LE GENIE GENETIQUE ET LE CLONAGE D'ADN

Le gnie gntique est un ensemble de techniques de biologie molculaire permettant d'isoler des gnes spcifiques, de les reconstruire puis de les rinsrer dans des cellules ou des organismes. Ces techniques ont fourni la mdecine et l'industrie un moyen efficace de produire en grandes quantits des protines spcifiques, qui, auparavant, n'taient disponibles (si elles l'taient) qu'en quantit extrmement faibles. Ces techniques ont permis galement d'tudier la rgulation de leur expression et ainsi de mieux comprendre le dveloppement de maladies gntiques. Les diffrentes tapes passent par : la construction d'une banque d'ADN, le criblage de la banque et l'expression du gne.

I. Construction d'une banque d'ADN : clonage de gne.

On peut distinguer 2 mthodes permettent de construire une banque d'ADN. La premire consiste fragmenter la molcule d'ADN l'aide d'enzymes de restriction, la seconde consiste purifier de l'ARN messager qui seront ensuite transcrit en ADN complmentaire (ADNc) par une transcriptase inverse. I.1. Prparation d'une banque d'ADN l'aide d'enzymes de restriction : banque d'ADN gnomique. 1.1.1 .Prparation de l'ADN. Les enzymes de restriction (voir polycopi introduction au gnie gntique) sont des nuclasse purifies partir de bactries qui coupent l'ADN au niveau de squences spcifiques de 4 8 nuclotides, produisant des fragments d'ADN de tailles strictement dfinies, les fragments de restriction. Les enzymes de restriction sont utilises pour produire de petits fragments d'ADN renfermant un gne particulier. Une autre proprit des enzymes de restriction, commode pour le clonage des gnes, est la capacit, pour beaucoup d'entre elles, de provoquer des coupures en zig-zag qui laissent de courtes extrmits monocatnaires aux 2 extrmits du fragment d'ADN : les extrmits cohsives. Ces extrmits peuvent former des paires de bases complmentaires avec n'importe quelle autre extrmit produite par la mme enzyme. Ainsi, cela permet de relier 2 fragments d'ADN double hlice provenant de gnome diffrents par appariement de bases complmentaires.

Les extrmits cohsives produites par de nombreux types de nuclases de restriction permettent de relier deux fragments d'ADN par des appariements de hases complmentaires. Les fragments d'ADN ainsi runis peuvent tre lis de faon covalente au cours d'une raction trs efficace catalyse par t'ADN ligase. Dans cet exemple, une molcule d'ADN recombinant de plasmide contenant une insertion d'ADN chromosomique est forme.

Par exemple, un fragment d'ADN contenant un gne humain peut tre reli au chromosome d'un virus bactrien en tube essai. La nouvelle molcule d'ADN recombinante peut ensuite tre introduite dans une cellule bactrienne. Sachant que le mcanisme de rplication normal d'un virus peut engendrer plus de 1012 molcules d'ADN viral identiques en moins d'un jour, l'ADN humain est ainsi considrablement amplifi. Le virus est appel vecteur de clonage. I 1.2. Les vecteurs de clonage. Un vecteur de clonage est une petite molcule d'ADN qui possde les proprits suivantes : pouvoir se rpliquer dans une bactrie fortement amplifiable possder des sites de restriction permettant d'introduire le fragment d'ADN cloner possder 2 types de marqueurs : marqueurs de transformation qui permet de faire la distinction entre des bactries transformes (ayant reu le vecteur) et les autres marqueurs de recombinaison qui permet de faire la diffrence entre des bactries ayant reu le vecteur seul de celles ayant reu le vecteur recombinant (c'est dire avec l'ADN d'intrt). Il existe 3 types de vecteur de clonage : plasmidiques, viraux et cosmides (phage associs des plasmides). Les-vecteurs plasmidiques de premire gnration sont drivs du plasmide pBR322. Actuellement, on utilise prfrentiellement des vecteurs plasmidiques de seconde gnration : le plasmide pUCIS et ses drivs. Parmi les vecteurs viraux, un des plus classiques est celui du bactriophage M13. I 1.3. Insertion dans les vecteurs de clonage. Les principes fondamentaux des mthodes utilises pour cloner des gnes sont les mmes pour les diffrents types de vecteurs, bien que les dtails techniques puissent tre diffrents. Pour simplifier, nous n'exposerons que les mthodes utilises pour les vecteurs plasmidiques. Quand on dispose de plasmide purifis (voir TP purification de plasmides), les ADN circulaires de plasmides sont tout d'abord coups par une nuclase de restriction afin de crer des molcules d'ADN linaires. Par ailleurs, l'ADN gnomique utilis pour constituer la banque est lui aussi coup par la mme nuclase et les fragments de restriction rsultants sont alors ajouts aux plasmides coups et rassocis pour former des ADN circulaires recombinants. Ces molcules recombinantes contenant des insertions d'ADN trangers sont ensuite scelles de faon covalente par l'ADN ligase (voir polycopi introduction au gnie gntique) pour former des ADN circulaires intacts. Il faut alors indiquer qu' cette tape, certains plasmides sont referms sans aucune molcule d'ADN trangre. I. 1. 4. Transformation des cellules Dans l'tape suivante de prparation de la banque, les molcules d'ADN recombinantes ainsi prpares sont introduites dans des cellules (habituellement des bactries ou des levures, parfois d'autres cellules eucaryotes) qui ont t rendues permables l'ADN de faon transitoire. De telles cellules sont dites alors transformes par les plasmides (on parle aussi de transfection de cellules, voir TP transfection de cellules eucaryotes in vitro). Pour faciliter l'introduction d'un gne dans une bactrie, il faut rendre les bactries comptentes en fragilisant leur paroi cellulaire. C'est ce que l'on fait par exemple lorsque l'on plonge des bactries Gram - dans une solution froide de CaCl2 (50 mM). Ce procd permet l'ADN extrieur de se fixer sur la paroi cellulaire. L 'entre de l'ADN est ensuite stimule par une brve incubation 42 C. Pour les cellules eucaryotes, on a recours des molcules comme le DEAE-dextran ou le phosphate de calcium qui fragilise la membrane cellulaire et favorise la formation de pore par lesquels les vecteurs plasmidiques peuvent pntrer (voir poly transfection d'un vecteur d'expression eucaryote dans des cellules de mammifre).

