PEPTDEOS

PEPTDEOS BIOATIVOS DE PRODUTOS LCTEOS

Introduo
As protenas do leite esto divididas em dois grupos principais: o grupo das casenas (78% a 80%) e o grupo das protenas do soro ou soroprotenas (20% a 22%), conforme mostrado na Tabela 1. Alm de exercerem diversas funes bsicas de nutrio (fonte de aminocidos para sntese protica e de energia) e tecnolgicas (propriedades funcionais e sensoriais), essas protenas possuem regies dentro de sua estrutura primria que codificam atividades latentes de proteo e regulao das funes biolgicas. Muitas delas possuem propriedades biolgicas especficas, que fazem desses componentes potenciais ingredientes de alimentos promotores de sade. As Tabelas 2 e 3 apresentam, respectivamente, as atividades biolgicas das principais protenas do leite e das principais protenas do soro. modulam a funo fisiolgica ao se ligarem a receptores especficos da clula alvo, levando a induo de respostas fisiolgicas. Os PBAs contm de 3 a 20 resduos de aminocidos por molcula e normalmente so inativos dentro da seqncia da molcula. Estudos tm identificado um grande nmero de seqncias de PBAs nas protenas do leite, alm das condies para sua liberao. Devido ao grande nmero de PBAs codificados em sua regio primria, as protenas do leite so consideradas, no momento, as principais fontes conhecidas de uma variedade de PBAs (veja Tabela 4). Muitos destes PBAs possuem propriedades biolgicas especficas, que fazem desses componentes potenciais ingredientes de alimentos promotores de sade. Alm dos estudos envolvendo identificao e condies para a liberao dos PBAs, h tambm estudos mostrando que estes peptdeos exercem vrias atividades biolgicas in vitro e in vivo e que alguns deles possuem propriedades multifuncionais. Por administrao oral, dependendo da seqncia de aminocidos, os PBAs podem afetar os principais sistemas corpreos - cardiovascular, digestivo, imune e nervoso. reconhecem a importncia das protenas do soro ( -lactoalbumina, -lactoglobulina, albumina srica bovina, imunoglobulinas, lactoferrina e lactoperoxidase), devido ao seu alto valor nutricional, propriedades funcionais excelentes, perfil de flavor neutro e limpo e por serem biologicamente ativas. Os ingredientes do soro so utilizados no mundo inteiro em bebidas, barras energticas e outros alimentos processados. Ingredientes de soro mais recentes incluem as protenas hidrolisadas de soro que contm elevados nveis de peptdeos bioativos (veja Tabela 5). As seqncias dos PBAs encontram-se em estado inativo quando inseridas na cadeia polipeptdica da protena do soro intacta. Estes peptdeos liberados durante o processo de digesto intestinal das protenas do soro, podem estar envolvidos na regulao da entrada de nutrientes e influenciar o metabolismo pospandrial atravs da estimulao de hormnios. Embora as protenas do soro possuam elevada digestibilidade e sejam rapidamente absorvidas para a circulao sangunea, sabe-se que os hidrolisados proticos contendo peptdeos de pequeno tamanho, di e tripeptdeos, so absorvidos numa velocidade maior, tanto em relao s protenas como aos aminocidos livres. Os hidrolisados, na forma de di e tripeptdeos, preservam melhor a estabilidade de alguns aminocidos em processos de esterilizao e estocagem. Portanto, uma vez que as protenas concentradas e hidrolisadas sejam obtidas e conservadas

Peptdeos bioativos (PBAs)

Peptdeos biologicamente ativos (bioativos) ou bio-funcionais foram definidos inicialmente como componentes (genunos ou liberados) de alimentos prontos para o consumo, capazes de exercer uma atividade reguladora no organismo humano, independentemente de seu valor nutritivo. Posteriormente, foram descritos como fragmentos especficos de protenas com um impacto positivo nas funes ou condies corpreas, podendo finalmente influenciar a sade. Finalmente, como peptdeos com atividade similar a uma droga ou hormnio, que eventualmente

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Funcionalidade dos peptdeos bioativos (PBAs)

PEPTDEOS BIOATIVOS DE SOROPROTENAS Cientistas da rea de alimentos

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TABELA 1 - CONCENTRAO E PESO MOLECULAR DAS PROTENAS EM LEITE E COLOSTRO Grupo Frao protica Peso molecular (Daltons) Concentrao (gramas/litro) Colostro Leite 10,4 2,8 9,8 4,2 1,2 3,3 0,6-1,0 1,2 0,3 0,1 0,03 0,0004

Casena as1-casena as2-casena b-casena K-casena a-lactoalbumina b-lactoglobulina Imunoglobulinas G, M, A Glicomacropeptdeo Soroalbumina Lactoferrina Lactoperoxidase Lisozima 23 614 25 230 23 983 19 023 14 200 18 400 150 000- 1000 000 8 000 66 300 80 000 78 000 14 000 3,0 8,0 20-150 2,5 1,3 1,5 0,02 0,0004

