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de 5 y 10 ml.
- Fiolas de 50, 100, 500 y 1 000 ml.
- Probetas graduadas de 10, 100, 250 y 500 ml.
- Vasos de precipitacin (50 ml., 100 ml., 500 ml.,1000 ml.)
- Placas Petri.
- Balones de digestin.
- Baln de fondo plano.
B. Otros materiales
- Cubetas de poliestireno, Gene Mate
(1cmx 1cmx4.5cm).
- Tips, FISHERBRAND
(1 000ul, 200ul).
- Microtubos (1,5 -2,00 ml).
- Filtros de membrana de 2 mm y 0,2 m.
- Capsulas de porcelana.
- Bureta.
- Esptulas.
- Gradillas.
- Sujetadores de balones.
- Pinzas de metal.
- Papel filtro.
- Esptulas.
4.1.1. Reactivos y solventes
- cido glico
- 2,2-Diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH; Sigma Aldrich, USA).
- Etanol absoluto al 96% y 80 %.
- Folin-ciocalteus, Merck. Germany.
- Carbonato de Sodio (Na
2
CO
3
) p.a. ISO. Scharlau.
- Hidrxido de Sodio (NaOH) en lentejas p.a. ISO. Merck.
Germany.
- Agua destilada (H
2
Od).
- Agua destilada desionizada (H
2
Odd).
- Fenolftalena.
- cido sulfrico concentrado.
- Hexano.
- Sulfato de potasio.
- Sulfato de cobre.
- cido brico.
- cido clorhdrico.
- Acetona.
- Diclorometano.
- ter de petrleo
- Benceno
- Cloroformo
- Gelatina
5.4. Mtodos de anlisis
5.3.2. Anlisis fitoqumico
Mtodo de estudio para determinar compuestos fitoqumicos
(NEIRA et al., 2005).
5.3.3. Anlisis de polifenoles totales.
Mtodo de espectrofotometra de absorcin molecular, descrito por
(SANDOVAL et al., 2001).
5.3.4. Evaluacin de la capacidad antioxidante
Inhibicin del radical 1,1 difenil 1-2- picril-hidrazil (DPPH). Mtodo
de inhibicin del radical DPHH, descrito por SANDOVAL et al.,( 2001).
PULPA
VI. METODOLOGIA EXPERIMENTAL
6.1. Obtencin de muestra
Para ejecutar esta parte de la investigacin se utilizarn frutos de
anona en estado verde y maduro, los cuales sern trados de Alto Pendencia,
luego se proceder al acondicionamiento de las muestras, segn sea su
naturaleza, tal como se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Acondicionamiento de la muestra
Cosecha
Seleccin
Blanqueado
do
Oreado
Secado
Molienda
Envasado
Almacenado
CASCARA
SEMILLA
Lavado
Secado
Molienda
Lavado
Pelado
Despepitado
Liofilizado
Conservacin
6.2. Caracterizacin fitoqumica de cscara, pulpa y semilla de anona
verde y madura.
Con la muestra acondicionada como se muestra en la figura 2 se
procede a la preparacin del extracto para la caracterizacin fitoquimo como se
menciona en el tem 5.3.2. mostrada tambin en la figura 2.
Figura 2. Flujograma de anlisis fitoqumico
100 g MP en polvo
Solucin etanlico
Marcha Fitoquimica
Extracto etanlico
Metabolitos
secundarios
Cantidad y tipo de
metabolitos
secundarios
Solventes de
polaridad
Tcnicas
cromatografas
Marcha de
solubilidad
Maceracin alcohlica x 7
dias
Concentrar
CASCARA PULPA SEMILLA
6.3. Determinacin del contenido de polifenoles de cscara, pulpa y
semilla de anona verde y madura
Se emplearn las muestras preparadas en la figura 1,
determinndose el contenido de polifenoles totales y en lo posible la
determinacin por HPLC de los componentes que constituyen los polifenoles
totales.
Figura 3. Flujograma para la evaluacin de contenido de polifenoles
MP en polvo
Evaluacin de contenido de
polifenoles(700 nm)
20C
Frascos ambar 200ml
Filtrado
Envasado
1.5 g / 15 ml de
hidroalcohol/24h
Almacenado
Extraccin hidroalcohlica
CASCARA PULPA SEMILLA
R1 R2
R3
6.4. Determinacin de la capacidad antioxidante de cscara, pulpa y
semilla de anona verde y madura.
Para determinar la capacidad antioxidante se emplear el mtodo
DPPH, se utilizarn las muestras acondicionadas, el mtodo se presenta en la
parte de mtodos de anlisis, inciso 5.3.4.
Para la determinacin del coeficiente de inhibicin del radical DPPH se
seguir el mtodo por espectrofotometra de luz visible a 517nm. Para ello se
preparar 10 mL de solucin stock de DPPH a 1mM en metanol al 99% de pureza, se
agitar hasta la solubilizacin completa del compuesto y se almacenar a 4C
protegido de la luz. A partir de sta solucin stock se preparar 50 mL de DPPH a 20
M en metanol al 99% de pureza. Para la inhibicin del radical DPPH en hojas, pulpa y
semilla de anona se realizarn partiendo del extracto hidroalcohlico en mg/mL
(filtrado y centrifugado 10000 rpm/10min a 4C). Para determinar el porcentaje de
inhibicin se utilizar la siguiente ecuacin:
( )
100 %
(
=
AbsControl
AbsMuestra AbsControl
DPPH Inhibicion
Dnde: Abs Control: Absorbancia del control
Abs Muestra: Absorbancia de la muestra en 10 min.
VII. DISEO EXPERIMENTAL
En la Figura siguiente se muestra el diseo experimental que se emplear.
FV
1
FM
M
ANONA
MP en polvo
Evaluacin de la actividad antioxidante (DPPH)
Longitud de onda (517nm)
20C
Frascos ambar 200ml
Filtrado
Envasado
1.5 g / 15 ml de
hidroalcohol/24h
Almacenado
Extraccin hidroalcohlica
CASCARA PULPA SEMILLA
R1 R2
R3
Dnde:
- FV y FM: Frutos verdes y maduros.
- C
1
, C
2
: Cscara de fruto verde y maduro.
- P1, P2: Pulpa de fruto verde y maduro.
- S1, S2: Semilla de fruto verde y maduro
Figura ?. Diseo experimental para determinacin de la variacin del
contenido de polifenoles y capacidad antioxidante.
VIII. ANALISIS ESTADISTICO
Los resultados del diseo experimental (Figura 3) para determinar
la hoja con mejor caracterstica fisicoqumica y capacidad antioxidante, sern
analizados mediante el diseo completo al azar con arreglo factorial (DCA),
3A2B con tres repeticiones (DE MENDIBURU, 2007).
Polifenoles
DPPH
IC
50
C
1
P1 S
1
P
2
S
2
C
2
Dnde: