduccin de peso en pacientes obesos como en aquellos que adems padecen diabetes de tipo 2 (Proietto y cols., 2000; Heck y cols., 2000). ANTAGONISTAS DE COLECISTOQUININA Las colecistoquininas (CCKs) son hormonas peptdicas y neurotransmisores ampliamente distribuidas a travs del tracto gastrointestinal y el sistema nervioso central, y median un buen nmero de funciones fisiolgicas. Existen dos subtipos de receptor, CCK-A y CCK-B, el primero de los cuales predomina en tejidos perifricos, mientras que el segundo es ms abundante en sistema nervioso central. La asperlicina fue descubierta en 1984 por cientficos de Merck como un antagonista selectivo de CCK-A producida por Aspergillus alliaceus (Chang y cols., 1985). Este descubrimiento represent un hito cientfico, siendo uno de los primeros ligandos no peptdicos descritos para un receptor de un pptido. La asperlicina fue utilizada para desarrollar otros antagonistas ms potentes, tales como el candidato clnico MK-329 (devazepide) y otros compuestos que han sido ensayados en humanos (Patchett, 2002). As, el devazepide fue ensayado como una posible terapia anti-ulcerosa, pero problemas de toxicidad detuvieron su desarrollo. Debido a que tanto el MK-329 como la asperlicina inhibieron el crecimiento de tumores de pncreas en ratones atmicos, el MK-329 fue ensayado en pacientes con cncer pancretico, pero no demostr eficacia. Otros derivados de la asperlicina selectivos para receptores CCK-B han sido desarrollados ms recientemente como candidatos para el tratamiento de ansiedad, pnico y dolor (Shu, 1998). Algunos de estos compuestos se han ensayado ya en humanos, con resultados poco concluyentes (McDonald, 2001). CONCLUSIONES Y FUTURO Como se ha visto en este captulo, los metabolitos microbianos poseen una amplia gama de actividades biolgicas, desde antibiticos en el ms amplio sentido de la palabra, hasta inhibidores o activadores de enzimas, receptores y otros procesos biolgicos. En algunos casos sto ha resultado en frmacos clnicamente tiles, con un impacto muy importante en la historia de la medicina moderna. Otros compuestos progresaron ms all de la etapa de descubrimiento, pero tuvieron que ser abandonados por una u otra razn, o estn todava en ensayos clnicos. La vasta diversidad estructural de los metabolitos secundarios de origen microbiano, combinada con su reconocida capacidad para interaccionar con sistemas biolgicos, debera hacer a hongos y bacterias una fuente atractiva de compuestos para los programas de descubrimiento de frmacos en la industria. Sin embargo, debido a la fuerte competencia de la qumica de sntesis y a las dificultades asociadas a la investigacin en productos naturales, es evidente que este tipo de programas han perdido el favor de la industria farmacutica. Las desventajas comnmente asociadas a los productos naturales van desde los altos costes y el tiempo requerido para aislar y elucidar las estructuras de los compuestos activos, hasta la percepcin de que los extractos de productos naturales no son compatibles con algunas de las tecnologas de deteccin en los ensayos usados en laboratorios de ultra-high throughput screening (cribado de alta densidad). Aunque 220