Soroprotena

Lipoprotenas

sem desnaturao, os peptdeos, obtidos pela protelise destas, podem ser capazes de conservar e ampliar sua atividade funcional. Os benefcios teraputicos das protenas do soro tambm podem ser resultantes da produo de peptdeos bioativos durante a fermentao. Peptdeos metabolicamente ativos podem ser usados para controlar ou alterar o crescimento de culturas bacterianas ou a qualidade de produo. Tais compostos tambm podero ser usados como reagentes em laboratrios de pesquisa ou como componentes de kits para testes clnico-diagnsticos. Deve-se tambm considerar o aproveitamento dos efeitos saudveis dos componentes do soro para consumidores no humanos como culturas de fermento. Provou-se tambm que os peptdeos bioativos possuem capacidade de introduzir propriedades benficas sade em produtos no alimentcios, tais

como produtos farmacuticos e cosmticos. Os PBAs so muito promissores para serem usados como componente de alimentos funcionais desenvolvidos especialmente para melhorar a sade cardiovascular. Os dois principais fatores de risco a nvel mundial associados incidncia de doenas cardiovasculares so a hipertenso e a dislipidemia. Peptdeos derivados de soro de leite demonstraram possuir atividade que pode reduzir estes dois fatores de risco. Pesquisas recentes mostram que os PBAs do soro podem estar envolvidos nas seguintes funes relacionadas sade cardiovascular: 1 - Atividade inibidora de ECA; 2 - Atividade similar s de substncias opiides; 3 - Atividade antitrombtica; 4 - Atividade associada reduo do nvel de colesterol. Podem ainda apresentar ativi-

dade antioxidante, antimicrobiana, estimular a proliferao e diferenciao de osteoblastos e auxiliar na cicatrizao de feridas. 1 - Atividade inibidora de ECA (enzima conversora de angiotensina). Peptdeos inibidores de ECA atuam no controle da presso arterial alta por meio da dilatao dos vasos sanguneos e de seu efeito sobre o volume de sangue. Vrios efeitos colaterais so associados com o uso de drogas inibidoras de ECA no controle da presso sangunea, incluindo aumento dos nveis de potssio, reduo da funo renal, tosse, erupes cutneas, anormalidades fetais, entre outros. Protenas do leite (casenas e soroprotenas) so fontes ricas de peptdeos inibidores de ECA (veja Tabela 6). Peptdeos inibidores de ECA so obtidos das protenas do leite a partir de tratamento com proteases gastrintestinais, pepsina, tripsina e quimotripsina, ou com proteases

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TABELA 2 - FUNES BIOLGICAS DAS PRINCIPAIS PROTENAS DO LEITE BOVINO Protena Casenas (a-, b- e K) b-lactoglobulina a-lactoalbumina Funo Transporte de minerais e elementos trao (Ca, PO4, Fe, Zn, Cu) Precursor de peptdeos bioativos Imunomodulao (hidrolisados/peptdeos) Ligao de cidos graxos Transporte de retinol Precursor de peptdeos bioativos Antioxidantes Sntese de lactose em glndulas mamrias Transporte de clcio Imunomodulao Anticarcinognico Precursor de peptdeos bioativos Potencial papel em leite humano (promoo de digesto e preveno de infeces gastrintestinais)

TABELA 3 - FUNES BIOLGICAS DAS PRINCIPAIS PROTENAS DO SORO Protena b-lactoglobulina a-lactoalbumina Imunoglobulinas G, M, A Glicomacropeptdeo Lactoferrinaa Lactoperoxidase Lisozima
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Atividade e Funo Carreador de retinol, ligao cidos graxos, potencial antioxidante, precursor para peptdeos bioativos. Sntese de lactose em glndulas mamrias, carreador de Ca, imunomodulao, anticarcinognico, precursor para peptdeos bioativos. Proteo imune especfica (antisoros e sistemas complementares), potencial precursor para peptdeos bioativos. Antiviral, antitrombtico, bifidognico, regulao gstrica. Antimicrobiano, antioxidativo, anticarcinognico, antiinflamatrio, imunomodulaao, transporte Fe, regulao do crescimento celular, precursor para peptdeos bioativos. Antimicrobiana, efeito sinergstico com Igs e LF. Antimicrobiana, efeito sinergstico com Igs e LF. precursor para peptdeos bioativos. glicomacropeptdeo demonstrou possuir atividade anti-hipertensiva. 2 - Atividade similar s de substncias opiides. Os peptdeos opiides so aqueles que possuem caractersticas farmacolgicas semelhantes s do pio (morfina). O mecanismo pelo qual o sistema opiide age sobre a regulao cardiovascular complexo, no entanto, peptdeos opiides endgenos so tidos como tendo um grande potencial para serem usados como moduladores da presso arterial. Vrios peptdeos derivados de soro tambm exibem atividade semelhan-

Soroalbumina

de plantas ou de bactrias. Peptdeos inibidores de ECA derivados da casena so chamados de casoquininas e os derivados de protenas do soro ( -lactoalbumina e -lactoglobulina) de lactoquininas. Um dos peptdeos derivados de

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TABELA 4 - EXEMPLOS DE PEPTDEOS BIOATIVOS CODIFICADOS EM PROTENAS DO LEITE Nome a-Casena exorfina Casoxina D Caseinofosfopeptdeo Caseinofosfopeptdeo Caseinofosfopeptdeo as1 - Imunocasoquinina b-Casomorfina-11 Fragmento as1 CN f(90-96) as1 CN f(158-164) as1 CN f(43-58) 2P as1 CN f(59-79)4P as1 CN f(66-74) 3P as1 CN (194-199) b-CN f(60-70) Enzima ou origem Pepsina Pepsina, Quimotripsina Tripsina Tripsina Digesto 2 Tripsina Digesto Bioatividade Opiide Opiide (antagonista) Transporte mineral Transporte mineral Transporte mineral Imunomodulatria Opiide Opiide imunomodulatria, Citomodulatria Citomodulatria Imunomodulatria Transporte mineral, Imunomodulatria, Citomodulatria Transporte mineral Transporte mineral Imunomodulatria Imunomodulatria Opiide (antagonista) Opiide (antagonista) Antitrombtica Antitrombtica Opiide Imunomodulatria Imunomodulatria Opiide Opiide Imunomodulatria Opiide (antagonista) vasculares. Para que a agregao plaquetria possa ocorrer necessria a fixao do fibrinognio s plaquetas do sangue. Acredita-se que os peptdeos do leite inibem
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b-CN f(60-66) Pepsina b- Casomorfina-7 b-Casomorfina-5 b-Casoquinina b-Casoquinina b- CN f(60-64) Opiide b-CN f(177-183) b-CN f(193-202) Tripsina Sinttica

