INTRODUCCIN

Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas, tambin conocido como ELISA, es tal vez el mtodo de diagnstico ms reconocido va inmunoanlisis, llamado laboratorio hmedo, que es usado por la mayora de empresas bioqumicas en actualmente. ELISA utiliza el mtodo de inmunoanlisis para ver si los organismos o virus que provocan enfermedades estn presentes en una muestra lquida; por eso es llamado laboratorio hmedo. Elisa podr determinar la presencia del analito usando reactivos lquidos y sustancias qumicas en el anlisis que ms adelante pueden ocasionar una marca que calificar y tambin, evaluar el analito en la muestra. ELISA es vital para determinar la presencia de una enfermedad y buscar formas para curarla o eliminarla.

CONCEPTO La tcnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimtico ampliamente empleado en el rea mdica para la cuantificacin de molculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parsitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antgenos de patgenos, toxinas, antgenos. Las tcnicas de ELISA son tambin muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las molculas de inters en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran los mtodos directo e indirecto. El mtodo directo permite la deteccin del antgeno con un anticuerpo especfico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el mtodo indirecto el antgeno reacciona con el anticuerpo especfico. El complejo antgeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser especfico de especie, es el que est marcado enzimticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antgenos. En ambos mtodos, la reaccin enzimtica puede ser detectada espectrofotogrficamente con un lector ELISA. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como seleccin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originara un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que stos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sera el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa.

-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antgeno-anticuerpo. En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediante centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad. Tambin, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacin, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro mtodo de diagnostico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultneamente, frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes estn presentes en el sujeto frente a esa infeccin. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.

GENERACIONES DE ELISAS Primera generacin: Las pruebas de ELISA de primera generacin miden anticuerpos dirigidos contra una protena de fusin recombinante que incluye la secuencia NS4 unida a una superxido dismutasa bacteriana; el antgeno es llamado "antgeno c100-3" Segunda generacin: Los ELISA de segunda generacin incluyen antgenos sintticos adicionales y detectan anticuerpos que reaccionan con la protena central (denominado antgeno "c23-3") y la protena no estructural NS3 (antgenos "c33-C" "c-200"). Aunque C es una protena estructural, los ELISA no miden anticuerpos dirigidos contra la superficie del virin. Tercera generacin: Los ELISA de tercera generacin que miden anticuerpos contra la regin NS5 an estn bajo estudio. An no existen pruebas que permitan evaluar los anticuerpos neutralizantes por lo sealado en prrafos anteriores. Las pruebas antes descritas permiten realizar un escrutinio inicial en la bsqueda de enfermedad aunque esto debe tomarse con reserva debido a que algunos anticuerpos aparecen primero que otros y esto hace necesario que el paciente sea seguido en la bsqueda de la respuesta serolgica (por ejemplo, los anticuerpos contra los antgenos C y NS3 aparecen antes que los anticuerpos contra c100-3) hasta por 12 meses. Por tal razn se han desarrollado las pruebas confirmatorias tales como los RIBA (iniciales en ingls de los ensayos de inmonoblot recombinantes). La sensibilidad de las pruebas de ELISA de segunda generacin actualmente disponibles es del 88%, lo cual apoya an ms la necesidad de realizar pruebas serolgicas an despus de haber superado la fase aguda. Cuarta generacion: Se adicion el p24.Elisa directo para la deteccinde antgeno p24 y un ELISA indirecto para detectar anticuerpos, reduce la ventana diagnstica en 4 das.

FASES DE UN ENSAYO ELISA Las 4 fases del mtodo de ELISA son las siguientes: 1. Conjugacin del anticuerpo o (peroxidasa, fosfatasa alcalina): del antgeno con una enzima

El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sndwich,etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno.

2. Unin del antgeno(o del anticuerpo) a los pocillos: La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas.

3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos: En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal el poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno.

4. Revelado de la reaccin enzimtica: Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica mediante espectrometra.

DISPOSITIVOS EMPLEADOS EN ELISA Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plsticos tratado para aumentar su capacidad de absorcin(fenmeno de superficie) de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas robotizados. Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados

CLASIFICACIN Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes. Anticuerpos Marcados ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sandwich Doble (DAS) Heterologo (HADAS) Antgenos Marcados ELISA Competitivo 1) ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas): Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas pero en las que se tengan la certeza de la ausencia del antgeno buscado.Asimismo se incluyen controles positivos(soluciones dende se encuentra el antgeno buscado, o bien se le ha aadido).

2) ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a a unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de anticuerpos.

