Industrializacin de la produccin de clulas madre

Las clulas madre tienen el potencial de ser una fuente disponible para diferenciarse en muchos tipos de clulas. Esta propiedad nica se puede aprovechar tanto para facilitar y mejorar una serie de procesos de descubrimiento y desarrollo de drogas para fines teraputicos. La produccin a gran escala, "industrializado" de clulas madre humanas en condiciones bien controladas deber entregar la cantidad y calidad de clulas necesarias para apoyar los ensayos clnicos y las actividades de desarrollo de descubrimiento de drogas (Figura 1). Alcanzar este nivel de produccin cumpliendo con las normas reglamentarias y rigurosa calidad depender de seguir avanzando en cultivo celular y escalado, caracterizacin, enriquecimiento, depuracin y control del proceso en forma segura y rentable ofrecer un suministro consistente y reproducible de clulas.

Figura 1. Produccin a gran escala de clulas madres es necesaria para apoyar el desarrollo de aplicaciones terapeticas y el descubrimiento y desarrollo de drogas. De Escala de Banco a gran escala El cultivo celular puede parecer tanto un arte como una ciencia, a veces piden un enfoque de "lo que funciona". Cada tipo de clula tiene necesidades nicas cuando se cultivan in vitro, y las clulas madre ciertamente no son una excepcin. Estas clulas pluripotentes han ganado una reputacin de ser de difcil crecimiento en el cultivo, y en algunos casos se comporta de forma distinta para los investigadores utilizando los mismos medios y protocolos de control. Se agrega a estos desafos, el hecho de que las clulas madre pueden diferenciarse en > 200 tipos de clulas. Controlar ese proceso por mantener las clulas en su estado pluripotentes o conduccin diferenciacin abajo el linaje deseado requiere la orquestacin cuidadosa de las condiciones de cultivo. En un entorno de investigacin bsica, clulas crecen tpicamente en frascos de cultivo de tejidos en pequea escala utilizando medios y suplementos de cultivo (p. ej., factores de crecimiento) que no son totalmente definidos o caracterizados y suelen ser de origen animal.

Con frecuencia se cultivan clulas madre en capas de alimentador de fibroblastos de ratn, que ayuda a mantener el estado indiferenciado. Aunque factores solubles secretados por tales clulas de ratn ayudan a proporcionar un ambiente adecuado para la proliferacin de clulas madre, uso de capas de alimentador tiene importantes inconvenientes en el cultivo de clulas madre para aplicaciones clnicas. Capas de alimentador de ratn pueden variar de lote a lote e introducir las protenas de ratn en un sistema de cultivo, contribuyendo a una ms mala definicin de las variables de las condiciones de cultivo. En vez de capas de alimentador, los cultivos de clulas madre pueden ser crecidos en extractos de la matriz extracelular y complementados con medio condicionado de cultivos de fibroblastos de ratn. Este enfoque elimina la necesidad de que las capas de alimentador, pero el sistema de cultivo todava contienen contaminantes animales y se define de forma incompleta. Las necesidades de los investigadores cientficos han impulsado el desarrollo y uso de medios, protocolos y tcnicas que, aunque optimizado para el descubrimiento de escala del blanco, no siempre son directamente traducibles a la produccin a gran escala, industrializada. Las condiciones de cultivo de escala de blanco pueden ser relativamente mal definidas. En muchos casos, contienen sustancias de origen animal. Procesos utilizados para la caracterizacin y enriquecimiento simplemente no son prcticos o factibles a escala industrial. Condiciones in vitro para la investigacin con clulas madre deben evolucionar para permitir la industrializacin, para esto necesitan para ser mucho ms definida, coherente y reproducible (Figura 2).

En paralelo, las tecnologas de prxima generacin deben disearse para activar clulas robusto "fabricacin" de la coleccin y la produccin de clulas madre de industrializacin por robert Shaw verde fluorescente proteinexpressing ratn clulas madre embrionarias (verde) teido de marcador de diferenciacin de protena cida fibrilar glial (GFAP) (rojo) y ADN (azul) para su uso en estudios de toxicologa. Esta microfotografa por Hideko Sone (Instituto Nacional de estudios ambientales, Japn) recibi mencin honorfica en el concurso de imagen de GE en celda

de 2008 (www.gelifesciences.com). 12 BioProcess internacional OctOber2010 aislamiento de clulas completamente al paciente administracin (Figura 3).