Tripsina Caseinofosfopeptdeo b-CN f(1-25) 4P Caseinofosfopeptdeo Caseinofosfopeptdeo Imunopeptdeo Imunopeptdeo Casoxina 6 Casoxina C Casoplatelina Peptdeo inibidor de trombina a-Lactorfina No nomeado Imunopeptdeo b-Lactorfina Serorfina Lactoferricina Lactoferroxina A b-CN f(7-18) 3P b-CN f(29-41) 1P b-CN f(63-68) b-CN f (191-193) k-CN f(33-38) k-CN f(25-34) k-CN f(106-116) Ovelha k-CN f(112-116) a-Lactalbumina f(50-53) a-Lactalbumina f(50-51), f(18-19) a-Lactalbumina f(18-20) b-Lactoglobulina Serum albumima f(399-404) Lactoferrina f(17-41) Lactoferrina f(318-323) Sinttica Sinttica Pepsina Pepsina Pepsina Digesto Digesto Sinttica Sinttica Pepsina Tripsina Tripsina Tripsina Sinttica Sinttica

te de substncias opiides. Estes incluem os peptdeos derivados da -lactoalbumina e -lactoglobulina. 3 - Atividade antitrombtica . A

trombose, definida como a formao ou presena de um cogulo de sangue em um vaso sanguneo, outro fator de risco de grande importncia nas doenas cardio-

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TABELA 5 - PEPTDEOS BIOATIVOS DERIVADOS DE SOROPROTENAS DO LEITE Protena precursora Fragmento Seqncia peptdica Nome Funo Opiide (antagonista) Inibidor de ECA Efeito estimulatrio no opiide sobre o leo Contrao do leo Atividade antitrombtica

50-53 YGLF a-lactoforina a-lactoalbumina 102-105 YLLF b-lactoforina b-lactoglobulina b-lactoglobulina GMP 146-149 106-116 HIRL MAIPPKKNQDK 108-110 106-112 113-116 IPP YGFQDA Serotonina b-lactotensina Casoplatelinas

GMP Albumina srica bovina 108-110 399-404

Atividade anti-hipertensiva Atividade opiide Contrao leo Inibidor de ECA

208-215 ALKAWSVAR Albutensina A Albumina srica bovina

*Adaptado de Shah (2000) e Korhonon et al. (1998)

essa fixao s plaquetas. Foi investigada a atividade antitrombtica de alguns peptdeos do soro e alguns estudos relataram que o glicomacropeptdeo ao ser decomposto deu origem a vrios fragmentos que mostraram possuir atividade antitrombtica. Outro estudo tambm forneceu evidncia limitada de que peptdeos derivados da lactoferrina podem estar envolvidos na adeso plaquetria. 4 - Atividade associada reduo do nvel de colesterol. Estudos com ratos, comparando a protena do soro versus casena, mostraram que a protena do soro reduziu de forma significativa a concentrao de colesterol no soro sanguneo em aproximadamente 35%. Os PBAs do soro alm de estarem envolvidos em vrias funes relacionadas sade cardiovascular, tambm atuam em outras reas da sade humana. A lactoferricina, peptdeo derivado da lactoferrina pela ao da pepsina, por exemplo, atua na cicatrizao de feridas, apresenta efeitos antimicrobianos e propriedades antioxidantes. Possui ao antimicrobiana mais eficiente

que a lactoferrina. Descobriu-se tambm, recentemente, que h uma frao ativa na protena do soro que estimula a proliferao e diferenciao de osteoblastos (clulas formadoras de osso) cultivados em laboratrios. Se o intestino absorver estes componentes, os mesmos podem desempenhar um papel importante na formao de ossos no homem. Em geral, pode-se concluir que os peptdeos do soro exibem um leque muito amplo de propriedades bioativas e, portanto, possuem um grande potencial e futuro promissor como componentes de alimentos funcionais. PEPTDEOS BIOATIVOS DAS CASENAS As casenas ( a s1, a s2, b e k -casenas) desempenham no organismo importantes funes fisiolgicas, tanto em suas estruturas nativas como atravs de peptdeos produzidos por enzimas proteolticas, tanto in vivo (sistema digestivo), como in vitro. Dentre as classes de peptdeos bioativos originados da protelise

das casenas destacam-se os que apresentam: 1 - Ao opiide; 2 - Ao antiopiide; 3 - Atuao no transporte (absoro) de mineral; 4 - Ao imunoprotetora ou imunoestimulante; 5 - Ao anti-hipertensiva; 6 - Ao antitrombtica; 7 - Ao antimicrobiana. A Tabela 7 mostra exemplos de peptdeos bioativos derivados das casenas.

Peptdeos opiides derivados da casena so denominados casomorfinas, sendo a maioria fragmentos da -casena ( -casomorfinas). Os peptdeos bioativos originados da protelise das casenas com ao opiide apresentam atividade semelhante dos opiides endgenos (endorfinas) que atuam tanto no sistema nervoso central como em rgos perifricos produzindo vrios efeitos fisiolgicos. Em nvel de sistema nervoso central podem promover sedao e torpor, depresso respiratria, hipoten-

Ao opiide e antiopiide.

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TABELA 6 - ATIVIDADE INIBIDORA DE ECA DE PEPTDEOS DE SORO Origem Peptdeo Fragmento YGLF 50-53 a-lactoalbumina digerida por pepsina e tripsina Soro de um produto semelhante ao iogurte (L. helveticus) a-lactoalbumina hidrolizada por tripsina a-lactoalbumina hidrolizada por tripsina a-lactoalbumina hidrolizada por tripsina b-lactoglobulina hidrolizada por tripsina b-lactoglobulina hidrolizada por tripsina b-lactoglobulina hidrolizada por tripsina b-lactoglobulina hidrolizada por pepsina, depois tripsina e quimotripsina b-lactoglobulina hidrolizada por pepsina, depois tripsina e quimotripsina b-lactoglobulina hidrolizada por pepsina, depois tripsina e quimotripsina Medicamento comercial YP VGINYWLAHKYGL YGL WLAHK VFK LAMA LDAGSAPLB 99-108 50-52 104-108 81-83 22-25 32-40 ndice de inibio (IC50) 733mM 720mM 327mM 409mM 77mM 1029mM 1062mM 635mM 788mM 521mM 946mM 0,006mM

CMENSA 106-111 ALPMH 142-146 VLDTDYK 94-100 CAPTOPRIL

* Tabela adaptada Gerdes et al (2007), de Pihlanto et al. (2000) e Mulay et al. (1997)

so, regulao da temperatura corporal, regulao da ingesto de alimentos, regulao do comportamento sexual, entre outros. Em nvel perifrico atuam na supresso da motilidade intestinal. Tanto os peptdeos com atividade opiide como os de atividade antiopiide (antagonista) se ligam aos tecidos alvo em receptores especficos, provocando a ao opiide especfica ou a inibio da atividade. Segundo Drewnowski (1992), a resposta sensorial para alimentos altamente palatveis, notadamente ricos em acar e em gordura, parece ser mediada por peptdeos opiides endgenos. Este mesmo pesquisador e colaboradores (1992) realizaram os primeiros estudos sobre os efeitos do bloqueio do stio de ligao de opiides em humanos e seus efeitos na preferncia e ingesto de misturas de acar e gordura. Mulheres que receberam infuso venosa de

peptdeos derivados das casenas alfa (a), beta (b ) e kappa ( k ) contendo um ou mais radicais fosfato

Ligao e transporte de minerais. Os caseinofosfopeptdeos so

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naloxona (bloqueador dos stios opiides) experimentaram 20 produtos lcteos com diferentes contedos de acar e gordura e classificaram a doura e a sensao prazerosa de cada amostra. A naloxona no mostrou influncia na percepo da intensidade do sabor doce, mas a sensao de prazer foi reduzida para todos os produtos. Assim, pode-se esperar que tais bloqueadores reduzam o prazer da ingesto de alimentos altamente palatveis que, desta forma, diminuiria seletivamente o seu consumo. Em estudos clnicos a naloxona reduziu o consumo de alimentos tanto em pessoas normais como obesas e diminuiu a quantidade excessiva de alimentos consumidos por mulheres com bulimia.

ligados serina. A estes peptdeos tem sido atribuda a funo de se ligar e transportar minerais, como Ca, P, Mg e Fe, facilitando, inclusive, sua absoro e fixao em vrios tecidos. A adio de caseinofosfopeptdeos em frmulas de pastas de dente tem sido sugerida visando o fortalecimento do esmalte dos dentes e efeito anticariognico. Ao imunoestimulante. Qualquer material estranho absorvido pelo organismo faz com que o sistema imune produza molculas protetoras especficas (anticorpos) e componentes celulares como macrfagos e linfcitos. Alguns peptdeos com ao imunoestimulatria j foram isolados, a partir das casenas alfa, beta e capa, e caracterizados, sendo que a atividade destes peptdeos exercida principalmente sobre os componentes celulares do sistema imune (macrfagos e linfcitos). Ao anti-hipertensiva. A ao

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TABELA 7 - PEPTDEOS BIOATIVOS DERIVADOS DE PROTENAS DO LEITE BOVINO Peptdeo bioativo Casomorfinas Casoquininas Casoxinas Casoplatelinas Imunopeptidases Caseinofosfopeptdeos
Fonte: SHAH, 2000 Adaptado de: Meisel & Schlimme (1990); Schlimme & Meisel (1993)

Protena precursora a, b-casena a, b-casena k-casena k-casena a, b-casena a, b-casena

Bioatividade Opiide Antihipertensivo Opiide antagonista Antitrombtico Imunoestimulante Carreadores de minerais

anti-hipertensiva de certos peptdeos originrios da hidrlise da alfa e b-casena j foi comentada quando foi abordada a ao antihipertensiva de soroprotenas. Ao antit rombtica. Alguns peptdeos derivados da k-casena, denominados de casoplatelinas, apresentam atividade antitrombtica, inibindo a agregao de plaquetas, bem como a ligao do fibrinognio a stios especficos na superfcie da plaqueta. Ao antimicrobiana. Nas ltimas dcadas, peptdeos antibacterianos, codificados na estrutura primria de protenas do leite, tm sido descritos. As propriedades bacterianas, origens e procedimentos de isolamento de tais peptdeos so mostrados na Tabela 8. A lactenina foi provavelmente o primeiro fator antibacteriano derivado do leite que foi obtido com renina. Casecidinas so peptdeos antimicrobianos obtidos de casena tratada com quimosina e atuam sobre os lactobacilos e tambm sobre vrias bactrias patognicas tais como Staphylococcus aureus. Outro peptdeo antibacteriano derivado da as1-casena tratada com quimosina a isracidina, a qual, in vivo, exerce uma forte ao protetora contra S. aureus, Streptococcus pyogenes e Listeria monocytogenes. Tambm protege vacas de mastite quando injetado no interior do bere a nveis comparveis aos

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observados em tratamentos com antibiticos padres. Alfa-s2-casena tambm precursora de diversos fragmentos de peptdeos com atividade antibacteriana. Um peptdeo correspondente ao fragmento as2-casena (f 150188), isolado de leite acidificado e fervido, chamado casocidina-1 mostrou atividade inibitria contra bactrias gram-positivas e negativas. H tambm relatos mostrando o efeito inibitrio, sobre o crescimento bacteriano, de peptdeos derivados da k-casena. Um destes peptdeos, chamado kappacina apresenta atividade contra bactrias Gram positivas e negativas. Alm disso, apresenta a capacidade de ligar enterotoxinas e inibir adeso de vrus e bactrias, como por exemplo, a ligao de bactrias cariognicas a superfcie oral. Embora antibiticos mais potentes estejam disponveis, peptdeos antimicrobianos mostram a vantagem de serem hbeis para matar clulas-alvo rapidamente e apresentam um amplo espectro de atividade, incluindo atividade para alguns dos mais srios patgenos resistentes antibiticos em clnicas.

