UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD TECNOLOGICA DEPARTAMENTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

ESTUDIO DEL EFECTO DE LA CAVITACIN ACSTICA SOBRE LA ESTABILIDAD MICROBIOLOGICA DEL VINO

MEMORIA DEL TRABAJO DE TITULACIN PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS

Director: Dr. Claudio Martnez F. Co-Directora: Dra. Yolanda Vargas H.

Paula Andrea Guzmn Hormazbal Marcelo Patricio Saldas Arce 2005

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD TECNOLOGICA DEPARTAMENTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

ESTUDIO DEL EFECTO DE LA CAVITACIN ACSTICA SOBRE LA ESTABILIDAD MICROBIOLOGICA DEL VINO

Paula Andrea Guzmn Hormazbal Marcelo Patricio Saldas Arce 2005

Un especial agradecimiento a mis paps por su apoyo incondicional durante toda mi carrera; y, a los profesores y amigos que hicieron posible la realizacin de este trabajo.

Paula

A mis padres, quienes creyeron en m y me apoyaron no solo en mi senda estudiantil, sino que en todo momento. A mis hermanos y amigos por su ayuda incondicional; y a mi sobrino por la alegra entregada en los ltimos aos de carrera.

Marcelo AGRADECIMIENTOS

Damos nuestros sinceros agradecimientos a las personas que trabajaron e hicieron posible la realizacin de esta tesis. En especial a nuestro profesor gua, el Doctor Claudio Martnez, quien nos entrego las herramientas necesarias y el apoyo constante durante este largo periodo. A la doctora Maria Anglica Ganga y a todo el equipo del laboratorio de microbiologa aplicada (LAMAP). Adems, nuestros agradecimientos a la Co-directora de este proyecto, Doctora Yolanda Vargas, por sus conocimientos otorgados. Al profesor Pettorino y a los integrantes del laboratorio de ultrasonidos del Departamento de Fsica.

INDICE
RESUMEN.....................................................................................................................1 SUMMARY.....................................................................................................................2 I. INTRODUCCIN ........................................................................................................3 II. REVISIN BIBLIOGRFICA.....................................................................................5
II.1 EL VINO.............................................................................................................................. 5

II.1.1 Situacin econmica del vino chileno................................................................5 II.1.3 Elaboracin del vino...........................................................................................6 II.1.4 Microorganismos en el vino................................................................................7 II.1.4.1 Levaduras en la fermentacin.....................................................................7 II.1.4.2 Bacterias lcticas en el vino........................................................................8 II.1.5 Enfermedades del vino.......................................................................................9
II.2 LOS ULTRASONIDOS......................................................................................................11

II.2.1 Ondas sonoras.................................................................................................11 II.2.3 Tipos de ondas.................................................................................................11 II.2.4 Caractersticas de las ondas............................................................................12 II.2.5 Ultrasonidos......................................................................................................12 II.2.6 Transductores...................................................................................................13
II.3 CAVITACIN ACSTICA.................................................................................................14

II.3.1 Descripcin del fenmeno................................................................................14 II.3.3 Efectos de la cavitacin acstica.....................................................................14 II.3.3.1 Aumento de presin y temperatura...........................................................14 II.3.3.2 Cambios en la viscosidad..........................................................................15 II.3.3.3 Inactivacin de enzimas............................................................................15 II.3.3.4 Inactivacin de microorganismos..............................................................16
II.4 LOS ULTRASONIDOS EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS...........................................17

II.4.1 Desespumacin................................................................................................17 II.4.3 Deshidratacin..................................................................................................18 II.4.4 Determinacin del grado de madurez en quesos............................................19 III. HIPTESIS..............................................................................................................20 IV. OBJETIVOS............................................................................................................20 V. MATERIALES Y MTODOS....................................................................................21

V.1 DISEO EXPERIMENTAL...............................................................................................21 V.2 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DE LEVADURAS PARA ENSAYOS EN SOLUCIN DE REFERENCIA.......................................................................................................23 V.3 PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DE LEVADURAS PARA ENSAYOS EN VINO.. . .23 V.4 ADAPTACIN FSICA DE LOS SISTEMAS ULTRASNICOS........................................24 V.5 ENSAYOS ULTRASNICOS...........................................................................................26

V.5.1 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada...26 V.5.3 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica...........27 V.5.4 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica, empleando sistema de agitacin...............................................................................28
V.6 RECUENTO DE CLULAS SOBREVIVIENTES..............................................................30 V.7 MEDICIN DEL CAMPO ACSTICO..............................................................................30 V.8 MORFOLOGA DE LAS CLULAS IRRADIADAS............................................................31 V.9 ANLISIS ESTADSTICO DE LOS DATOS.....................................................................32 V.10 ANLISIS QUMICOS....................................................................................................32

V.9.1 Determinacin de la acidez total......................................................................32 V.10.3 Determinacin de la acidez voltil.................................................................32 V.10.4 Determinacin del pH....................................................................................32
V.11 ANLISIS FSICOS....................................................................................................32

V.10.1 Determinacin de la densidad.......................................................................32 V.11.3 Determinacin de la viscosidad..................................................................33 V.11.4 Determinacin de la tensin superficial......................................................33 V.11.5 Determinacin de la intensidad colorante (IC)..............................................34
V.12 EVALUACIN SENSORIAL ..........................................................................................35 V.13 ENSAYOS ULTRASNICOS COMPLEMENTARIOS....................................................36

V.11.1 Bao ultrasnico............................................................................................36 V.13.3 Celda ultrasnica...........................................................................................37 VI. RESULTADOS .......................................................................................................38

VI.1 ENSAYOS ULTRASNICOS..........................................................................................38

VI.1.1 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada..38 VI.1.1.1 Diseo experimental 22............................................................................38 VI.1.1.2 Diseo experimental 32............................................................................42 VI.1.2 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica..........45 VI.1.2.1 Cavitacin con 200 mL de suspensin de levaduras..............................45 VI.1.2.2 Cavitacin empleando agitacin..............................................................47

VI.1.2.3 Cavitacin con 100 mL de suspensin de levaduras..............................49

VI.2 ANLISIS QUMICOS, FSICOS Y SENSORIALES........................................................56 VI.3 MORFOLOGA CELULAR...............................................................................................60 VI.4 ENSAYOS ULTRASNICOS COMPLEMENTARIOS.....................................................61

VI.4.1 Bao ultrasnico...........................................................................................62 VI.4.2 Celda ultrasnica..........................................................................................63 VII. DISCUSIONES.......................................................................................................67

VII.1 Sobrevida celular............................................................................................................ 67 VII.2 Incremento de temperatura.............................................................................................68 VII.3 Campo acstico.............................................................................................................. 69 VII.4 Estructura celular............................................................................................................69 VII.5 Anlisis qumicos............................................................................................................ 69 VII.6 Anlisis fsicos................................................................................................................70 VII.7 Evaluacin sensorial.......................................................................................................71 VII.8 Evaluacin econmica....................................................................................................72

VIII. CONCLUSIONES..................................................................................................73 IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................74 X. ANEXOS...................................................................................................................77

X.1 EVALUACIN SENSORIAL.............................................................................................77 X.2 EVALUACIN ECONOMICA............................................................................................78 X.3 GLOSARIO DE TRMINOS FSICOS..............................................................................79

INDICE DE GRFICOS

GRFICO VI.1. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA Y COMBINACIONES SEGN DISEO EXPERIMENTAL 22......................................................................................39 GRFICO VI.2. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR LAS MUESTRAS DE LEVADURA, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA Y SEGN LAS COMBINACIONES DEL DISEO EXPERIMENTAL 22.............................................40 GRFICO VI.3. GRFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA DE LA SOBREVIDA CELULAR OBTENIDA CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA, UTILIZANDO COMBINACIONES SEGN DISEO EXPERIMENTAL 22. 41 GRFICO VI.4. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA Y COMBINACIONES SEGN DISEO EXPERIMENTAL 32......................................................................................43 GRFICO VI.5. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR LAS MUESTRAS DE LEVADURA, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA Y SEGN LAS COMBINACIONES DEL DISEO EXPERIMENTAL 32.............................................43 GRFICO VI.6. GRFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA DE LA SOBREVIDA CELULAR OBTENIDA CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA, UTILIZANDO COMBINACIONES SEGN DISEO EXPERIMENTAL 32. 44 GRFICO VI.7. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 200 ML DE MUESTRA. 46 GRFICO VI.8. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR LAS MUESTRAS DE LEVADURA, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 200 ML DE MUESTRA. 47

GRFICO VI.9. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA Y SISTEMA DE AGITACIN..............48 GRFICO VI.10. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR LAS MUESTRAS DE LEVADURA, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA Y SISTEMA DE AGITACIN..............49 GRFICO VI.11. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 100 ML DE MUESTRA. 51 GRFICO VI.12. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR LAS MUESTRAS DE LEVADURA, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 100 ML DE MUESTRA. 51 GRFICO VI.13. GRFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA DE LA SOBREVIDA CELULAR OBTENIDA CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 100 ML DE MUESTRA...........................................................52 GRFICO VI.14. EFECTOS PRINCIPALES DE LA SOBREVIDA CON RESPECTO A LA POTENCIA Y TIEMPO DE EXPOSICIN EN EL ENSAYO CON EL TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 100 ML DE MUESTRA...............................................................................................................53 GRFICO VI.15. EFECTOS PRINCIPALES EN LA VARIACIN DE TEMPERATURA CON RESPECTO A LA POTENCIA Y TIEMPO DE EXPOSICIN EN EL ENSAYO CON EL TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 100 ML DE MUESTRA.................................................................................................54 GRFICO VI.16. ESTUDIO DEL CAMPO ACSTICO EN EL SISTEMA CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA.................................55 GRFICO VI.17. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EMPLEANDO BAO ULTRASNICO...............62 GRFICO VI.18. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR LAS MUESTRAS DE LEVADURA EN EL BAO ULTRASNICO, A DISTINTOS TIEMPOS DE EXPOSICIN....................................................................63 GRFICO VI.19. VALOR DEL CAMPO ACSTICO EN EL INTERIOR DE LA CELDA ULTRASNICA, ANTES Y DESPUS DE AJUSTAR LOS MODOS DE VIBRACIN. 64

GRFICO VI.20. VARIACIN EN LA TEMPERATURA DE LAS MUESTRAS DESPUS DE SER IRRADIADAS EN LA CELDA ULTRASNICA A 40 W DURANTE 15 MINUTOS. ............................................................................................66 GRFICO VI.21. PORCENTAJE DE SOBREVIDA CELULAR DESPUS DE IRRADIAR TRES MUESTRAS DE LEVADURAS EMPLEANDO LA CELDA ULTRASNICA............................................................................................................66

INDICE DE TABLAS

TABLA II.1. CUADRO RESUMEN DE LAS ENFERMEDADES DEL VINO...............10 TABLA V.2. COMBINACIONES DE POTENCIA Y TIEMPO SEGN DISEO EXPERIMENTAL 22.....................................................................................................22 TABLA V.3. COMBINACIONES DE POTENCIA Y TIEMPO SEGN DISEO EXPERIMENTAL 32.....................................................................................................22 TABLA VI.4. PARMETROS FSICOS DEL ENSAYO CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA UTILIZANDO DISEO EXPERIMENTAL 22.....................................................................................................38

TABLA VI.5. CONDICIONES PTIMAS DE TIEMPO Y POTENCIA SEGN GRFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA DEL DISEO EXPERIMENTAL 22 PARA OBTENER LA MNIMA SOBREVIDA...............................................................41 TABLA VI.6. PARMETROS FSICOS DEL ENSAYO CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA UTILIZANDO DISEO EXPERIMENTAL 32. ...................................................................................................42 TABLA VI.7. CONDICIONES PTIMAS DE TIEMPO Y POTENCIA SEGN GRFICO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA DEL DISEO EXPERIMENTAL 32 PARA OBTENER LA MNIMA SOBREVIDA...............................................................44 TABLA VI.8. PARMETROS FSICOS PARA LA ADAPTACIN DEL SISTEMA ULTRASNICO, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 200 ML DE MUESTRA...........................................................45 TABLA VI.9. PARMETROS FSICOS PARA LA ADAPTACIN DEL SISTEMA ULTRASNICO, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA Y SISTEMA DE AGITACIN........................................................................48 TABLA VI.10. PARMETROS FSICOS PARA LA ADAPTACIN DEL SISTEMA ULTRASNICO, EMPLEANDO TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA INSERTO EN 100 ML DE MUESTRA...........................................................50 TABLA VI.11. ANLISIS QUMICOS, FSICOS Y SENSORIALES REALIZADOS AL VINO TINTO..................................................................................................................56 TABLA VI.12. COMPARACIN DE PARMETROS COLORIMTRICOS ENTRE VINO TINTO CAVITADO Y VINO TINTO NO CAVITADO..........................................57 TABLA VI.13. ANLISIS QUMICOS Y FSICOS REALIZADOS AL VINO BLANCO. 58 TABLA VI.14. COMPARACIN DE PARMETROS COLORIMTRICOS ENTRE VINO BLANCO NO CAVITADO Y VINO BLANCO CAVITADO.................................59 TABLA VI.15. PARMETROS FSICOS DE LOS TRANSDUCTORES LUEGO DEL AJUSTE DE POSICIN EN LA CELDA......................................................................65 TABLA X.16. TABLA PARA INTERPRETACIN DE RESULTADOS DE LA PRUEBA TRIANGULAR...............................................................................................................77

TABLA X.17. EVALUACIN ECONMICA DE DIVERSOS SISTEMAS ULTRASNICOS OFRECIDOS EN EL MERCADO...................................................78

INDICE DE FIGURAS

FIGURA II.1. ESQUEMA DE LA IMPLOSIN DE UNA MICROBURBUJA. EN UNA PRIMERA INSTANCIA SE FORMAN LAS MICROBURBUJAS (A) Y, POR EFECTO DE LA PRESIN ULTRASNICA, SE COMPRIMEN (B) TRAYENDO COMO EFECTO UNA IMPLOSIN (C) QUE TERMINA FINALMENTE EN EL COLAPSO DE LA BURBUJA (D).........................................................................................................14 FIGURA II.2. CONTROL DE ESPUMA EN UNA CADENA DE EMBOTELLAMIENTO. SE EMPLEAN TRANSDUCTORES FOCALIZADOS QUE TRABAJAN EN FORMA PARALELA. LA VELOCIDAD DE LA BANDA PERMITE IRRADIAR 20 LATAS POR SEGUNDO Y EL CONSUMO DE ENERGA ES DE TAN SOLO 5 MW*H / LATA.. . .18 FIGURA II.3. DESHIDRATACIN DE ALIMENTOS POR ULTRASONIDOS. EL DISPOSITIVO CONSISTE BSICAMENTE EN UN GENERADOR DE AIRE CALIENTE, UN TRANSDUCTOR ULTRASNICO DE POTENCIA DE PLACA ESCALONADA CON EL GENERADOR ELECTRNICO CORRESPONDIENTE Y UNA PLACA PLANA PARALELA AL RADIADOR ULTRASNICO, ACTUANDO COMO SOPORTE DE LAS MUESTRAS. ADEMS, SE UTILIZAN OTROS APARATOS COMPLEMENTARIOS PARA MEDIR LA TEMPERATURA, LA VELOCIDAD DE FLUJO DE AIRE, EL CAMPO ACSTICO Y EL PESO.................19 FIGURA V.4. ANALIZADOR DE IMPEDANCIA HEWLETT PACKARD MODELO 4194 A...........................................................................................................................24 FIGURA V.5. MONTAJE DEL SISTEMA ULTRASNICO. EL GENERADOR DE POTENCIA, RESPONSABLE DE LA ENERGA NECESARIA PARA PRODUCIR CAVITACIN ACSTICA, SE CONECTA A UN MEDIDOR DE POTENCIA ANALGICO. POR OTRA PARTE EL ADAPTADOR DE IMPEDANCIA, EL CUAL IMPIDE QUE SE REFLEJE LA ENERGA QUE ENTREGA EL GENERADOR, SE CONECTAN EN FORMA PARALELA AL TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA, ESTE LTIMO SE SITA EN LA SUPERFICIE DEL LQUIDO QUE EST CONTENIDO EN UN VASO PRECIPITADO............................................25 FIGURA V.6. SISTEMA ULTRASNICO CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA. LA FOTOGRAFA MUESTRA EL GENERADOR DE POTENCIA ULTRASNICO (ATRS) Y EL TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA ESCALONADA (AL FRENTE) INSERTO EN UN TUBO DE ENSAYO

DE 20 ML DE CAPACIDAD CON 5 ML DE SUSPENSIN DE LEVADURAS. LA FLECHA INDICA LA INMERSIN DEL TRANSDUCTOR EN EL LQUIDO..............27 FIGURA V.7. SISTEMA ULTRASNICO CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA. EN LA FOTOGRAFA SE APRECIA LA CONEXIN EN PARALELO ENTRE EL ADAPTADOR DE IMPEDANCIA Y EL MEDIDOR DE POTENCIA. EL VASO PRECIPITADO DE 250 ML DE CAPACIDAD CONTIENE 200 ML DE SUSPENSIN DE LEVADURAS Y EL TRANSDUCTOR SE SUMERGE APROXIMADAMENTE 2 MILMETROS......................................................................28 FIGURA V.8. SISTEMA ULTRASNICO CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA Y SISTEMA DE AGITACIN. LA FOTOGRAFA MUESTRA UN AGITADOR MAGNTICO INSERTO EN EL VASO PRECIPITADO DE 250 ML DE CAPACIDAD CON 200 ML DE SUSPENSIN DE LEVADURAS. EL TRANSDUCTOR SE SUMERGE APROXIMADAMENTE 2 MILMETROS EN EL LQUIDO.......................................................................................................................29 FIGURA V.9. SISTEMA ULTRASNICO CON TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA. LA FOTOGRAFA MUESTRA LA INSERCIN DEL TRANSDUCTOR EN UN VASO PRECIPITADO DE 500 ML DE CAPACIDAD CON 100 ML DE VINO TINTO. AL IGUAL QUE EN LOS SISTEMAS ANTERIORES LA CONEXIN ENTRE EL MEDIDOR DE POTENCIA Y EL ADAPTADOR DE IMPEDANCIA ES EN PARALELO...............................................................................29 FIGURA V.10. MONTAJE DEL SISTEMA PARA LA MEDICIN DEL CAMPO ACSTICO ACTUANTE. EL GENERADOR DE POTENCIA ULTRASNICO SE CONECTA CON EL MEDIDOR DE POTENCIA Y ESTE LTIMO, AL IGUAL QUE EL ADAPTADOR DE IMPEDANCIA, CON EL TRANSDUCTOR PIEZOELCTRICO TIPO BOCINA CNICA. EN LA SUPERFICIE DEL LQUIDO SE SITA UNA SONDA CONECTADA A UN OSCILOSCOPIO QUE MIDE LA DIFERENCIA DE VOLTAJE EN MV. POR ULTIMO, A TRAVS DE UNA TARJETA ESPECIAL, SE CONECTA EL OSCILOSCOPIO CON UN COMPUTADOR QUE REGISTRA LOS DATOS.............31 FIGURA V.11. TENSIMETRO DUNOUY. ESTE EQUIPO CONSTA DE UNA BASE METLICA (A) EN LA CUAL SE SOSTIENEN TODOS LOS COMPONENTES: EL BRAZO QUE SUJETA EL ANILLO (B), EL ANILLO DE PLATINO-IRIDIO (C), LA BASE QUE SOSTIENE LA MUESTRA (D) Y EL DINAMMETRO QUE MIDE LA FUERZA APLICADA PARA LEVANTAR EL ANILLO (E). ADEMS DE LOS TORNILLOS DE AJUSTE DE LA MUESTRA (F), BASE (G) Y MOVIMIENTO DEL ANILLO (H, I)................................................................................................................34 FIGURA V.12. BAO ULTRASNICO. EN ESTE SISTEMA LA CAVITACIN SE PRODUCE DEBIDO A QUE LAS PAREDES DEL EQUIPO VIBRAN, POR LO QUE LOS ULTRASONIDOS SE IRRADIAN HACIA LAS MUESTRAS EN TODAS

DIRECCIONES, EXCEPTO POR ARRIBA GENERANDO UN CAMPO ACSTICO DIFUSO.........................................................................................................................36 FIGURA V.13. CELDA ULTRASNICA CON MUESTRAS DE 200 ML. ESTE SISTEMA SE COMPONE DE DOS TRANSDUCTORES PIEZOELCTRICOS QUE GENERAN ULTRASONIDOS HACIA UNA CELDA DE 1.331 CM3, LA CUAL SE LLENA CON AGUA Y SE COLOCA EN SU INTERIOR LA MUESTRA A IRRADIAR 37 FIGURA VI.14. MICROFOTOGRAFAS DE CLULAS DE LEVADURAS SACCHAROMYCES CEREVISIAE, ANTES Y DESPUS DE SER SOMETIDAS A LOS ULTRASONIDOS. EN (A) SE OBSERVAN CLULAS DE LEVADURAS ANTES DEL TRATAMIENTO ULTRASNICO, LA PARED CELULAR EST INTACTA CON TODO SU CITOPLASMA. (B) MUESTRA CLULAS DE LEVADURAS DESPUS DEL TRATAMIENTO ULTRASNICO, LA PARED CELULAR EST DESTRUIDA Y EL CITOPLASMA SE HA PERDIDO CASI POR COMPLETO...................................61

INDICE DE ECUACIONES

ECUACIN V.1:

L= [4 X 2 X F2 * CB]-1............................................24

ECUACIN V.2. F = 1,084 + 0,000333 [P/(D-D)]......................................................33 ECUACIN V.3 ECUACIN V.4 IC VINO BLANCO = A 420......................................................34 IC VINO TINTO = A 420 + A 520 + A 620..........................34

ECUACIN VI.5. % SOBREVIDA = 34,2768+2,23326*P+4,30527*T 1,195297*10-2 * P2 1,0335 * .............................................................................................................53

RESUMEN
Los ultrasonidos de potencia aplicados a alimentos traen una serie de beneficios que recin se han comenzado a estudiar, entre los que destacan la deshidratacin de alimentos y la destruccin microbiana. De hecho, los ultrasonidos de potencia generan en un medio lquido un fenmeno fsico llamado cavitacin acstica, el cual se basa en la formacin de microburbujas que implotan generando un chorro de energa que impacta a las clulas microbianas adyacentes, produciendo en ellas dao fsico con la consiguiente prdida de viabilidad. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la cavitacin acstica en la carga microbiana del vino y al mismo tiempo en las caractersticas fsicas, qumicas y sensoriales de ste. Se irradi con transductores piezoelctricos tipo bocina escalonada y cnica insertos en muestras de vino bajos en alcohol a las cuales se agreg una suspensin controlada de levaduras, determinando al final del ensayo el nmero de clulas viables. Las muestras se irradiaron en intervalos de potencia y tiempo que variaron entre 1-60 Watts y 1-25 minutos. Para los anlisis qumicos, fsicos y sensoriales se irradiaron muestras de vino tinto y blanco; entre los anlisis realizados cabe destacar la densidad, ndice colorimtrico, acidez voltil y tensin superficial. La evaluacin sensorial indic que no existen diferencias significativas entre las muestras de vino cavitado y no cavitado. Los resultados obtenidos en esta investigacin indican que la cavitacin acstica puede ser un mtodo efectivo para la destruccin microbiana presente en vinos, teniendo mnimo o nulo efecto sobre las caractersticas fsicas y qumicas del producto.

SUMMARY
The high power ultrasound applied in food may be an effective process of microbial decontamination. In fact, high intensity ultrasound generates a physical phenomenon called acoustic cavitation, which is based on the formation of micro bubbles. This cavitation bubbles after irregular oscillations implode, producing damage on the cells.

This work investigates the effects of acoustic cavitation on wine microorganisms, and on the physical, chemical and sensorial characteristics of the wine. The wine samples were inoculated with Saccharomyces cerevisiae and the ultrasonic treatments were carried out in piezoelectric transducers. Samples were irradiated to intervals of power (1-60 Watts) and time (1-25 minutes) determining viable yeast number. To study of physical, chemical and sensorial analysis, the samples were not inoculated with yeast. Different analyses were performed, including density, colour index, acidity and surface tension. The sensorial evaluation and physical and chemical analysis showed mainly there were not bigger differences between irradiated and not irradiated wine samples.

I.

INTRODUCCIN
El objetivo de este proyecto de tesis fue evaluar las posibilidades del uso de la tecnologa

de los ultrasonidos como tcnica de control microbiolgico en la elaboracin del vino. Es sabido que los microorganismos son un factor de suma importancia en la elaboracin del vino. Las levaduras, principalmente Saccharomyces cerevisiae, son las responsables de formar el alcohol a travs de la fermentacin de los azcares del mosto. Por otra parte, las bacterias acidolcticas disminuyen la acidez del vino por medio de la fermentacin malolctica. Sin embargo, en algunas etapas del proceso, la presencia de microorganismos provoca alteraciones en el vino que son perjudiciales para sus caractersticas organolpticas y, por ende, afectan de manera considerable la calidad del producto final. Entre algunos fenmenos causados por microorganismos se encuentran: la excesiva produccin de cido actico (causante del aumento de acidez del vino), el picado lctico (excesiva produccin de cido lctico y/o actico por fermentacin de los azcares), la vuelta maniltica (produccin de manitol a partir de fructosa por las bacterias lcticas heterofermentativas), ahilado o grasa (formacin de polisacridos que dan al vino un aspecto oleoso y viscoso), olor a mantequilla (ocasionado por un exceso de diactilo), amargor (debido a la transformacin de glicerol en acrolena, la cual se combina con los antocianos) y la formacin de aminas biognicas, como la histamina, putrescina y cadaverina (generadas por Pediococcus spp, Lactobacillus heterofermentativos y Oeneococcus oeni, principalmente) (Pardo, 2003). Lamentablemente, algunos mtodos para controlar la contaminacin microbiana en el vino no son completamente efectivos e inclusive pueden causar problemas en su calidad al alterar algunas de sus caractersticas organolpticas. Algunos de estos mtodos son: Utilizacin de dixido de azufre (SO2): Se usa habitualmente en la etapa anterior a la

fermentacin alcohlica para inhibir el crecimiento de levaduras y bacterias indeseadas, pero su problema es la alteracin del sabor y la toxicidad que presenta si se aumenta su concentracin.

- Microfiltracin: Este mtodo de control es bastante eficaz para eliminar microorganismos e impurezas del vino, pero se corre el riesgo de perder color, aroma y cuerpo, dependiendo del tamao de los poros del filtro. - Uso de inhibidores microbianos: Segn la Ley N 18.455 (sobre produccin, elaboracin y comercializacin de alcoholes), el uso de antibiticos est prohibido. Sin embargo, esta prctica se sigue aplicando en algunas vias artesanales.

En este trabajo se analiza la potencialidad de la tecnologa de ultrasonidos como mtodo de control microbiolgico en vinos. Esta tecnologa se produce al aplicar un campo acstico en un medio lquido, generando burbujas de cavitacin. El ultrasonido produce una diferencia de presin en el medio acuoso que da como resultado la formacin de microburbujas que implotan. Esto genera un chorro de lquido de gran poder que impacta a las clulas microbianas provocndoles un dao fsico, que sera el responsable de su destruccin y la consiguiente desinfeccin del lquido. Para este efecto se tom como patrn de estudio la levadura Saccharomyces cerevisiae, ya que es el microorganismo de mayor importancia en la elaboracin del vino, es de fcil disponibilidad, reproducibilidad y no representa mayores riesgos durante su manipulacin. Esta ltima condicin fue necesaria para trabajar con este microorganismo fuera del laboratorio de microbiologa. Los resultados obtenidos con sta levadura podran ser representativos para los dems microorganismos presentes en el vino.

II.
II.1 II.1.1

REVISIN BIBLIOGRFICA
EL VINO Situacin econmica del vino chileno

Segn la Ley de Alcoholes N 18.455, artculo 16, vino es la fermentacin alcohlica del mosto de uvas frescas o asoleadas de la especie Vitis vinfera. En Chile la produccin de esta bebida ha tomado gran relevancia econmica en la ltima dcada. El vino es de los productos chilenos que ms relevancia tiene en el mercado internacional, incluso ms que el local, ya que dos tercios de la produccin se envan hacia el exterior. El clima y suelo presentes en el pas, lo hacen apto para la elaboracin de un producto de excelente calidad frente a competidores extranjeros. Los principales importadores de vino chileno son Estados Unidos e Inglaterra, con 7 y 6 millones de litros de vino embotellado, respectivamente. Luego estn Alemania, Dinamarca, Japn, Canad, Holanda e Irlanda con importaciones que superan 1 milln de litros (Vias de Chile, perodo enero-mayo 2005). La globalizacin econmica y la incorporacin de nuevos pases productores de vino, han generado una alta competencia en los mercados internacionales, siendo esto un estmulo para encontrar nuevas tecnologas que permitan mejorar la calidad del producto, donde el tema microbiolgico es de gran impacto.

II.1.3

Elaboracin del vino

La elaboracin del vino comienza con la vendimia, donde se cosechan las uvas que presentan una madurez avanzada (20% de slidos solubles, aproximadamente). Para controlar a los microorganismos y levaduras naturales que puedan contaminar los racimos de uva se agrega anhdrido sulfuroso (SO2). Si la cosecha es manual, resultan racimos ms sanos que si se cosecha a mquina, ya que sta golpea los frutos y los daa, favoreciendo la contaminacin de los racimos. Mientras ms daados estn los frutos, ms anhdrido sulfuroso deber agregarse, lo que afectar directamente los sabores y aromas del vino, obtenindose un producto de calidad inferior. Las levaduras salvajes no son deseadas, ya que poseen reducido poder fermentativo, bajo rendimiento alcohlico, generan grandes cantidades de cidos voltiles y steres, tienen menor resistencia al alcohol y las caractersticas organolpticas que puedan aportar al vino son desconocidas. Por el contrario las levaduras que son favorecidas son las llamadas levaduras seleccionadas que corresponden a cepas de las especies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus y Saccharomyces pastorianus, las que se seleccionan de acuerdo a sus caractersticas fermentativas (Vergara, 1994). El pie de cuba se elabora con la cepa de levadura seleccionada inoculado en jugo de uva. En este caldo nutritivo se reproducir la levadura seleccionada hasta lograr una cantidad suficiente para la fermentacin. Posteriormente y una vez prensada la uva vendimiada se le incorporan las levaduras seleccionadas, provenientes del pie de cuba, para comenzar la fermentacin (Vergara, 1994). Cuando la densidad del mosto alcanza 1.070 g/cc termina la fermentacin alcohlica o primaria obtenindose el vino como tal; despus se da inicio a la fermentacin malolctica o secundaria (realizada por bacterias acidolcticas) hasta obtener un vino de 990 g/cc de vino, aproximadamente. Para los vinos tintos la fermentacin dura entre 3 y 5 das a unos 24 C, mientras que para los vinos blancos dura de 7 a varias semanas entre 7 y 21 C. Adems de la densidad, durante el proceso se debe ir controlando la temperatura. Dado que la fermentacin es una reaccin exotrmica sube la temperatura del sistema, acelerando el metabolismo de las levaduras, por lo que consumen ms rpido el oxigeno y los nutrientes, y generan ms alcohol etlico, cidos y dixido de carbono (Vergara, 1994).

Otro factor importante a tener en consideracin es la hermeticidad del sistema, ya que si la fermentacin no se realiza en anaerobiosis podran desarrollarse microorganismos indeseados o generarse compuestos inaceptables en el vino, como el cido actico (Vergara, 1994). Si se desea obtener vinos frutosos, aromticos y pigmentados, se debe fermentar el jugo de uva junto con los orujos, la pulpa y las semillas. Los orujos son ricos en antocianinas, las que se solubilizan en el alcohol formado durante la fermentacin, al igual que los aceites de las semillas, los que aportan suavidad al vino. Terminada la fermentacin alcohlica se obtiene el vino gota y el vino prensa; este ltimo proviene del prensado de las partes slidas y es de menor calidad. La acidez de ambos vinos es provocada principalmente por el cido tartrico y el cido mlico; si se desea obtener un vino con menor grado de acidez se puede realizar una segunda fermentacin para transformar el cido mlico en cido lctico, que tiene una acidez menor. Esta fermentacin malolctica es llevada a cabo por bacterias lcticas, principalmente Oeneococcus oeni, poseedora de la enzima mlica. Este vino ser de mejor calidad y tendr mayor valor agregado (Vogt, 1985).

II.1.4

Microorganismos en el vino

II.1.4.1 Levaduras en la fermentacin

En la elaboracin tradicional del vino, la fermentacin depende de la presencia natural de levaduras en el mosto. Inicialmente Saccharomyces cerevisiae no es importante numricamente, siendo las levaduras dominantes en esta etapa: Candida stellata,

Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia pulcherrima y Pichia anomala. La situacin geogrfica del viedo y las condiciones climticas durante el crecimiento de las vides influye en la microbiota presente en una via. Adems de las levaduras, los hongos filamentosos y las bacterias acidolcticas tambin estn presentes al comienzo de la fermentacin. Los hongos aparecen en las primeras etapas de la fermentacin, mientras que las bacterias cido lcticas actan terminada la fermentacin alcohlica, cuando desciende el nmero de Saccharomyces y comienza la fermentacin malolctica.