La creacin de condiciones de cultivo CGMP Como el progreso de la teraputica basado en clulas madres hacia pruebas clnicas, la consistencia, calidad, y reproducibilidad de sistemas in vitro a gran escala convertido en imperativo. El uso de mtodos estandarizados para el cultivo y cosecha de las clulas ser necesario asegurar poblaciones celulares con fenotipos uniformes y comportamientos predecibles. De hecho, cuando "el proceso es el producto" como sera el caso con la produccin de clulas madre industrializado variabilidad es el enemigo, por lo que debe ser reducido y controlado tan completamente como sea posible. A la luz de estos desafos, las clulas madre deben cultivarse en condiciones que cumplan con las normas de prctica de fabricacin (CGMP). Sistemas de cultivo de clulas madre CGMP incorporan medios bien definidos, caracterizados y suplementos para apoyar la diferenciacin y expansin de clulas madre. Aunque la FDA no implica una ausencia total de productos de origen animal en cultivos de clulas madre para los primeros ensayos clnicos, empresas fuertemente desean alejarse de uso de sueros mal definidos que pueden ser incompatible con la necesidad de que las condiciones de cultivo estrictamente controlados. La incorporacin de suplementos CGMP contribuye a las condiciones de cultivo de alta calidad, consistente y reproducible. Cuando son fabricados bajo condiciones CGMP, los suplementos que

permiten la proliferacin robusta de clulas madre en el cultivo sin la necesidad de que las capas de alimentador sern plenamente caracterizados y validados para la actividad, potencia y pureza. Adems, dichos suplementos generalmente se producen en tamaos mucho ms grandes que contribuyen a la reproducibilidad de las condiciones de cultivo. Algunos suplementos del cultivo celular estn actualmente disponibles en forma CGMP, pero muchos no lo son (por ejemplo, los factores de crecimiento epidrmico y fibroblastos ampliamente usados). En los laboratorios donde se cultivan clulas madre para la evaluacin en el mbito clnico, los investigadores a menudo desarrollan sus propios suplementos de CGMP. El proceso puede ser lento y trabajoso, y no permite a travs de diferentes laboratorios y organizaciones de normalizacin de las condiciones de cultivo. Caracterizacin y enriquecimiento Se han generado una serie de protocolos para la diferenciacin dirigida de clulas de tejidos especficos de roedores y humanas, clulas madre embrionarias. Inducir diferenciacin controlada de estas clulas se realiza normalmente mediante ccteles de suplementos de los medios, factores de crecimiento y citoquinas optimizadas para producir un fenotipo deseado. Protocolos para inducir la diferenciacin de clulas madre no producen poblaciones de clulas homogneas; culturas contienen no slo clulas diferenciadas pero tambin clulas indiferenciadas y otros que son algo entre. Los intentos para impulsar tales culturas hacia una poblacin ms homognea pueden conducir a la prdida de un porcentaje significativo de las clulas, en algunos casos 30% o ms. La caracterizacin de clulas dentro de una poblacin heterognea as se convierte en sumamente importante, especialmente cuando el cultivo de clulas con fines teraputicos. Se utilizan mtodos como el anlisis de flujo, inmunohistoqumica y representacin celular para caracterizar las clulas utilizando marcadores de superficie celular. La evaluacin de caractersticas funcionales (por ejemplo, la produccin de una hormona especfica) y morfologa (por ejemplo, neurita excrecencia) tambin se utilizan para distinguir subpoblaciones. Nuevas estrategias estn utilizando la expresin gnica y microRNA perfiles as como anlisis de glycomic ms eficazmente y precisamente caracterizar las clulas. La industrializacin de clulas madre probablemente requerir el desarrollo personalizado de protocolos de caracterizacin. Una prctica que se espera se convierta en ms comn es primero en identificar un conjunto putativo de biomarcadores especficos de clulas durante el desarrollo del proceso y eventualmente restringir que a los pocos marcadores para su uso durante la caracterizacin real. Una serie de tcnicas de enriquecimiento puede utilizarse para obtener una poblacin celular deseado: partculas magnticas, mtodos basados en la afinidad y matar (de forma seleccionada) a las clulas no deseadas. Enriquecer un cultivo de gran escala para un tipo deseado mientras selecciona contra otros, sin embargo, puede ser un ejercicio de inutilidad. Los procesos existentes para hacerlo no siempre son escalables, y es poco probable que cualquiera cediera un cultivo que es 100% el tipo celular deseado. Adems, los pasos de control de calidad utilizados durante los procesos de enriquecimiento requieren el sacrificio de muchas clulas, as que agotan sus poblaciones. Introducir o modificar un gen para convertirse en un marcador seleccionable dentro de una poblacin celular deseado es una opcin. Este enfoque entonces tendra que respeten las normas de la FDA sobre productos recombinantes. Con un enriquecimiento proceso presentando sus propios retos y no es probable que sea 100% eficaz, cuidadosa caracterizacin de subpoblaciones dentro de una cultura determinada ser fundamental a la industrializacin. Sistemas de "fabricacin" de clulas integradas