Ocorrncia de PBAs em produtos lcteos

Sabe-se que os PBAs podem ser gerados durante a fermentao do

leite por meio da ao de fermentos lcticos empregados. Assim, uma grande variedade de PBAs tem sido encontrada em produtos lcteos fermentados, tais como iogurte, leite fermentado e queijo. Esses produtos tradicionais podem, sob certas condies, carrear efeitos benficos especficos quando ingeridos como parte da dieta diria. No entanto, tais benefcios sade, atribudos aos PBAs nestes produtos tradicionais, ainda no foram bem estabelecidos. Por outro lado, j existem alguns produtos comerciais suplementados com PBAs derivados do leite, nos quais os benefcios sade foram documentados em estudos clnicos humanos. As bactrias cido lcticas (BAL), usadas na obteno de produtos fermentados do leite, possuem considervel atividade proteoltica resultante de seu rpido crescimento em leite. Durante a fermentao, as casenas passam por uma rpida degradao proteoltica, que resulta na liberao de potenciais peptdeos bioativos (veja Tabela 9). Em comparao com outras espcies avaliadas, as linhagens de Lb. helveticus possuem forte atividade proteoltica e peptideoltica, degradando as casenas e seus derivados. Portanto, elas podem ser utilizadas para a produo de PBAs, com diferentes atividades, tais como opiide e hipotensiva.

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FUNCIONAIS & NUTRACUTICOS

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TABELA 8 - PROPRIEDADES, ORIGENS E PROCEDIMENTOS DE ISOLAMENTO DE PEPTDEOS ANTIMICROBIANOS
Nome* Fragmento Atividade Lactenina No conhecido Estreptococos patognicos Enzima ou origem Leite bovino Renina Quimosina ou tratamento trmico Referncias

Jones e Simms (1930) Lahov et al. (1971); Lahov e Regelson (1996) Hill et al. (1974); Lahov e Regelson (1996) Zucht et al. (1995) Recio e Visser (1999) Recio and Visser (1999) Minervini et al. (2003) Malkoski et al. (2001) Liepke et al. (2001) Pellegrini et al. (1999) Pellegrini et al. (1999) Pellegrini et al. (1999) Pellegrini et al. (2001) Pellegrini et al. (2001) Pellegrini et al. (2001) Pellegrini et al. (2001) Recio and Visser (1999); Hoek et al. (1997) Dionysius e Milne Dionysius e Milne (1997) Hoek et al.(1997) Recio e VIsser (1999) Groenink et al. (1999) Groenink et al. (1999)

Casecidinas Fragmentos de k-e as1 CN Staphylococcus aureus e lactobacilos

Isracidina as1 CN f(1-23) Alguns microrganismos Quimosina Casocidina-I as2-CN f(150-188) SN as2-CN f(164-179) SN as2-CN f(183-207) SN Humana b-CN f(184-210) Kappacina k-CN f(106-169) SN Humana k-CN f(43-97) SN SN SN SN SN SN SN a-Lactalbumina f(1-5) a-Lactalbumina f(17-31) S-S(109-114) a-Lactalbumina f(61-68) s-s(75-80) b-Lactoglobulina f(15-20) b-Lactoglobulina f(25-40) b-Lactoglobulina f(78-83) b-Lactoglobulina f(92-100) Staphylococcus carnosus; Escherichia coli Fervura e acidificao

Bactrias Gram-positivas e Pepsina Gram-negativas Bactrias Gram-positivas Pepsina e Gram-negativas Bactrias Gram-positivas e Escherichia coli Lactobacillus helveticus

Streptococcus mutans Quimosina Escherichia coli Staphylococcus carnosus Pepsina Escherichia coli Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas Escherichia coli Escherichia coli Tripsina Tripsina Quimotripsina Tripsina Tripsina Tripsina Tripsina Pepsina ou quimosina Pepsina Pepsina Quimosina

Lactoferricina-B Lactoferrina f(17-41/42) SN Lactoferrina f(1-16) S-S(43-48) SN SN SN SN SN SN Lactoferrina f (1-42) S-S(43-48) Lactoferrina f(1-16)S-S(17-48)

Lactoferrina f(1-16)S-S(45-48) Micrococcus flavus Pepsina Lactoferrina f(1-11)S-S(17-47) Lactoferrina f(17-30) Lactoferrina f(19-37) Patognicos orais Patognicos orais Sinttico Sinttico

Lactoferricina-C Caprine Lactoferrina f(14-42) Lactoferricina-C Caprina Lactoferrina f(17-41) Lactorricina-M Lactoferricina-H SN SN SN Murina Lactoferrina f(17-41) Humana Lactoferrina f(1-11)S-S(12-47) Humana Lactoferrina f(18-31) Humana Lactoferrina f(20-38) Humana lisozima f(87-115)

Micrococcus flavus Escherichia coli Staphilococcus aureus Sinttico Escherichia coli Staphilococcus aureus Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas Prevotella intermedia Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas Sinttico Sinttico Groenink et al. (1999) Ibrahim et al., (2001) Sinttico Groenink et al. (1999) Sinttico Escherichia coli Vorland et al. (1998) Vorland et al. (1998)

