Ruta de síntesis de glucósidos de

steviol en hojas de Stevia rebaudiana.

ALFREDO JARMA OROZCO – JUAN JARABA NAVAS
Ph.D. Fisiología de Cultivos – Ph.D. Fitopatología
Facultad de Ciencias Agrícolas
Universidad de Córdoba
Montería ‐ Colombia

V SIMPOSIO INTERNACIONAL DE KA´A HE’Ë

STEVIA Ka´a
K ´ He´ë
H ´ë – Stevia,
St i lla planta
l t d de lla iintegración
t ió y patrimonio
ti i ancestral
t l de
d América
A éi
17 y 18 de Noviembre de 2010 (Asunción – Paraguay)
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
 CADENA PRODUCTIVA

Producción 
Agroindustria Comercio
primaria

=
CONOCIMIENTO 
= $
 Stevia rebaudiana

COMO OBTENER ESE CONOCIMIENTO?

COMO OBTENER ESE CONOCIMIENTO?

Documentación

I i ió / di
Investigación / estudios

Inversión CIENCIA & TECNOLOGÍA

Inversión CIENCIA & TECNOLOGÍA
 Stevia rebaudiana

POR DONDE EMPEZAR?

Conociendo la planta
p

Como es?

Donde y como crece?
Que afecta ese crecimiento?
f i i ?
Como produce los compuestos de 
p p
interés comercial?
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
“Lo que garantiza la existencia de la vida en la tierra es...una 
pequeña corriente mantenida por la luz solar“ 
Alb t S t G
Albert Szent‐Gyorgyi (1893‐1986) Premio Nobel  fisiología medicina 1937
i (1893 1986) P i N b l fi i l í di i 1937
LA CELULA VEGETAL
C U G
Maquinaria de la vida
 FOTOSÍNTESIS
El principio de la síntesis de glucósidos
p p g
Sección Transversal de la
hoja
Pared celular
Hoja

Vacuola
Núcleo
Citosol

Cloroplasto
estoma

Almidón
Tilacóide
Membrana
externa
Membrana
interna
Grana

Estroma

Eletromicrografia Eletromicrografia Lumen del Tilacoide

de las grana del cloroplasto
 FOTOSÍNTESIS
El principio de la síntesis de glucósidos
p p g

luz

Luz
reflejada
Cloroplasto
p

LLuz Grana
G
absorbida

Luz
transmitida
 FOTOSÍNTESIS
El principio de la síntesis de glucósidos
p p g

Fotones
Fluorescencia reflejados
((0,5%)
, )
97% para 
FOTOQUÍMICA

IPP

CALOR
(2,5%)
 FOTOSÍNTESIS
El principio de la síntesis de glucósidos
p p g

Fotoquímica Ciclo de Calvin

H2O CO2

Luz
NADP+
ADP
+ P
i
RuBP 3-Fosfoglicerato
Fotosistema II
Cadena transportadora
de electrones y
Fotosistema I
ATP G3P
Almidón
Al idó
NADPH (almacenamiento)

Cloroplasto Aminoácidos
Ácidos grasos

O2
Glucosa + Fructuosa = Sacarosa
(exportación)

Glucólisis
 FOTOSÍNTESIS
El principio de la síntesis de glucósidos
p p g

PERO....

Ahora queremos
saber como
produce...
OK.....
GLUCÓSIDOS
Entendemos
como se
construye esto

$
Foto: Cortesía Sr. Francisco Guerrero. Cultivo Agroindustrias de la Stevia
(Cerrito – Valle del Cauca, Colombia)
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
 METABOLISMO SECUNDARIO
La ruta que normalmente aprovechamos de Stevia

METABOLISMO SECUNDARIO
Rutas metabólicas de las plantas que conducen a la síntesis de compuestos químicos 
que cumplen funciones no esenciales en ellas y que intervienen en las interacciones 
ecológicas entre la planta y su ambiente.

Los MS pueden variar:

Los MS pueden variar:

 Entre y dentro de especies
 Dentro de una planta
d l
 Época del año 
 Características del suelo 
 Estímulos químicos
 El ambiente en el que se encuentre 
 La época del año 
p
 La hora del día 
 METABOLISMO SECUNDARIO
La ruta que normalmente aprovechamos de Stevia

Porque los sintetizan las plantas?