3) ELISA sndwich DAS (Double Antibody Sandwich): Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte)conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

4) ELISA Sndwich HADAS: Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte),los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminarlos antianticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

10

5) ELISA Competitivo: Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adicin enconcentracin conocida de una mezcla de antgenosdel anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcadoscon una enzima y antgenos desconocidos objeto deestudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenosdel anticuerpo usado en el paso anterior, marcadoscon una enzima. Lavar para eliminar los antgenos queno hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobreel que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Sepuede parar la reaccin si se desea. Lectura visual ocolorimtrica del producto final coloreado de ambaspruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudiono tienen nada que ver con los anticuerposempleados para tapizar el soporte. Si haydiferencia en las lecturas de ambos pocillos, elantgeno objeto de estudio, est relacionadoserolgicamente con el anticuerpo empleado paratapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica,es proporcional a la concentracin del antgenoproblema en la muestra.

11

MARCADORES ENZIMTICOS MAS COMUNMENTE UTILIZADOS EN ELISA La enzima escogida como marcador debe unirse fcilmente a antgenos y anticuerpos, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromognico o fluorognico conveniente y de fcil preparacin. Las enzimas ms utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rbano y galactosidasa; a continuacin se muestra una tabla con las ventajas y desventajas de cada una as como los substratos que se emplean con cada una de ellas. Las operaciones de marcado o conjugacin, llevan implcitas dos etapas: Purificacin de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una precipitacin generalmente salina de las protenas del antisuero, seguida de una dilisis y purificacin de la fraccin de anticuerpos mediante filtracin molecular, cromatografa o separacin en gradiente de densidad mediante ultracentrifugacin. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y ajustarlos a una dosis de 1mg/mL. Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente que normalmente suele ser el glutaraldehdo o el del periodato sdico (apenas existen diferencias entre ellos en cuanto a los resultados finales).

12

Actualmente existe otra posibilidad para sustituir el conjugado anti-especie para la deteccin de IgGs y es la utilizacin de protena A o G marcadas con peroxidasa. Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su utilizacin; esta conservacin se suele realizar mediante liofilizacin, congelacin a 70C o filtrado estril y conservacin a -20C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado estril.

13

La bsqueda de la concentracin ptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA empleado; para cualquier ELISA que utilice antianticuerpos conjugados, se suele probar diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas diluciones de antisuero en placas tapizadas con antgeno a concentracin idnea Aquella dilucin del conjugado que produzca menor reaccin inespecfica(menor color de fondo o background) con muestras negativas e implique una clara distincin de las muestras positivas, ser la ptima. La eleccin de una concentracin de conjugado ptima va completamente ligada a planteamientos econmicos en los que se ha de procurar el mayor ahorro del conjugado an a costa de aumentar el tapizado. La eleccin del substrato es de gran importancia para la estandarizacin del mtodo ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, repetibilidad, facilidad de lectura y complejidad de preparacin, as como estabilidad despus de la parada de reaccin.

CARACTERSTICAS QUE DEBEN REUNIR LAS ENZIMAS PARA ELISA

o o o o o o o o o

Debe ser econmica y obtenerse con un alto grado de pureza Elevada actividad especfica Estable en condiciones de almacenamiento y prueba Soluble Sencilla, sensible y medible con gran rapidez No debe estar presente en el medio analizado Sustratos inhibidores no deben interferir con el ensayo No perder actividad cuando se conjuga Debe conservar la actividad en condiciones de ensayo

LIMITACIONES DEL ELISA

Anticuerpos solo son producidos en centros especializados. Anticuerpos necesitan tener propiedades correctas. ELISA necesita ser validado para cada aplicacin. ELISA necesita estar acoplado con confirmacin de identidad.

14

INTERPRETACION DE RESULTADOS La prueba ELISA VIH puede resultar: 1. No reactiva: (o negativa) Significa que no se encontraron anticuerpos detectables en el momento de la prueba. Es necesario tener en cuenta el llamado "perodo de ventana" y analizar la necesidad o conveniencia de repetir la prueba posteriormente. Si este periodo de ventana inmunolgica an no ha transcurrido totalmente es necesario realizarse otra prueba a los 3 meses para tener la plena seguridad de que esta primer prueba no es lo que se llama un -falso negativo- es decir que salga negativo porque el cuerpo an no ha reaccionado a la presencia del virus, es decir no ha creado anticuerpos contra el virus vih y la prueba de sangre lo que analiza es si ya hay o no hay anticuerpos contra el virus, la prueba no ve al virus, lo que ve son los anticuerpos, por ello la prueba de Elisa para vih se denomina prueba indirecta. Para ser an ms claro y especifico si se encuentran en el examen anticuerpos para el vih, significa que existe el vih en el organismo si no se encuentran anticuerpos significa que el virus no esta en el organismo o tambin puede significar que el organismo an no ha dado respuesta a la presencia del virus creando estos anticuerpos (es decir que esta en el periodo de ventana inmunolgica) y por lo tanto en la muestra de sangre no se pudo ver si exista o no el vih, entonces se requiere darle al organismo ese tiempo aproximado de los 3 meses para que responda y cree los anticuerpos que sern los que se vern en la prueba de Elisa. Si una segunda prueba que se haga a los 3 meses sale negativa significa que usted definitivamente no tiene el virus vih; la sugerencia es continuar con el uso del condn, que es la nica forma de prevenir la infeccin por vih. 2. Reactiva: (positiva) Significa que se detectaron anticuerpos contra el vih y es necesario confirmar su especificidad pues la prueba puede ser realmente reactiva o falsamente reactiva. Normalmente se debe realizar otra prueba EIA de deteccin de anticuerpos, y si esta resulta reactiva se debe hacer una prueba confirmatoria como el Western blot. Los resultados del ELISA son expresados de forma diversa respecto al IFI.
Resultado test ELISA Nivel anticuerpos Negativo Duduso Positivo < 10 % 10-13% > 13 % Positividad al test ELISA Nivel bajo Nivel medio Nivel alto Nivel anticuerpos <80% 80-150% 150-300%