Desafos surgen durante todo el proceso de escalado de clulas madres para el uso teraputico. Debido a que las propias clulas son el producto, su sistema de cultivo debe ayudar a minimizar la variabilidad en la poblacin; controlar eficazmente la diferenciacin para permitir la cosecha y formulacin sin dao celular; e incorporar procesos que garanticen la viabilidad durante el almacenamiento, transporte y administracin a los pacientes. Adems de las condiciones de cultivo CGMP, produccin a gran escala de las clulas madre requerir sistemas completamente integrados y escalables. Nueva tecnologa Microcarrier o alternativa soluciones que permiten partculas libres en cultivo de clulas madre en un biorreactor: cuando se cultiva en biorreactores, las clulas madres adherentes deben cultivarse en superficies slidas como microcarriers. Lamentablemente, las partculas pequeas o "multas" a menudo se generan durante la fabricacin de microcarrier y puede contaminar a un sistema de cultivo. Multas pueden tambin resultar de perlas de ser aplastados durante la cosecha de la celda. Porque no pueden filtrarse culturas de clulas madre para eliminar estas partculas, todas las partculas que son lo suficientemente pequeas se copurified junto con las clulas. La presencia de materia particulada como microcarrier multas es inaceptable para productos inyectables. Biorreactores optimizada para el cultivo de clulas madre: la tecnologa de biorreactor existente est diseada principalmente para apoyar la produccin de protenas expresadas en el sobrenadante de cultivos celulares. Muestras de sobrenadante se extraen fcilmente estos reactores para el anlisis. Sin embargo, para los cultivos de clulas madre, los biorreactores deben permitir el muestreo rpido de pequeos volmenes que contienen clulas actuales. Adems de supervisar las condiciones tpicas de temperatura, pH, oxgeno disuelto (DO) y osmolaridad, investigadores regularmente toman muestra de cultivos de clulas madre para la caracterizacin. Cultivos de clulas madre tambin necesitan mezclarse bien en un bioreactor antes de muestreo ya que tienden a resolver rpidamente. Tamaos de muestra deben ser pequeos para no desperdiciar producto valioso, y deben procesarse rpidamente mientras que las clulas son an viables. Tecnologa de cosecha y embalaje de clulas vivas: las tecnologas existentes de centrifugacin y filtracin no estn optimizadas para la cosecha y la recuperacin de clulas vivas. Aunque la centrifugacin se utiliza a menudo para recoger clulas para aplicaciones de investigacin, no siempre es prctico para recoger grandes cantidades de clulas madre. Centrifugacin no suele ser un sistema cerrado, y las fuerzas de cizalla involucradas pueden daar las clulas. Una vez que las clulas son cosechadas, deben ser rpidamente concentradas (sus medios arrastrados con solucin amortiguadora) y envasados en recipientes para congelar o administracin a pacientes (la terapia celular equivalente a "fillfinish"). Actualmente no existen sistemas para administrar de manera eficiente este proceso para las clulas madre Aplicaciones en desarrollo y descubrimiento de frmacos Adems de su uso directo en el rea de la medicina regenerativa, clulas madres podran ofrecer ventajas significativas para el descubrimiento de medicamentos y el desarrollo. Las compaas farmacuticas estn explorando el uso de estas clulas para dilucidar vas y mecanismos de la enfermedad, facilitar la deteccin del destino nuevo, evaluar la eficacia y mejorar el perfil de seguridad. Entre los ms prometedores de las aplicaciones es investigacin de toxicidad. Estudios de toxicidad eficiente y predictivo activados por clulas madres pueden esperarse para reducir los