Atracción polinizadores o dispersores de semillas

Agentes alelopáticos
Agentes alelopáticos

Defensa contra predadores y patógenos 

Cuales son los principales?

FENILPROPANOIDES (lignina, pigmentos, ácidos grasos, etc) 

ALCALOIDES (cafeína, nicotina, cocaína, etc)

TERPENOIDES (aromas, pigmentos protectores,  glucósidos, etc)
 METABOLISMO SECUNDARIO
La ruta que normalmente aprovechamos de Stevia
La ruta que normalmente aprovechamos de Stevia

G Azúcares
l
u
c
ó MEP
l
i
Aminoácidos
oác dos s
Ácidos grasos y 
i lípidos
s
GLUCÓSIDOS DE
Acetil-CoA
STEVIOL

Nucleótidos

ATP y NADPH
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
 TERPENOS
La importancia de IPP
La importancia de IPP
 A. PIRUVICO GLUCÓLISIS TERPENOS
La importancia de IPP
Acetil CoA
Ácido mevalónico Dimetilalil Pirofosfato
Acetoacetil CoA
(MVA) (DMAPP)

ATP y Mg
g+ Isomerización
F f il
Fosforila reversible
ibl

Descarboxila CH OPP
CH OPP 2
2
Isopentenil Pirofosfato
(IPP)
Condensación GPP sintasa
Geranilgeranil Pirofosfato Farsenil Pirofosfato Geranil Pirofosfato
(GGPP) (FPP) (GPP)
FPP sintasa
Sesquiterpenos (C15) Dimerización
Dimerización
Triterpenos (C30) Monoterpenos GGPP sintasa
Tetraterpenos
T t t (carotenoides)
( t id ) (Esteroles
(E t l / brasinoesteroides)
b i t id ) (C10)
(C40)
PPi CPP sintasa
Copalil pirofosfato
(CPP) H Kaureno sintetasa
Intermediario dícíclico Dipertenos cíclicos
ent-kaurenol
(Kaurenoides) (C20) H
ent - kaureno
Dipertenos ent-kaurenal
Diterpeno tetracíclico
lineales (C20)

Acido ent - 7 α --hidroxi

hidroxi Acido ent - kaurenoico
H - kaurenoico
kaurenólidos

H
CHO
COOH
Giberelinas
GA - aldehído
12
 INTRODUCCION
 CONCEPTOS BÁSICOS
CONCEPTOS BÁSICOS
o Fotosíntesis
o Metabolismo secundario 
Metabolismo secundario H
H

oTerpenos
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
SÍNTESIS DE GLUCÓSIDOS DE STEVIOL
CONCLUSIONES
 SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL
ORGANELOS CELULARES IMPLICADOS

5. VACUOLA

1. CLOROPLASTOS

4. CITOPLASMA

3. RETICULO
ENDOPLASMÁTICO

2. MITOCONDRIAS
SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL

TODO SE INICIA CON LA FOTOSINTESIS

SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL
INICIO DEL PROCESO: FOTOSINTESIS

Fotoquímica Ciclo de Calvin

Cloroplastos H2O CO2

Luz
NADP+
ADP
+ P
i
RuBP 3-Fosfoglicerato
Fotosistema II
Cadena transportadora
de electrones y
CLOROPLASTOS F t i t
Fotosistema I
ATP G3P
Almidón
NADPH (almacenamiento)

Cloroplasto Aminoácidos
Ácidos grasos

O2

Glucosa + Fructuosa = Sacarosa
(exportación)
 SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL
CONTINUACION DEL PROCESO: RESPIRACION

Mitocondria/Citoplasma/ Mitocondria
Cloroplasto
GLUCÓLISIS
(G3P Y/O A. PIRUVICO)

A. PIRUVICO
A PIRUVICO
al citoplasma
G3P + A. PIRUVICO
al cloroplasto
ACoA (cit)
MVA (cit)
MEP (plastos)
IPP (cit/plastos)
IPP (plastos)
KAURENO (cit/plastos)
KAURENO (plastos)
GA12 Ald (RE)
GIB (cit)
 SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL
FINAL DEL PROCESO: ALMACENAMIENTO

RE/Vacuola

RE
PLASTOS K se oxida a A KAURENOICO (AK) y se 
K se oxida a A. KAURENOICO (AK) y se
KAURENO (K)...al RE reduce a STEVIOL (ST)…al cit

