ATUALIZAO CONTINUADA

Angiognese e doenas da retina

Angiogenesis and retinal diseases

Francisco Max Damico 1

RESUMO

Angiognese o processo de formao de vasos sangneos a partir de vasos preexistentes, que ocorre em condies fisiolgicas e patolgicas. fenmeno complexo no qual participam inmeras molculas que estimulam e inibem a formao dos neovasos. O aumento da permeabilidade vascular e a neovascularizao sub-retiniana so as causas da perda visual nas doenas proliferativas da retina, como a degenerao macular relacionada idade e a retinopatia diabtica, e o fator de crescimento do endotlio vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF) desempenha um papel muito importante nesse processo. Existem quatro isoformas da molcula de VEGF biologicamente ativas em seres humanos, das quais o VEGF165 a isoforma predominante no olho humano, e existem evidncias de que seja a isoforma responsvel pela neovascularizao patognica no olho. Alm de ser potente mitgeno de clulas endoteliais, o VEGF aumenta a permeabilidade vascular, inibe a apoptose das clulas endoteliais e promove migrao de precursores de clulas endoteliais. O VEGF no a nica molcula cuja expresso est aumentada na angiognese patolgica. O fator de crescimento de fibroblasto (basic fibroblast growth factor, bFGF), as angiopoetinas, o fator derivado do epitlio pigmentado (pigment epithelium-derived factor, PEDF) e os fatores de adeso relacionados matriz extracelular tambm exercem papel importante no balano entre fatores pr- e antiangiognicos. Todo o conhecimento adquirido sobre o mecanismo da angiognese ocular patolgica tem possibilitado o desenvolvimento de vrios inibidores desse processo. Atualmente existem dois anticorpos anti-VEGF para uso intravtreo e outras abordagens teraputicas do bloqueio da angiognese ocular esto em fase de desenvolvimento. As novas drogas devero ser armas poderosas no tratamento das principais causas de cegueira legal irreversvel em indivduos com mais de 65 anos.
Descritores: Neovascularizao patolgica; Degenerao macular; Retinopatia diabtica; Inibidores da angiognese; Agentes indutores da angiognese

Trabalho realizado na Clnica Oftalmolgica da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - USP e no Laboratrio da Viso do Instituto de Psicologia da Universidade de So Paulo - USP.
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INTRODUO

Doutor em Cincias - Universidade de So Paulo - USP - So Paulo (SP) - Brasil; Ps-Doutorado em Retina Harvard Medical School - Boston - EUA. Endereo para correspondncia: Francisco Max Damico - Rua Barata Ribeiro, 414 - Conj. 11- So Paulo (SP) CEP 01308-000 E-mail: fmdamico@uol.com.br Recebido para publicao em 27.04.2006 ltima verso recebida em 16.10.2006 Aprovao em 24.11.2006 O autor no tem interesse comercial em nenhum dos produtos citados nesta reviso.

A neovascularizao ocorre em situaes patolgicas como uma tentativa de reparao de danos teciduais atravs da formao local de neovasos. No entanto, em retinopatias proliferativas, como a retinopatia diabtica e a degenerao macular relacionada idade (DMRI), geralmente a neovascularizao traz consigo efeitos visuais devastadores. O processo de formao de vasos sangneos conhecido como angiognese. Esse fenmeno ocorre em condies fisiolgicas e patolgicas. A angiognese fisiolgica ocorre durante a embriognese, o crescimento dos tecidos e o ciclo reprodutivo da mulher, enquanto a angiognese patolgica caracterizada pela neovascularizao ineficaz (como no caso das reti-

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nopatias proliferativas) ou excessiva (como nos tumores)(1). Em 1971, Folkman sugeriu que o controle da angiognese poderia ser til no controle do crescimento tumoral(2). Esse conceito de antiangiognese foi aplicado a outras doenas e vem sendo estudado extensivamente nos ltimos anos. A angiognese um fenmeno complexo no qual participam inmeras molculas que estimulam e inibem a formao dos neovasos. O desbalano entre esses fatores pr- e antiangiognicos a chave para a compreenso da angiognese, e a partir do qual vm emergindo novos tratamentos farmacolgicos que vm comprovar a hiptese de Folkman.
FISIOPATOGENIA DA NEOVASCULARIZAO DE CORIDE