costos de desarrollo asociados con el fracaso de la ltima etapa de candidatos de frmacos de molculas pequeas. La identificacin de tales candidatos con problemas de toxicidad anteriormente en desarrollo mejorara la seguridad para los pacientes y participantes de ensayos clnicos. Lesin heptica inducida por drogas es la principal razn para la suspensin de los ensayos clnicos y retirar los medicamentos del mercado. De hecho, esta ha sido la causa ms frecuente de retiros relacionados con la seguridad de los medicamentos comercializados en los ltimos 50 aos. Estudios de investigacin in vitro de toxicidad heptica normalmente se realizan utilizando hepatocitos humanos primarias o una lnea de inmortalizadas celular (genticamente transformadas) derivado del hgado como HepG2. A pesar de uso rutinario para investigacin toxicidad, ambas opciones presentan inconvenientes importantes: Hepatocitos humanos primarios derivan de tejido del hgado fresco, normalmente procedente de cadveres o resecciones de cncer. Suministro de estas clulas puede ser limitada, y el tejido puede variar ampliamente entre los donantes. Los hepatocitos primarios no pueden mantenerse por ms de unos das en la cultura sin perder la funcin. Asegurar un suministro constante de clulas requiere compras repetitivas, lo que contribuye an ms a la variabilidad. Las lneas celulares de hepatocitos inmortalizadas pueden cultivarse indefinidamente, que aborda las cuestiones de suministro y la variabilidad. Sin embargo, estas clulas muestran diferencias de las clulas del hgado normales y no pueden exhibir comportamiento celular normal o respuesta. Por ejemplo, la mayora enzimas citocromo P450 (responsables de metabolismo de drogas) se expresan slo dbilmente en las clulas HepG2 comparado con hepatocitos humanos normales. Los desafos de las pruebas de toxicidad in vitro en hepatocitos han llevado las empresas farmacuticas dependen de modelos animales para pruebas de toxicidad y metabolismo preclnico. Pero esos modelos tienen sus propias limitaciones. No pueden ser completamente y confiable predictivos de toxicidad humana. Estudios en animales estn "bajo rendimiento" y caro, y pueden plantear problemas ticos. Costo y rendimiento de relegan a menudo uso de modelos animales para etapas posteriores de desarrollo preclnico, despus de que una empresa ha invertido importantes recursos y tiempo en un compuesto de plomo. Dicha evaluacin tarda de toxicidad contribuye a la tasa alta de fracaso de muchos compuestos en fase pruebas preclnicas, que es muy costoso La evaluacin mas temprana, ms eficaz de la toxicidad de candidato de drogas podra reducir la tasa de desercin de las drogas en etapas posteriores de desarrollo. Diferenciacin y expansin de clulas madre humanas en hepatocitos para su uso en dichos estudios de toxicidad de investigacin podran superar las deficiencias de hepatocitos primarios y lneas celulares inmortalizadas, as como los modelos animales. Uso de hepatocitos derivado del tallo (y otros tipos celulares utilizados para estudios de toxicidad) ofrece una serie de ventajas importantes para los estudios de toxicidad de investigacin: Disponibilidad de una fuente constante de clulas que ms se asemejen fisiologa y fenotipo in vivo Eliminacin de la dependencia en fuentes de donantes disponibles espordicamente Estandarizacin de un proceso reproducible para pruebas de toxicidad Reduccin en el uso de modelos animales y tejidos animales Mejora de la capacidad predictiva de los primeros estudios de toxicidad para reducir el desgaste de la etapa tarda de drogas El camino a seguir

Desde 1998, cuando las clulas madre primero fueron aisladas de embriones en fase temprana, los investigadores han tratado de ingeniero condiciones ptimas para su crecimiento in vitro. Rutas y eficaces para mantener el robusta crecimiento y control la diferenciacin de estas clulas surgen a un ritmo impresionante. Ahora, en el punto de inflexin entre la escala blanco y produccin industrializado a gran escala, surge un conjunto diferente de problemas biolgicos y tcnicos. Uso de clulas madre, tanto en el mbito clnico y apoyar los esfuerzos de desarrollo de drogas exige un nuevo nivel de calidad, consistencia y reproducibilidad. Mientras se desarrollan los avances en la caracterizacin, las condiciones de cultivo CGMP y sistemas de fabricacin integrada, la promesa de las clulas madre se acerque a la realidad.

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