Bioqumica I 2012/2013

Trabalho N 5

Reaces caractersticas dos glcidos

1.

Objectivo e introduo do trabalho

Este trabalho tem por objectivo a verificao de algumas reaces coradas dos glcidos que se baseiam no seu carcter redutor e/ou na sua estrutura qumica. Adicionalmente, pretende-se determinar o contedo em glcidos redutores de farinhas alimentares atravs da aplicao do mtodo do 3,5dinitrosalicilato (DNS). Os glcidos podem ser definidos, quanto sua estrutura qumica, como sendo polihidroxialdedos ou polihidroxicetonas e seus derivados. Estes compostos constituem um grupo de grande importncia biolgica pois funcionam quer como fonte de energia para os processos vitais, quer como componentes estruturais de um organismo ou ainda como fontes de carbono para a sntese de novas biomolculas. Os glcidos subdividem-se, genericamente, nas seguintes classes: 1. oses - classe que inclui os glcidos no hidrolizveis; estes podem ter entre 3 a 9 tomos de carbono e, consoante apresentem um grupo cetona ou aldedo, so designadas por, respectivamente, cetoses ou aldoses; 2. sidos - classe que inclui os glcidos hidrolizveis que, por sua vez, se subdividem em: 2.1. oligsidos - constitudos por 2 a 10 resduos de ose; 2.2. polisidos - constitudos por mais do que 10 resduos de ose. Os sidos que, por hidrlise, originam apenas oses designam-se de holsidos, sendo hetersidos aqueles que do origem a molculas de oses diferentes e homsidos os que originam molculas de ose iguais. Outros sidos, como a heparina, o cido hialurnico, as glicoprotenas e outros do origem a oses e a outro tipo de compostos aps sofrerem um tratamento hidroltico. Na primeira parte deste trabalho, ir-se-o estudar as seguintes reaces caractersticas dos glcidos: Teste de Benedict - o reagente de Benedict uma soluo alcalina de CuSO4 com Na2CO3 e citrato de sdio. O io citrato forma um complexo com o io Cu , impedindo que este precipite da soluo sob a forma de Cu(OH)2 (de cor azul) ou CuO (de cor preta). O Cu
+ 2+ 2+

do reagente de Benedict oxida

os glcidos redutores presentes numa soluo, originando uma variedade de produtos ao mesmo tempo que reduzido a Cu . Este precipita da soluo sob a forma de Cu2O (xido cuproso; precipitado de cor vermelha). Teste de Barfoed - as oses e os disidos apresentam uma velocidade de reaco distinta com uma soluo de acetato de cobre em cido actico, o que permite diferenci-las. Neste teste, como no anterior, as oses so oxidadas, originando uma variedade de produtos, e o Cu
+ 2+

presente no

reagente de Barfoed reduzido a Cu , precipitando sob a forma de Cu2O (de cor vermelha). Teste do Iodo - os polisidos e os seus produtos de degradao originam uma cor caracterstica quando tratados com uma soluo de iodo em KI. O amido produz uma cor azul intensa que devida formao de um complexo amido-iodo. Este complexo consiste num arranjo aproximadamente
5-1

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-

Trabalho N 5

linear de anies I5 dentro da cavidade da amilose. Com efeito, a amilose existe sob a forma de uma hlice com 6 resduos de glucose por volta. Para a formao do complexo com o iodo, necessrio um mnimo de 6 voltas da hlice (isto , 36 resduos de glucose). Os poli sidos ramificados que apresentam hlices interrompidas (por ex., a amilopectina) originam complexos de cores menos intensas; por sua vez, os polisidos muito ramificados que possuem apenas pequenos segmentos helicoidais na sua estrutura (por ex., o glucognio), formam complexos castanho-avermelhados pouco intensos. Na Fig.1 apresenta-se a estrutura de alguns dos glcidos a testar:

CH2OH O H H OH OH H

OH

CH2OH O H H 4 OH H HO
5 3 2

CH2OH O H
1 5

OH HO
3 1 2

H
4

OH

CH2OH

OH

OH

Ribose (-D-ribose)

Glucose (-D-glucopiranose)

Frutose (-D-frutofuranose)

CH2OH 5 O H H 4 OH H HO
3 2

H
1(

CH2OH O
2( )

H HO
4 6 5

H
3

CH2OH

CH2OH 5 O HO H 4 OH H H
3 2

CH2OH O H H O 4 OH H 1( ) H
5 3

OH
1

H
2

OH

OH

OH

OH

Glucose Sacarose (Glc 1

Frutose 2) Fru)

Galactose Lactose (Gal 1

Glucose 4) Glc)

Figura 1. Estrutura de alguns dos glcidos a estudar.