do EPR faz com que a mcula dos olhos com DMRI se encontre num estado inflamatrio subclnico contnuo(8-9). A inflamao crnica leva produo local de citocinas quimiotxicas(8,10), migrao de clulas inflamatrias para o espao subretiniano (como macrfagos)(11-12) e provoca ativao do sistema complemento(13-14), causando destruio focal da membrana de Bruch. Os macrfagos tambm secretam VEGF, amplificando os seus efeitos locais(15). Por fim, a grande quantidade de VEGF local induzida pela hipxia(16) associada aos defeitos da membrana de Bruch(17) resultam na formao de neovasos que penetram no espao subretiniano dessa provocando exsudao e hemorragia (Figura 1).
ANGIOGNESE E VEGF

Apesar do enorme esforo que vem sendo dedicado elucidao do mecanismo patolgico da neovascularizao nas doenas da retina, ainda existem vrias incertezas. Uma caracterstica comum maioria das doenas retinianas nas quais ocorre neovascularizao a presena de algum grau de leso da membrana de Bruch na mcula. Clinicamente, essa leso pode ser visvel oftalmoscopia como alteraes pigmentares, atrofia do epitlio pigmentado da retina (EPR), roturas traumticas da coride, estrias angiides e degenerao mipica. As boas condies das clulas do EPR, da membrana de Bruch e da coriocapilar so fundamentais para a homeostase e sobrevivncia desse complexo, e a destruio de qualquer uma dessas camadas retinianas cursa, invariavelmente, com atrofia das outras duas. Na DMRI, que a principal causa de neovascularizao sub-retiniana, existem evidncias de que o envelhecimento diminui a capacidade do EPR de reciclar metablitos resultantes do processo visual que ocorre nos fotorreceptores, e esses metablitos se acumulam no espao sub-retiniano. Alm disso, o envelhecimento tambm promove acmulo de lipdios na membrana de Bruch(3), tornando-a mais espessa e diminuindo a capacidade de difuso do oxignio(4). As clulas do EPR, que normalmente so bastante permeveis ao oxignio devido produo local do fator de crescimento do endotlio vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF), tornam-se menos permeveis devido aos fatores mencionados acima, o que resulta numa menor capacidade de difuso de oxignio e VEGF, levando a hipxia dos fotorreceptores e atrofia da coriocapilar(5-6). Outros fatores tambm contribuem para a hipxia macular. Os olhos com DMRI encontram-se em estado de estresse oxidativo(7) pois h consumo de oxignio muito elevado na mcula devido alta taxa de metabolismo local e grande quantidade de cidos graxos poliinsaturados. Essas caractersticas, associadas exposio contnua luz visvel, causam dano oxidativo s clulas do EPR e acmulo de lipofuscina na mcula. Oftalmoscopicamente, a lipofuscina visvel sob a forma de drusas, que so uma das primeiras manifestaes clnicas da DMRI. A presena dos metablitos provenientes dos fotorreceptores, da lipofuscina e da degenerao oxidativa das clulas

Um dos mais importantes fatores pr-angiognicos j identificados o fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF). O VEGF foi isolado pela primeira vez em 1983 como um potente fator indutor do aumento da permeabilidade vascular 10.000 vezes mais potente que a histamina(18). Em 1989, identificou-se seu efeito mittico sobre clulas do endotlio vascular e a molcula recebeu o nome de VEGF(19). Essas duas caractersticas (especificidade pelo endotlio vascular e grande potncia) fazem do VEGF um fator pr-angiognico muito importante na patognese de doenas proliferativas. O VEGF produzido por macrfagos, linfcitos T, clulas tumorais e, no olho, pelas clulas do EPR, e o aumento na sua produo ocorre principalmente em condies de hipxia, que o principal indutor da produo de VEGF(20). Sua secreo polarizada nas clulas do EPR: em condies normais, a secreo da poro basal 2 a 7 vezes maior que a da poro apical, e sob hipxia essa razo muito maior(16). A expresso de receptores de VEGF tambm maior no endotlio da coriocapilar que est voltado para o EPR(21), demonstrando indiretamente a importncia do VEGF na manuteno da integridade da coriocapilar.