La adicin de dixido de azufre (SO2) al mosto reduce el nmero total de levaduras salvajes, ya que inhibe hongos y bacterias, favorecindose la supervivencia de levaduras resistentes como S. cerevisiae y S. ludwigii. S. cerevisiae generalmente se convierte en la levadura predominante segn avanza la fermentacin y la concentracin creciente de etanol va inhibiendo a otras levaduras. Sin embargo, los patrones de sucesiones microbianas pueden ser modificados por la temperatura; a 25 C pueden predominar S. exiguus y Zygosaccharomyces bailii. A 10 C S. cerevisiae domina, pero adems estn en gran cantidad Klockera apiculata, Candida stellata y Candida krusei (Varnam, 1997).

II.1.4.2 Bacterias lcticas en el vino

Terminada la fermentacin alcohlica, en el vino an quedan remanentes de glucosa y fructosa, que son la principal fuente de energa de las bacterias lcticas responsables de la fermentacin malolctica o segunda fermentacin. Las bacterias lcticas pueden ser homofermentativas o heterofermentativas, pero para realizar la degradacin del cido mlico en cido lctico necesitan la enzima malolctica, hasta el momento, presente en todas las bacterias lcticas aisladas en vinos. Algunas bacterias lcticas del vino, como Pediococcus damnosus, Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus brevis, generan polisacridos extracelulares, tales como lvanos, dextranos, glucanos y heteropolisacridos. Estos compuestos dan viscosidad al vino. Otras son capaces de metabolizar los aminocidos que hay en el mosto o en el vino y de dar lugar a aminas bigenas o a precursores del carbamato de etilo, ambos productos son considerados peligrosos para la salud humana. Las aminas bigenas son indeseables en todos los alimentos y bebidas, porque absorbidas en alta concentracin pueden producir dolores de cabeza, alteraciones respiratorias, palpitaciones cardacas, hiper o hipotensin y fenmenos de alergia. Por su parte, el carbamato de etilo es considerado como un compuesto cancergeno (Pardo, 2003). Los principales cidos orgnicos presentes en el mosto son el cido tartrico, cido mlico, cido ctrico, cido ascrbico y glucnico. Como consecuencia de la fermentacin de origen

bacteriano pueden aparecer los cidos pirvico o D-lctico, succnico, actico, citramlico, axalactico y fumrico. Las bacterias lcticas degradan mayoritariamente el cido mlico, ctrico y no con mucha frecuencia el tartrico. Entre las bacterias que degradan el cido mlico y tartrico, se encuentran principalmente: Lactobacillus plantarun, Lactobacillus brevis y Oenococcus oeni (Pardo, 2003). De todas las actividades metablicas que las bacterias lcticas pueden llevar a cabo en el vino, la nica deseada es la fermentacin malolctica, que es beneficiosa para disminuir la excesiva acidez de los vinos. El resto de las actividades conducen generalmente a alteraciones del vino (Pardo, 2003).

II.1.5

Enfermedades del vino.

Desde el prensado hasta el embotellado el vino est expuesto al peligro de sufrir daos que pueden llegar a motivar su completo deterioro. Estos cambios con influencia negativa sobre la calidad de los vinos reciben los nombres de tacha, defectos o enfermedades, segn su intensidad y caractersticas. Entre las tachas o deficiencias se incluye un contenido demasiado escaso de alcohol, carencia de pigmento, de buqu, de cuerpo, etc.

Los defectos del vino estn originados por procesos fsicos o qumicos que ocurren en ste al captar sustancias extraas y se manifiestan en variaciones indeseables de aspecto, olor y sabor (Vogt, 1985).

Reciben el nombre de enfermedades del vino todos aquellos cambios perjudiciales provocados por microorganismos. Obedecen a las modificaciones o alteraciones de determinados componentes del vino, causados por bacterias, levaduras u hongos y a la formacin de sustancias nuevas indeseables. Estas ltimas pueden incluso afectar a la aptitud del vino para el consumo, es decir, que no slo afectan a los carcteres sensoriales. Es frecuente que en las enfermedades se superpongan varios procesos microbianos, que por ello mismo son difcilmente diferenciables en la prctica (Vogt, 1985).

Tabla II.1. Cuadro resumen de las enfermedades del vino Enfermedad Florecido Avinagrado Microorganismo Levaduras genero Candida, Pichia y Hansenula Bacterias Acetobacter xylinum, A. rancens, A. mesoxydans, A. aceti, A. ascendens, A. suboxydans y A. pasteurianum. Bacteria Bacterium mannitopoeum y B. gracile. Alteracin Telilla superficial griscea de hasta 1 cm. de espesor. El vino es transformado en cido actico.

Picado lctico y fermentacin mantica.

Arratonado Viscosidad

Descomposicin del cido tartrico y de la glicerina Amargor del vino tinto Enturbiamientos por la sal clcica del cido mcico Enturbiamientos por levaduras Enturbiamientos por bacterias y levaduras mcicas. (Vogt, 1985).

Penetrante sabor cido dulce y olor peculiar que recuerda el de las coles frescas fermentadas. Los vinos suelen estar turbios. Bacteria Bacterium mannitopoeum. Gran cantidad de cidos voltiles y sabor picante. Bacteria Pediococcus cerevisiae, El vino se torna espeso y Pediococcus damnosus, Leuconostoc viscoso con burbujas en la mesenteroides, Lactobacillus brevis, superficie. hongo Dematium pallidum Bacterias Bacterium tartarophtorum y Transformacin del color rojo a marrn, enturbiamiento, B. tartarophtorum . sedimento pardo. Bacterias, hongos y levaduras. Sabor amargo, color parduzco, enturbiamiento y sedimento castao Hongo Botrytis. En vinos embotellados causa el depsito de cristales. Levaduras en gemacin Enturbiamiento, gran cantidad de CO2, sabor penetrante. Enturbiamiento del vino con espesamiento y sabor picante.

Levaduras del genero Cndida, Torulopsis, Brettanomyces.

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II.2 II.2.1

LOS ULTRASONIDOS Ondas sonoras

Fsicamente el sonido es una perturbacin que se propaga en un medio elstico. Cuando en alguna regin del aire se produce una perturbacin de presin, por ejemplo en forma de compresin, esta regin se expande hacia regiones vecinas. Esto produce a su vez una compresin en dichas regiones, que volvern a expandirse creando una compresin ms lejos todava. Este proceso se desarrolla en forma continua haciendo que la perturbacin original se propague a travs del aire alcanzando en algn momento la posicin que ocupa algn receptor (por ejemplo un micrfono o un odo). El exceso de presin caracterstico de la perturbacin descrita se denomina presin sonora (Kieffer, 2002).

II.2.3

Tipos de ondas

Este tipo de movimiento, en el cual no es el medio en si mismo sino alguna perturbacin lo que se desplaza, se denomina onda. Cuando la onda tiene lugar en un medio lquido o gaseoso se denomina onda acstica. Cuando resulta audible se llama onda sonora (Alvarenga, 1983). Existen muchos tipos de ondas, tales como las ondas de radio, la luz, la radiacin del calor, las ondas sobre la superficie de un lago, los tsunamis, los movimientos ssmicos, etc. Las ondas mecnicas (sonoras) se diferencian en varios tipos, dependiendo de la relacin existente entre la direccin del movimiento de las partculas de materia con la direccin de propagacin de la onda. Si el movimiento de las partculas es perpendicular a la direccin de propagacin de la onda misma, se denominan ondas transversales. Al contrario, si el movimiento de las partculas de una onda sonora es de vaivn a lo largo de la direccin de propagacin, se habla de ondas longitudinales. Existen ondas que poseen dos o ms direcciones de propagacin de energa, las cuales se denominan ondas bi y tridimensionales.

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II.2.4

Caractersticas de las ondas

El tipo de onda ms comn es la sinusoidal, que presenta caractersticas de suma importancia en el estudio de la acstica, tales como amplitud (A) o desplazamiento mximo de la curva, longitud de onda () o distancia entre dos puntos adyacentes de la onda que tengan la misma fase, periodo (T) o tiempo necesario para que un punto en cualquier coordenada x efecte un ciclo completo de movimiento transversal, y frecuencia ( f) o ciclos por segundo de una onda (Sonic, 1997). La onda longitudinal ms conocida es la onda sonora y de acuerdo a su frecuencia de emisin podemos clasificar el sonido en: subsnicos o infrasonidos cuando las ondas se sitan debajo de los 20 Hz (por ejemplo las ondas generadas por sismos), sonidos propiamente tal cuando las ondas se sitan entre los 20Hz y 20kHz (todos aquellos sonidos percibidos por el ser humano), y finalmente ultrasonidos cuando las ondas se sitan sobre los 20 kHz (aquellos utilizados en ecografas y radares submarinos) (Sonic, 1997).

II.2.5

Ultrasonidos

En 1880 los hermanos Pierre y Paul-Jacques Curie descubrieron el llamado efecto piezoelctrico, que consiste en la capacidad de un cristal o cermica piezoelctrica de generar una carga elctrica cuando son sometidos a presin. Al pasar los aos se comprob que realizando el experimento de manera inversa, es decir, al aplicar un campo elctrico, las molculas de los cristales se separan y se unen produciendo una vibracin, una oscilacin en el aire que les envuelve, o de otra manera, produciendo una onda ultrasnica (UIB, 2003). Los ultrasonidos tambin se pueden agrupar en funcin de la intensidad acstica, es decir la potencia aplicada por rea. De esta manera si la intensidad acstica es inferior a 1 W/cm 2 se denominan ultrasonidos de baja intensidad. Estos tienen la propiedad de no generar dao mecnico, siendo esta la razn de su uso en el estudio de diversos materiales, desde un hueso humano hasta la soldadura de un barco (Gallego y otros, 2000). Cuando la intensidad acstica es superior a 1 W/cm2 se habla de ultrasonidos de alta intensidad. Estos poseen la caracterstica de afectar mecnicamente al material estudiado, e incluso afectar a todo un proceso o a una reaccin qumica. Entre los efectos producidos se encuentra la cavitacin acstica, que es la formacin de burbujas de vapor localizadas dentro de un lquido que se

12

encuentra en reposo y que en cierto momento "implotan", generando un chorro de lquido de gran energa, responsable del dao a los slidos presentes (Blamey, 2000).

II.2.6

Transductores

El dispositivo utilizado para generar ondas ultrasnicas se denomina transductor, elemento que puede transformar la energa elctrica en energa mecnica y, en consecuencia, igualmente en energa acstica. Los de mayor uso son aquellos que emplean la tecnologa piezoelctrica. Esta consiste en utilizar las caractersticas de ciertos materiales cermicos que modifican sus tensiones elsticas internas y su forma cuando se les aplica un campo elctrico. Cada transductor est fabricado juntando dos cermicas piezoelctricas la una bajo la otra, entre las dos partes metlicas de aluminio o acero y apretadas con un tornillo, constituyendo un sndwich pretensado. El conjunto est calculado de forma que constituya una estructura mecnica con una frecuencia propia de oscilacin (frecuencia de resonancia). Se obtiene as un sistema resonante capaz de aumentar la amplitud del movimiento de las superficies de las cermicas piezoelctricas cuando se aplique a estas ltimas el campo elctrico alterno, normalmente con varios cientos de voltios de tensin, y cuya frecuencia coincida exactamente con la resonancia mecnica (CM Electronics, 2004).

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II.3 II.3.1

CAVITACIN ACSTICA Descripcin del fenmeno

El sonido se transporta a travs del lquido como una onda, con ciclos alternados de compresin y expansin. Si la onda de expansin es lo suficientemente poderosa, pueden generarse presiones negativas que traen como resultado que las molculas comiencen a separarse formando microcavidades (Vergara, 2003). Estas microcavidades crecen acompaando los ciclos de presin y dependiendo de la intensidad del sonido. Durante los ciclos de expansin, la presin negativa que se ejerce sobre las burbujas hace que en ellas se acumulen pequeas cantidades de gases disueltos, y durante los de compresin, los dimetros de estas burbujas aumentan trayendo como resultado un aumento gradual del tamao hasta llegar, en cierto momento, al colapso violento de las burbujas y a una gran liberacin de energa (figura II.1).

Figura II.1. Esquema de la implosin de una microburbuja. En una primera instancia se forman las microburbujas (A) y, por efecto de la presin ultrasnica, se comprimen (B) trayendo como efecto una implosin (C) que termina finalmente en el colapso de la burbuja (D).

II.3.3

Efectos de la cavitacin acstica

II.3.3.1 Aumento de presin y temperatura

El colapso de las burbujas establece un ambiente inusual para las reacciones qumicas. Los gases y vapores del interior de la cavidad son comprimidos de tal forma que generan intenso calor y crean regiones o puntos calientes, con presiones de 500 atm y temperaturas de hasta 5000 K. Si bien la temperatura de estos puntos es extraordinariamente alta, la regin en si es tan pequea que el calor se disipa rpidamente.

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Las primeras reacciones qumicas en el lquido se dan a causa de estas extremas condiciones. Las altas temperaturas y presiones generadas, proveen la energa de activacin requerida para la fragmentacin de las molculas (rotura de enlaces), generando molculas mas pequeas o radicales libres (Kuldiloke, 2002).

II.3.3.2 Cambios en la viscosidad

Cuando un fluido es sometido a radiaciones ultrasnicas de alta intensidad, se produce agitacin mecnica y fuerzas de cizalla que afectan las propiedades estructurales de ste, principalmente la viscosidad. Los fluidos newtonianos luego del tratamiento ultrasnico mantienen sus caractersticas newtonianas, sin embargo, los fluidos dilatantes y tixotrpicos tienden a ponerse ms rgidos o menos viscosos, respectivamente. Los ultrasonidos de alta intensidad en fluidos newtonianos producen violenta agitacin que puede utilizarse para dispersar partculas. En las interfaces lquido/slido o gas/slido las ondas acsticas causan una turbulencia extrema conocida como corriente acstica o microcavidades. Esto genera un incremento en la transferencia convectiva de masa y una considerable aceleracin en la difusin. Este ltimo efecto permitira reducir el tiempo de secado en la deshidratacin de productos alimenticios (Kuldiloke, 2002).

II.3.3.3 Inactivacin de enzimas

Un prolongado perodo de exposicin a los ultrasonidos de alta intensidad puede producir una inactivacin enzimtica, que se debe probablemente a la intensa presin existente, altas temperaturas y formacin de radicales libres (Miranda y otros, 1998). Algunas enzimas como la catalasa, invertasa y pepsinas son muy resistentes al tratamiento ultrasnico, sin embargo, cuando ste se combina con un proceso trmico cercano a los 61 C genera un gran efecto, siendo de gran ayuda en la inactivacin de la enzima peroxidasa (indicador de tratamientos trmicos). La resistencia de la enzima depende de la potencia aplicada, la geometra del instrumento y el volumen tratado (De la Fuente y otros, 2004).

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II.3.3.4 Inactivacin de microorganismos

El ultrasonido de alta intensidad se ha usado para facilitar la descontaminacin microbiana de agua y varios tipos de alimentos (Mason y otros, 2003b). Efecto que se debe probablemente a la destruccin de la pared celular de los microorganismos debido a las variaciones de presin, fuerzas de corte y altas temperaturas generadas. El ultrasonido resulta ser ms efectivo cuando se utiliza en combinacin con otras tcnicas de descontaminacin, tales como calor, pH extremo o cloracin (Guerrero y otros, 2001). Sin embargo, la resistencia a los ultrasonidos varia ampliamente entre las distintas especies microbianas. Generalmente, los microorganismos de mayor tamao son ms sensibles que los de menor tamao, los Gram positivos ms que los Gram negativos y los aerobios ms que las especies anaerobias (Mason y otros, 2003a).

16

II.4

LOS ULTRASONIDOS EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS

Las aplicaciones de los ultrasonidos de alta intensidad son aquellas en que la energa ultrasnica se utiliza para producir efectos permanentes en el medio tratado. El uso de esta tcnica en la industria de alimentos es mnima, en particular la aplicacin de ultrasonidos de alta potencia en fluidos y medios multifsicos (lquidos con partculas slidas), debindose esto a la complejidad de los mecanismos bsicos involucrados y a las dificultades existentes en la generacin de ultrasonidos de alta intensidad (Gallego, 1998). Como se dijo anteriormente, los efectos permanentes que se producen con el ultrasonido de alta intensidad se deben a las variaciones de presin de gran amplitud, que traen como consecuencia: corrientes acsticas, cavitacin, calor, agitacin, inestabilidades en las interfases, friccin, difusin y rotura mecnica (Gallego y otros, 2000). Las caractersticas anteriores han permitido el uso del ultrasonido en el campo de los alimentos en diversos procesos descritos a continuacin.