15

APLICACIONES DEL ELISA. 1. Diagnstico de enfermedades virales -Rubola -Citomegalovirus -Herpes virus en RN y embarazadas -HIV (Ver ms adelante...) 2. Diagnstico de enfermedades parasitarias -Malaria -Tripanosomiasis -Esquistosomiasis -Tripanosoma cruzi en fase crnica (no en la fase aguda, durante la cual el diagnstico se efecta por deteccin de parsitos en sangre!!!) 3. Respuesta humoral en enfermedades autoinmunes Se desarrollaron sistemas ELISA para analizar Ac contra: -ADN -Hsitona -Tiroglobulina Y para detectar: -Complejos inmunes -Factor reumatoideo 4. Endocrinologa Hormonas proteicas -Gonadotrofina corinica humana (HCG) -Hormona luteinizante -Hormona folculo estimulante -Insulina Hormonas esteroideas -Estrgenos -Progesterona -Testosterona -Cortisol 5. Cuantifiicacin de algunos medicamentos 6. Deteccin de protenas oncofetales

16

MTODO DE ELISA EN EL DIAGNOSTICO VIRAL Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de la infeccin. Elisa en mtodos directos: Detecta la presencia de antgenos virales. Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida, en general el pocillo de una microplaca o una pequea esfera de plstico. El antgeno viral presente en la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas vara. En la reaccin con la peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un color caracterstico. En el caso de la fosfatasa la desfosforilizacin es la responsable directa de la aparicin del color. Por esta tcnica se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotmetros especialmente diseados, siendo entonces una tcnica ms objetiva. Elisa en mtodos indirectos: Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del husped. Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los ltimos aos al diagnstico de anticuerpos virales. Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente econmico, sensible y de lectura objetiva (instrumental). La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se inmovilizan sobre una fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual.

17

ELISA APLICADA EN LA RUBEOLA Significacin y aspectos generales La rubola es una infeccin viral contagiosa de carcter leve que afecta principalmente a los nios y los adultos jvenes . Se caracteriza por un exantema eritematoso maculopapuloso de dos o tres das de duracin. Sin embargo, ms del 50% de las infecciones por este virus no son evidentes desde el punto de vista clnico. Otros sntomas de la rubola son febrcula, sntomas leves de las vas respiratorias superiores y adenopatas linfticas suboccipitales. En los adultos jvenes son sntomas frecuentes las artralgias y artritis transitorias, mientras que las complicaciones ms graves, como la encefalitis y la prpura trombocitopnica, son muy raras. Aunque la rubola en el nio y el adulto suele ser una enfermedad benigna y autolimitada, la infeccin del feto durante el primer trimestre de gestacin puede causar aborto espontneo, mortinato o defectos congnitos de nacimiento. Los sujetos que adquieren la infeccin dentro del tero pueden nacer con defectos del nacimiento evidentes o, lo que es ms frecuente, pueden parecer normales y permanecer normales o experimentar ms adelante complicaciones. El sndrome de la rubola congnita se conoce desde hace mucho tiempo y se caracteriza por la presencia de cardiopata congnita, sordera neurosensorial, retraso mental y retraso del crecimiento intrauterino. Tras una epidemia de rubola en 1964, se identificaron otras manifestaciones clnicas de la rubola congnita, tales como prpura trombocitopnica, hepatitis, lesiones seas y meningoencefalitis en el recin nacido. Adems, la diabetes mellitus y la panencefalitis rubelica progresiva son manifestaciones tardas de la rubola congnita recientemente identificadas. La rubola es endmica en todo el mundo . En los pases que carecen de programas de vacunacin, entre el 10 y el 25% de las mujeres en edad frtil son seronegativas y susceptibles a la infeccin. Si la mujer adquiere la rubola durante el embarazo, especialmente durante el primer trimestre, el feto puede tener riesgo de infectarse. La infeccin aguda por el virus de la rubola puede confirmarse analizando simultneamente pares de sueros (fase aguda y fase de convalecencia) y comprobando si existe seroconversin o una elevacin al cudruplo de los ttulos de anticuerpos IgG, o detectando anticuerpos IgM especficos del virus de la rubola. La presencia de IgM especfica del virus de la rubola en el neonato o la persistencia de un ttulo elevado de anticuerpos IgG durante ms tiempo del que cabe esperar para los anticuerpos adquiridos de forma pasiva (6 meses) confirma el diagnstico de rubola congnita.

