Inmunologa Clnica

T.P.N4
2009

Separacin de Inmunoglobulinas

Separacin de Inmunoglobulinas
Mtodos basados en la diferencia de solubilidad Mtodos basados en el tamao molecular Mtodos basados en la carga elctrica Mtodos basados en especificidad de ligandos

Solubilidad

Tamao

Carga

Especifici dad de unin

*Dilisis (con membrana *Precipitacin semipermeable) isoelctrica *Filtracin en *Salting in y geles salting out *Ultracentrifuga *Fraccionamien cin to del solvente *Electroforesis *Temperatura en gel SDS-PAGE

*Electroforesis: de zona; de disco; enfoque isoelctrico *Cromatografa de intercambio inico

*Cromato grafa de afinidad *Western blot *RIA, ELISA, IF

Mtodos basados en la diferencia de solubilidad

Precipitacin isoelctrica
Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de pH.
pH 2 (cido) GRADIENTE DE pH

+
A B

+ +
A B
0

Protenas migran hasta la zona del gel donde pH=pI de la protena

pH 6

A
0

pH 7

Prot A pI=6 Prot B pI=7

pH 10 (bsico)

H2 O

Fraccionamiento salino
H2 O

H2 O

H2 O H2 O

H2 O

Se usa mucho en los primeros pasos de la purificacin de protenas. Deshidratacin precipitacin de protenas (salting-out).

Prot. A: + apolar, hidrofbica + sal (NaCl) (poca)

Prot. B: + polar, hidroflica

H2 O Na H2 O Cl SOLUBLE Na

Sales: Sulfato amnico (NH4)2SO4 Cloruro sdico NaCl

Cl INSOLUBLE

sobrenadante Prot. B precipitado Prot. A

Mtodos basados en el tamao molecular

Dilisis y ultracentrifugacin
Membrana semipermeable (poros) molculas < poro fuera molculas > poro dentro Desalar muestras por diferencia de presin osmtica dentro y fuera del saco de dilisis. fuera (< poro) sal protenas dentro (> poro)

 Centrifugacin en gradiente de densidad

Se basa en la separacin de las partculas en funcin de su densidad de flotacin. Muestra + sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente se desplazar hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posicin en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra). Como consecuencia se producirn una serie de bandas discretas, las ms prximas al fondo del tubo contendrn las partculas con mayor densidad de flotacin.

 Cromatografa de exclusin molecular

Molculas GRANDES RPIDAS Avanzan con mayor velocidad a travs de los espacios intersticiales Molculas PEQUEAS LENTAS Son retenidas por las fibras de las micropartculas y avanzan con menos velocidad

PERFIL DE ELUCIN

grande
respuesta del detector

pequea

8 9 fraccin

Mtodos basados en la carga elctrica

Electroforticos

Migracin de partculas coloidales en el seno de un campo elctrico Se mueven las partculas en base a: Su carga neta Tamao Estructura tridimensional

Las tcnicas electroforticas son utilizadas para:

Separaciones efectivas cidos nucleicos Protenas Otras biomolculas Control de pureza Separar mezclas complejas Determinar El PM de una protena pI Nmero de cadenas polipeptdicas de una protena

Aplicaciones
Electroforesis de protenas en:
suero (proteinograma), orina (uroproteinograma), y otros fluidos biolgicos: LCR, lquido sinovial

Electroforesis de isoenzimas: LDH, CK Electroforesis de lipoprotenas (lipidograma)

Las biomacromolculas:
Poseen carga elctrica Grupos catinicos y aninicos disociables

La carga neta de una molcula depende de:

pH del medio La interaccin con otras pequeas molculas de iones La interaccin con otras macromolculas El pH influye en la migracin de una molcula En el pI, la protena no migra Por debajo del pI migra hacia el ctodo Por encima del pI migra hacia el nodo

El enlace peptdico

Estructura de un aminocido

Equipo de electroforesis
Fuente de alimentacin Soporte para las tiras de acetato de celulosa
Aplicador Cubeta Puente Reactivos

Tiras de acetato de celulosa

(Cellogel 2,5 x 17 cm)