parte de lo anterior es cierto, sigue siendo verdad que los microorganismos son una valiosa fuente de nuevas estructuras qumicas con actividad biolgica, y ello debera mantenerlos como un recurso ms para la industria. Una reciente revisin ha estimado que el 50% de todas las NCEs (nuevas entidades qumicas) aprobadas por la FDA en el periodo 1981-2002 son de origen natural o estn inspiradas en molculas existentes en la naturaleza, sin contar vacunas y otras macromolculas de uso teraputico (Newman y cols., 2003). Slo mediante la superacin de las desventajas mencionadas, utilizando sistemas ms eficientes para recortar el tiempo y los costes necesarios para avanzar desde las cepas aisladas hasta los compuestos activos, podrn los microorganismos volver al sitio que les corresponde, en el ncleo de los programas de descubrimiento de nuevos frmacos en la industria farmacutica. BIBLIOGRAFA (1) Air, E.L., Strowski, M.Z., Benoit, S.C., et al. (2002) Small molecule insulin mimetics reduce food intake and body weight and prevent development of obesity. Nature Med. 8: 179-183. (2) Ali, S.M., Chee, S.K., Yuen, G.Y., et al. (2002) Hypocrellins and hypericin induced apoptosis in human tumor cells: a possible role of hydrogen peroxide. Int. J. Mol. Med. 9: 461-472. (3) Abbanat, D., Macielag, M., Bush, K. (2003) Novel antibacterial agents for the treatment of serious Gram positive infections. Expert Opin. Investig. Drugs 12: 379399. (4) Ackermann, G., Rodloff, A.C. (2003) Drugs of the 21st century: telithromycin (HMR 3647) - the first ketolide. J. Antimicrobial Chemother. 51: 497-511. (5) Amemiya, H. (1996) 15-deoxyspergualin: A newly developed immunosuppressive agent and its mechanism of action and clinical effect: A review. Artificial Organs 20: 832-835. (6) Ashizawa, T., Kawashima, K., Kanda, Y., et al. (1999) Antitumor activity of KF22678, a novel thioester derivative of leinamycin. Anti Cancer Drugs 10: 829-836. (7) Bentley, R. (2000) Mycophenolic acid: a one hundred year odyssey from antibiotic to immunosuppressant. Chem. Rev. 100: 3801-3825. (8) Bergstrom, J.D., Dufresne, C., Bills, G.F., et al. (1995) Discovery, biosynthesis and mechanism of action of the zaragozic acids: potent inhibitors of squalene synthase. Annu. Rev. Microbiol. 49: 607-639. (9) Best, J.D., Jenkins, A.J. (2001) Novel agents for managing dyslipidaemia. Expert Opin. Investig. Drugs 10: 1901-1911. (10) Bonfiglio, G., Furneri, P.M. (2003) Patents on streptogramin antibiotics. Expert Opin. Ther. Patents. 13: 651-659. (11) Borzilleri, R.M., Vite, G.D. (2002) Epothilones: new tubulin polymerization agents in preclinical and clinical development. Drugs Future 27: 1149-1163. (12) Brinkmann, V., Lynch, K.R. (2002) FTY720: targeting G-protein-coupled receptors for sphingosine 1-phosphate in transaplantation and autoimmunity. Curr. Opin. Immunol. 14: 569-575. (13) Bush, K., Macielag, M., Clancy, J. (2000) Superbugs: new antibacterials in the pipeline. Emerging Drugs 5: 347-365. (14) Cacciari, B., Romagnoli, R., Baraldi, P.G., et al. (2000) CC-1065 and the duocarmycins: recent developments. Expert Opin. Ther. Patents 10: 1853-1871.

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Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias Aptdo Oficial. 46113 Moncada Valencia INTRODUCCION Los patgenos del suelo son la causa de muchas prdidas de cosecha La repeticin de un cultivo en la misma parcela, que es una prctica cultivos ms rentables, acaba seleccionando en el suelo una microorganismos rica en los patgenos ms especializados que agricultores a cambiar de parcela o a cambiar de cultivo. en los cultivos. habitual en los poblacin de fuerza a los