Lorsque les cellules se divisent et se multiplient, les plasmides recombinants se rpliquent galement pour produire un trs grand nombre de copies d'ADN renfermant l'ADN tranger. I. 1.5. Slections des cellules transformes Les vecteurs utiliss portent des marqueurs de transformation. Dans le cas des plasmides, il s'agit de gnes de rsistance aux antibiotiques. Ainsi, si des bactries transformes avec ce plasmide arrivent cultiver sur un milieu contenant l'antibiotique, c'est que ces bactries initialement sensible l'antibiotique sont devenues rsistantes. Seule l'intgration du plasmide porteur du gne de rsistance peut expliquer l'apparition soudaine de cette rsistance. Ces bactries contiennent la banque d'ADN. Cependant, parmi ces bactries transformes, certaines peuvent avoir reues le plasmide sans ADN tranger, d'autres possdent un plasmide recombinant et parmi ces dernires, seules une infime minorit peuvent possder le plasmide recombinant qui contient le gne que l'on veut isoler. Il faut tre capable d'identifier ces cellules afin de rcuprer FADN intressant sous forme pure et en quantit suffisante. I. 1.6. Slection des clones intressants dans une banque d'ADN La slection des rares colonies de la banque qui contiennent le fragment d'ADN intressant est souvent la partie la plus dlicate du clonage des gnes. Une des techniques frquemment utilise est une forme d'hybridation in situ qui se sert de l'extrme spcificit des interactions d'appariement entre 2 molcules d'acide nuclique complmentaires. Des boites de cultures contenant les colonies bactriennes en croissance sont transfres avec un morceau de papier filtre, auquel quelques bactries de chaque colonie adhrent. Ces bactries sont ensuite traites afin de faire clater les cellules et de dnaturer l'ADN du plasmide puis hybrides avec une sonde radioactive contenant une partie de la squence de l'ADN du gne d'intrt. Les colonies bactriennes qui ont fix la sonde sont identifies par autoradiographie.

Une technique efficace couramment utilise pour trouver une colonie bactrienne portant un clone d'ADN particulier (voir aussi Figure 5-79). Chaque cellule portant un plasmide recombinant se dveloppe en une colonie de cellules identiques, visible sous la forme d'un point blanc sur l'agar. Une rplique de la culture est ensuite ralise en appuyant un morceau de papier absorbant sur la surface. Cette rplique est traite l'alcali (afin de faire clater les cellules adhrentes et de dnaturer l'ADN du plasmide) puis hybride avec une sonde d'ADN trs radioactive. Les colonies bactriennes qui ont fix la sonde sont identifies par autoradiographie.

Il est alors possible de reprendre la colonie bactrienne correspondante, de l'inoculer pour une culture de grande ampleur et de purifier les plasmide recombinant.

Purification et amplification d'une squence d'ADN spcifique par clonage de l'ADN dans une bactrie.

