Instrumentele chemische analyse - lab

Exclusiechromatografie

Felix Smout 2de jaar bachelor in de chemie 2CX3/4A 04/05/2012 Onder begeleiding van S. Arickx

Katholieke Hogeschool Leuven Departement Gezondheidszorg en Technologie Herestraat 49 3000 Leuven Tel. +32 16 37 52 00 Fax +32 16 37 52 99 gt@khleuven.be

Inhoud
1 Doel ....................................................................................................... 3 2 Meetresultaten en verwerking meetresultaten ............................................. 3 2.1 Opstellen van het chromatogram ......................................................... 3 2.2 Migratiesnelheid van de componenten .................................................. 6 2.2.1 Verdelingscofficint van glucose ................................................... 6 2.2.2 Capaciteitsfactor van glucose ......................................................... 7 2.3 De efficintie van de chromatografische kolom ...................................... 7 2.4 De kolomresolutie .............................................................................. 7 2.5 Kwantitatieve analyse ......................................................................... 8 3 Besluit.................................................................................................... 9

1 Doel
Door middel van exclusiechromatografie wordt een mengsel van albumine en glucose gescheiden. De doorstroming van de 2 componenten wordt bepaald via transmissiemetingen van de opgevangen fracties. Hiervoor worden eerst kleurreacties volgens de methode van Lowry, voor albumine, en de methode van Somogyi-Nelson, voor glucose, toegepast. Na verwerking van de bekomen meetwaarden, wordt een chromatogram opgesteld. Nadien worden de verdelingscofficint van glucose,de capaciteitsfactor van glucose, de efficintie van de chromatografische kolom en de kolomresolutie bepaald. Tenslotte wordt de concentratie aan albumine en glucose in het onbekende staal bepaald.

2 Meetresultaten en verwerking meetresultaten

2.1 Opstellen van het chromatogram
Het debiet van de loopfase wordt berekend door het totale volume te delen door de totaal genoteerde tijd.

De tijd waarbij elke fractie gevuld was wordt berekend met behulp van het debiet van de loopfase en de cumulatieve volumes van de opgevangen fracties.

Voor bijvoorbeeld fractie 8 geeft dit onderstaande waarde:

De absorbantiewaarden worden berekend door het negatieve logaritme te nemen van 1 honderdste van de gemeten transmissiepercentages.

Voor bijvoorbeeld fractie 8 geeft dit onderstaande waarde:

De meetwaarden en de berekende waarden voor de absorbantie en voor de tijd waarbij elke fractie gevuld was, worden weergegeven in tabel 1. Het chromatogram (figuur 1) wordt bekomen door de waarden voor de absorbantie in functie te stellen van de tijd. 3

Tabel 1: meetwaarden voor de volumes en de transmissiepercentages en de berekende waarden voor de absorbantie en de tijd waarbij elke fractie gevuld was

fractie 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Veluens (ml) 15,7 3,86 3,11 3,47 3,09 3,08 3,13 3,02 2,74 3,23 3,18 3,12 3,11 2,99 3,01 2,87 3,11 2,88 3,15 2,91 3,09 2,79 3,12 2,89 2,79 2,90

Vcum (ml) 15,7 19,6 22,7 26,1 29,2 32,3 35,4 38,5 41,2 44,4 47,6 50,7 53,8 56,8 59,8 62,7 65,8 68,7 71,9 74,8 77,9 80,6 83,8 86,7 89,4 92,3

t (min) 3,28 4,09 4,74 5,47 6,12 6,76 7,41 8,05 8,62 9,29 9,96 10,6 11,3 11,9 12,5 13,1 13,8 14,4 15,0 15,6 16,3 16,9 17,5 18,1 18,7 19,3

T%albumine 100,0 100,0 100,0 95,3 63,8 55,8 72,9 81,3 83,9 83,7 83,0 85,9 88,8 89,1 88,7

Aalbumine 0,00 0,00 0,00 0,0209 0,195 0,253 0,137 0,0899 0,0762 0,0773 0,0809 0,0660 0,0516 0,0501 0,0521

T%glucose

Aglucose

100,0 88,7 70,2 50,9 45,0 47,1 55,4 59,9 65,5 70,3 77,4 81,0 86,2 88,9 88,3

0,00 0,0521 0,154 0,293 0,347 0,327 0,256 0,223 0,184 0,153 0,111 0,0915 0,0645 0,0511 0,0540

0,400

Agluc
0,300

albumine glucose

Aalb
0,200 A

0,100

0,000 4,00

tb

tr

8,00

te

12,00 t (min)

tb

tr

16,00

te

20,00

Figuur 1: chromatogram

In het chromatogram (figuur 1) wordt gebruik gemaakt van de driehoeksconstructie om de pieken weer te geven. Elke piek wordt weergegeven met behulp van een benadering voor de stijging van de absorbantie en een benadering voor de daling van de absorbantie. Met behulp van de vergelijkingen van deze benaderingen kunnen de begintijden, eindtijden en retentietijden bepaald worden. Voor de benaderingen van de stijging en de daling van de absorbantie van albumine worden respectievelijk de gegevens gebruikt van de fracties 4,5 en de fracties 6-8. Voor de benaderingen van de stijging en de daling van de absorbantie van glucose worden respectievelijk de gegevens gebruikt van de fracties 12-14 en de fracties 16-21.
Tabel 2: richtingscofficinten en snijpunten van de benaderingen voor de stijgingen en dalingen van de absorbantie

benadering steiging A daling A

albumine richting snijpunt 0,2705 -1,633 -0,1365 1,256

glucose richting snijpunt 0,1922 -2,119 -0,06528 1,210

De retentietijd wordt bepaald door de vergelijking van de benadering van de stijging van de absorbantie gelijk te stellen aan de vergelijking van de benadering van de daling van de absorbantie. albumine: glucose: De begin- en eindtijden worden bepaald door de vergelijking van de benadering van de stijging of daling van de absorbantie gelijk te stellen aan 0. albumine:

glucose:

De gextrapoleerde absorbantie wordt dan als volgt bepaald: albumine: glucose: 5

Tabel 3: berekende waarden voor de retetietijd, begintijd, eindtijd en absorbantie

albumine glucose

tr (min) 7,10 12,93

tb (min) 6,04 11,03

te (min) 9,20 18,53

A 0,287 0,366

2.2 Migratiesnelheid van de componenten

2.2.1 Verdelingscofficint van glucose
Albumine wordt volledig gexcludeerd door het gel en heeft dus een K=0; de retentietijd van albumine is dus de dode tijd, tM. Glucose heeft een grotere K en dus een hogere retentietijd. De relatie tussen de retentietijd en de verdelingscofficint wordt gegeven door onderstaande vergelijking:

L is de lengte van de kolom in cm. Hiervoor werd een waarde van 22,7 cm opgemeten. tr is de retentietijd van glucose. u is de lineaire snelheid van de loopfase in cm/min. Deze kan berekend worden uit de dode tijd en L:

VM is het dood volume van de kolom of het volume van de mobiele fase in de kolom in ml. Dit kan berekend worden uit de dode tijd en het debiet van de mobiele fase: Vs is het volume van de stationaire fase in ml. Dit wordt berekend uit het totale volume van de kolom en het dood volume:

Nu zijn alle gegevens bekend die nodig zijn om K te bepalen:

2.2.2 Capaciteitsfactor van glucose

De migratiesnelheid van een component kan eveneens beschreven worden door de capaciteitsfactor k. De waarde hiervan ligt idealiter tussen 1 en 5.

2.3 De efficintie van de chromatografische kolom

De efficintie wordt uitgedrukt door middel van het aantal theoretische platen N en door de plaathoogte H. Het aantal theoretische platen kan berekend worden met volgende vergelijking:

Albumine:

Glucose:

De waarde voor het aantal theoretische platen van de kolom bedraagt dan het gemiddelde van deze 2 waarden:

De plaathoogte bedraagt dan:

2.4 De kolomresolutie
Het bekomen scheidingsresultaat wordt uitgedrukt door middel van de kolomresolutie Rs:

Deze waarde is te laag om van een volledige scheiding te kunnen spreken aangezien de kolomresolutie hiervoor minimaal een waarde van 1,5 moet bedragen. De lengte die de kolom zou moeten hebben om in dezelfde omstandigheden volledige scheiding te bekomen, wordt berekend met behulp van de volgende formule:

2.5 Kwantitatieve analyse

De concentraties aan albumine en aan glucose van de oorspronkelijke onbekende, kunnen berekend worden door de piekoppervlakken (Figuur 1) te bepalen in Absorbantiemin en deze waarden te vermenigvuldigen met de corresponderende responsfactoren. De responsfactoren voor deze methode, zijn de volgende:
Een albumine oppervlak van 1 Absorbantiemin correspondeert met 2218 mg albumine/l. Een glucose opppervlak van 1 Absorbantiemin correspondeert met 1127 mg glucose/l.

Met behulp van de driehoeksmethode werd voor elke piek de begintijd, eindtijd en gextrapoleerde absorbantie op de retentietijd berekend.(Tabel 3) Door gebruik te maken van deze gegevens kunnen de piekoppervlakken bepaald worden:

De concentraties aan albumine en aan glucose van de oorspronkelijke onbekende bedragen dan:

3 Besluit
In Tabel 4 worden de resultaten van de analyse weergegeven.
Tabel 4: berekende waarden voor de verdelingscofficint van glucose, de capaciteitsfactor van glucose, de efficintie van de chromatografische kolom, de kolomresolutie, de ideale lengte van de kolom en de concentraties aan albumine en glucose van het onbekende staal.

Kglucose k'glucose N H (mm) Rs Lideaal (cm) Calbumine (g/l) Cglucose (g/l)

0,382 0,821 65 3,5 1,09 43 1,00 1,54

Voor de berekende waarden voor de retetietijd, de begintijd, de eindtijd en de gextrapoleerde absorbantie op de retentietijd wordt verwezen naar Tabel 3. Uit de berekende verdelingscofficint kan afgeleid worden dat, wanneer het staal door de kolom ging, de concentratie aan glucose in de mobiele fase 2,62 keer groter was dan de concentratie aan glucose in de stationaire fase:

De migratiesnelheid van glucose in de kolom ligt te hoog, aangezien de capaciteitsfactor 0,821 bedraagt terwijl deze idealiter tussen 1 en 5 ligt. Het aantal theoretisch platen en de plaathoogte van de kolom bedragen respectievelijk 65 en 3,5 mm. Deze plaathoogte bevestigt de theoretische waarden die tussen 0 en 5 mm bedragen voor de klassieke vloeistofchromatografie in glazen kolommen met hoge diameters van de vastestof-deeltjes. Het scheidend vermogen van de kolom is niet groot genoeg om een volledige scheiding te bekomen aangezien de kolomresolutie 1,09 bedraagt terwijl deze idealiter hoger is dan of gelijk is aan 1,5. Op het chromatogram (Figuur 1) lijken de pieken elkaar nochtans niet te overlappen. Wanneer het model van de driehoeksconstructie echter zou worden vervangen door Gauss-krommen, zou er nog een aantal procent overlapping zijn. Om een nagenoeg volledige scheiding te bekomen zou de lengte van de kolom 43 cm moeten bedragen. De oorspronkelijke onbekende bevatte een concentratie aan albumine van 1,00 g/l en een concentratie aan glucose van 1,54 g/l.