II.4.1

Desespumacin

La espuma causa, en general, dificultades en el control del proceso y en el manejo de los equipos. Un ejemplo tpico es el de la fermentacin industrial donde la espuma representa uno de los mayores problemas. El ultrasonido se incluye dentro de los mtodos mecnicos de ruptura de burbujas, constituyendo las ondas ultrasnicas un medio limpio para romper espumas. En cadenas de embotellamiento y/o enlatado, la radiacin ultrasnica en aire se enfoca en el rea de trabajo donde el exceso de espuma es destruido rpidamente para evitar prdidas de lquido (figura II.2). Se utilizan transductores focalizados que operan a frecuencias de 20 kHz y con potencias de aproximadamente 150 W (Gallego y otros, 2000).

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Figura II.2.

Control de espuma en una cadena de embotellamiento.

Se emplean transductores

focalizados que trabajan en forma paralela. La velocidad de la banda permite irradiar 20 latas por segundo y el consumo de energa es de tan solo 5 mW*h / lata.

II.4.3

Deshidratacin

La deshidratacin es un mtodo para preservar alimentos. En la actualidad se utilizan principalmente dos sistemas: el secado por aire caliente y la liofilizacin (De la Fuente y otros, 2004). El secado por aire caliente es un mtodo ampliamente utilizado, que puede producir deterioro en el alimento. En la liofilizacin, en el que las piezas son primeramente congeladas y luego sublimadas, el deterioro del producto es despreciable, pero el proceso resulta costoso (De la Fuente y otros, 2005). El sistema de secado ultrasnico combina el aire caliente con la energa ultrasnica, siendo su ventaja la menor temperatura del aire. Los ultrasonidos de alta intensidad aplicados a travs del aire introducen variaciones de presin en las interfases gas/lquido, aumentando la tasa de evaporacin de la humedad (De la Fuente y otros, 2005). Durante la fase negativa del ciclo de presin la humedad se elimina y no vuelve a entrar durante la fase de presin positiva. Este mecanismo es ms eficaz cuando la superficie del material est completamente cubierta de humedad. En un sistema de secado por aire forzado, el efecto de la velocidad del aire influye

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en la transferencia de calor y de masa (De la Fuente y otros, 2004). La energa acstica produce un efecto de variacin de velocidad que puede incrementar la tasa de secado con una velocidad estable del aire (figura II.3). Adems, los ultrasonidos de alta intensidad propagados por aire causan microcorrientes, en las interfases. Esto reduce la capa lmite de difusin (De la Fuente y Gallego, 2003).

Figura II.3. Deshidratacin de alimentos por ultrasonidos. El dispositivo consiste bsicamente en un generador de aire caliente, un transductor ultrasnico de potencia de placa escalonada con el generador electrnico correspondiente y una placa plana paralela al radiador ultrasnico, actuando como soporte de las muestras. Adems, se utilizan otros aparatos complementarios para medir la temperatura, la velocidad de flujo de aire, el campo acstico y el peso.

II.4.4

Determinacin del grado de madurez en quesos

La madurez de un queso depende de las condiciones de humedad y temperatura a las cuales se somete. Para determinar si las piezas de un mismo lote alcanzan igual humedad, stas se someten a ondas ultrasnicas de baja intensidad y se mide la seal despus de atravesar el queso. De esta forma se logra conocer el grado de madurez del queso (UIB, 2003). Otra aplicacin del ultrasonido en quesos es en la etapa de curado. El proceso de salar el queso es largo y provoca un volumen considerable de salmuera, cuya eliminacin es problemtica. Los ultrasonidos de potencia facilitan la deshidratacin del queso y la entrada de la sal de una manera ms rpida, siendo ellos los catalizadores de esta reaccin. De esta manera no sera necesario sucesivas inmersiones en agua con sal. 19

III. HIPTESIS
Si la cavitacin acstica es capaz de destruir estructuras celulares, entonces puede ser un efectivo mecanismo de control microbiolgico en la elaboracin del vino

IV. OBJETIVOS
General Evaluar experimentalmente el efecto que tiene la cavitacin acstica sobre las caractersticas microbiolgicas, qumicas y sensoriales del vino. Especficos a) Evaluar porcentaje de sobrevida del microorganismo versus tiempo y potencia de aplicacin de ultrasonidos. b) Observar la morfologa celular luego de la aplicacin de ultrasonidos. c) Observar cambios de color en el vino tratado con ultrasonidos. d) Realizar anlisis qumicos, fsicos y sensoriales al vino tratado con ultrasonidos.

20

V.

MATERIALES Y MTODOS
Con el objeto de comprobar la efectividad que tienen los ultrasonidos en la inhibicin de

microorganismos, se montaron diferentes sistemas experimentales con los que se gener el fenmeno de cavitacin acstica en el interior de recipientes que contenan las muestras a estudiar. Estos sistemas bsicamente consistan en un transductor piezoelctrico conectado a un generador de ultrasonidos, un medidor de potencia y un adaptador de impedancia; el transductor fue sumergido en la superficie del lquido usado como muestra. La variable dependiente fue el porcentaje de sobrevida de clulas viables, mientras que las variables independientes fueron el tiempo y la potencia de aplicacin de los ultrasonidos.

V.1

DISEO EXPERIMENTAL

El nmero de ensayos realizados se determin con el diseo experimental factorial 2 k. Este modelo involucra K factores (tiempo y potencia) y dos niveles para stos (mximo y mnimo). Es decir, se ensay con un diseo experimental 22. Las variables estudiadas y los valores mximos y mnimos escogidos para ellas fueron analizadas con el programa STATGRAPHICS 4.0 PLUS, el cual arroj una combinacin de 8 experimentos, a los que se sum la repeticin del punto central 4 veces, dando un total de 12 combinaciones (Tabla V.1). Se trabaj con un rango de potencias entre 10 y 50 Watts, debido a que a mayores potencias la temperatura suba demasiado y sta poda interferir en los resultados, ya que una disminucin en la viabilidad podra deberse a la temperatura y no a la cavitacin. El tiempo de irradiacin ultrasnica se estableci entre 5 y 20 minutos, por considerarse un tiempo razonable. La frecuencia de trabajo se mantuvo entre 15 y 21 kHz, ya que los instrumentos trabajaban en ese rango. Paralelamente se estudi un diseo experimental de mayor complejidad, el 32, con el objeto de verificar si existan diferencias entre los resultados obtenidos con este modelo y el del 2 2 que era de mayor simpleza. La combinacin de tiempo y potencia del diseo experimental 32 se muestra en la tabla V.2.

21

Tabla V.2. Combinaciones de potencia y tiempo segn diseo experimental 22. Combinacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Potencia (W) 30 58 1,8 30 30 10 30 30 10 50 50 50 Tiempo (min) 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 20,0 1,8 12,5 5,0 5,0 20,0 23,0

Tabla V.3. Combinaciones de potencia y tiempo segn diseo experimental 32. Combinacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Potencia (W) 30 30 50 10 50 50 30 10 30 30 30 10 30 30 Tiempo (min) 5,0 12,5 12,5 5,0 5,0 20,0 12,5 20,0 12,5 20,0 12,5 12,5 12,5 12,5

22

V.2

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DE LEVADURAS PARA ENSAYOS EN SOLUCIN DE REFERENCIA.

Se realiz un cultivo de levadura S. cerevisiae en caldo YPD, preparado con una mezcla de extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 2%, esterilizado en autoclave a 121 C por 20 minutos. Este medio lquido luego de la inoculacin con la levadura se incubo a 28 C con agitacin constante durante 24 horas. Al final del perodo de incubacin el nmero de clulas alcanz los 107 cel/mL. Luego se centrfugo a 9000 rpm por 15 minutos, el sobrenadante fue separado y las levaduras fueron resuspendidas en tampn KCl 0,1 M. La suspensin de levaduras usadas como muestra se prepar diluyndolas en el mismo tampn. Las muestras de levaduras fueron mantenidas en hielo hasta ser sometidas a los tratamientos que se indican en este trabajo.

V.3

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS DE LEVADURAS PARA ENSAYOS EN VINO.

Se utiliz vino tinto y blanco embotellado, marca 120 de via Santa Rita, de graduacin alcohlica 11,5 g/L. Debido a que la levadura ve dificultado su crecimiento en concentraciones alcohlicas superiores a 13 g/L, se debi destilar previamente el alcohol etlico. Adems, el vino fue filtrado a travs de una membrana de 0,45 m de poro para eliminar cualquier otro posible microorganismo. Para evaluar si los componentes propios del vino ejercan algn efecto sobre la viabilidad de las levaduras, se inoculo este medio con S. cerevisiae y se incub a 28 C durante 4 horas. Cada una hora se retir muestra del cultivo para determinar el nmero de clulas viables mediante plaqueo en superficie de agar YPD. Las muestras de vino incubadas con levaduras se mantuvieron en hielo para su posterior irradiacin ultrasnica.

23

V.4

ADAPTACIN FSICA DE LOS SISTEMAS ULTRASNICOS

El sistema de excitacin electrnico que se emplea en el experimento tiene una impedancia de salida de 50 y solo puede conectarse un elemento que sea resistivo. Como los transductores ultrasnicos que se emplean en este tipo de estudios, dadas sus caractersticas de diseo y materiales que lo conforman, presentan una carga reactiva de cara al sistema electrnico, es necesario adaptar elctricamente el dispositivo. Para ello se determina por medio de un analizador de impedancias Hewlett Packard 4194A (figura V.1) los parmetros elctricos del circuito equivalente que mejor modelan su comportamiento elctrico. Con estos parmetros se calcula, mediante la ecuacin V.1, la inductancia que se conectara en paralelo al sistema transductor cmara de cavitacin para eliminar la capacidad interelectrdica de este. Adems el valor de la impedancia del sistema completo se emplea para disear y construir un transformador de impedancias que constituya una red de adaptacin de dos puertos presentando en la entrada una impedancia de 50 y por la salida la impedancia del dispositivo.

Ecuacin V.1: Donde:

L= [4 x 2 x f2 * Cb]-1

L : Impedancia del transductor piezoelctrico (mH.) f : Frecuencia del transductor (Hz.) Cb: Condensador o capacitor (nF.)

Figura V.4. Analizador de impedancia Hewlett Packard Modelo 4194 A.

24

Generador de potencia Adaptador de impedancia Medidor de potencia Transductor piezoelctrico

Figura V.5.

Montaje del sistema ultrasnico. El generador de potencia, responsable de la energa

necesaria para producir cavitacin acstica, se conecta a un medidor de potencia analgico. Por otra parte el adaptador de impedancia, el cual impide que se refleje la energa que entrega el generador, se conectan en forma paralela al transductor piezoelctrico tipo bocina cnica, este ltimo se sita en la superficie del lquido que est contenido en un vaso precipitado.

Finalmente, el sistema se instal como se muestra en la figura V.2. Se emple un generador ultrasnico de potencia con una capacidad mxima de 500 Watts marca CSIC modelo LC-9601, ste se conect a un medidor de potencia analgico marca ENI EMB modelo 2K 250. Adems se utiliz un adaptador de impedancia el que finalmente se conect con el transductor piezoelctrico correspondiente.

25

V.5

ENSAYOS ULTRASNICOS

Todas las experiencias de aplicacin de ultrasonidos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Ultrasonidos de la Facultad de Ciencia de la Universidad de Santiago de Chile.

V.5.1 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada.

Primero, se revisaron las condiciones de trabajo del transductor piezoelctrico y se procedi a la adaptacin fsica del sistema, tal como se indica en el punto V.4. Luego, se prepar una suspensin de levaduras en medio KCl 0,1 M, como se describe en el punto V.2, y se vaci 5 mL de sta en 12 tubos de ensayo de 20 mL de capacidad. Las 12 muestras de levaduras se cavitaron segn las combinaciones entregadas por el diseo experimental 22 (Tabla V.1). Para estudiar el diseo experimental 32 se prepararon 14 tubos de ensayo con 5 mL de suspensin de levaduras. Las combinaciones de tiempo y potencia de cavitacin se muestran en la tabla V.2. Para realizar la cavitacin, se introdujo el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada en los tubos de ensayo y se sumergi 2 mm. dentro de las muestra de levaduras. El montaje del sistema se ilustra en la figura V.3. Con un termmetro de mercurio se midi la temperatura de cada muestra antes y despus de la irradiacin ultrasnica. Luego de cavitar las muestras de levaduras en tampn KCl 0,1M, se realiz el mismo experimento con levaduras en vino tinto y vino blanco. Las muestras de levaduras en vino fueron preparadas como se indica en el punto V.3.

26

Figura V.6. Sistema ultrasnico con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada. La fotografa muestra el generador de potencia ultrasnico (atrs) y el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada (al frente) inserto en un tubo de ensayo de 20 mL de capacidad con 5 mL de suspensin de levaduras. La flecha indica la inmersin del transductor en el lquido.

V.5.3 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica.

Se adapt el sistema ultrasnico como se indica en el punto V.4. Se prepar una suspensin de levaduras S. cerevisiae en tampn KCl 0,1 M, como se explica en el punto V.2. De sta se agregaron 200 mL a un vaso precipitado de 250 mL de capacidad y se midi su temperatura inicial. Luego, se introdujo el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica en el vaso precipitado hasta sumergir 2 mm. de ste en la suspensin de levaduras, como se muestra en la figura V.4, y se aplic ultrasonidos utilizando una potencia de 10 W durante 15 minutos. Se trabaj en un rango de frecuencia de 15 20 kHz. Terminada la cavitacin ultrasnica se midi la temperatura final de la muestra. El procedimiento anterior tambin se llev a cabo con potencias de 20, 40 y 60 W. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.

27

Figura V.7. Sistema ultrasnico con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica. En la fotografa se aprecia la conexin en paralelo entre el adaptador de impedancia y el medidor de potencia. El vaso precipitado de 250 mL de capacidad contiene 200 mL de suspensin de levaduras y el transductor se sumerge aproximadamente 2 milmetros.

V.5.4 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica, empleando sistema de agitacin.

Se prepar una suspensin de levaduras S. cerevisiae en tampn KCl 0,1 M como se indica en el punto V.2. Se adapt el transductor piezoelctrico como se indica en el punto V.4 y se introdujo en la suspensin de levaduras hasta quedar sumergido 2 mm. Bajo el vaso precipitado se coloc un agitador magntico Heidoph MR 3001 K (figura V.5). La cavitacin se llev a cabo de la siguiente forma: 200 mL de suspensin de levadura utilizando agitacin durante la cavitacin, 100 mL de suspensin de levaduras sin agitacin durante la cavitacin y 100 mL de suspensin de levaduras con agitacin. Se utiliz una potencia de 40 W durante 15 minutos. La temperatura de cada muestra antes y despus de ser sometidas a los ultrasonidos se midi con termmetro de mercurio.

28

Figura V.8. Sistema ultrasnico con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica y sistema de agitacin. La fotografa muestra un agitador magntico inserto en el vaso precipitado de 250 mL de capacidad con 200 mL de suspensin de levaduras. El transductor se sumerge aproximadamente 2 milmetros en el lquido.

Para ensayar el diseo experimental 22, propuesto en el punto V.1 se prepar una suspensin de levaduras en tampn KCl 0,1 M, como se indica en el punto V.2 y se vaci 100 mL de sta en un vaso precipitado de 500 mL (figura V.6). Se prepararon 12 vasos con 100 mL de muestra y se cavitaron sin agitacin segn el diseo experimental (Tabla V.1). Al igual que en los ensayos anteriores, la temperatura de las muestras se midi antes y despus de cada irradiacin ultrasnica, por medio de un termmetro de mercurio. Con ste mismo sistema se cavitaron muestras de 100 mL de vino tinto y vino blanco a una potencia de 58 W durante 23 minutos.

Figura V.9. Sistema ultrasnico con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica. La fotografa muestra la insercin del transductor en un vaso precipitado de 500 mL de capacidad con 100 mL de vino tinto. Al igual que en los sistemas anteriores la conexin entre el medidor de potencia y el adaptador de impedancia es en paralelo.

29

V.6

RECUENTO DE CLULAS SOBREVIVIENTES

El porcentaje de levaduras sobrevivientes se determin mediante plaqueo en superficie, en agar YPD. Se usaron dos placas para cada dilucin (10-3, 10-4 y 10-5) y se incubaron a 28 C durante 48 horas. Una muestra de la suspensin inicial de levaduras, preparada como se indica en el punto V.2, fue plaqueada antes de iniciar los ensayos , con el fin de conocer el nmero inicial de clulas viables existentes al tiempo cero (100% de sobrevida). El porcentaje de sobrevida se obtuvo relacionando la cantidad de levaduras al tiempo cero con los recuentos obtenidos despus de las irradiaciones ultrasnicas. En los resultados de sobrevida se consider la dilucin en la que sus dos placas contenan un nmero similar de unidades formadoras de colonias (UFC) y adems se encontraban homogneamente distribuidas.

V.7

MEDICIN DEL CAMPO ACSTICO

Se implement un recipiente de PVC con 600 mL de agua destilada en el que se coloc el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica por el fondo y se introdujo en el centro de la superficie del lquido una sonda de PVDF (Fluoruro de polivinilo) calibrada (figura V.7). La sonda se conect a un osciloscopio Tektronik TDS 320 que registr las variaciones de frecuencia que ocurran al ir variando la potencia y entreg la seal medida como el promedio de amplitud de las ondas (mV). El osciloscopio se conect a un computador a travs de una tarjeta de conexin. Los datos fueron registrados en computador por medio de un software diseado en QBASIC que se program para registrar las mediciones cada 5 segundos durante 2 minutos. Luego, con el valor de la calibracin de la sonda se calcul la presin acstica (atm) en el lquido. La medicin se realiz para 10, 20, 30, 40, 50 y 60 Watts de potencia.

30

Sonda
PC

Generador de potencia

Osciloscopio

Transductor Medidor de potencia Adaptador de impedancia

Figura V.10.

Montaje del sistema para la medicin del campo acstico actuante. El generador de

potencia ultrasnico se conecta con el medidor de potencia y este ltimo, al igual que el adaptador de impedancia, con el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica. En la superficie del lquido se sita una sonda conectada a un osciloscopio que mide la diferencia de voltaje en mV. Por ultimo, a travs de una tarjeta especial, se conecta el osciloscopio con un computador que registra los datos.

V.8

MORFOLOGA DE LAS CLULAS IRRADIADAS.

Se tom con una micropipeta una muestra de suspensin de levadura irradiada y se coloc en un portaobjeto, luego se adicion una gota de azul de algodn y se tap con un cubre objeto. El portaobjeto se llev a un microscopio ptico acoplado con una cmara digital Nikon Coolpix 4500 y se obtuvo la microfotografa. El mismo procedimiento se realiz con una muestra de levadura sin irradiar.

31

V.9

ANLISIS ESTADSTICO DE LOS DATOS

Los datos recopilados de las pruebas donde se empleo el diseo experimental, se analizaron con el software estadstico STATGRAPHICS 4.0 PLUS. Mediante ste se obtuvo el punto ptimo de destruccin celular, en cuanto a tiempo y potencia de exposicin a la radiacin ultrasnica, adems de los grficos de efectos principales.

V.10 ANLISIS QUMICOS

V.9.1 Determinacin de la acidez total La acidez total se determin mediante potenciometra. Los resultados fueron expresados como (g/L) de cido sulfrico y (g/L) de cido tartrico (Bourdeau y Scarpa, 1998).

V.10.3 Determinacin de la acidez voltil La acidez voltil se determin segn el mtodo Blarez. Los resultados se expresaron como (g/L) de cido actico (Bourdeau y Scarpa, 1998).

V.10.4 Determinacin del pH El pH se midi mediante pHmetro digital marca HANNNA modelo 200.

V.11

ANLISIS FSICOS

V.10.1 Determinacin de la densidad La densidad se determin utilizando un picnmetro y se expres en (g/mL). Las mediciones se realizaron a 20 C.

32

V.11.3

Determinacin de la viscosidad

La viscosidad se determin utilizando un viscosmetro capilar de vidrio y se expres en (Kg/m*s).

V.11.4

Determinacin de la tensin superficial

La tensin superficial se determin por medio del mtodo del anillo, para lo cual se emple un tensimetro DuNouy (figura V.8). El equipo se calibr con anterioridad a la medicin de acuerdo al procedimiento establecido en el manual del equipo, norma internacional CSC N 70535. Para ello el instrumento se situ en una superficie lisa (a) y se nivel por medio de los tornillos de ajuste de nivel (g). La limpieza del anillo (c) se hizo con acetona y el recipiente donde se coloc la muestra (placa petri) con agua destilada y acetona. La muestra de vino se coloc en la placa petri, cubriendo aproximadamente hasta dos tercios de su altura. Luego, por medio del tornillo de ajuste de la base de la muestra (f) y del brazo que sujeta al anillo (b), se centr el anillo en la placa y se sumergi unos 5 mm en el lquido. Manteniendo el ndice en lnea, se comenz a levantar el anillo mediante (h) y al mismo tiempo se baj la muestra con el tornillo (i) hasta que el anillo quebr la pelcula de lquido. Finalizado este proceso se ley en el dinammetro (e) la medida de la tensin superficial aparente de la muestra, la que se reemplaz en la ecuacin V.2 para obtener la tensin superficial real.

Ecuacin V.2.

F = 1,084 + 0,000333 [P/(D-d)]

Donde: F : Tensin superficial real (dinas/cm). P : Tensin superficial aparente (dinas/cm). D : Densidad del liquido (g/cm3). d : Densidad del aire saturado (g/cm3).

33

Figura V.11. Tensimetro DuNouy. Este equipo consta de una base metlica (a) en la cual se sostienen todos los componentes: el brazo que sujeta el anillo (b), el anillo de platino-iridio (c), la base que sostiene la muestra (d) y el dinammetro que mide la fuerza aplicada para levantar el anillo (e). Adems de los tornillos de ajuste de la muestra (f), base (g) y movimiento del anillo (h, i).

V.11.5 Determinacin de la intensidad colorante (IC) La intensidad colorante se determin mediante espectrofotometra. Las muestras de vino se filtraron a travs de una membrana de 0,45 m y se colocaron en cubetas de vidrio de 1 cm. Para vino tinto se midi la absorbancia (A) a 420, 520 y 620 nm, y para vino blanco se midi a 420 nm. Se us agua destilada como blanco. Con los valores obtenidos se calcul la intensidad colorante segn las siguientes ecuaciones:

Ecuacin V.3 Ecuacin V.4

IC vino blanco = A 420 IC vino tinto = A 420 + A 520 + A 620

Adems, se grafic el espectro de absorcin de las muestras de vino (cavitadas y no cavitadas) con el objeto de determinar el punto en que presentaban la absorcin mxima y comparar los resultados antes y despus de la cavitacin (Bourdeau y Scarpa, 1998). Para las muestras de vino blanco se realiz un barrido de absorcin entre 300 y 500 nm; ya que, los pigmentos taninos (amarillos) presentan mayor absorcin a 420 nm. Para las muestras de vino tinto se realiz el barrido de absorcin entre 300 y 800 nm para abarcar los pigmentos

34

antocianos (azules) y flavonoides (rojos) que presentan una mayor absorcin a 520 y 620 nm, respectivamente. Todas las mediciones se realizaron por duplicado.

V.12 EVALUACIN SENSORIAL

La evaluacin sensorial se realiz en el Edificio de Alimentos de la Universidad de Santiago de Chile y el grupo evaluador estuvo conformado por funcionarios y estudiantes del mismo. Para realizar la evaluacin sensorial con jueces que presentasen algn grado de sensibilidad olfativa y degustativa, primero, se pre-seleccion a 20 personas que bebiesen vino regularmente y se les aplic una prueba triangular. La prueba triangular es una prueba discriminativa en la que se desea conocer si la persona encuentra diferencia entre dos o ms muestras. Consiste en colocar tres muestras ante la persona, dos de las cuales son iguales y una es diferente, y solicitarle que indique cal es la muestra diferente (Anzalda, 1994). La interpretacin de los resultados se llev a cabo mediante tabla. En la tabla se encuentra, para el nmero de jueces que participan en la prueba, el nmero mnimo de respuestas correctas para establecer si existe diferencia significativa entre las muestras (anexo X.1). Para la prueba triangular se escogieron dos vinos de cepas distintas, pero de igual marca y calidad (merlot y syrah de la lnea Len de Tarapac Gold), los que son muy similares en apariencia, sabor y aroma. De las 20 personas evaluadas se seleccion a 12 de ellas, que fueron las personas capaces de detectar diferencia entre las muestras, ya sea, por sabor o por aroma. Por lo tanto, el panel catador qued integrado finalmente por 12 jueces. Para determinar si existan diferencias significativas entre las muestras de vino cavitado y no cavitado, se realiz nuevamente una prueba triangular, en la que se utilizaron muestras de vino tinto cavitado y no cavitado y se solicit a los 12 jueces seleccionados que identificasen la muestra diferente. Lo mismo se hizo para determinar si existan diferencias entre el vino blanco cavitado y no cavitado.

35

V.13 ENSAYOS ULTRASNICOS COMPLEMENTARIOS

V.11.1 Bao ultrasnico

Se prepar una suspensin de levaduras en tampn KCl 0,1 M (punto V.2) y se coloc 50 mL de sta suspensin en vasos precipitados de 250 mL. Al bao ultrasnico (figura V.9) se le adicion agua hasta una altura de 3,2 cm y se introdujo 3 vasos precipitados con muestras de levadura; luego, se encendi el equipo para comenzar la irradiacin de las levaduras. La primera muestra se mantuvo irradiando durante 5 minutos y luego se retir; la segunda muestra se retir a los 12,5 minutos y el tercer vaso con muestra se retir a los 20 minutos de irradiacin. A todas las muestras se les midi la temperatura antes y despus de la irradiacin ultrasnica. Para determinar la sobrevida de las muestras tratadas, se realiz un recuento en placa, tal como se describe en el punto V.6. La experiencia con el bao ultrasnico se realiz por duplicado.

Figura V.12. Bao ultrasnico. En este sistema la cavitacin se produce debido a que las paredes del equipo vibran, por lo que los ultrasonidos se irradian hacia las muestras en todas direcciones, excepto por arriba generando un campo acstico difuso.

36

V.13.3 Celda ultrasnica

Para la adaptacin del sistema, la celda ultrasnica (figura V.10) se llen con 800 mL de agua destilada y se analizaron los parmetros fsicos de cada transductor para luego obtener la inductancia de cada uno por medio de la ecuacin V.1. Para medir el campo acstico que se gener debido a la irradiacin de ambos transductores, se realiz un barrido de voltaje RMS dentro de la celda ultrasnica, pasando por el interior del vaso precipitado. Para esto se coloc una sonda calibrada dentro de la celda y se registr el voltaje cada 5 mm de distancia. Con el valor de la calibracin de la sonda se determin el nivel de presin acstica dentro de la celda. Se prepararon 6 vasos precipitados de 250 mL con 200 mL de suspensin de levaduras tampn KCl 0,1M. La cavitacin se llev a cabo durante 15 minutos con una potencia de 40 W para cada muestra. Al igual que en los casos anteriores, la temperatura se midi antes y despus del proceso ultrasnico y la sobrevida celular se determin mediante recuento en placa (punto V.6).

Figura V.13.

Celda ultrasnica con muestras de 200 mL. Este sistema se compone de dos

transductores piezoelctricos que generan ultrasonidos hacia una celda de 1.331 cm 3, la cual se llena con agua y se coloca en su interior la muestra a irradiar

37

VI. RESULTADOS

VI.1 ENSAYOS ULTRASNICOS

VI.1.1 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada VI.1.1.1 Diseo experimental 22

Como se mencion en el capitulo anterior, se realizaron dos diseos experimentales para determinar que efecto tienen las variables, tiempo de tratamiento y potencia de cavitacin, sobre la sobrevida celular y descubrir si estas variables interaccionan entre ellas (Montgomery, 1991). Esto permiti obtener la informacin con el mnimo nmero de experimentos y con la menor incertidumbre posible, ya que los errores aleatorios de las respuestas se promediaron. Como uno de los objetivos de esta tesis fue la inhibicin microbiana, se emple, para generar cavitacin acstica, en una primera instancia, un transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada bajo las combinaciones (tiempo y potencia) entregadas por el diseo experimental 22 (Tabla V.1). Con el objeto de impedir una prdida de energa en el sistema se realiz en agua destilada una lectura de las variables fsicas del transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada. Las medidas de estas variables se muestran en la Tabla VI.1. Por medio de la ecuacin V.1 se calcul la inductancia (L) y se acopl al sistema, por medio de un adaptador de impedancia.

Tabla VI.4. Parmetros fsicos del ensayo con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada utilizando diseo experimental 22. Parmetro Rango de frecuencia Fo Z Circuito equivalente R L Ca Cb L calculado Valor 21.500-22.000 Hz. 21.708,75 Hz. 60 56,851 433,107 mH. 124,093 pF. 11,048 nF. 4,9 mH.

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Luego de la adaptacin fsica se realiz la irradiacin ultrasnica a 12 muestras de 5 mL cada una de una suspensin de levaduras en tampn KCl, en vino tinto y vino blanco, inicialmente y como se conoca de estudios anteriores que el fenmeno de cavitacin acstica conlleva una variacin de temperatura (Kuldiloke, 2002), se midi esta respuesta antes y despus de la irradiacin. Estos resultados se aprecian en el grfico VI.1 y se observa que a mayores tiempos de exposicin y potencia aplicada, el incremento de temperatura es mayor, existiendo una mayor dependencia con la potencia aplicada. La desviacin estndar de las combinaciones se realiz por medio de los resultados del punto central (30 Watts y 12,5 minutos), debido a que ste se repiti 3 veces.

Grfico VI.1. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas empleando transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada y combinaciones segn diseo experimental 22.
26 24 22 20 Temperatura (C) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1,7/12,5 10/5 10/20 30/1,8 30/12,5 30/23 50/5 50/20 58/12,5 Potencia(W) / Tiem po (m in)

Levaduras en tampn KCl Levaduras en vino tinto bajo en alcohol Levaduras en vino blanco bajo en alcohol

Los resultados de la sobrevida celular (en las tres matrices ensayadas) obtenidos con el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada y las combinaciones del diseo experimental 22 se muestran en el grfico VI.2. En ste se observ, al igual que con la temperatura, que la sobrevida celular disminuye al aumentar el tiempo de exposicin y la potencia aplicada. Cabe destacar, que para el ensayo con vino blanco, la inhibicin celular alcanz un 99,9 % en la

39

combinacin de 58 Watts y 12,5 minutos. La desviacin estndar de las distintas combinaciones se obtuvo por medio del resultado del punto central.

Grfico VI.2. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar las muestras de levadura, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada y segn las combinaciones del diseo experimental 22.
7,0%
6,243%

6,0% 5,0% Sobrevida (%)

4,1 62%

5,376% 4,467% 3,800%

4,0%
3,1 33%

3,0% 2,0%
1 ,1 79% 1 ,474% 0,607% 0,787% 0,1 64% 0,1 1 0% 0,739% 0,1 1 3% 0,067% 0,087% 0,01 5% 0,008% 0,936% 0,393% 0,268%

1,0% 0,0% 1,7/12,5

0,053% 0,009% 0,006%

0,1 84% 0,005% 0,01 1 %

10/5

10/20

30/1,8 30/12,5 30/23 50/5 Potencia(W) / Tiem po (m in)

50/20

58/12,5

Levaduras en tampn KCl Levaduras en vino tinto bajo en alcohol Levaduras en vino blanco bajo en alcohol

Con los datos de sobrevida celular se construy, mediante el programa STATGRAPHICS 4.0 PLUS, el grfico de superficie de respuesta para los tres ensayos realizados. Debido a que la respuesta fue similar se muestra a modo de ejemplo la superficie de respuesta del ensayo ultrasnico en suspensin de levaduras en tampn KCl (grfico VI.3). Este grfico representa en tres dimensiones las variables tiempo, potencia y porcentaje de sobrevida celular, generando un manto en el cual el pico cncavo representa las condiciones ptimas para la mxima inhibicin celular. En todos los anlisis estadsticos desarrollados, se consider un nivel de confianza de 95%.

40

Grfico VI.3. Grfico de superficie de respuesta de la sobrevida celular obtenida con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada, utilizando combinaciones segn diseo experimental 22.

Sobrevida (%)

1,4 1 0,6 0,2 -0,2 0 10 11 14 17 20

20

30

40

50

Tiempo (min)

Potencia (W)

Utilizando las herramientas disponibles en el programa estadstico, se obtuvo las condiciones ptimas para la mnima sobrevida celular. Estas combinaciones ptimas de tiempo y potencia (para los tres ensayos) se muestran en la tabla VI.2. El promedio obtenido de las tres combinaciones fue de 16,3 2,3 minutos y 42,0 2,0 Watts.