18

La inhibicin de la hemaglutinacin (IH), la primera tcnica de uso extendido para la deteccin de anticuerpos frente al virus de la rubola, ha sido el estndar de referencia con el que se han comparado mtodos ms nuevos. Sin embargo, la prueba IH es laboriosa y difcil de realizar, ya que es preciso pretratar las muestras de suero para eliminar la lipoprotena-beta. La prueba ELISA ha demostrado ser un mtodo sensible y fiable para la deteccin de anticuerpos frente al virus de la rubola. La prueba ELISA es menos incmoda y ms aplicable al anlisis de grandes cantidades de muestras, puesto que las determinaciones se realizan en una sola dilucin de suero que no requiere pretratamiento. Adems, los resultados de la prueba ELISA se basan en una lectura objetiva de absorbencia que puede correlacionarse con los ttulos de IH . Fundamento de la prueba elisa El sistema de pruebas Rubella IgG ELISA de Zeus est diseado para detectar anticuerpos de tipo IgG contra la rubola en suero humano. Los pocillos de las tirillas de micropocillos de plstico se sensibilizan mediante adsorcin pasiva con antgeno del virus de la rubola. El procedimiento de la prueba comprende tres pasos de incubacin: 1. Los sueros de la prueba (debidamente diluidos) se incuban en micropocillos revestidos de antgeno. Los anticuerpos contra antgeno especfico que existan en la muestra se fijarn al antgeno inmovilizado. La placa se lava para eliminar el anticuerpo no fijado y otros componentes sricos. 2. Se agrega anti-IgG humana (especfica de la cadena ) de cabra conjugada con peroxidasa a los pocillos y se incuba la placa. El conjugado reaccionar con el anticuerpo tipo IgG inmovilizado en la fase slida del paso 1. Se lavan los pocillos para eliminar el conjugado que no haya reaccionado. 3. Los micropocillos que contienen conjugado de peroxidasa inmovilizado se incuban con solucin de sustrato de peroxidasa. La hidrlisis del sustrato por la peroxidasa produce un cambio de color. Transcurrido un tiempo, se detiene la reaccin y se mide fotomtricamente la intensidad del color de la solucin. La intensidad del color de la solucin depende de la concentracin de anticuerpos en la muestra original analizada.

19

CONCLUSIONES

El enzimoinmunoanlisis es una de las tcnicas inmunoqumicas ms importantes desarrollada en los ltimos aos. Esta tcnica presenta como requisito que los Ac o los Ag se puedan ligar a una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunolgica como la enzimtica. Las enzimas consideradas hasta ahora ms satisfactorias son: Peroxidasa del rbano picante, Glucosa oxidasa, Beta-galactosidasa, Fosfatasa alcalina (FAL). El ELISA puede utilizarse para el anlisis de cualquier Ac siempre que el Ag adecuado se pueda inmovilizar convenientemente en la fase slida. ELISA es una tcnica de bajo costo, estabilidad de los reactivos, seguridad, sensibilidad, facilidad de realizacin.

20

BIBLIOGRAFA -Craig, J.C. et. al. Journal of Biological Standardization. 17; 1989; 125-135. -Engvall, E. and Perlmann, P.Immunochemistry. 8:871; 1971. -Gardas, A. and Lewartowska, A. Journal of Immunological Methods. 106; 1988; 251-255. -http://www.guiadelasalud.info/articulo.php?art=93&id=245 -http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf -http://www.alimentacioncanina.com/salud-mascotas/que-es-el-test-de-elisa-paraleishmaniosis/ -Torfason EG, Galindo R, Keyserling HL. Comparison of five ELISA assays for IgG antibodies against Coxsackievirus B1. J Med Virol 1988;25:53-60. -http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf -Voller, A., Barlett, A. y Bidwell, D. E. Enzyme- immunoassays for parasitic diseases. Trans R Soc Trop Med Hyg 70:98-106, 1976 -http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo30_parte1.pdf -http://www.cocmed.sld.cu/no12/n12ori5.htm -http://www.indetectable.org/pages/noticias/examenes.htm http://www.vet.unicen.edu.ar/html/Areas/Inmunologia/Documentos/2006/TP4%202 0061.pdf

21