Figura 1 - Diagrama do mecanismo de neovascularizao sub-retiniana na DMRI

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Existem pelo menos 4 isoformas da molcula de VEGF biologicamente ativas em seres humanos, contendo 121, 165, 189 e 206 aminocidos, e cada uma desempenha um papel diferente no processo de angiognese(22). O VEGF165 a isoforma predominante no olho humano e existem evidncias de que seja a isoforma responsvel pela neovascularizao patognica no olho(23). No entanto, o VEGF165 no desempenha papel apenas na angiognese patolgica, essa isoforma contm toda a informao necessria para o desenvolvimento e a organizao da rede vascular retiniana normal. Por sua vez, as isoformas VEGF189 e VEGF206 no parecem exercer nenhum papel na neovascularizao patolgica(22), enquanto o VEGF121 parece ser essencial para o funcionamento normal da vasculatura retiniana(23). O VEGF estimula a angiognese direta e indiretamente. Alm de ser um potente mitgeno de clulas endoteliais(24-25), o VEGF aumenta a expresso celular de metaloproteinases, degradando a matriz extracelular e facilitando a penetrao dos neovasos no tecido(26-27), ao mesmo tempo em que diminui a expresso endotelial dos inibidores de metaloproteinases(26-27). O VEGF tambm possui efeito pr-inflamatrio(12,28-29), neuroprotetor(30), e um fator importante na estabilizao e remodelao vasculares(31). Tanto na embriognese da retina quanto nas retinopatias proliferativas, a expresso de VEGF est temporal, espacial e quantitativamente relacionada com a formao de neovasos(32). Durante a embriognese, a depleo de VEGF letal aos embries(33-34). Em modelo experimental com macacos, os nveis intra-oculares de VEGF esto diretamente relacionados gravidade da neovascularizao(32-35). Em situaes patolgicas, os nveis de VEGF esto elevados em olhos com retinopatia diabtica proliferativa e a forma isqumica da ocluso da veia central da retina(36-37). Da mesma forma, encontram-se elevados nas clulas do EPR e de vasos coroideanos de mculas com DMRI(38). O estudo de membranas neovasculares de olhos com DMRI retiradas cirurgicamente tambm revela aumento na expresso de VEGF em relao membranas secundrias a retinopatias no proliferativas(39-41). Os estudos em animais mostram que a expresso aumentada de VEGF uma condio necessria para a induo da neovascularizao ocular, e que somente esse aumento suficiente para induzir esse processo. O aumento da expresso de VEGF no EPR e nos fotorreceptores de ratos promove aumento da permeabilidade vascular, aumento da adeso leucocitria e formao de neovasos de coride(35). Em macacos, a injeo intravtrea de VEGF provoca o aparecimento de neovasos retinianos cujas caractersticas histolgicas e funcionais so muito semelhantes aos encontrados nas retinopatias proliferativas(42-43) (Figura 2). Por outro lado, a injeo intravtrea de anticorpo anti-VEGF previne a formao de neovasos sub-retinianos(23) (Figura 3). Todos esses resultados mostram a importncia do VEGF no processo de angiognese, e abriram caminho para as novas terapias antiangiognicas de retinopatias proliferativas. Outros fatores envolvidos na angiognese O VEGF no a nica molcula cuja expresso est aumentada na angiognese patolgica, embora parea ser a princi-

Figura 2 - Angiografia fluorescenica de olhos de macacos aps injeo intravtrea de VEGF mostrando dilatao e tortuosidade vascular, reas de no perfuso capilar, micro-aneurismas, reduo da zona avascular da fvea e vazamento de contraste no disco ptico. (Tolentino MJ, et al. Pathologic features of vascular endothelial growth factor-induced retinopathy in the nonhuman primate. Am J Ophthalmol. 2002;133(3):373-85.)

pal. Outras molculas, como o fator de crescimento de fibroblasto (basic fibroblast growth factor, bFGF), as angiopoetinas, o fator derivado do epitlio pigmentado (pigment epithelium-derived factor, PEDF), e os fatores de adeso relacionados matriz extracelular tambm exercem um papel importante no balano entre fatores pr- e antiangiognicos. Embora seja um fator muito importante na angiognese dos tumores, o papel do fator de crescimento de fibroblasto (bFGF) na neovascularizao ocular ainda no est bem estabelecido. Os nveis de bFGF encontram-se aumentados em membranas neovasculares sub-retinianas retiradas cirurgicamente(40-41,44), e em neovascularizao de coride induzida por laser(45). Em coelhos, o implante intravtreo de bFGF induz neovascularizao sub-retiniana(46). No entanto, a sua ablao gentica em camundongos no capaz de impedir o desenvolvimento de neovascularizao(47), sugerindo que o bFGF deva desempenhar um papel secundrio ao VEGF na formao dos neovasos oculares. As angiopoetinas so fatores de maturao e estabilizao de neovasos e so altamente especficas para o endotlio vascular, assim como o VEGF(48). A angiopoetina 1 promove maturao dos neovasos induzidos pelo VEGF, enquanto a angiopoetina 2 aumenta a neovascularizao estimulada pelo VEGF(48). Ambas angiopoetinas 1 e 2 esto presentes em membranas neovasculares(49). Embora a regulao da expresso dessas angiopoetinas e sua relao com as membranas neovasculares sub-retinianas sejam complexas(48), a inibio dessas molculas pode ser uma abordagem teraputica interessante.