Remarques : de nombreuses techniques peuvent tre utilises pour vrifier que le gne clon dans un vecteur correspond un gne d'intrt : squenage d'ADN, contrle de taille par lectrophorse sur gel d'agarose, etc... I.2. Prparation d'une banque d'ADN partir d'ARNm : banque d'ADNc. Le clivage de la totalit du gnome d'une cellule avec une nuclase de restriction spcifique pour le clonage d'un gne est parfois qualifi de pche la ligne En effet, on obtient des millions de fragments d'ADN qui produit des millions de colonies diffrentes de cellules transformes. Une autre stratgie possible est de commencer le processus de clonage en slectionnant les seules squences d'ADN qui sont transcrites en ARN et qui sont donc supposes correspondre des gnes : les ARN messagers. Cette mthode consiste extraire l'ARNm partir des cellules et faire ensuite une copie d'ADN complmentaire (ADNc) de chaque molcule d'ARNm prsente grce une transcriptase inverse. La transcriptase inverse (ou reverse) isole des rtrovirus est capable de catalyse la synthse d'une chane d'ADN partir d'une matrice d'ARN. Les molcules d'ADN monocatnaires

synthtises par cette enzyme sont ensuite converties en molcules d'ADN bicatnaire par l'ADN polymrase. Ces molcules d'ADNc sont ensuite insres dans des plasmides et clones comme prcdemment. On obtient alors une banque d'ADNc.

Une copie d'ADN (ADNc} d'une molcule d'ARNm es! effectue par la transcriptase reverse (voir p. 254), une enzyme virale qui utilise une chane d'ARN comme matrice pour la synthse d'une chane d'ADN complmentaire, formant ainsi une hlice hybride ADN/ARN. Le traitement de l'hybride ADN/ARN avec un alcali dgrade slectivement la chane d'ARN en nuclotides. L'ADNc monocatnaire restant est alors copi en ADNc bicatnaire par l'ADN polymrase. Comme l'indique la figure, la transcriptase reverse et l'ADN polymrase requirent toutes les deux une amorce pour commencer leur synthse. Pour la transcriptase reverse, un petit oligonuclotde est utilis ; dans cet exemple, l'oligo(dT) a t associ au poly A l'extrmit 3' de la plupart des ARNm (voir p. 528). Noter que la molcule d'ADN bicatnaire produite ici ne possde pas d'extrmits cohsives ; de telles molcules d'ADN extrmits tronques peuvent tre clones par un seul ou plusieurs procds analogues celui que montre la Figure 5-78, mais moins efficaces. Par exemple, des oligonuclotides synthtiques qui contiennent des sites de coupure par les enzymes de restriction peuvent tre lis aux extrmits d'ADN, ou des queues d'ADN monocatnaires peuvent tre additionnes par voie enzyrnatique pour faciliter l'insertion d'une molcule d'ADNc dans un vecteur de clonage.

II. Expression des gnes clones dans les microorganismes.

Quand on dispose d'une banque d'ADN d'intrt (banque gnomique ou banque d'ADNc) dont on a vrifi que le gne clone est celui que l'on veut faire exprimer, il faut alors transformer

nouveau des cellules avec le vecteur de clonage purifi (avec les mmes techniques de transformation prsentes prcdemment) Cependant, pour que le gne s'exprime dans la cellule, celui-ci doit tre entour d'un ensemble de signaux que la bactrie (ou tout autre cellule transforme) devra reconnatre. II. 1. Promoteurs de transcription. Les vecteurs dexpression possdent un ou plusieurs promoteurs qui doivent tre puissants et aisment rguls. En effet, chaque cellule possde des promoteurs faibles de transcription de gnes codant pour des molcules requises en faible quantit par la cellule et des promoteurs forts pour des substances devant tre produites en quantit importantes. De plus, l'expression d'un gne peut tre induite ou rprime par la prsence d'un compos spcifique. Un des promoteurs le plus couramment utilis est le promoteur_Lac qui est la squence contrlant la transcription du gne Lac Z codant pour la galactosidase bactrienne. Ce promoteur est induit par l'IPTG (voir cours). Il est aussi possible d'utiliser d'autres promoteurs de transcription comme celui du gne de la tryptophane synthtase (Tryp E). Il est possible d'augmenter la puissance du promoteur par des sries de mutations ou de dltions dans la squence promotrice. On arrive alors dans certains cas obtenir une efficacit de transcription multiplie par un facteur 10. Le gne de la protine exprimer doit donc tre clone de telle sorte que sa transcription soit sous la dpendance de ce promoteur et introduit dans la bonne phase de lecture. Ensuite, l'expression peut tre amliore sous les conditions environnementales qui normalement activent le promoteur : c'est le cas par addition d'IPTG dans le cas du promoteur Lac. II. 2. Terminateurs. La prsence de terminateurs de transcription la fin des gnes clones est importante pour plusieurs raisons : la synthse de longs transcrits non ncessaires va exiger de l'nergie et des structures secondaires indsirables peuvent se former dans le transcrit ce qui peut diminuer l'efficacit de la traduction du cot 5'.