Tabla VI.5. Condiciones ptimas de tiempo y potencia segn grfico de superficie de respuesta del diseo experimental 22 para obtener la mnima sobrevida. Tiempo ptimo 19 min. 15 min. 15 min. Potencia ptima 40 W 42 W 44 W

Ensayo en tampn KCl Ensayo en vino tinto bajo en alcohol Ensayo en vino blanco bajo en alcohol

41

VI.1.1.2 Diseo experimental 32

Con el objeto de justificar el uso de un modelo experimental simple (2 2), se compararon los resultados de ste con los obtenidos en un diseo experimental ms complejo, el 32. Este ltimo presenta un mayor nmero de experiencias y una mayor dificultad al momento de analizar estadsticamente los datos. Para este efecto se utiliz el mismo transductor del ensayo anterior (punto VI.1.2.1), la diferencia radic en el nmero de experimentos (14) y las combinaciones de tiempo y potencia. Al igual que en el ensayo anterior se realiz, primeramente, una adaptacin fsica del transductor piezoelctrico. Las medidas de las variables involucradas se muestran en la tabla VI.3. La inductancia (L) calculada por medio de la ecuacin V.1 fue prcticamente igual a la obtenida antes. El valor ms heterogneo fue el de la impedancia (Z), lo que se debe a los conductores usados (cables de conexin), y a la dificultad que present colocar el transductor en la misma posicin.

Tabla VI.6. Parmetros fsicos del ensayo con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada utilizando diseo experimental 32. Parmetro Rango de frecuencia Fo Z Circuito equivalente R L Ca Cb L calculado Valor 21.500-22.000 Hz. 21.790,00 Hz. 87,0378 85,3249 409,178 mH. 130,376 pF. 10,5755 nF. 5,04 mH.

La irradiacin ultrasnica se realiz nicamente a 14 muestras, cada una de 5 mL, de suspensin de levaduras en tampn KCl y segn la combinacin de tiempo potencia del diseo experimental 32 (Tabla V.2). Al igual que en el ensayo anterior, la temperatura se midi antes y despus de la exposicin a los ultrasonidos. Los resultados de la variacin de temperatura se muestran en el grfico VI.4. Aqu se observa nuevamente una mayor variacin de la temperatura al aumentar la potencia de aplicacin, mayor al obtenido con respecto al tiempo de tratamiento.

42

Grfico VI.4. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas empleando transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada y combinaciones segn diseo experimental 32.

30 25 Temperatura (C) 20 15 10 5 0 10/5 10/12,5 10/20 30/5 30/12,5 30/20 50/5 50/12,5 50/20 Potencia (W) / Tiem po (m in) Levaduras en tampn KCl

En cuanto a sobrevida celular los resultados se muestran en el grfico VI.5. En ste se aprecia claramente una disminucin de la sobrevida celular al aumentar la potencia de aplicacin. Para potencias de aplicacin de 10 a 50 Watts la sobrevida disminuye en un 99,85 % al exponer la suspensin durante 20 minutos y 89,45% para una exposicin de 5 minutos.

Grfico VI.5. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar las muestras de levadura, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada y segn las combinaciones del diseo experimental 32.
12% 9% Sobrevida (%) 6% 3% 0% 10/5 10/12,5 10/20 30/5 30/12,5 30/20 50/5 50/12,5 50/20 Potencia (W) / Tiempo (min) Levaduras en tampn KCl

8,44% 5,31% 6,70% 4,64% 1,93% 0,89% 0,07% 0,01% 4,78%

43

Al igual que en el diseo experimental 22, se construy para los resultados de sobrevida del modelo 32, un grfico de superficie de respuesta para obtener las condiciones ptimas de inhibicin celular (grfico VI.6).

Grfico VI.6. Grfico de superficie de respuesta de la sobrevida celular obtenida con transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada, utilizando combinaciones segn diseo experimental 32.

13 10 Sobrevida (%) 7 4 1 -2 0 10 20 Potencia (W) 30 5 8 11 14 17 20

40

50

Tiempo (min)

La combinacin ptima de inhibicin celular se muestra en la tabla VI.4. Esta combinacin es similar a la obtenida en el ensayo con suspensin de levaduras realizado con el diseo experimental 22. De esta manera se corrobor que ambos diseos experimentales eran factibles para la respuesta sobrevida celular, por lo que se opt por el primer modelo para los ensayos posteriores. Tabla VI.7. Condiciones ptimas de tiempo y potencia segn grfico de superficie de respuesta del diseo experimental 32 para obtener la mnima sobrevida. Tiempo ptimo 12 min. Potencia ptima 50 W

Ensayo en tampn KCl

44

VI.1.2 Cavitacin acstica con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica.

Para estudiar el efecto de la cavitacin acstica en vino se necesit irradiar volmenes mayores. Por este motivo se debi cambiar el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada por un transductor piezoelctrico tipo bocina cnica, ya que el primero fue adecuado para cavitar pequeos volmenes (5 mL), insuficiente para los anlisis qumicos, fsicos y sensoriales. Cabe destacar que el transductor piezoelectrico tipo bocina cnica presentaba un mayor dimetro y por ende una mayor superficie de irradiacin (Ensminger, 1964).

VI.1.2.1 Cavitacin con 200 mL de suspensin de levaduras

Debido a que la efectividad del sistema ultrasnico, en cuanto a inhibicin microbiana, depende necesariamente de sus parmetros fsicos, se realiz, de igual manera que los ensayos anteriores, una adaptacin fsica. Para ello se midieron las variables fsicas en agua destilada (tabla VI.5). La principal diferencia que se observ, con respecto a los ensayos con el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada, fue el rango de frecuencia ingresado. ste fue ms amplio, ya que la frecuencia de resonancia del transductor se encontraba dentro de ese rango.

Tabla VI.8. Parmetros fsicos para la adaptacin del sistema ultrasnico, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 200 mL de muestra. Parmetro Rango de frecuencia Fo Z Circuito equivalente R L Ca Cb L calculado Valor 15.000 - 21.000 Hz. 16.762,5 Hz. 21.2 21,200 29,037 mH. 3,106 nF. 16,289 nF. 5,5 mH.

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La cavitacin acstica se aplic a muestras de 200 mL de suspensin de levaduras en tampn KCl. El tiempo de exposicin a los ultrasonidos fue de 15 minutos y se emple un rango de potencia de 10 a 60 Watts con el objeto tener valores similares a los entregados por el modelo 22. La temperatura se midi antes y despus de la irradiacin y sus resultados se muestran en el grfico VI.7. Como en los casos anteriores, en este grfico se observa que la temperatura aumenta al incrementar la potencia de aplicacin, siendo este aumento de aproximadamente un 31% al aplicar potencias de 10 a 60 Watts. Cada ensayo se repiti 2 veces y a partir de estos resultados se obtuvo la desviacin estndar.

Grfico VI.7. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 200 mL de muestra.

42 40 38 36 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 10 20 Potencia (W) 40 60

Levaduras en tampn KCl

Los resultados para la inhibicin microbiana se observan en el grfico VI.8. Estos valores se encuentran sobre el 25% de sobrevida y no muestran una tendencia consecuente a la potencia aplicada, ya que la sobrevida no disminuye al aumentar la potencia.

Temperatura (C)

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Grfico VI.8. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar las muestras de levadura, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 200 mL de muestra.
60% 50% 40% Sobrevida (%) 30% 20% 10% 0% 10 Levaduras en tampn KCl 20 Potencia (W) 40 60

VI.1.2.2 Cavitacin empleando agitacin.

Se continu ensayando con distintos volmenes de muestras, incluyendo adems, la agitacin de estas durante la cavitacin acstica, como una manera que la irradiacin ultrasnica afectara a todas las clulas. Se emple el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica en conjunto con un agitador magntico en donde se colocaron las muestras. La adaptacin del transductor se realiz nuevamente, igual que en el ensayo anterior (punto VI.1.2.1), ya que los parmetros fsicos varan al modificar las condiciones del sistema. Las medidas de estas variables se muestran en la tabla VI.6 donde se aprecia que la mayor variacin la presenta la impedancia (Z). Esta diferencia es de un 37% con respeto al ensayo anterior (punto VI.1.2.1), atribuyndose principalmente al movimiento del agua durante la lectura (producto del agitador).

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Tabla VI.9. Parmetros fsicos para la adaptacin del sistema ultrasnico, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica y sistema de agitacin. Parmetro Rango de frecuencia Fo Z Circuito equivalente R L Ca Cb L calculado Valor 15.000 20.000 Hz. 16.525,0 Hz. 7,82 7,897 26,988 mH. 3,435 nF. 16,390 nF. 5,7 mH.

La cavitacin acstica se realiz de la siguiente forma: 1 muestra de 100 mL con y sin agitacin; y una muestra de 200 mL con y sin agitacin. Cada ensayo se repiti 2 veces para calcular la desviacin estndar. El tiempo y potencia que se utiliz fue de 15 minutos y 40 Watts, respectivamente. Se decidi por estos valores, ya que se encontraban cercanos a las condiciones ptimas obtenidas en el modelo 22. La temperatura se midi antes y despus de la irradiacin y los resultados se encuentran en el grfico VI.9. En este grfico se observa un incremento mayor al utilizar menores volmenes, sin embargo la agitacin parece no disminuir este efecto, ya que para un volumen de 200 mL la diferencia es de 1 C y para un volumen de 100 mL sta es de aproximadamente 4 C.

Grfico VI.9. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica y sistema de agitacin.
60 50 Temperatura (C) 40 30 20 10 0 200 ml / agitado Levaduras en tampn KCl 200 ml / sin agitacin 100 ml / agitado Com binacin 100 ml / sin agitacin

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Los resultados de sobrevida celular de este ensayo se observan en el grfico VI.10. Para el volumen de 200 mL se apreci una diferencia de aproximadamente 13% de sobrevida entre las muestras agitadas y no agitadas. Y el doble de esta cifra (26 %) para el volumen de 100 mL, encontrndose en este ultimo la menor sobrevida celular.

Grfico VI.10. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar las muestras de levadura, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica y sistema de agitacin.

70% 60% 50% Sobrevida (%) 40% 30% 20% 10% 0% 200 ml / agitado 200 ml / sin agitacin 100 ml / agitado Com binacin 100 ml / sin agitacin

Levaduras en tampn KCl

VI.1.2.3 Cavitacin con 100 mL de suspensin de levaduras

De los ensayos anteriores result que el menor porcentaje de sobrevida celular se consigui con el sistema sin agitacin y con un volumen de muestra de 100 mL. Por lo tanto se ensayo este sistema con las combinaciones de tiempo y potencia del diseo experimental 2 2 (Tabla V.1). Si bien se utiliz el mismo transductor anterior (piezoelctrico tipo bocina cnica), se procedi a adaptar nuevamente el sistema. Para lo cual se realiz la lectura de las variables fsicas del instrumento (transductor), esto debido a que en este ensayo se emple un recipiente distinto (vaso precipitado de 500 mL de capacidad). La lectura se realiz con agua destilada (100 mL), simulando la suspensin de levaduras. Las medidas de estas variables se encuentran en la tabla VI.7. A diferencia de los ensayos anteriores con el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica existe una gran heterogeneidad

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en las lecturas, principalmente en cuanto a impedancia elctrica (Z) e Inductancia (L). La inductancia del transductor (L calculada) difiere de la lectura anterior (punto VI.1.2.2) en 2 mH.

Tabla VI.10. Parmetros fsicos para la adaptacin del sistema ultrasnico, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra. Parmetro Rango de frecuencia Fo Z Circuito equivalente R L Ca Cb L calculado Valor 16.000 21.000 Hz 16.762,5 Hz 22,2109 26,074 40,339 mH 2,229 nF 11,648 nF 7,7mH

Con este sistema, la cavitacin acstica se llev a cabo en muestras de 100 mL de suspensin de levaduras en tampn KCl, contenidas en vasos precipitados de 500 mL. Este cambio de recipiente se hizo, ya que permiti un mayor desplazamiento del transductor dentro de la muestra, impidiendo un acoplamiento mecnico entre el transductor y las paredes del vaso. El nmero de muestras irradiadas fueron 12, segn el diseo experimental 2 2. Aqu se incluye tres repeticiones de la combinacin 30 Watts y 12,5 minutos, equivalente al punto central, con el fin de calcular la desviacin estndar. Al igual que en todos los ensayos anteriores se midi la temperatura antes y despus de la exposicin a los ultrasonidos. El resultado de esta variacin se muestra en el grfico VI.11. En este grfico se observa un mayor incremento de la temperatura, por efecto de la cavitacin acstica, en las combinaciones que incluyen una potencia alta y un largo tiempo de exposicin. Ambas variables ejercen similar efecto.

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Grfico VI.11. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra.
60 50 Temperatura (C) 40 30 20 10 0 1,7/12,5 10/5 10/20 30/1,8 30/12,5 30/23 50/5 50/20 58/12,5 Potencia (W) / Tiem po (m in)

Levaduras en tampn KCl

En cuanto a sobrevida celular, los resultados se muestran en el grfico VI.12. De igual manera que en la temperatura, la sobrevida disminuye en las combinaciones de potencia y tiempos altos. Comparando los resultados con el ensayo empleando el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada, se observ una gran diferencia. A igual combinacin (50 Watts y 20 minutos) en el primero se obtiene una sobrevida de 0,006 %, sin embargo en este ltimo la sobrevida alcanza nicamente el 23%. Esto implicara que el tipo de transductor influye notablemente en los resultados obtenidos.

Grfico VI.12. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar las muestras de levadura, empleando transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra.

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120% 100% 80% Sobrevida (%) 60% 40% 20% 0% 1,7/12,5 10/5 10/20 30/1,8 30/12,5 30/23 50/5 50/20 58/12,5 Potencia (W) / Tiem po (min)

Levaduras en tampn KCl

Con los datos de sobrevida celular se construy un grfico de superficie de respuesta (grfico VI.13). El manto que se observa es convexo, a diferencia del obtenido con el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada, el cual fue cncavo. Este efecto se debe exclusivamente a la distribucin espacial de los datos y que en el primero la sobrevida cae de manera lineal con la potencia, en cambio en ste se aprecia una leve alza y luego el descenso.

Grfico VI.13. Grfico de superficie de respuesta de la sobrevida celular obtenida con transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra.

100 80 60 40 20 0 0

Sobrevida (%)

10 20 30 40 50 60 Potencia (W)

26 23 20 17 14 Tiempo (min) 11

Con la ayuda del software estadstico STATGRAPHICS 4.0 PLUS se optimizaron los datos del grfico anterior, con el objeto de encontrar la combinacin de tiempo y potencia adecuado para la mxima destruccin de clulas. El resultado que arroj fue el siguiente:

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Tiempo ptimo 23 min.

Potencia ptima 58 W

Al cavitar una muestra de levadura con esta combinacin se obtuvo un porcentaje de sobrevida de 0,29%. Al interpolar este valor en la ecuacin VI.1, entregada por el programa estadstico, se estim que este resultado correspondera aproximadamente a la combinacin: 50W y 23 minutos. Con este resultado se comprob que existe una diferencia de un 19% entre los resultados reales y los tericos, obtenidos a travs de la ecuacin VI.1.

Ecuacin VI.5. % Sobrevida = 34,2768+2,23326*P+4,30527*t 1,195297*10-2 * P2 1,0335 * 10-1 * P*t 0,147856*t2. Donde : P : Potencia (W) t : Tiempo (minutos)

Por otro lado, con el fin de observar independientemente la relacin entre las variables dependientes (tiempo y potencia) y la variable independiente (porcentaje de sobrevida) se elabor un grfico de efectos principales para esta ltima variable (grfico VI.14). En este grfico se distingue un leve aumento de la sobrevida al aumentar la potencia, el que luego desciende; en el caso del tiempo slo se observa una baja.

Grfico VI.14. Efectos principales de la sobrevida con respecto a la potencia y tiempo de exposicin en el ensayo con el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra.

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88 78 68 58 48 60,0 10,0 Potencia (w) 5,0 25,0 Tiempo (min)

Luego para conocer la relacin entre tiempo-potencia de aplicacin y la variacin de temperatura se construy el grfico de efectos principales para la temperatura (grfico VI.15).

Grfico VI.15. Efectos principales en la variacin de temperatura con respecto a la potencia y tiempo de exposicin en el ensayo con el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra.

Sobrevida (%)

38 Temperatura (C) 35 32 29 26 23 20
10,0 60,0 Potencia (W) 5,0 25,0 Tiempo (min)

De los grficos anteriores se desprende que la temperatura de las muestras que fueron cavitadas aument de manera lineal con respecto a la potencia y tiempo de aplicacin de

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ultrasonidos. En el caso de la potencia, en particular, este aumento de temperatura es menos pronunciado a potencias bajas (menores a 20 Watts) que a potencias altas. Para estudiar el comportamiento del campo acstico a distintas potencias, se midi la presin acstica generada con la conformacin del ltimo sistema ultrasnico ensayado. Las mediciones se llevaron a cabo con 600 mL de agua destilada, contenidos en un vaso precipitado de 1000 mL. Se introdujo una sonda de PVDF por arriba del recipiente, la cual midi los V generados al aplicar una potencia dada. Este voltaje se transform en presin acstica (atm), por medio de la sensibilidad de la sonda (169.314,075 V/atm). Los resultados de esta medicin se aprecian en el grfico VI.16.