O desenvolvimento de mtodos que permitam dosear os glcidos presentes nos alimentos extremamente importante, uma vez que estes compostos so um dos constituintes fundamentais da nossa dieta. Com efeito, os polisidos glucognio e amido so importantes formas de armazenamento de energia, estando presentes em tecidos animais e vegetais, respectivamente. A capacidade redutora dos glcidos tem constitudo a base qumica de vrios mtodos de anlise quantitativa destes compostos. Na segunda parte deste trabalho, pretende-se determinar o contedo em glcidos redutores de farinhas alimentares atravs da aplicao do mtodo do 3,5-dinitrosalicilato (DNS). Em meio alcalino, e quando aquecido na presena de glcidos redutores, o DNS forma um produto de reduo castanho-avermelhado, o 3-amino-5-nitrosalicilato que pode ser doseado espectrofotometricamente a 540 nm.

5-2

Bioqumica I 2012/2013 2. Procedimento experimental

Trabalho N 5

2.1. Material e reagentes

- Ribose 0,1 M - Glucose 0,1 M - Frutose 0,1 M - Sacarose 0,1 M - Lactose 0,1 M - Amido 1% (m/v) - Glucognio 1% (m/v) - reagente de Benedict (dissolver 173 g de citrato trisdico dihidratado e 100 g de Na2CO3 anidro em 600 mL de gua. Aquecer at ocorrer a dissoluo dos sais e filtrar a soluo em seguida, se necessrio. Diluir para 850 mL com gua destilada. Dissolver parte 17,3 g de CuSO4.5H2O em 150 mL de gua destilada e adicionar, lentamente e com agitao, esta soluo anterior) - soluo de Iodo (I2 0,01 M e KI 0,12 M - dissolver 10 g de KI em 500 mL de gua destilada. Adicionar 12,5 g de iodo e agitar vigorosamente (com o auxlio de um agitador magntico) at dissolver. Esta soluo estvel durante um ms. Guardar o reagente num frasco escuro) - reagente de Barfoed (dissolver 13,3 g de acetato cprico (monohidratado) em 200 mL de gua destilada. Filtrar, se necessrio, e adicionar 1,8 mL de cido actico glacial) - farinha alimentar - H2SO4 1,5M - NaOH 10% (m/v) - Reagente de DNS (Dissolva 10g de cido 3,5-dinitrosaliclico em 200 mL de NaOH 2N, aquecendo e agitando vigorosamente. Dissolva 300 g de tartarato de sdio e potssio tetrahidratado em 500 mL de gua destilada. Misture as duas solues e perfaa o volume para 1 L com gua destilada) - Soluo de glucose 5 mg/mL

- vidro de relgio - almofariz e pilo - esptula - tubos de ensaio - balo volumtrico de 50 mL - bales volumtricos de 25 mL - erlenmeyer com rolha de 50 mL - funil
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Bioqumica I 2011/2012 - papel de filtro Whatmann n 1 - pipetas volumtricas de 1,0 mL - pipetas volumtricas de 2,0 mL - pipetas volumtricas de 5,0 mL - pipetas de Pasteur

Trabalho N 5

2.2. Reaces caractersticas dos glcidos

2.2.1. Teste de Benedict

Para cada glcido, adicione 5,0 mL de reagente de Benedict a um tubo de ensaio e junte 1,0 mL da respectiva soluo de glcido a testar. Agite bem. Prepare um controlo do ensaio adequado. Aquea as vrias solues preparadas num banho de gua em ebulio durante 5 min. Arrefea os tubos torneira, observe-os e anote os resultados. Resultado positivo: a presena de glcidos redutores indicada atravs da formao de um precipitado amarelo, verde, ou vermelho. A mera alterao da cor da soluo no indica um resultado positivo. A cor do precipitado obtido varia com o tamanho das partculas formadas (em geral, as partculas de maiores dimenses, produzidas por reaces lentas, formam um precipitado vermelho; as partculas mais pequenas, resultantes da ocorrncia de reaces rpidas, formam um precipitado esverdeado).

2.2.2. Teste de Barfoed

Para cada glcido, adicione 2,0 mL de reagente de Barfoed a um tubo de ensaio e junte 1,0 mL da respectiva soluo de glcido a ensaiar. Agite bem. Prepare um controlo do ensaio adequado. Coloque as solues preparadas num banho de gua em ebulio e inicie imediatamente a contagem do tempo de incubao. Se o banho se mantiver em ebulio, mantenha os tubos de ensaio no banho durante exactamente 1 min. Aps a sua remoo, deixe os tubos de ensaio arrefecer temperatura ambiente. Examine os tubos de ensaio e anote os resultados, registando em particular a quantidade de precipitado formado em cada caso. Ateno: um aquecimento prolongado das solues pode originar um falso resultado positivo Resultado positivo: um teste positivo caracterizado pela formao de um precipitado avermelhado abundante.

5-4

Bioqumica I 2012/2013 2.2.3. Teste do Iodo

Trabalho N 5

Adicione 5,0 mL de cada uma das solues de glcido a ensaiar a um tubo de ensaio e junte quatro gotas da soluo de iodo. Agite bem. Prepare um controlo do ensaio adequado. Observe os tubos e anote os resultados obtidos. Resultado positivo: a obteno de uma cor azul indica um teste positivo para o amido; uma cor amarelo-acastanhada indica um teste positivo para o glucognio e para os produtos de degradao do amido (dextrinas).

2.3. Doseamento de glcidos redutores numa farinha alimentar

2.3.1. Preparao da amostra

Pese aproximadamente 80 mg da farinha alimentar a analisar e reduza-a a p fino com o auxlio de um almofariz. Pese ento uma amostra com cerca de 50 mg, registando a massa at ao dcimo de mg. Transfira o material pesado para um tubo de ensaio e adicione 10 mL de H2SO4 1,5 M. Aquea o tubo de ensaio num banho de gua em ebulio durante 20 min na hotte, e agitando de vez em quando. Arrefea o tubo torneira e transfira o seu contudo para um erlenmyer de 50 mL com rolha. Lave o tubo de ensaio cuidadosamente com 12 mL de NaOH a 10% e transfira a soluo para o erlenmyer anterior. Aquea ligeiramente o erlenmyer contendo o hidrolisado e filtre, enquanto quente, para um balo de 50 mL. Se a amostra no estiver aquecida, a filtrao far-se- lentamente. Lave o erlenmyer com gua destilada quente e adicione-a ao papel de filtro, de modo a que o material hidrolisado seja todo transferido. Perfaa o volume do balo at 50 mL. Agite bem.

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Trabalho N 5

2.3.2. Curva de calibrao do mtodo do dinitrosalicilato

Prepare a curva de calibrao do mtodo do DNS de acordo com o Quadro I:

Quadro I- Curva de calibrao do mtodo do DNS. Reagente (mL) Glucose 5 mg/mL Hidrolisado Reagente de DNS gua destilada 1,0 3,0 1,0 2,9 1,0 2,8 1,0 2,7 1,0 2,6 1,0 2,5 1,0 2,3 1,3 1,0 1,7 1,6 1,0 1,4 2,0 1,0 1,0 0 0 1 0,1 2 0,2 3 0,3 4 0,4 Tubo N 5 0,5 6 0,7 7 8 9 -

o aps colocar as tampas adequadas, aquea os tubos de ensaio anteriores num banho de gua em ebulio durante exactamente 5 min; o arrefea todos os tubos torneira e transfira cuidadosamente o volume de cada tubo de ensaio para um balo volumtrico de 25 mL, perfazendo o seu volume com gua destilada. Misture por inverso. o leia a absorvncia de cada soluo a 540 nm, aps acertar o zero do espectrofotmetro com gua destilada.