El control qumico mediante fumigantes, a las dosis necesarias para disminuir el potencial infeccioso a unos niveles aceptables para los cultivos, afecta tambin al ambiente biolgico, fsico y qumico del suelo. Tambin las cosechas son afectadas por los residuos txicos de estos fumigantes. Las legislaciones de losp aises europeos son cada vez ms restrictivas en el contenido en residuos de los productos para el consumo humano. Suecia tolera un mximo de 30ppm de Br inorgnico en todo tipo de fruta y verdura, Alemania Holanda y Dinamarca toleran hasta 30 ppm de Br- en frutas y verduras (ctricos, fresa) y hasta 50 ppm en verduras de hoja (lechuga). Estos valores son fcilmente sobrepasados en los cultivos siguientes a la desinfeccin con bromuro de metilo a las dosis habituales. Igualmente est adquiriendo gran importancia la contaminacin de acuferos por actividades agrcolas. Los residuos de fertilizantes (nitratos) y productos fitosanitarios suponen ya en la actualidad un grave riesgo para la utilizacin de aguas potables. En Israel, por sugerencia de agentes de extensin y de agricultores, Katan puso a punto una tcnica de calentamiento del suelo mediante el acolchado con una lmina de polietileno transparente, en la poca del ao de mayor insolacin. El calentamiento del suelo mediante la radiacin solar es un mtodo para el control de enfermedades con el objeto de reducir su incidencia al menos en la temporada siguiente. Entre los trminos usados para denominar este mtodo estn: Calentamiento solar (solar heating), acolchado plstico, (plastic tarping o plastic mulching), solarizacin del suelo (soil solarization), pasteurizacin del suelo (soil pasteurization). Desde que en 1980 Katan presentara esta tcnica, se han producido contribuciones importantes en cuanto a erradicacin efectiva del inculo a la profundidad deseada, reinfestacin, efecto contra microorganismos benficos, efectos residuales en las plantas, as como la problemtica de la aplicacin y la valoracin y comparacin de costes de aplicacin EL SUELO DESDE EL PUNTO DE VISTA TRMICO El suelo tiene una capacidad calorfica alta, entre 0.27 y 0.80 cal/g/C, lo que significa que es un buen acumulador de calor, y una baja conductividad trmica, que hace que la penetracin del calor en el suelo sea lenta, al igual que su enfriamiento.

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La ecuacin que describe el balance de energa de un suelo no acolchado es (MAHRER, 1979) (1-a)* Rs+es*Rl-H-E-S-es*o*Ts4=0 Donde: a = Albedo, que depende del color del suelo Rs= Radiacin solar incidente Rl= Radiacin incidente de onda larga H = Flujo de calor sensible desde o hacia la atmsfera. E = Flujo de calor latente (evaporacin). S = Flujo de calor en el suelo. o = Constante de Stephan-Boltzman. Ts= Temperatura superficial del suelo. es= Coeficiente de emisividad del suelo. La energa que llega al suelo a travs de la radiacin solar, penetra en l en funcin de sus propiedades trmicas, capacidad calorfica, conductividad trmica, difusividad trmica etc., que a su vez dependen de las caractersticas fsicas del propio suelo, y de su contenido de humedad, y sufre una serie de prdidas por radiacin, conduccin, conveccin y evaporacin. Por la noche el suelo tiene un proceso de enfriamiento, de modo que la temperatura a lo largo del tiempo describe una curva cclica parecida a una sinusoide. En el caso de que el suelo est hmedo y acolchado con una lmina de polietileno, el balance de energa se modifica, debido por una parte a que la humedad aumenta la conductividad y sobre todo la difusividad trmicas, haciendo posible un calentamiento ms rpido hacia el interior, y por otra, hay una reduccin de la radiacin solar incidente debido a la transmitancia y reflexin de la lmina plstica, y una disminucin notable de prdidas calorficas por conduccin y conveccin, y sobre todo una eliminacin de prdidas de calor latente de evaporacin a causa de la barrera impuesta por el acolchado. Asmismo las prdidas nocturnas por radiacin calorfica al cielo, se hacen menores por la condensacin del agua en la superficie interna del plstico. El balance de energa del suelo hmedo acolchado es: Rmn-Hm-Em-Sm=0 en donde: Rmn= Flujo neto radiante en la superficie del suelo. Hm = Flujo de calor sensible entre el terreno y el aire atrapado por el acolchado. Em = Flujo de calor latente. Sm = Flujo de calor en el suelo. El resultado es que un suelo en estas condiciones de elevado contenido de humedad y acolchado, consigue elevar progresivamente su temperatura, con diferencias que superan al suelo no solarizado en unos 10 C.