IIL Exemple de production : le cas de l'insuline humaine.

L'insuline est une hormone peptidique constitue de 2 chaines (A) et (B) relies par des ponts disulfures et formes partir de la prproinsuline par clivage d'une partie de la chane peptidique.

Utilise pour le traitement des diabtes insulino-dpendants, elle fut tout d'abord extraites du buf (3 acides amins diffrents avec l'insuline humaine) puis du porc (un seul acide amin diffrent). Cependant, du fait de ces diffrences, ces insulines exognes taient immunognes. Le gnie gntique a permis de produire de l'insuline humaine partir de bactries gntiquement modifies. La stratgie exprimentale suivante a t utilise : 1) Isolement du gne de l'insuline L'ARNm codant pour la proinsuiline est isol de cellules du pancras. Par utilisation de la rverse transcriptase, on obtient de l'ADNc puis avec la polymrase, de l'ADNc bicatnaire.

2) Vecteur Le plasmide pBR322 portant les gnes de rsistance l'ampicilline et la ttracycline est choisi comme vecteur de clonage. Le gne de rsistance la ttracycline contient un site de 6 bases reconnu par l'enzyme de restriction Bam Hl. Il contient aussi un promoteur puissant, celui de la (3 galactosidase (P gai) ou celui de tryptophane synthtase (Tryp E). On a commenc par utiliser le promoteur de la p gai mais celui-ci produisant moins d'insuline que le promoteur Tryp E, c'est finalement ce second promoteur qui a t utilis. 3) Insertion dans le vecteur Le plasmide est ouvert au site Bam HI. L'ADNc codant pour la proinsuline est flanqu de 2 linkers (squence d'ADN bicatniare artificiellement ajout) pour avoir la squence de nuclotides approprie la ligation (compatibilit). La ligation des 2 molcules d'ADN (vecteurs et ADNc) se fait par une ligase. 4) Hte : cellule transforme Le plasmide ainsi modifi est introduit dans une bactrie. La souche choisie est E coli K12 initialement sensible la ttracycline et l'ampicilline 5) Slection des clones Le plasmide pBR322 apporte initialement les 2 rsistances l'ampicilline et la ttracycline. Cependant, l'insertion du gne de la proinsuline au site Bam HI du plasmide ne lui permet pas d'apport cette seconde rsistance la ttracycline. Ainsi, les colonies bactrienne capable de se dvelopper sur un criilieu contenant de l'ampicilline sont des bactries ayant intgres le plasmide Par rplique ( l'aide d'un papier buvard) sur un milieu contenant de la ttracycline, on repre alors les colonies d'E. coli qui sont la fois rsistante l'ampicilline et sensible la ttracycline ; Ces dernires sont alors celles qui ont intgres le plasmide transform avec le gne de la proinsuline. 6) Vrification de la production de proinsuiline II faut ensuite vrifier que les colonies slectionnes produisent bien de la proinsuline. Pour cela, on applique sur les colonies choisies une membrane sur laquelle ont t fixs des anticorps capables de reconnatre la proinsuline. A l'aide d'un second anticorps marqu (mthode indirecte), on dtecte alors les clones bactriens capables de produire de la proinsuline. 7) Modification et caractrisation du produit Les clones slectionns sont mis cultiver grande chelle. Le produit obtenu est purifi puis convertie en insuline par un mlange de trypsine et de carboxypeptidase B L'insuline est ensuite analyse par HPLC et sa streochimie vrifie. Enfin, des tests de toxicit et d'activit biologique sont effectus sur animal en mmes temps que des tudes pharmacologiques et cliniques. Autres applications possibles : de nombreuses molcules sont aujourd'hui synthtises par gnie gntique (vaccins, hormones, vitamines...). Actuellement, une autre voie de d'applications nombreuses sont la cration d'organismes transgniques, organismes dans lesquels on introduit ds les premiers stades embryonnaires des gnes modifis. Une autre voie d'application est celle de la thrapie gnique qui permettrait d'introduire des gnes sains dans un organisme contenant des gnes dfectueux provoquant des maladies gntiques.