3.

Bibliografia

Switzer, R. e Garrity, L. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in Fundamental Methods, 3 . ed., W.H. Freeman: New York, pp. 175-178. Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry Cap.9, Addison Wesley Longman: New York. Mathews, C.K., e van Holde, K.E. (1996) Biochemistry, 2 ed., Benjamin/Cummings Co: Menlo Park, pp.68-81. Bittman, R. (1974) Analysis of reducing sugars in breakfast cereal and other foods. A general chemistry experiment J. Chem. Ed. 51: 46-47 Miller, G.L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Anal. Chem. 31: 426-428. Reed, R., Holmes, D., Weyers, J., Jones, A. (2003) Practical Skills in Biomolecular Science, 2 Pearson - Prentice Hall: Harlow, pp. 359-363.
nd rd

ed.,

5-6

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Trabalho N 5

RELATRIO

Data: ___________ Turma : _________ Grupo N.: _______

Alunos: _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________

Prepare o relatrio do trabalho prtico efectuado atendendo s seguintes instrues gerais: 1. Resumo

2. Apresentao e Discusso de Resultados

2.1. Testes de identificao de glcidos

2.1.1. Complete a seguinte chave dicotmica de identificao de glcidos, atendendo legenda: 1. glcido ou grupo de glcidos que identificado pelo teste. 2. resultado positivo caracterstico do teste . 3. glcido ou grupo de glcidos que d um resultado negativo no teste.

Chave dicotmica de identificao de glcidos

Glcido

Teste de Benedict + 1. ___________ 2. ___________ Teste do Barfoed + 1. ___________ 3. __________ 2. ___________ Teste do Iodo

3. ____________

+ + 1. ___________ 1. ___________ 3. ________ 2. ___________ 2. ___________

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Bioqumica I 2011/2012 2.1.2. Complete o seguinte quadro resumo dos resultados obtidos:

Trabalho N 5

Teste

Soluo estudada gua

Observaes

Resultado

Benedict

ribose glucose frutose sacarose lactose amido glucognio gua ribose

Barfoed

glucose frutose sacarose lactose amido glucognio gua ribose

Iodo

glucose frutose sacarose lactose amido glucognio

2.1.3. Discuta brevemente os resultados obtidos nos vrios testes realizados, relacionando-os com a estrutura qumica dos glcidos estudados.

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Trabalho N 5

2.2. Doseamento de glcidos redutores numa farinha alimentar

Resuma o trabalho efectuado sob a forma de um fluxograma comentado. Apresente o esquema da reaco do mtodo do dinitrosalicilato. Preencha o quadro seguinte com os valores de absorvncia a 540 nm referentes aos padres e s amostras utilizadas na determinao de glcidos redutores pelo mtodo do dinitrosalicilato:

Tubo N 0 [glucose] (mg/mL) Abs540 nm Represente a curva de calibrao do mtodo do DNS e calcule a percentagem (m/m) de glcidos redutores (em termos de glucose) na amostra de farinha alimentar de que partiu. Compare o valor obtido com o indicado no pacote da farinha analisada e discuta possveis causas para a diferena registada. 1 2 3 4 5 6 7 8 9

3. Bibliografia

4. Questes a desenvolver

4.1. A forma predominante da glucose em soluo a estrutura em anel representada pela projeco de Haworth. Porque que a glucose d um resultado positivo, reagindo completamente, nas reaces caractersticas da sua forma em cadeia aberta? 4.2. Apesar de possurem uma extremidade redutora, o amido e o glucognio do um resultado negativo nos testes de deteco de glcidos redutores. Justifique. 4.3. Como explica a obteno de um falso resultado positivo se efectuar um aquecimento prolongado de algumas solues de glcidos no teste de Barfoed? 4.4. Por que foi necessrio proceder hidrlise cida da farinha alimentar previamente aplicao do mtodo do DNS?

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