Preparo de Materiais em microbiologia,Meios de cultura usados no laboratrio, tcnicas de semeadura e Coloraes

Prof (a) Dr Luciana Debortoli de Carvalho

Preparo de materiais

Meios de Cultura
O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material Agar sangue (AS) meio rico e no seletivo, diferencial para a hemlise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espcies de hemfilos e outros fastidiosos

Meios de Cultura
gar Thayer Martin Modificado (TMM) meio seletivo pela adio de colistina, vancomicina e nistatina. Inibe crescimento de enterobactrias, Gram positivos, fungos e algumas espcies de Neisserias saprfitas. Enriquecido com a adio de complementos para a recuperao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae.

Meios de Cultura
Agar chocolate (AC) meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e facultativas. Quando incubado em

CO2 d suporte tambm ao crescimento dos microaerfilos. Pode-se

observar halos esverdeados com colnias alfa- hemolticas. base do meio, adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura

alta, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina,
compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes.

Meios de Cultura
GAR CLED CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT: usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. A deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus. Empregado para isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. INTERPRETAO Cor original do meio: azul claro. Colnias lactose positiva: cor amarela. Colnias lactose negativa: cor azul.

Meios de Cultura
Agar MacConkey (MC) meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilizao de lactose. O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. Lactose positiva colorao avermelhada Lactose negativa colorao inalterada

Como exceo, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e

Bacillus

Meios de Cultura
gar Salmonela-Shigella (SS) meio seletivo para Salmonela e Shigella e
diferencial para a utilizao de lactose (colorao rsea) e produo de H2S (colorao negra); possue componentes (sais de bile, verde brilhante

e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos.

Meio de Rugai
Este meio utilizado para identificao presuntiva das principais espcies de Enterobactrias. Sua finalidade

principal a triagem bioqumica de colnias isoladas nos

meios seletivos para bacilos gram-negativos oxidasenegativa. Em um nico tubo a leitura possvel verificar 9 reaes: motilidade da bactria indicado pela turvao da lisina na base, lisina descarboxilase, fermentao da glicose em profundidade e da sacarose na superfcie do meio, produo de gs sulfdrico (H2S), gs em glicose, utilizao do aminocido L-triptofano (desaminao), hidrlise da uria e no tampo do tubo, um desenvolvimento de colorao avermelhada que indica a formao de indol.

Meio IAL
(Pessoa e Silva)
Identificao presuntiva

LWENSTEIN JENSEN
A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis). INTERPRETAO Cor original do meio: verde claro

Positivo: Crescimento de colnias amarelas

Negativo: ausncia de crescimento.

TCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Isolamento de um microrganismo: O isolamento consiste na obteno de uma cultura pura (colnias isoladas de um nico microrganismo, separando-o de outros que se encontram no mesmo material).

Finalidades do isolamento: Identificao de um microrganismo. A simples observao de

caracteres morfolgicos no suficiente para a identificao e classificao dos microrganismos. Para isto, lanamos mo da anlise de uma srie de caractersticas destes, como: caractersticas bioqumicas, sorolgicas, de patogenicidade, etc. O estudo destas caractersticas est na dependncia do microrganismo que se pretende identificar.

Semeadura: Consiste no plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer.

Repique: Consiste na transferncia de um microrganismo de um meio de cultura para outro.

TCNICAS DE SEMEADURA
Mtodos de Isolamento e Identificao A identificao da maioria dos microrganismos depende de uma completa descrio de suas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e

antignicas. Desde que, na maioria dos casos, o organismo a ser isolado

faz parte de uma populao mista, indispensvel o seu isolamento, no sentido de obteno de cultura pura.

Mtodos de Inoculao
1. Semeadura em Meio Slidos

1.1. Semeadura em Tubos de Ensaio (em meios inclinados) Esgotamento de ala 1.1.1. Tcnica utilizada para obteno de crescimento bacteriano e/ou para a

observao de propriedades bioqumicas da

bactria. A semeadura , geralmente, feita da base do meio para a extremidade do mesmo

(pode tambm ser chamada de estriamento).

Figura 1: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela tcnica do esgotamento (Ex. meio de cultura: TSI)

Mtodos de Inoculao
1.1.2. A semeadura tambm pode ser

realizada da base para a extremidade do

meio, de forma uniforme. Esta tcnica realizada para que haja crescimento

bacteriano, bem como poderemos utiliz-la para observar funes metablicas de algumas bactrias.

Figura 2: Figura ilustrativa de um meio de cultura semeado pela tcnica supracitada (Ex. meio de cultura: Citrato de Simmons)

Mtodos de Inoculao
1.1.3. Em Picada: Esta tcnica de semeadura utilizada para que se

possa observar funes metablicas de alguns microrganismos

(bactrias) que so submetidas a anlise microbiolgica.

Figura 3: Figura ilustrativa de dois meios de cultura semeados com a tcnica em picada. No tubo esquerda, observamos o momento da picada que realizada com o auxlio de uma agulha de semeadura e direita observamos a picada propriamente dita (Ex. meio de cultura: SIM).