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Figura 3 - Imunofluorescncia da retina de ratos demonstrando a inibio da neovascularizao patolgica e da adeso de leuccitos aps injeo intravtrea de anti-VEGF. (A) Injeo intravtrea de polietilenoglicol (controle) no inibe a neovascularizao patolgica. (B) Inibio da neovascularizao patolgica aps injeo intravtrea de anti-VEGF. (Ishida S, et al. VEGF164 mediated inflammation is required for pathological, but not physiological, ischemia-induced retinal neovascularization. J Exp Med. 2003;198(3):483-9).

O fator derivado do epitlio pigmentado (PEDF) um fator neurotrfico de fotorreceptores e inibidor da angiognese, produzido em grande quantidade pelo EPR(50). O PEDF age inibindo a migrao endotelial(51) e induzindo apoptose das clulas endoteliais neoformadas(52). Interessantemente, e ao contrrio do VEGF, sua expresso estimulada pela maior tenso local de oxignio e inibida pela hipxia(51), e por isso supe-se que o PEDF possa ser um antagonista natural do VEGF. Acredita-se, inclusive, que a ausncia de vasos na crnea e no vtreo seja devida a grande quantidade de PEDF encontrada nessas estruturas. O vtreo de pacientes com retinopatia diabtica proliferativa contm nveis mais baixos de PEDF em relao ao vtreo de olhos sem retinopatia proliferativa, e o inverso ocorre com os nveis de VEGF(53-55). A concentrao vtrea de PEDF tambm menor em olhos com DMRI(54). Embora seja um potente fator antiangiognico, a administrao sistmica de doses diferentes de PEDF provoca resultados controversos em relao neovascularizao retiniana induzida por laser: enquanto doses baixas de PEDF diminuem a taxa de neovascularizao, doses altas aumentam a taxa(48). Esses resultados geram dvidas em relao ao potencial do uso de PEDF para o controle da angiognese.

A invaso e migrao de clulas endoteliais atravs da matriz extracelular durante a angiognese so modulados pelas integrinas, uma famlia de molculas de adeso celular. As integrinas facilitam a migrao atravs da interao com molculas da matriz extracelular. Esse processo potencializado pela secreo de enzimas proteolticas chamadas metaloproteinases (MMPs) e modulado por inibidores tissulares das MMPs (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs). Vrias MMPs esto presentes em membranas neovasculares secundrias DMRI(56-57), e o prprio VEGF pode induzir a sua produo(58). Nveis aumentados de MMP-2 so detectveis no espao sub-retiniano de olhos com DMRI(59), assim como de MMP-2 e MMP-9 na membrana de Bruch de olhos de pacientes idosos(60). No entanto, essas enzimas se encontram na forma inativa, e a sua importncia na neovascularizao ocular ainda no est bem esclarecida.
TERAPIAS ANTIANGIOGNICAS PARA DOENAS PROLIFERATIVAS DA RETINA

Todo o conhecimento adquirido sobre o mecanismo de angiognese ocular tem possibilitado o desenvolvimento de