FUNCIONAIS & NUTRACUTICOS

*A menos que seja indicada outra fonte, o precursor o leite bovino

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TABELA 9 - EXEMPLOS DE PBAS LIBERADOS DAS PROTENAS DO LEITE POR VRIOS MICROORGANISMOS E ENZIMAS MICROBIANAS Micoorganismo Protena precursora Seqncia Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro Bioatividade Referncias

Lb. helveticus, b-cn, k-cn S. cerevisae Lactobacillus GG

b-cn, aS1-cn Enzimas + Pepsina e tripsina Proteinase de b-cn

Inibidor ECA Nakamura et al. Antihipertensivo (1995)

Tyr-Pro-Phe-Pro, Opiide, Nakamura et al. Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg, inibidor ECA (1995) Hr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp Imunestimulador Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-(Glu) Inibidor ECA Rokka et al. (1997) Maeno et al. (1996) Yamamoto et al. (1999) Gobbetti et al. (2000) Kudoh et al. (2001) HernndezLedesma et al. (2004) Ashar e Chand, (2004) Ashar e Chand, (2004) Pan et al. (2002)

Lb. helveticus CP90 Lb. helveticus CPN4

Protenas soro Tyr-Pro Inibidor ECA Muitos fragmentos Inibidor ECA Lb. delbrueckii subsp. b-cn, k-cn bulgaricus SS1 Lc. lactis subsp. cremoris FT4

Lb. delbrueckii subsp. k-cn bulgaricus IFO13953 Lb. rhamnosus+ digesto

b-cn com pepsina e Corolase PP b-cn

Ala-Arg-His-Pro-His-Pro- Antioxidativo HisLeu-Ser-Phe-Met Asp-Lys-Ile-His-Pro-Phe, Inibidor ECA Tyr-Gln-Glu-Pro-Val-Leu, Val-Lys-Glu-Ala-Met-Ala- Pro-Lys Ser-Lis-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro- Gly-Pro-Ile bulgaricus Antioxidativo Inibidor ECA

Lb. delbrueckii subsp.

St. thermophilus+ Lc. lactis b-cn Ser-Lys-Val-Try-Pro Inibidor ECA subsp. lactis biovar. diacetylactis Lb. helveticus ICM 1004 (extrato celular)
*cn=casena

Hidrolisado de Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro Inibidor ECA leite desnatado

PEPTDEOS HIPOTENSORES At o momento, a atividade bio-funcional, produzida durante a fermentao lctica, mais estuda-

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FUNCIONAIS & NUTRACUTICOS

A protelise pode ocorrer por ao enzimas proteolticas durante a fermentao do leite e a maturao do queijo. So elas: i) naturalmente presentes em leite; ii) do coagulante adicionado; iii) das enzimas microbianas, principalmente as de BAL autctones e adicionadas, bem como das enzimas do trato digestivo, resultando na liberao de muitos PBAs.

da aquela que envolve o controle da alta presso sangunea. Certos peptdeos originrios da hidrlise das casenas e , como de algumas protenas do soro de leite, agem no sistema renina-angiotensina, inibindo a enzima conversora de angeotensina I em angiotensina II (ECA). Esses peptdeos podem ser liberados durante a maturao do queijo por enzimas proteolticas das BAL, tais como as proteinases ligadas parede celular e as peptidases citoplasmticas das BAL. Inclusive, a potncia do sistema

inibidor ECA em queijo tem sido relacionada com a extenso da maturao. O tipo de BAL usado um dos principais fatores que influenciam a sntese de PBAs inibidores do sistema ECA em produtos lcteos. Fraes de peptdeos inibidores do sistema ECA possuindo diferentes potenciais tm sido isolados de vrios tipos de queijos. A Tabela 10 apresenta os peptdeos originados das casenas S1, S2 e . Esses peptdeos liberados da S1-, S1- e -casena apresentam valores de IC50 de 13,4 a 592

PEPTDEOS
TABELA 10 - ALGUNS PEPTDEOS INIBIDORES DO SISTEMA ECA IDENTIFICADOS EM DIFERENTES VARIEDADES DE QUEIJO Fragmento aS1-cn f(1-9) aS1-cn f(102-109) aS2-cn f(205-208) b-cn f(60-68) b-cn f(58-72) b-cn f(199-204)
a

Seqnciab RPKHPIKHQ KKYNVPQL VRYL YPFPGPIPN LVYPFPGPINSLPQ VRGPFP

IC50 (M)c 13,4 77,1 24,1 14,8 18,0 592,0

Queijo Gouda Manchego Manchego Gouda Crescenza Manchego

cn= casena. bUm cdigo de letra. CConcentrao de material medindo 50% da atividade ECA

M. At ento nenhuma protena do soro derivada de peptdeos inibidores de ECA foi identificada em queijo. A Tabela 11 apresenta alguns peptdeos, inibidores do sistema ECA, identificados em diferentes leites fermentados. A maioria dos peptdeos derivada da casena, possuindo valor de IC 50 variando de 5 a 720 M. Em certos casos, onde culturas do iogurte foram empregadas para fermentar a casena e soro chegou a ser necessria a atividade de tripsina para liberar a atividade inibidora ECA. Os Lb. helveticus so mais efetivos na produo de peptdeos inibidores de ECA que Lactococcus lactis. Duas bebidas de leite, Ameal STM e EvolusTM, fermentadas com diferentes linhagens de Lb. helveticus, possuindo propriedades hipotensoras, foram desenvolvidas respectivamente pela Companhia Calpes, no Japo, e pela Valio, na Finlndia. O produto Ameal S fermentado com Sacharomyces cerevisae em conjunto com Lb. helveticus. Eles contm os tripeptdeos IPP (beta-casena f(74-76) e capa-casena f(108-110)) e VPP (beta-casena f(84-86)), conforme mostra a Tabela 12. Uma linhagem de Lb. helveticus utilizada para originar um leite fermentado, possuindo ambas as propriedades, anti-hipertensiva e redutora de batimento cardaco.