Mtodos de Inoculao
1.2. Semeadura em Placas de Petri (em superfcie): O material a ser
semeado dever conter poucos microrganismos porque o inculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colnia formada na superfcie

de um meio slido originada de um ou alguns microrganismos. Quanto

maior o nmero, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inculo for obtido a

partir de meio slido (inculo pesado), este poder ser diludo em salina
estril ou ser utilizada a tcnica de esgotamento adequada.

Mtodos de Inoculao
1.2.1. Estrias Mltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazendo estrias sucessivas at o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactrias existentes na amostra. Quando o material muito denso, a ala dever ser flambada.

Figura 4: Figura ilustrativa de como se deve proceder para realizar a tcnica de estrias mltiplas, onde a ala dever ser deslizada sobre a regio onde h um inculo bacteriano e logo depois deve ser passada na superfcie da placa para semeadura com movimentos em ZIG-ZAG, visando o isolamento bacteriano.

Mtodos de Inoculao
1.2.2. Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano, ou colnias isoladas (aps diluio) utiliza-se o mtodo de espalhamento em placa. Consiste em espalhar o material (suspenso bacteriana na maioria das vezes) com o auxlio de um swab (para

obteno de tapete uniforme) ou ala de Drigalski (para obteno de colnias isoladas aps diluio),
fazendo a semeadura por toda a superfcie da placa de Petri a ser utilizada nesta tcnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfcie da placa seja semeada, evitando regies sem semeadura. Recomenda-se que faa o procedimento de semeadura com o swab em trs direes distintas, com a ala em toda a superfcie rodando a placa.

Ala de drigalski

Tcnica para semeadura em superfcie (meios slidos):

O inculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluio da cultura em meio slido feito da seguinte maneira: Retiramos o inculo do tubo com a ala j flambada e fria. Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapu com a placa . Colocamos o inculo junto a parte superior da placa, espalhando-o a seguir atravs de estriamento (que poder ser contnuo ou descontnuo). O estriamento poder se feito de

maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a ala duas vezes no mesmo
local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na ala. Quando passamos a mesma 2 vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bactrias, o que dificultar o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento,

aps termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a
ala, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a ala na ltima estria que realizamos. Depois de terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levandoa a seguir para incubao na estufa, com a tampa voltada para baixo. Flambar a ala utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado.

Tcnica para semeadura em meios lquidos:

Segurar a ala com a mo direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a ala flambada na posio vertical e dever ficar atrs da chama para proteo do operador). Retirar a rolha de algodo do tubo que contem o microrganismo a ser semeado ou repicado (que dever estar na mo esquerda) utilizando-se o dedo mnimo da mo direita. A ROLHA DEVER PERMANECER SENDO SEGURA COM O DEDO MNIMO, AT O FINAL DA OPERAO. Flambar a boca do tubo, e retirar o inculo com a ala fria. Flambar novamente a boca do tubo e fechar. Pegar o tubo onde se ir realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. Esterilizar a ala, identificar o tubo semeado e levar para incubao em estufa.

Tcnica para semeadura em meios semi-slidos

Retirar o microrganismo do meio slido ou lquido com o auxlio de uma ala em agulha j flambada e fria. Abrir o tubo que contm o meio semi-slido e semear o microrganismo atravs de picada at mais ou menos 1/3 ou do tubo.

Fechar o tubo, identificar e levar para incubao.

Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado.

Colorao de GRAM
Passar a lamina c/ esfregao por 3x sob a chama. Fixao do esfregao pelo calor

Ala

Bactrias isolada

Esfregao

Tcnica de GRAM
1. Cobrir lamina com cristal violeta e deixar por 1 min. 2. Escorrer excesso do corante e lavar. 3.Cobrir lamina com Lugol e deixar por 1 min. 4. Escorrer excesso do corante e lavar. 5.Cobrir lamina com Eter-acetona e deixar por 30s. 6. Escorrer excesso do corante e lavar. 7.Cobrir lamina com Fucsina e deixar por 30s. 8 . Escorrer excesso do corante, lavar e deixar secar.

Proceder a colorao de GRAM

Fucsina

Colorao de Ziehl-Neelsen
Colnias de Micobactrias
Usar capela de fluxo laminar. Passar a lamina c/ esfregao por 3x sob a chama.

Meio de cultura para Micobactrias

Esfregao

Fixao do esfregao pelo calor

a) Cobrir os esfregao com fucsina de Ziehl. Aquecer at a emisso de vapores (No deixar o corante secar). Esperar 5 minutos; b) Lavar com gua corrente;

Resultado

c) Descorar com lcool (97%), cido clordrico (1%); d) Lavar em gua corrente; e) Corar com azul de metileno por 1 minuto; f) Lavar e secar; g) Observar ao microscpio as lminas coradas; h) Como se apresentam os BAAR. Proceder a colorao de Ziehl-Neelsen