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vrios inibidores desse processo. Como o denominador comum das retinopatias proliferativas o aumento da permeabilidade e a proliferao vascular, os esforos tm se concentrado na inibio do principal fator responsvel por essas alteraes: o VEGF. Existem atualmente dois anticorpos produzidos especificamente para o bloqueio da interao do VEGF com o seu receptor no olho: pegaptanibe sdico e ranibizumabe. O pegaptanibe sdico um aptmero que se liga com muita afinidade e especificidade molcula de VEGF165, impedindo sua interao com o receptor de VEGF(61). O ranibizumabe um fragmento de anticorpo monoclonal recombinante humanizado que inibe todas as isoformas do VEGF(62). Os estudos clnicos para avaliar segurana e eficcia dessas drogas mostram que a injeo intravtrea produz benefcios anatmico e visual aos pacientes, independentemente do subtipo angiogrfico e tamanho das membranas neovasculares e da viso inicial, e os efeitos colaterais locais e sistmicos so insignificantes(61-65). O bevacizumabe um anticorpo monoclonal recombinante humanizado completo do qual deriva o ranibizumabe(66), e vem sendo usado para o tratamento da forma neovascular da DMRI e da retinopatia diabtica proliferativa. A droga foi aprovada para o tratamento sistmico do cncer de clon com metstase, mas vem sendo utilizada na forma de injees intravtreas, fora dos padres para os quais foi desenvolvida. Alguns estudos clnicos e experimentais com perodo de seguimento curto tm demonstrado ausncia de efeitos adversos oculares e sistmicos aps a injeo intravtrea de bevacizumabe(67-70), e os resultados do tratamento da forma neovascular da DMRI com bevacizumabe parecem ser bons(68,70-71), mas no existem estudos que demonstrem sua segurana quando injetado dentro do olho. A disseminao sistmica dessas drogas aps a injeo intravtrea um motivo de preocupao. Embora os estudos mostrem que existe passagem muito pequena das drogas atravs do olho, no se conhecem os efeitos da presena sistmica crnica de baixas doses desses antiangiognicos. Como a angiognese fisiolgica fundamental para a formao de vasos colaterais importantes para a sobrevivncia de reas hipxicas em outros rgos, somente a experincia com o uso dessas drogas ser capaz de mostrar a segurana sistmica e at mesmo ocular. Existem outras abordagens teraputicas do bloqueio da angiognese ocular em fase de desenvolvimento. Entre elas, destacam-se a terapia gnica com a administrao intra-vtrea de PEDF, o VEGF Trap, o siRNA (small interfering RNAs), e a administrao sistmica de lactato de esqualamina. Todas possuem estudos pr-clnicos mostrando sua eficincia no bloqueio da angiognese e os estudos clnicos esto nas fases I e II.
CONCLUSO

mitido o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da forma neovascular da DMRI, da retinopatia diabtica e das ocluses vasculares da retina, o que as tornaro armas preciosas no tratamento das principais causas de cegueira legal irreversvel em indivduos com mais de 65 anos.
ABSTRACT

Angiogenesis is the process involving the growth of new blood vessels from preexisting vessels which occurs in both physiologic and pathological settings. It is a complex process controlled by a large number of modulating factors, the proand antiangiogenic factors. The underlying cause of vision loss in proliferative retinal diseases, such as age-related macular degeneration and proliferative diabetic retinopathy, are increased vascular permeability and choroidal neovascularization, and vascular endothelial growth factor (VEGF) plays a central role in this process. VEGF is produced in the eye by retinal pigment epithelium (RPE) cells and is upregulated by hypoxia. There are four major biologically active human isoforms, of which VEGF165 is the predominant in the human eye and appears to be the responsible for pathological ocular neovascularization. Besides being a potent and specific mitogen for endothelial cells, VEGF increases vascular permeability, inhibits endothelial cells apoptosis, and is a chemoattractant for endothelial cell precursors. VEGF is not the only growth factor involved in ocular neovascularization. Basic fibroblast growth factor (bFGF), angiopoietins, pigment epithelium-derived factor (PEDF), and adhesion molecules also play a role in the pro- and antiangiogenic balance. Advances in the understanding of the bases of pathological ocular angiogenesis and identification of angiogenesis regulators have enabled the development of novel therapeutic agents. Anti-VEGF antibodies have been developed for intravitreal use, and other approaches are currently under investigation. These new drugs may be powerful tools for the treatment of the leading causes of irreversible blindness in people over age 65. Keywords: Neovasculatization, pathologic; Macular degeneration; Diabetic retinopathy; Angiogenesis inhibitors; Angiogenesis inducing agents
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O tratamento das retinopatias proliferativas vem sendo rapidamente aprimorado. O melhor conhecimento dos mecanismos que levam angiognese ocular patolgica tem per-

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*Participao neste evento conta 20 pontos para a revalidao do ttulo de especialista em oftalmologia

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