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Debido al inters por conocer las posibilidades de la solarizacin, diversos autores (MAHRER, 1979;MAHRER y KATAN, 1981;CENIS, 1986) han elaborado modelos de prediccin, que tratan de ser tiles para valorar la posible eficacia de la solarizacin de cada zona, a las diversas profundidades del suelo y en cada poca del ao. El modelo de MAHRER, se basa en el conocimiento de un conjunto de datos como son las temperaturas en suelo no acolchado, la del aire, la radiacin solar y la atmosfrica calorfica, el perfil de velocidad del viento, y datos como la transmitancia de la cubierta de plstico y su emisividad, la capacidad calorfica, la conductividad y la emisividad del suelo. La complejidad del modelo por el tipo de datos necesarios, a veces no fcilmente disponibles, hace que otros autores busquen la posibilidad de usar otros modelos ms sencillos (CENIS 1986), an cuando su uso quede ms restringido. Este modelo de CENIS basado en el anlisis de FOURIER, precisa nicamente conocer las temperaturas mxima y mnima del suelo a dos profundidades, 10 y 20 cm, y la hora de cualquiera de ellas durante 7 das en una parcela acolchada de 2 por 2 metros. El mtodo permite predecir las temperaturas alcanzables y estimar tiempos de exposicin, a partir de los cuales se puede decidir si los niveles de letalidad para los patgenos a combatir son suficientes. El modelo es til para profundidades hasta de 20 cm, en zonas de condiciones climticas estables en verano.

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Lectura La fijacin simbitica de nitrgeno en soya Nodulacin, inoculantes y mtodos de inoculacin Las legumbres (Leguminosae o Fabaceae) incluyen unas 18.000 especies distribuidas en aproximadamente 750 gneros entre las que se cuentan la soja, la alfalfa, el trbol y las que producen las arvejas o porotos. Las legumbres constituyen la fuente ms importante de alimentos vegetales tanto para los seres humanos como para el ganado. Las legumbres adems son esenciales para mantener el balance de nitrgeno del suelo debido a su capacidad de albergar bacterias que utilizan nitrgeno gaseoso que proporcionan a las plantas la fuente de este elemento sin consumir los compuestos nitrogenados presentes en el suelo. La simbiosis La simbiosis es una de las ms importantes interacciones biolgicas. Los organismos que participan en ella se benefician mutuamente en situaciones en las que ninguno de ellos podra realizar una funcin vital o sobrevivir aisladamente. Para que una simbiosis tenga lugar, dos o ms organismos diferentes deben vivir en inmediata proximidad. Algunas simbiosis microbianas involucran solo a microorganismos, mientras que en otras existen asociaciones de microorganismos con insectos, plantas o animales superiores. Un ejemplo de simbiosis es la fijacin simbitica de nitrgeno. En ella se establece una relacin de este tipo entre bacterias hetertrofas (esto es, que dependen de un sustrato orgnico como principal fuente de carbono) de los gneros Rhizobium y Bradyrhizobium (denominados colectivamente rhizobios) y plantas leguminosas. Los microorganismos son albergados por races o tallos y as logran, mediante sistemas enzimticos especficos, que el nitrgeno gaseoso (N 2) que no es aprovechable por las plantas se transforme en amonio que puede ser utilizado por ellas. La asociacin es mutuamente beneficiosa porque permite que las bacterias obtengan hidratos de carbono del vegetal mientras que este se beneficia incorporando nitrgeno del aire. Esto a su vez impide que el suelo pierda sustancias con nitrgeno. La bacteria fijadora