Reactivos
Solucin tampn: Buffer Veronal-Veronal sdico (pH 8,6): Veronal sdico (10,30 g), Veronal (1,34 g), Agua destilada (h/1 L) Colorante: Amidoschwartz 10 B (0,5 mg), Metanol (35 mL), Agua destilada (45 mL), Acido actico glacial (10 mL) Decolorante: Acido actico al 5% en agua Solucin trasparentizadora: Metanol (87 mL), Acido actico (12 mL), Glicerina (1 mL)

Cubeta y puente
Las tiras sobre el puente y en la cubeta Con tampn Con la tapa para crear una atmsfera saturada Con los cables para conectar a la fuente

puente soporte de 11 cm x 8,5 cm

Fuente de alimentacin
0-400 voltios 0-50 mA Temporalizador Inversor de corriente Varias tomas Cable rojo y negro

Aplicador
Macro Semi-micro Micro

Colocacin de la tira y de la muestra

Hacer pasar una corriente de 200 V fijos y 2,5 mA/tira de acetato de celulosa. Tiempo de corrida ptimo de 55

Migracin
Protocolo de la tcnica para la migracin Colorear Decolorar Transparentizar

Resultado final

albmina
+

globulinas 2 -globulinas
-

Protenas del Suero

Clase prealbmina albmina -1-globulinas -2-globulinas -1-antitripsina -1-glicoprotena cida haptoglobinas -2-macroglobulina ceruloplasmina transferrina lipoprotena de baja densidad IgG IgA IgM IgD IgE Protena Concentracin normal srica (g/L) 0,25 40 2,9 1,0 2,0 2,6 0,35 3,0 1,0 14,0 3,5 1,5 0,03 trazas

-globulinas

-globulinas

Fotodensmetro

 Cromatografa de intercambio inico

Molculas MENOR CARGA (+) RPIDAS Son desplazadas ms fcilmente por la fase mvil. Molculas MAYOR CARGA (+) LENTAS Son retenidas por los grupos cargados inicamente de la f. estacionaria. PERFIL DE ELUCIN Gradiente de pH Gradiente salino

q+ Q+
respuesta del detector

Na+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 fraccin

Purificacin de IgG por Cromatografa en DEAE-celulosa

Mtodos basados en especificidad de ligandos

La protena A es un polipptido de 42.000 Da constituyente habitual de la pared celular de S. aureus. Se ha estudiado con gran detalle la interaccin entre la protena A y los anticuerpos. La afinidad de la protena A depende de las regiones Fc del anticuerpo, dependientes de la subclase (IgG1,IgG2 y IgG4). La protena A tiene alta afinidad por los anticuerpos humanos y de otros animales. La protena A se ha empleado en mtodos cromatogrficos unida a resinas pudindose purificar anticuerpos IgG.

Produccin y purificacin de sueros antiofdicos

En la produccin industrial de los antivenenos se llevan a cabo las siguientes etapas: Primera etapa: Obtencin de veneno

 Segunda etapa: Produccin del antisuero

Tercera etapa: Fraccionamiento del plasma equino

Sangra

Plasma

Precipitacin salina

Filtracin

Dilisis

Filtracin estril

Envasado del producto final

Control de Calidad

Etiquetado y empaquetado

Obtencin de antisueros (anticuerpos policlonales)

Uso diagnstico En terapia antisueros antitetnicos

Que vamos hacer en el prctico???

Primera etapa Precipitacin de inmunoglobulinas

5 mL de suero + 5 mL de sulfato de amonio Medir pH y ajustar a 7,8 heladera 10 vortex

Centrifugar 4000 rpm durante 25 Eliminar el sobrenadante y agregar igual cantidad de sulfato de amonio (1:2) lmpido Precipitado + 5 mL de PBS o agua destilada

Segunda etapa Desionizacin

SF Cambiar cada 2 hs. Reposar toda la noche

Tercera etapa Control por electroforesis

Luego se procede a transparentizar con una mezcla de metanol + cido actico 1:10 o 1+9 Tincin: Azul de Coomassie Negro amido Rojo Ponceau

Es aplicable a: suero orina LCR