Esta descoberta levou ao desenvolvimento do Cardi-04TM Chr. Hansen A/S (Dinamarca), que comercializado como uma linhagem de BAL que possui a propriedade de gerar peptdeos anti-hipertensivos durante a fermentao.

Liberao de PBAs a partir do leite

Conforme mencionado, os PBAs esto presentes na seqncia primria das casenas do leite num estado inativo. Precisam ser liberados, a fim de mediar um efeito fisiolgico. Esses peptdeos ou seqncias pr-peptdeos associadas podem ser gerados por diferentes vias: (i) Hidrlise por enzimas digestivas (pepsina, tripsina, quimotripsina e pancreatina), (ii) Protelise pela fermentao com bactrias lcticas, (iii) Hidrlise por enzimas proteolticas derivadas de microrganismos ou plantas e combinaes por fermentao lctica e por hidrlise com enzimas digestivas. Exemplo: Peptdeos inibidores de ECA foram isolados de leite UAT aps tratamento com pepsina, seguido de fermentao com Lactobacillus GG e de digesto com tripsina. As seqncias bioativas devem apresentar as seguintes propriedades: (i) Resistncia s condies de degradaes subseqentes, as quais podem levar a perda comple-

ta de sua bioatividade. Exemplo: uma frao de peptdeo inibidor ECA isolado de leite de ovino e de caseinato de sdio hidrolisado com uma proteinase de Lb. helveticus PR4 mostrou ser resistente degradao subseqente com tripsina e quimotripsina. A degradao pode ocorrer in vivo durante o trnsito gastrintestinal, absoro intestinal e o transporte sanguneo. (ii) Capacidade de adsoro mucosa intestinal. Exemplo: um estudo in vitro mostrou que o tripeptdeo VPP, constituinte dos leites fermentados Ameal S e Evolus, foi capaz de cruzar as clulas Caco-2. (iii) Capacidade para alcanar os organismos-alvo. Exemplo: foi mostrado que IPP e VPP foram detectados na aorta de SHR, aps ingesto de Ameal S. Alm disso, a ingesto de Ameal S por SHR foi associada com uma diminuio da atividade ECA em soro. Finalmente, a ingesto de ambos os produtos resultou em significativo aumento da atividade da renina em SHR. Todos os exemplos citados indicam que os peptdeos inibidores de ECA presente nesses leites fermentados so resistentes digesto gastrintestinal, ou seja, que estes cruzam a barreira da mucosa, que eles so resistentes digesto pelas peptidases e que estes peptdeos mediam uma resposta fisiolgica. Normalmente, os peptdeos peque-

FUNCIONAIS & NUTRACUTICOS

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PEPTDEOS
TABELA 11 - ALGUNS INIBIDORES DO SISTEMA ECA IDENTIFICADOS EM DIFERENTES LEITES FERMENTADOS Fragmento aS1-cn f(194-199) aS1-cn f(142-147) aS1-cn f(157-164) aS1-cn f(146-147) b-cn f(74-76) b-cn f(84-86) b-cn f(177-183) b-cn f(193-198) b-cn f(114-115) b-cn f(108-113) k-cn f(108-110) k-cn f(58-59) A-Ia f(105-110) b-Ig f(9-14) b-Ig f(15-20)
a

Seqnciab TTMPLW LAYFYP DAYPSGAW YP IPP VPP AVPYPQR YQEPVL YP EMPFPK IPP YP LAHKAL GLDIQK VAGTWY

IC50 (M)c 51,00 65,00 98,00 720,00 5,00 9,00 274,00 280,00 720,00 423,00d 5,00 720,00 621,00 580,00 1000,00

Bactria Lcticad Iogurte e linhagens filantesf Iogurte e linhagens filantesf Iogurtef Lb. helveticus CPN4

S. e cerevisae + Lb.f helveticus S. cerevisae + Lb. helveticus

Iogurte e linhagens filantesf Iogurte e linhagens filantesf Lb. helveticus CPN4 Iogurte e linhagens filantesf Lb. helveticus Lb. helveticus CPN4 Iogurte e linhagens filantesf Iogurte e linhagens filantesf Iogurte e linhagens filantesf

cn, casena. bUm cdigo de letra. CConcentrao de material mediando 50% da atividade ACE. dBactria lctica. dmg L-1, eLb,Lactobacillus. fPepsina e tripsina tambm foram adicionadas para liberar PBAs inibidores de ECA.

nos (2 a 4 aminocidos) so mais estveis nas condies gstricas. Alguns peptdeos se ligam a receptores especficos do lmen intestinal e induzem s reaes fisiolgicas. Pequenos peptdeos so absorvidos intactos por um sistema de transporte de peptdeos na circulao sangunea e transportados aos organismos-alvo.

Produo comercial de PBAs

A produo comercial de peptdeos bioativos das protenas do leite limitada pela falta de tecnologias adequadas. At agora, tcnicas de separao por membranas representam a melhor tecnologia disponvel para o enriquecimento de peptdeos com determinada faixa de peso molecular. A ultrafiltao rotineiramente empregada para enriquecer PBAs a partir de hidrolisados de protenas.