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Figura 1. Raz de soja nodulada. En 1838, el francs Boussingault demostr la capacidad de las leguminosas para emplear el nitrgeno atmosfrico, pero solo 50 aos ms tarde, los alemanes Hellriegel y Nilfarth mostraron de manera indiscutible que esta capacidad era propia de las leguminosas que forman ndulos en sus races y que es en estos ndulos (vase la figura 1) donde se produce la fijacin de nitrgeno. Los ndulos pueden adoptar diferentes formas. Es as como existen ndulos aproximadamente esfricos, cilndricos, aplastados y a menudo otros que presentan formas totalmente irregulares. El aislamiento del rhizobio por el botnico y fitopatlogo holands Beijerinck en 1888, dio lugar a un sustancial aumento de los trabajos dedicados a esta bacteria y sus asociaciones con las leguminosas. Las bacterias del suelo que son capaces de establecer la simbiosis con las leguminosas pertenecen a los gneros Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium, los que estn agrupados en distintas familias segn la clasificacin bacteriana del Manual Bergey en su versin de marzo de 2001. Todas estas bacterias son quimioorganotrficas (esto es, extraen la energa de compuestos inorgnicos como el dixido de carbono y utilizan como fuente de carbono compuestos orgnicos) y aerobias (se desarrollan en presencia de oxgeno). No forman esporas y son capaces de moverse utilizando uno o ms (hasta seis) flagelos. Sus dimensiones son de entre 0,5 a 0,9m de ancho y entre 1, 2 a 3m de largo (m son millonsimas de metro). La soja El nombre cientfico de la soja es Glycine max L. Merrill, pertenece a la familia de las Fabceas, subfamilia Papilionoidae. Si bien ha sido denominada la planta de los mil usos por la enorme cantidad de aplicaciones que posee, la mayor parte de la demanda de este cultivo est orientada a la obtencin del aceite y de la harina a partir de su semilla. Los alimentos obtenidos a partir de la soja fueron desarrollados a lo largo de miles de aos como parte de la cultura oriental de modo que, en Oriente, la soja (figura 3) ha sido un componente esencial en la alimentacin humana desde que existen registros histricos. En Occidente desde la mucho ms reciente difusin de la soja como cultivo extensivo, su importancia en la alimentacin humana estuvo basada en que esta proporciona a bajo precio caloras y protenas de alto valor nutritivo, y puede de ese modo ser un sustituto eficaz de la carne y de la leche en poblaciones de bajo poder adquisitivo o en tiempos de crisis. La investigacin cientfica en el campo de la salud ha establecido un slido vnculo entre la adecuada alimentacin y la prevencin de enfermedades como los trastornos cardiovasculares, el cncer y la osteoporosis. Los componentes de la soja contribuyen sustantivamente a esto. A lo largo de las dos ltimas dcadas, el cultivo de soja a nivel mundial se increment notablemente, aumentando tanto la superficie cultivable como la produccin de esta leguminosa. EEUU es todava el mayor productor de soja, pero tanto Brasil como la Argentina han logrado incrementos importantes de la produccin de este cultivo. Actualmente en nuestro pas se siembran doce millones de hectreas y se producen aproximadamente treinta y cuatro millones de toneladas de soja lo que lo ubica en el tercer lugar como productor mundial de soja y entre los primeros pases exportadores de su aceite y su harina.

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Etapas de la fijacin simbitica de nitrgeno La fijacin simbitica de nitrgeno en los ndulos de las leguminosas es el resultado de una serie de complejas interacciones entre la bacteria y las races de la planta entre las que se distinguen las siguientes etapas

Etapas en la nodulacin de soja: 1. Multiplicacin rizosfrica de los rhizobios y adhesin de estos a las clulas superficiales de los pelos radiculares de las races; 2. Encurvamiento de los pelos radiculares y marcada deformacin de los mismos con penetracin de las bacterias a travs del cordn de infecccin tubular; 3. Invasin, proliferacin, alargamiento y emergencia de tejido nodular infectado con rhizobios;

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4. Diferenciacin de los ndulos en las races de la planta. (Tomado de Brock, 1999, Biologa de los microorganismos). o El aumento en el nmero de los rhizobios que ingresarn a los pelos radiculares de la leguminosa. Esto es posible gracias a sustancias excretadas por las races La adhesin entre las bacterias y las clulas superficiales de los pelos radiculares de las races . Esto ocurre por mltiples mecanismos, en la mayora de ellos la planta produce protenas que se unen a los hidratos de carbono de la superficie de las bacterias. En los primeros pasos de la infeccin los pelos radiculares se curvan deformndose . De este modo encierran y atrapan los rhizobios que se hubieran adherido a ellos. Penetracin de las bacterias . Esta se produce a travs de la pared de los pelos radiculares mediante la formacin de un cordn de infeccin tubular por donde las bacterias penetran las clulas de las races. Diferenciacin de los ndulos radiculares. Una vez que las bacterias han invadido las clulas radiculares estas ltimas proliferan con la consiguiente emergencia de tejido nodular infectado con rhizobios. La fijacin de nitrgeno se produce varios das despus de la entrada de las bacterias a las races. Al hacerlo las bacterias fijan nitrgeno atmosfrico y excretan amonaco en el citoplasma de la clula el que ser utilizado por la planta como fuente para la sntesis de sustancias que contienen nitrgeno.