Grfico VI.16. bocina cnica.

Estudio del campo acstico en el sistema con transductor piezoelctrico tipo

4,4 4 3,6 3,2 2,8 2,4 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0 10 20 30 40 50 60 Potencia (W)

Agua destilada

El grfico anterior indica que existe una relacin proporcional entre potencia aplicada y presin acstica. Adems, se observa que entre 30 y 50 Watts la presin acstica es muy similar, con slo una diferencia de aproximadamente 0.13 atm. En cambio entre 10 y 60 Watts esta diferencia aumenta a 2,15 atm.

Presin acstica (atm)

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VI.2 ANLISIS QUMICOS, FSICOS Y SENSORIALES Uno de los objetivos de esta tesis fue evaluar si el mtodo de irradiacin ultrasnica era eficaz en la reduccin de la carga microbiana del vino; as como observar si esta tcnica influye en la calidad qumica, fsica y sensorial del producto. Para esto se realiz una serie de anlisis descritos en el capitulo anterior (capitulo V), de manera de evaluar una posible utilizacin a nivel industrial de los ultrasonidos.

Con las condiciones ptimas obtenidas con el ltimo sistema ultrasnico (transductor piezoelctrico tipo bocina cnica inserto en 100 mL de muestra, sin agitacin) se llev a cabo la cavitacin ultrasnica de las muestras de vino tinto y vino blanco que luego fueron analizadas qumica, fsica y sensorialmente. Los resultados de estos anlisis para la irradiacin de vino tinto se muestran en la tabla VI.8. Tabla VI.11. Anlisis qumicos, fsicos y sensoriales realizados al vino tinto. Vino no cavitado Vino cavitado 3,03 0,02 (g/L) 4,63 0,03 (g/L)

Anlisis

Acidez total (cido sulfrico) 2,93 0,02 (g/L) Acidez total (cido tartrico) 4,48 0,03 (g/L)

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Acidez voltil (cido actico) pH Densidad Viscosidad Tensin superficial Intensidad colorante (IC) Evaluacin sensorial

0,53 0,01 (g/L) 3,77 0,00 0,990 0,000 (g/mL) 12,89 0,01 (Kg/m*s) 52,7 1,5 (dinas/cm) 8,165

0,53 0,00 (g/L) 3,72 0,00 0,992 0,000 (g/mL) 12,77 0,01 (Kg/m*s) 58,6 1,2 (dinas/cm.) 9,240 No existen diferencias

Se observa que el vino cavitado presenta diferencias mnimas con respecto al vino tinto que no ha sido tratado con ultrasonidos, lo que se corrobora con la evaluacin sensorial. La mayor diferencia se obtuvo en los anlisis de intensidad colorante con un 11,63 % entre el vino tinto no cavitado y el vino tinto cavitado. Como se sabe que el color del vino es un factor de suma importancia (Aguirre, 2001), siendo mayor en las cepas tintas. Se realiz un anlisis espectrofomtrico de las muestras de vino, antes y despus de ser irradiadas, con el fin de verificar si la cavitacin acstica influye en esta caracterstica. Estos resultados se muestran en la tabla VI.9. Estas grficas muestran un barrido de absorbancia, entre 300 y 800 nm, aqu se observa que su espectro de absorcin ptica es similar, adems, ambas muestras de vino presentan una absorbancia mxima a 514,5 nm.

Tabla VI.12. Comparacin de parmetros colorimtricos entre vino tinto cavitado y vino tinto no cavitado.

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No cavitado

Cavitado

Longitud de onda (nm) Absorbancia

Peak 514,5 0,485

Longitud de onda (nm) Absorbancia

Peak 514,5 0,469

De igual manera se realiz los anlisis qumicos, fsicos y sensoriales a muestras de vino blanco antes y despus de ser sometidas al tratamiento ultrasnico. Estos resultados se aprecian en la tabla VI.10. De estos resultados se desprende que el vino cavitado presenta diferencias mnimas con respecto al vino blanco que no ha sido tratado con ultrasonidos; sin embargo, la tensin superficial del vino blanco cavitado aument en un 10,07%. La evaluacin sensorial indic que las diferencias organolpticas entre ambos tipos de vino no son significativas.

Tabla VI.13. Anlisis qumicos y fsicos realizados al vino blanco. Anlisis Vino no cavitado Vino cavitado 3,86 0,02 (g/L) 5,91 0,03 (g/L) 0,41 0,01 (g/L)

Acidez total (cido sulfrico) 3,82 0,0 (g/L) Acidez total (cido tartrico) Acidez voltil (cido actico) 5,85 0,0 (g/L) 0,47 0,01 (g/L)

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pH Densidad Viscosidad Tensin superficial Intensidad colorante (IC) Evaluacin sensorial

3,16 0,00 0,998 0,000 (g/mL) 13,57 0,01 (Kg/m*s) 54,9 1,0 (dinas/cm) 0,082

3,16 0,01 0,992 0,000 (g/mL) 13,20 0,11 (Kg/m*s) 67,6 1,4 (dinas/cm) 0,082 No existen diferencias

La espectrofotometra realizada a las muestras de vino blanco, antes y despus del tratamiento ultrasnico, se muestran en la tabla VI.11. Los espectros muestran un barrido de absorbancia, entre 300 y 500 nm, adems se observa un espectro de absorcin ptica similar y una absorbancia mxima a 300 nm.

Tabla VI.14. Comparacin de parmetros colorimtricos entre vino blanco no cavitado y vino blanco cavitado.

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No cavitado

Cavitado

Longitud de onda (nm) Absorbancia

Peak 300 1,476

Longitud de onda (nm) Absorbancia

Peak 300 1,359

VI.3 MORFOLOGA CELULAR Con el fin de observar cambios en la morfologa de las clulas de levaduras despus de la irradiacin ultrasnica, se observaron muestras de la suspensin de levaduras antes y despus de la aplicacin de los ultrasonidos. Las microfotografas se muestran en la figura VI.1. En la microfotografa (a) se observa que las clulas de levadura se encuentran intactas, antes del tratamiento ultrasnico. Su contenido celular est completo y su forma es tpica a la de una

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clula levaduriforme viable, en cambio en la microfotografa (b) se observ una destruccin fsica de la clula efecto provocado por la cavitacin acstica (Mason y otros, 2003a). Clulas antes de la aplicacin del ultrasonido Objetivo: 40x (a) Clulas despus de la aplicacin del ultrasonido Objetivo: 40x (b)

Figura VI.14. Microfotografas de clulas de levaduras Saccharomyces cerevisiae, antes y despus de ser sometidas a los ultrasonidos. En (a) se observan clulas de levaduras antes del tratamiento ultrasnico, la pared celular est intacta con todo su citoplasma. (b) muestra clulas de levaduras despus del tratamiento ultrasnico, la pared celular est destruida y el citoplasma se ha perdido casi por completo.

VI.4 ENSAYOS ULTRASNICOS COMPLEMENTARIOS

Para complementar la investigacin se ensayaron dos sistemas ultrasnicos distintos: un bao ultrasnico y una celda ultrasnica, en donde el principio de destruccin en ambos son los efectos mecnicos provocados por la cavitacin acstica. Se ensay, al igual que en los

61

sistemas anteriores, con una suspensin de levadura y la cavitacin acstica se realiz como se detalla a continuacin:

VI.4.1 Bao ultrasnico

Este sistema no requiri de adaptacin fsica. La cavitacin acstica se realiz en muestras de 50 mL y durante un periodo de 20 minutos, entre el cual se extrajo muestras a 5 y 12.5 minutos. Los resultados de variacin de temperatura se muestran en el grfico VI.17. En ste se observ que el incremento de temperatura fue proporcional al tiempo de aplicacin de los ultrasonidos.

Grfico VI.17. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas empleando bao ultrasnico.

18 Temperatura (C) 15 12 9 6 3 0 5 Levaduras en tampn KCl 12,5 Tiem po (m in) 20

Los resultados de la sobrevida celular se aprecian en el grfico VI.18. En este grfico se observa que la sobrevida celular es baja, menor al 5% en los tres tiempos experimentados. As mismo, se desprende que el tiempo de tratamiento no influye en la inhibicin microbiana. Cabe destacar que la variabilidad fue mayor cuando se cavit durante 5 minutos.

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Grfico VI.18. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar las muestras de levadura en el bao ultrasnico, a distintos tiempos de exposicin.

8% 7% 6% Sobrevida (%) 5% 4% 3% 2% 1% 0% 5 Levaduras en tampn KCl 12,5 Tiem po (m in) 20

VI.4.2 Celda ultrasnica

Para llevar a cabo la adaptacin fsica de ste sistema se midieron los parmetros fsicos de sus dos transductores y, adems, se realiz un barrido de voltaje entre stos. La distancia entre ambos transductores era 110 mm y el vaso con la muestra a irradiar se encontraba entre los 20 y 90 mm.

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Los resultados de la lectura fsica se muestran en el grfico VI.19. Este grfico indica que la energa acstica (medida en mV) se concentra en los extremos de la celda ultrasnica, fuera del vaso precipitado. Para aumentar la energa en el centro de la celda ultrasnica y del vaso precipitado, se ajustaron los modos de vibracin de la celda mediante el desplazamiento de los dos transductores piezoelctricos laterales. La energa acstica aumenta levemente en el centro de la celda, pero se sigue concentrando en los extremos de sta.

Grfico VI.19. Valor del campo acstico en el interior de la celda ultrasnica, antes y despus de ajustar los modos de vibracin.

22,00 20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00
0 5 1 0 1 5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 1 00 1 05 1 1 0

RMS (mV)

Distancia (m m ) Despues del ajuste Antes del ajuste

Las medidas de las variables fsicas de ambos transductores que conforman la celda, se muestran en la tabla VI.12. Para la adaptacin elctrica del sistema se observa que ambos transductores requirieron un adaptador de impedancia con una inductancia similar, en cuanto a la impedancia elctrica la del primer transductor fue mayor a la del segundo en aproximadamente un 7 Ohms.

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Tabla VI.15. Parmetros fsicos de los transductores luego del ajuste de posicin en la celda. Parmetro Rango de frecuencia Fo Z Circuito equivalente R L Ca Cb L calculado Transductor 1 16.000 21.000 Hz. 17.037 Hz. 22 22,4901 26, 4175 mH. 3,29988 nF. 12,8347 nF. 6,81 mH. Transductor 2 16.000 21.000 Hz. 16.912 Hz. 14.57 14,5183 27,1916 mH. 3,25700 nF. 13,6855 nF. 6,47 mH.

En este ensayo la cavitacin acstica se realiz con muestras de 200 mL de suspensin de levaduras en tampn KCl, la potencia aplicada fue de 40 Watts y el tiempo de exposicin fue 15 minutos (combinacin cercana al ptimo de inhibicin microbiana entregado por el modelo 22). Los resultados de la variacin de temperatura se muestran en el grfico VI.20. Este grfico indica que el incremento de temperatura de las tres muestras cavitadas fue similar, de 23 a 24 C, indicando la homogeneidad de este sistema en cuanto a generacin de energa ultrasnica.

65

Grfico VI.20. Variacin en la temperatura de las muestras despus de ser irradiadas en la celda ultrasnica a 40 W durante 15 minutos.

27,0 24,0 21,0 Temperatura (C) 18,0 15,0 12,0 9,0 6,0 3,0 0,0 40/15 Levaduras en tampn KCl Potencia (W)/Tiem po (m in)

La sobrevida celular se muestra en el grfico VI.21. Aqu se distingue claramente una baja inhibicin microbiana, ya que, en promedio las levaduras sobrevivieron un 70,95 % despus de ser sometidas a tratamiento ultrasnico. Este resultado fue motivo suficiente para descartar este sistema de irradiacin ultrasnica.

Grfico VI.21. Porcentaje de sobrevida celular despus de irradiar tres muestras de levaduras empleando la celda ultrasnica

100% 90% 80% 70% Sobrevida (%) 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 40/15 Levaduras en tampn KCl Potencia (W)/ Tiempo (m in)

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VII. DISCUSIONES
VII.1 Sobrevida celular

A pesar de que es improbable lograr un 100% de inactivacin celular, s se lograron resultados de ms del 99,9% cuando se cavitaron suspensiones de levadura utilizando el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada; as por ejemplo, al cavitar una muestra de levadura en tampn KCl, aplicando 50 W durante 20 minutos, se obtuvo una sobrevida de 0,006% (grfico VI.2). Sin embargo, al utilizar el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica, el mejor resultado obtenido fue 23,060% de sobrevida (grfico VI.12), aplicando 50 W durante 20 minutos. En el primer caso la efectividad del sistema aport una reduccin de 4 ciclos logartmicos, ya que se comenz con una carga de 10 8 UFC/mL y se finaliz con 104 UFC/mL; mientras que con el segundo sistema la carga microbiana se redujo slo 1 ciclo logartmico, bajando de 107 UFC/mL a 106 UFC/mL, lo que implica que los resultados de destruccin microbiana dependen del tipo de transductor con el que se cavite y la conformacin del sistema. Todos los resultados de sobrevida celular obtenidos de las cavitaciones con el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada fueron menores al 10%. Esto se podra explicar porque con este transductor se utiliz un volumen pequeo (5 mL), lo que resulta en un incremento de la intensidad del ultrasonido entrante al sistema (Mason y otros, 2003b). Del grfico VI.11 de efectos principales de sobrevida, se desprende que la variable independiente que ejerce una mayor influencia en la destruccin de levaduras es el tiempo de irradiacin, ya que la relacin entre tiempo y porcentaje de sobrevida es inversamente proporcional; mientras que la relacin entre potencia y porcentaje de sobrevida es una curva semi-cncava.

67

De los sistemas ultrasnicos anexos que se estudiaron, se puede decir que el ms efectivo en la destruccin de levaduras fue el bao ultrasnico, ya que el porcentaje de sobrevida no super el 5%, no importando el tiempo de exposicin de las muestras a los ultrasonidos. La limitante en el equipo utilizado fue la imposibilidad de variar la potencia de cavitacin. Por otro lado, los ensayos realizados con la celda ultrasnica, conformada por dos transductores laterales, entregaron una sobrevida mnima de 57,86%, cuando se cavitaron las muestras a 40 W durante 15 minutos. Los resultados son similares a los obtenidos con el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica.

VII.2 Incremento de temperatura

Con respecto al incremento de temperatura apreciado en los distintos ensayos ultrasnicos, de los resultados obtenidos, se infiere que este aumento es mayor al aplicar mayores potencias acsticas. El incremento de temperatura, empleando el transductor piezoelctrico tipo bocina escalonada fue menor a 24 C, en todos los experimentos realizados utilizando las combinaciones de ambos diseos experimentales (22 y 32). Al emplear el transductor piezoelctrico tipo bocina cnica la temperatura aument hasta alcanzar aproximadamente los 50 C en aquellas combinaciones de tiempo y potencia alta. Con los resultados anteriores se comprob que la inhibicin de levaduras se debi principalmente al efecto de la cavitacin acstica y no a la temperatura, ya que los rangos de inhibicin trmica de la cepa que se estudi se encuentra sobre los 60 C. Adems esto se corrobor con las microfotografas de las clulas, en donde se observ una destruccin fsica de las clulas, efecto generado por los ultrasonidos y no por la temperatura (Mason y otros, 2003a). Por otra parte se puede apreciar que al utilizar combinaciones altas de potencia y tiempo se obtienen mayores alzas de temperatura. Sin embargo, el volumen de muestra es un factor que aumenta o disminuye este incremento; ya que al irradiar 100 mL de muestra el aumento de temperatura fue mayor que al irradiar 200 mL, independientemente si en el sistema se inclua o no agitacin. Lo que resulta obvio si se considera que un mayor volumen de agua posee una mayor capacidad calorfica. En cuanto al mecanismo de agitacin empleado su efecto no fue considerable, ya que igual volumen de muestra, su variacin de temperatura fue similar con y sin agitacin. En cuanto a los sistemas ultrasonicos complementarios los incrementos de

68

temperatura en ambos sistemas, bao y celda ultrasnica, no superaron los 24 C, siendo mayor en la celda ultrasnica.

VII.3 Campo acstico

La medicin del campo acstico a distintas potencias, arroj como resultado que exista una relacin proporcional entre la potencia y la presin acstica generada en el medio lquido. Por lo tanto, se infiere que a mayores potencias las clulas son expuestas a mayores presiones acsticas, lo que aumentara su tasa de destruccin.