Hidrlise enzimtica pode ser feita por batelada ou contnua usando membrana de UF. O mtodo convencional de batelada tem algumas desvantagens, como o alto custo da enzima e sua ineficincia, quando comparado com o processo contnuo. Uso de reatores de membrana para a produo contnua de seqncias peptdicas especficas foi introduzido em 1990. Ela j foi bem aplicada para a converso de protenas de alimentos de vrias origens a hidrolisados com propriedades nutricionais e/ou funcionais. Uso de reatores de membrana de UF aperfeioou a eficincia da bioconverso catalisada por enzima e aumentou o rendimento do produto. Alm disso, reatores de membrana de UF forneceram um produto consistentemente uniforme com as caractersticas de peso molecular desejadas. Extrao contnua de PBAs em reatores de membrana tem

Perspectivas futuras
O desenvolvimento de qual-

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FUNCIONAIS & NUTRACUTICOS

sido principalmente aplicado s protenas do leite: recuperao de peptdeos antitrombticos derivados do caseinomacropeptdeo (CMP); combinao de hidrlise enzimtica e UF para produo de peptdeos emulsificantes da b-lactoglobulina. Mas, eles notaram problemas de incrustaes (interao peptdeo-membrana), principalmente em UF de hidrolisados de casena. Quando desenvolvidos como ingredientes alimentares, o tipo de processamento aplicado aos PBAs de importncia vital para sua atividade. Considerando que tratamentos trmicos severos tm um efeito muito negativo sobre a biodisponibilidade dos peptdeos do soro, os processadores devem monitorar cuidadosamente os parmetros de produo.

PEPTDEOS
TABELA 12 - EFEITOS HIPOTENSIVOS DE LEITES FERMENTADOS EM HUMANOS Produtob Dose (subjetiva) Microrganismo(s)a Resposta (max D PSS mmHg)c Referncia

Lb. helveticus CM4 Ameal STM S. cerevisae Lb. casei TCM0409

Leite fermentado (LF) contendo soro

95mL/dia (30 mild hipertensive)

-14,13,1 (P<0,01) Hata et al. Aps 8 semanas (1996) Kawase et al. (2000)

Ad libitum -7 (P<0,05) (20 voluntrios saudveis) Aps 8 semanas

Str. thermophilus TCM Concentrado protico

1543

Lb. helveticus LBK16H Evolus Lb. helveticus LBK16H Evolus

150 mL/dia (30 mild hipertensive) 150 mL/dia (39 hypertensives)

-10,13,0 (P<0,05) Seppo et al. Aps 8 semanas (2002) -6,73,0 (P<0,03) Aps 21 semanas Seppo et al. (2003)

Lb. casei Shirota LF + -cidoaminobutrico 100 mL/dia Lc. lactis YT2027 (35 mild hipertensives) Lb. helveticus LBK16H Evolus 150 mL/dia Lb. helveticus Ameal S 160 g/dia S. cerevisae
a

-17,44,3 (P<0,05) Inoue et al. Aps 12 semanas (2003) -2,615,9(P<0,3111) Tuomiletho Aps 21 semanas et al. (2004) -5,28,1(P<0,390) Aps 2 semanas Mizushima et al. (2004)

Lb,Lactobacillus; S., Saccharomyces. bAmeal STM produzido por Calpis Food Industry CO Ltda, Tokyo, Japo; EvolusTM produzido por Valio Ltda. Valio, Finlndia. cPSS, presso sangunea sistlica; Valor expressado + erro padro; mmHg. Milmetros de mercrio.

quer produto lcteo fermentado com benefcios sade humana, alm das necessidades nutricionais, requer um conhecimento detalhado dos mecanismos que esto por trs dos efeitos benficos. Exemplo: PBAs inibidores de ECA: conhecimento detalhado do mecanismo envolvido na interao existente entre o stio ativo da enzima e o peptdeo e/ou aminocidos presentes dentro desses peptdeos, em ordem para efetivamente produzir peptdeos inibidores e/ou produtos lcteos contendo cada peptdeo. Muitos PBAs derivados das protenas do leite ocorrem dentro de uma mesma regio da protena intacta, por exemplo, as seqncias de peptdeos especficos possuindo duas ou mais atividades in vitro tem sido identificados. Essas regies so consideradas zonas estratgicas, que devem ser parcialmente protegidas da protelise.

Devido a multifuncional bioatividades, por exemplo, atividades inibidoras opiide e ECA, a posse de produtos lcteos possuindo ambas as atividades pode ser benfica para a sade cardiovascular. Recentemente, tecnologias adequadas para a produo comercial de PBAs, a partir de leites fermentados em escala industrial, tm sido desenvolvidas e lanadas para sua subseqente utilizao como ingredientes de alimentos funcionais. Estas tm como base os novos mtodos de separao em membranas e de cromatografia de troca inica empregados pela emergente indstria de ingredientes lcteos. As substncias bioativas, originadas de alimentos, podem ser disponibilizados ao consumidor em produtos convencionais, alimentos funcionais ou medicinais ou como suplementos dietticos. Cada categoria necessita de uma alegao especfica.

Leila Maria Spadoti Engenheira de alimentos (ESALQ/ USP). Possui Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos (ESALQ/USP), rea de Leite e Derivados, e doutorado em Tecnologia de Alimentos (FEA/ UNICAMP), rea de Leite e Derivados. Atua profissionalmente no Centro Estadual de Educao Tecnolgica Paula Souza, Fundao Tropical de Pesquisas e Tecnologia Andr Toselo e, atualmente, pesquisadora do Centro de Tecnologia de Laticnios - TECNOL AT / ITAL. Izildinha Moreno Graduada em Biologia (PUCCampinas). Possui Mestrado em Cincia dos Alimentos (FCF/USP), rea de Bromatologia, e doutorado em Cincia dos Alimentos (FCF/USP), rea de Bromatologia. pesquisadora e diretora tcnica do Centro de Tecnologia de Laticnios - TECNOL AT / ITAL.

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PEPTDEOS

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