CITOPLASMA
ST sufre glucosilaciones
y forma GLUCOSIDOS DE 
ESTEVIOL (GE) a vacuola
ESTEVIOL (GE)…a vacuola

VACUOLA
GE
almacenamiento
 SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL
A. PIRUVICO GLUCÓLISIS VIA ACIDO 
Acetil CoA MEVALONICO (AMV)
Ácido mevalónico Dimetilalil Pirofosfato
Acetoacetil CoA
(MVA) (DMAPP) Kim et al
al., 1996: citoplasma
ATP y Mg+ Isomerización Altos niveles HMG-CoA en Stevia
Fosforila reversible

Descarboxila CH OPP
CH OPP 2
2
Isopentenil Pirofosfato
(IPP)
Condensación
Geranilgeranil Pirofosfato Farsenil Pirofosfato Geranil Pirofosfato
(GGPP) (FPP) (GPP)

Sesquiterpenos (C15) Dimerización

Dimerización
Di i ió
Triterpenos (C30) Monoterpenos
GPP sintasa
Tetraterpenos (carotenoides) (Esteroles / brasinoesteroides) (C10)
(C40)
PPi
FPP sintasa
Copalil pirofosfato
(CPP) H GGPP sintasa
Intermediario dícíclico Dipertenos cíclicos
ent-kaurenol
(Kaurenoides) (C20) H CPP sintasa
ent - kaureno
Dipertenos Diterpeno tetracíclico ent-kaurenal
lineales (C20) Kaureno sintetasa

Acido ent - 7 α --hidroxi Acido ent - kaurenoico Kaureno oxidasa

H - kaurenoico
kaurenólidos Esteviol?

H
CHO
COOH
Giberelinas
GA - aldehído
12
 SÍNTESIS DE GLUCOSIDOS DE STEVIOL
VIA METIL ERITRITOL 4 
FOSFATO (MEP)
Totté et al
al., 2000
Brandle et al., 2002

CH OPP
2
Isopentenil Pirofosfato
(IPP)
Condensación
Farsenil Pirofosfato Geranil Pirofosfato
(FPP) (GPP)

Di
Dimerización
i ió CPP sintasa
Tetraterpenos (carotenoides) (Esteroles / brasinoesteroides)
(C40) Kaureno sintetasa
PPi
Copalil pirofosfato
(CPP) H Kaureno oxidasa
Intermediario dícíclico Dipertenos cíclicos
ent-kaurenol
(Kaurenoides) (C20) H A. kaurenoico hidroxilasa
ent - kaureno
Dipertenos Diterpeno tetracíclico ent-kaurenal
lineales (C20)

Acido ent - 7 α --hidroxi Acido ent - kaurenoico

H - kaurenoico
kaurenólidos Esteviol

H
CHO
COOH
Giberelinas?
GA - aldehído
12
 Esteviósido: R1=Glu
R1 Glu
R2=Glu-Glu
1. G. hidroxilo del C-13
OR2
Rebaudiósido A: R1=Glu
20
17 R2=Glu-Glu
R2 Glu Glu
12
13
CH2 l
CH3 11

9 14
16 Glu
1
2 10 15
8
Rebaudiósido C: R1=Glu
H
3 5 7 R2=Glu-Rha
4 6
l
H3C Glu
18 H
R1OOC19 D l ó id A
Dulcósido A: R1
R1=Glu
Gl
2. C-19 del G. carboxilo del C-4
R2=Glu-Rha

Glu=Glucosa; Rha=Ramnosa

Tomado de Geuns, 2003

 PERO…COMO SE PRODUCE
CADA GLUCÓSIDO?

UDP GLUCOSIL TRANSFERASAS (UGT): Catalizan las

glucosilaciones de acuerdo al grupo aceptor

Glc a OH
UGT85C2 2

2a

Steviolbiósido
Rebaudiósido B
1 4

Steviol Glc a Glc

Steviolmonósido
3 UGT76G1
Steviósido

Glc a COOH Rebaudiósido A

UGT74G1
1a Rhamnosa: Rebaudiósido C
Rubusósido
Xilulosa: Rebaudiósido F

Tomado de Richman et al., 2005; Geuns, 2003

 Kaurene
(13)

Tomado de Brandle y Telmer, 2007

$