La inoculacin de leguminosas La inoculacin de las leguminosas es una prctica agrcola destinada a incorporar bacterias fijadoras de nitrgeno a las semillas o al suelo en el momento de la siembra con el objeto de proveer una cantidad apropiada de bacterias a la raz de una planta, en el momento de la iniciacin de la formacin de ndulos. De esta manera la planta obtendr, mediante la simbiosis con la bacteria, el nitrgeno necesario para su desarrollo. La inoculacin ha sido usada en todo el mundo desde hace aproximadamente una centuria, con el propsito de mejorar la productividad de los cultivos de leguminosas. Principales propiedades de un inoculante El producto debe contener bacterias con las siguientes caractersticas: Capacidad de fijar nitrgeno en diferentes condiciones ambientales. Capacidad para desplazarse en el suelo. Estabilidad de las bacterias durante su almacenamiento. Formacin de ndulos y fijacin de nitrgeno aun en presencia de nitrgeno en el suelo Como es bien sabido el nitrgeno es un elemento fundamental para los seres vivos. Frecuentemente el desarrollo de los vegetales se ve limitado por la ausencia de una adecuada cantidad de compuestos con nitrgeno en el suelo. La alternativa a la inoculacin es el uso de los fertilizantes qumicos que contengan compuestos con 231

nitrgeno. Si bien esto es una prctica frecuente, la produccin de fertilizantes qumicos consume energa ya que para producirlos es necesario por un lado separar el hidrgeno de los otros componentes del gas natural o del petrleo, luego comprimir los reactivos y finalmente trasladar el fertilizante as producido desde las plantas industriales al campo. La creciente necesidad de conservar los combustibles fsiles como el carbn, el metano y el petrleo que son recursos no renovables ha incentivado las investigaciones sobre las bacterias (rhizobios) capaces de establecer simbiosis con leguminosas de importancia econmica y aportar de esta manera el nitrgeno necesario para el adecuado desarrollo de los cultivos. Los inoculantes Los inoculantes son los productos comerciales con alta densidad de cultivos especficos de rhizobios incorporados a diversos soportes. La preparacin del inoculante comercial que ser utilizado por el productor agrcola, comprende el cultivo en el laboratorio de las bacterias apropiadas y su incorporacin a un soporte adecuado. Existen varios soportes entre los cuales cabe mencionar los provenientes de turba estril, de compuestos inorgnicos y los lquidos u oleosos Un producto comercial ser adecuado cuando el inoculante se forme a partir de bacterias especficas para constituir ndulos con la soja y cuando las bacterias estn presentes en cantidad suficiente como para aportar un mnimo de un milln de bacterias por semilla inoculada al momento de la siembra. Es tambin necesario tener en cuenta los requisitos para la conservacin de los inoculantes. En el caso de los inoculantes de soporte slido, estos incluyen la temperatura y la humedad de almacenamiento mientras que en los inoculantes lquidos es fundamental la temperatura de almacenamiento. Tanto las altas temperaturas como la desecacin afectan la viabilidad de las bacterias. Los inoculantes de alta calidad deben retener su capacidad de nodulacin y fijacin de nitrgeno durante 6 meses o ms cuando se almacenen a 20C; se puede extender su vida til si se mantienen a temperaturas inferiores. La temperatura ptima de conservacin de un producto con bacterias es de 5C. En esta condicin, el nmero de ellas no disminuye en por lo menos 31 das de almacenamiento. Esta temperatura es la indicada como la adecuada en los envases de muchos de los productos comerciales. En un ensayo realizado en el Laboratorio de Microbiologa Agrcola del Departamento de Agronoma de la Universidad Nacional del Sur, se observ una disminucin en el nmero de rhizobios en los inoculantes comerciales lquidos conservados a 20 y 30C de temperatura. Investigaciones realizadas en otros pases, como Estados Unidos y Canad, demostraron que exposiciones de inoculantes para leguminosas a altas temperaturas y la desecacin durante el transporte, almacenamiento e inoculacin resultan en la disminucin del nmero de rhizobios y en la capacidad para fijar nitrgeno por los mismos. Propiedades del inoculante como producto comercial Puede estar formado por uno o dos tipos de bacterias que fijen nitrgeno. Debe poseer un nmero adecuado de rhizobios o bacterias, y esto vara segn las empresas fabricantes. El soporte o base del inoculante debe permitir la supervivencia de los rhizobios. 232