VII.4 Estructura celular

Las microfotografas tomadas a las clulas de levaduras antes y despus de ser expuestas al fenmeno de cavitacin (ver punto VI. 6), permiten apreciar el dao fsico que sufrieron luego de ser cavitadas. La ruptura de la pared celular provocara la salida del citoplasma hacia el exterior. En las microfotografas se distinguen levaduras vacas y otras en las que an queda algo de contenido celular; en ambos casos el dao es irreparable, lo que asegura la destruccin de stas. No obstante, en los ensayos realizados durante esta investigacin, siempre quedaron levaduras sobrevivientes, no se sabe si fue porque el chorro de burbujas no las alcanz, o bien, porque el dao que les caus no fue suficiente para producir su inhibicin.

VII.5 Anlisis qumicos

Los anlisis qumicos realizados al vino tinto y vino blanco, arrojaron un leve aumento en su acidez total luego de ser cavitados, lo que sugiere que con el fenmeno de cavitacin acstica se concentraran los cidos, tales como el sulfrico o el tartrico; o bien, se formaran nuevos cidos, ya que est comprobado que la cavitacin acstica induce la formacin de radicales libres, que podran actuar como precursores de nuevos cidos. (Mason y otros, 2003a).

69

Por otra parte, la acidez voltil no experiment variacin en el vino tinto despus de ser irradiado con ultrasonidos, pero s disminuy 0,1 g/L en el vino blanco despus de ser tratado con ultrasonidos. Esta pequea baja en la acidez podra deberse a una volatilizacin de los cidos presentes en el vino, como consecuencia del aumento de temperatura que sufren las muestras al ser cavitadas. Cabe mencionar que los valores de acidez total y voltil encontrados en todas las muestras de vinos, cavitados y no cavitados, se encontraron dentro de los lmites permitidos por la Ley de alcoholes N 18.455. Aunque la legislacin chilena (Reglamento Sanitario de los Alimentos y Ley de Alcoholes N 18.455) no establece lmites mximos y mnimos de pH y densidad para los vinos chilenos, puede decirse que los resultados de estos anlisis se encuentran dentro de los rangos normales aceptados por los productores de vinos. As, por ejemplo, en algunas vias se establece como limite mnimo una densidad de 0,980 g/mL para vinos tintos y vinos blancos. La diferencia de pH entre vinos tinos y vinos blancos es normal, ya que generalmente los vinos blancos tienen un pH menor que los vinos tintos, dado principalmente por la cantidad de cidos presentes en las uvas blancas (Vergara, 1994).

VII.6 Anlisis fsicos

La intensidad colorante del vino tinto present un aumento de 13,23% despus de ser cavitado. Esta diferencia se puede deber a que el fenmeno de cavitacin acstica produce una leve concentracin de los slidos presentes en el vino tinto, debido a la evaporacin del agua que se produce al incrementarse la temperatura de la muestra (cercana a 50 C), lo que provoca una mayor absorcin espectrofotomtrica. Este incremento en la intensidad colorante sera favorable para un vino tinto. En cuanto al vino blanco, no se observ variacin alguna. La tensin superficial mide la fuerza necesaria para separar las molculas de un lquido; en pocas palabras, representa la fuerza existente entre ellas. Este anlisis no se realiza normalmente a los vinos; sin embargo, de esta medicin se infiere una caracterstica fundamental en ellos, su cuerpo. Por lo que, se eligi la tensin superficial del agua (72,4

70

dinas/cm) como parmetro de comparacin para ste anlisis, dado que se trata de un fluido laminar al igual que el vino. Al analizar los vinos, cavitados y no cavitados, se encontr que su tensin superficial era menor que la del agua, lo que se debe a la mayor cantidad de alcohol presente en ellos, por lo que se forman enlaces de menor fuerza entre sus molculas. Luego de la cavitacin acstica, la medicin de la tensin superficial arroj un aumento de un 10,07% para el vino tinto y de 18,80% para el vino blanco. Debido probablemente a la posible concentracin que sufren los vinos al evaporarse el agua.

VII.7 Evaluacin sensorial

Para determinar si los vinos (tinto y blanco) presentaban diferencias significativas despus de ser cavitados, se realiz una prueba triangular con los 12 jueces seleccionados (ver punto V.1.2). De los 12 jueces, 2 encontraron diferencias entre las muestras de vino tinto cavitado y no cavitado y 5 encontraron diferencias entre las muestras de vino blanco cavitado y no cavitado, lo que indica que los vinos cavitados no presentan diferencias significativas con respecto a los vinos no cavitados. Para que hubiesen existido diferencias significativas entre las muestras de vino, 8 de los 12 jueces tendran que haber encontrado diferencia entre las muestras (anexo X.2). Este resultado es determinante si se desea utilizar los ultrasonidos como mtodo alternativo para la disminucin microbiana en vinos, ya que es muy importante que el vino no cambie las propiedades organolpticas de las que fue dotado durante la vinificacin. Si bien estadsticamente no se present diferencias significativas entre las muestras de vino cavitado y no (para vino blanco y tinto), el nmero de jueces que encontr diferencias, entre las muestras tratadas y no, fue mayor en el caso del vino blanco. En base a sus comentarios, al parecer existira una destruccin y, por ende, prdida de componentes aromticos en el vino; tal vez, como consecuencia del calentamiento que sufrieron las muestras de vino al ser sometidas a ultrasonidos.

71

VII.8 Evaluacin econmica

Un sondeo realizado a diversos sistemas ultrasnicos ofrecidos en el mercado, para la industria alimentaria (punto X.2), demuestra la factibilidad econmica en la adquisicin de stos equipos; ya que, el costo de los principales componentes de un sistema ultrasnico (generador de potencia, transductor y sistema de registro) no parece ser una cifra exorbitante e inaccesible para una empresa vitivincola. Sin embargo, es necesario realizar un estudio ms acabado de la rentabilidad de la utilizacin de cada sistema ultrasnico. Se debe tener en consideracin que el sistema a utilizar, se deber escoger dependiendo de la cantidad y caractersticas del alimento que se desee irradiar.

Despus de estudiar diferentes sistemas ultrasnicos, se comprob que todos tenan la capacidad de destruir o daar la estructura celular de la levadura con la cual se ensay ( S. cerevisiae), algunos en mayor proporcin que otros. Adems, como la cavitacin acstica es un fenmeno fsico, la efectividad de la destruccin celular depender de las caractersticas fsicas del sistema ultrasnico con que se lleve a cabo la irradiacin del producto, como por ejemplo: la potencia aplicada, la frecuencia y los parmetros electricos del transductor, tales como la impedancia e inductancia. En cuanto a las caractersticas del sistema y condiciones de pruebas, los que ms influyeron en la efectividad de la tcnica fueron el tiempo de exposicin, volumen de las muestras y potencia acstica efectiva, dejando para un estudio ms exhaustivo las dos ltimas. De lo anterior se desprende que el fenmeno de cavitacin acstica es un mtodo efectivo en la descontaminacin microbiana, que altera mnimamente las caractersticas fsicas, qumicas y organolpticas del vino, lo que sugiere seguir estudiando el tema, ya que podra ser incluido como una etapa en la elaboracin de vino de exportacin; ms an, si se considera que la implementacin de un sistema ultrasnico no tendra un costo demasiado elevado, siendo de gran utilidad para la industria vitivincola chilena, la que cada vez llega a mercados ms exigentes.

72

VIII. CONCLUSIONES
1. El fenmeno de cavitacin acstica provocara la destruccin de la pared celular de las levaduras. 2. De las variables independientes analizadas en todos los sistemas estudiados, la que ejerce

mayor efecto en la destruccin celular es el tiempo de exposicin al ultrasonido. 3. Se comprob que el incremento de temperatura es proporcional a la potencia acstica aplicada, siendo en este caso dependiente del volumen de muestra utilizado. 4. No se observan cambios visuales en el color de los vinos tratados con ultrasonidos. 5. Los resultados qumicos y fsicos indican que los vinos cavitados slo presentan mnimas diferencias con los vinos no cavitados. 6. La mayor variacin entre vinos cavitados y no cavitados se registr en la tensin superficial, con un aumento de 10% en los vinos tintos cavitados y 19% en los vinos blancos cavitados. 7. No se encontraron diferencias significativas, en cuanto a caractersticas organolpticas, entre las muestras de vino cavitadas y no cavitadas. 8. La cavitacin acstica podra utilizarse como un mtodo de descontaminacin microbiana en vinos, siendo dependiente de las caractersticas fsicas del transductor que se emplee (frecuencia de resonancia, impedancia elctrica e inductancia). Adems juega un importante rol la conformacin del sistema, en cuanto a generacin de potencia y adaptacin de impedancia, principalmente.

73

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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20) Mximo A., Alvarenga B. 2002. Fsica General. 3ra Edicin. Editorial Mexicana. 21) Miranda M.J.S., Da Costa S.P., Martins R.M.M., Sae M.L. 1998. Ultrasound In Chemical And Enzymatic Syntheses. [I Simposio Iberoamericano de Acstica]. Lisboa, Portugal: Centro de Estudios Farmacuticos, Facultad de Farmacia, Universidad de Coimbra. 4p. Disponible desde: http://www.ia.csic.es/Sea/4335.htmL. 22) Montgomery D. 1991. Diseo y Anlisis de Experimentos. Editorial Iberoamericana. 23) Pardo I. Metabolismo de sustratos de mosto y vino por bacterias lcticas y sus en la calidad del vino [en lnea], 28 de Agosto de 2003;

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76

X.

ANEXOS

X.1

EVALUACIN SENSORIAL

Tabla X.16.

Tabla para interpretacin de resultados de la prueba triangular Nmero de respuestas correctas necesario para establecer diferencia significativa NIVEL DE SIGNIFICANCIA 5% 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 10 11 11 12 12 13 13 13 1% 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 14 15 0.1 % 7 8 8 9 9 10 10 11 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17

Nmero de jueces 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 (Anzalda, 1994)

77

X.2

EVALUACIN ECONOMICA

Tabla X.17. mercado. Sistema 1

Evaluacin econmica de diversos sistemas ultrasnicos ofrecidos en el

Modelo UIP50

UIP250

UIP500

UIP2000

UIP4000

Caractersticas Precio($pesos) Generador ultrasnico industrial de 2.593.500 50 Watts de potencia y 30 kHz de frecuencia. Emplea un transductor de 7 mm de dimetro con una longitud de 80 mm. Incluye computador de control y registro. Generador ultrasnico industrial de 4.089.750 250 Watts de potencia y 24 kHz de frecuencia. Emplea un transductor de 8 mm de dimetro con una longitud de 800 mm. Incluye computador de control y registro. Generador ultrasnico industrial de 5.120.500 500 Watts de potencia y 24 kHz de frecuencia. Emplea un transductor de 40 mm de dimetro con una longitud de 1000 mm. Incluye computador de control y registro. Generador ultrasnico industrial de 8.013.250 2000 Watts de potencia y 20 kHz de frecuencia. Emplea un transductor de 55 mm de dimetro con una longitud de 375 mm. Incluye computador de control y registro. Generador ultrasnico industrial de 13.133.750 4000 Watts de potencia y 20 kHz de frecuencia. Emplea un transductor de 65 mm de dimetro con una longitud de 630 mm. Incluye computador de control y registro.

HIELSHER SYSTEMS 15.

78

X.3

GLOSARIO DE TRMINOS FSICOS

a)

Amplitud: Valor pico de una onda. En ondas simtricas es el valor de la mitad del valor

pico-pico.

b)

Analizador de espectros: Es un instrumento electrnico que permite visualizar en una

pantalla las componentes espectrales de las seales presentes en las entradas. En el eje de ordenadas suele presentarse en una escala logartmica el nivel en dB del contenido espectral de la seal. En el eje de abscisas se representa la frecuencia, en una escala que es funcin de la separacin temporal y el nmero de muestras capturadas

c)

Circuito equivalente: Circuito donde todas las fuentes de alimentacin estn

representadas por una sola fuente equivalente y las resistencias de carga estn representadas por una sola resistencia equivalente.

d)

Circuito paralelo: Circuito por donde el total de la corriente se divide por varias ramas

y/o elementos. Circuito que tiene ms de un camino la corriente.

e)

Circuito serie: Circuito por donde circula la misma corriente por todos los elementos.

Circuito que tiene un nico camino la corriente.

f)

Condensador (elctrico): En electricidad y electrnica, un condensador, a veces

denominado con el anglicismo capacitor, es un dispositivo formado por dos conductores armaduras, generalmente en forma de placas o lminas, separados por un material dielctrico, que sometidos a una diferencia de potencial adquieren una determinada carga elctrica. A esta propiedad de almacenamiento de carga se le denomina capacidad, y en el sistema internacional de unidades se mide en Faradios (F), siendo un faradio la capacidad de un condensador en el que, sometidas sus armaduras a una diferencia de potencial de 1 voltio, estas adquieren una carga elctrica de 1 culombio.

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g)

Espectrofotometra: La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado

en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioleta visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y slo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

h)

Forma de onda sinusoidal: Una forma de onda de tensin (o corriente) con la

siguiente expresin matemtica V=Vp sen (wf).

i)

Frecuencia: Es un trmino empleado en fsica para indicar la velocidad de repeticin de

cualquier fenmeno peridico. Se define como el nmero de veces que se repite un fenmeno en la unidad de tiempo. La unidad de medida de frecuencia es el Herz (Hz), en honor al fsico alemn Heinrich Rudolf Hertz donde 1 Hz es un evento que tiene lugar una vez por segundo.

j)

Frecuencia de resonancia: Frecuencia donde los efectos reactivos se cancelan y la

impedancia o admitancia alcanzan su mayor valor.

k)

Impedancia: La impedancia es la oposicin que presenta un circuito al paso de la

corriente alterna. Es un valor vectorial compuesto en su parte real por un valor de resistencia y en su parte imaginaria por un valor de reactancia. Su smbolo es Z y se calcula de la siguiente manera: Z = (R2 + X2).

80

Donde Z = Impedancia medida en Ohms () R = Resistencia medida en Ohms () X = Reactancia total medida en Ohms ()

l)

Inductancia: Es la propiedad de un circuito que establece la cantidad de flujo

magntico que lo atraviesa, en funcin de la corriente que circula por l. El coeficiente de autoinduccin, L, es la medida de esta propiedad y se define: = L * I. Donde es el flujo magntico e I es la corriente. El valor de este coeficiente viene determinado exclusivamente por la geometra del circuito y por la permeabilidad magntica del espacio donde ste se expresa. Un cambio en la intensidad de la corriente (dI / dt) resultar en un cambio en el campo magntico y, por lo mismo, un cambio en el flujo que est atravesando el circuito, lo que dar lugar a la generacin de una fuerza electromotriz autoinducida en l, debido a la Ley de Faraday, y por tanto a la circulacin de una corriente que se opone a su propio cambio de corriente

m)

Intensidad: La intensidad de corriente es la cantidad de carga elctrica que pasa a

travs de una seccin del conductor por unidad de tiempo.

n)

Reactancia: Se denomina Reactancia a la impedancia ofrecida, al paso de la corriente

alterna, por un circuito en el que slo existen inductores (bobinas) o capacidades (condensadores) puras, esto es, sin resistencias. No obstante, esto representara una condicin ideal, puesto que no existen en la realidad bobinas ni condensadores que no contengan una parte resistiva, con lo cual los circuitos en general estarn formados por una composicin R-LC (resistencia, inductor y capacidad).

81

o)

Osciloscopio: Un osciloscopio es un instrumento de medida electrnico para la

representacin grfica de seales elctricas que pueden variar en el tiempo. Es muy usado en electrnica de seal, frecuentemente junto a un analizador de espectros. Presenta los valores de las seales elctricas en forma de coordenadas en una pantalla, en la que normalmente el eje X (horizontal) representa tiempos y el eje Y (vertical) representa tensiones. La imagen as obtenida se denomina oscilograma.

p)

Potencia elctrica: La velocidad con que se consume o suministra energa de un

sistema. Potencia = Energa / tiempo. La unidad de de medicin de la potencia es el Watts (W).

q)

Resistencia elctrica: Se denomina resistencia elctrica de una sustancia a la

oposicin que encuentra en dicha sustancia la corriente elctrica para recorrerla. Segn sea la magnitud de esta oposicin, las sustancias se clasifican en buenas conductoras, conductoras o aislantes elctricos. La resistencia elctrica de un conductor es la medida de la oposicin que dicho conductor presenta al movimiento de los electrones en su seno, o sea la oposicin que presenta al paso de la corriente elctrica. La resistencia depende de la longitud del conductor, de su seccin y de la temperatura del mismo.

r)

Resonancia elctrica: La resonancia en Electricidad es un fenmeno que se produce

en un circuito en el que existen elementos reactivos (bocinas y condensadores) cuando es recorrido por una corriente alterna de una frecuencia tal que hace que la reactancia se anule, en caso de estar ambos en serie o se haga mxima si estn en paralelo.

s)

RMS: Valor eficaz que un instrumento debera medir para una onda seno. Es calculado

a partir de una onda rectificada. Si se miden seales que no son sinusoidales el valor es errneo.

82