 Estar libre de otras bacterias y de posibles contaminantes. Estar envasado para proteger a los rhizobios hasta ser usado por el productor, permitiendo el intercambio de gases y la retencin de humedad. El envase debe contener informacin sobre la fecha de elaboracin, de vencimiento y sobre el tipo de bacterias presentes. Tipos de inoculantes Los inoculantes para leguminosas son diseados para ser aplicados a la semilla, mientras que existen otros de aplicacin directa en el suelo. Las distintas formas comerciales de inoculantes para semilla en la Argentina incluyen: Lquido acuoso Lquido oleoso Slido con soporte orgnico (turba estril) Slido con soporte inorgnico. Mtodos de inoculacin La inoculacin convencional es el mtodo mediante el cual el productor agropecuario incorpora el inoculante en la semilla. Puede realizarse en condiciones hmedas, en las cuales el inoculante es mezclado primero con agua para formar una suspensin uniforme y fluida que se agrega a las semillas las que deben ser sembradas inmediatamente, ya que como hemos visto el secado provoca una disminucin importante en el nmero de bacterias. La inoculacin de este tipo es sencilla y prctica aunque posee desventajas entre las que se cuentan el nmero menor, comparado con otros procedimientos, de rhizobios que se adhieren a la superficie de la semilla, el contacto directo del inoculante con otros productos qumicos que se aplican a la semilla y la exposicin de las bacterias a la desecacin y a otros factores ambientales desfavorables. Estas desventajas fueron comprobadas en los distintos ensayos realizados en el Laboratorio de Microbiologa Agrcola del Departamento de Agronoma de la Universidad Nacional del Sur sobre plantas de soja, los que mostraron que la inoculacin convencional produjo escasos ndulos con bajo peso a pesar de que la cantidad de bacterias inoculadas (un milln por semilla) fue la adecuada. Mtodos alternativos estudiados en la cmara de crecimiento del Laboratorio mencionado anteriormente (figura 6) mostraron mejores resultados. Por ejemplo, cuando el inoculante fue colocado sobre la superficie del suelo, se observ un aumento en el nmero de ndulos y en el peso de estos, lo que indicara que la inoculacin sobre la superficie del suelo es ms eficiente que la practicada sobre las semillas. Adems, el Laboratorio de Microbiologa Agrcola evalu los efectos de la inoculacin al suelo cuando esta se realizaba despus de la siembra, por ejemplo a los 11 y 20 das. Los resultados fueron muy positivos: se observ la aparicin de un elevado nmero de ndulos de soja con un peso mayor al obtenido con las inoculaciones a la semilla. La inoculacin posterior a la siembra ha sido propuesta fundamentalmente como un procedimiento para corregir la nodulacin escasa. En evaluaciones realizadas en otros pases (Smith, 1992) sobre la inoculacin de soja en estadios avanzados de la plntula, se observ tambin mayor nmero de ndulos cuando una inoculacin inicial de semillas era seguida por otra inoculacin a los 14 o 21 das despus de la siembra. El futuro 233

La agricultura moderna es la actividad humana con mayor impacto sobre el ambiente a escala global. La progresiva ampliacin de las fronteras agrcolas, que estn alcanzando los lmites prcticos de la superficie cultivable, y la continua degradacin de suelos y napas acuferas, constituyen manifestaciones claras de este proceso. Paralelamente, las inadecuadas prcticas de explotacin utilizadas en las regiones menos desarrolladas estn conduciendo a la paulatina deforestacin y desertificacin de vastas regiones del planeta. La creciente contaminacin ambiental, incluyendo la de los ecosistemas del suelo, debido al mal manejo y utilizacin de los recursos e insumos, demandar la implementacin de nuevas prcticas agrcolas que preserven el suelo. Como consecuencia, la inoculacin se presenta como una alternativa biolgica sustentable, en la cual se aprovechan los microorganismos y sus capacidades fisiolgicas, como la fijacin simbitica de nitrgeno.

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