TEMA 1. METODOS DE ANLISIS EN CIDOS NUCLEICOS 1. Propiedades c. nucleicos. 2. Mtodos de estudio. 3.

La tcnica de PCR y sus variaciones

Gentica: ciencia que estudia los mecanismos de la herencia y los genes desde cualquier perspectiva.

Anlisis Gentico
GENOTIPO
Aislamiento de variantes fenotpicas Anlisis de descendientes de cruzamientos controlados entre variantes fenotpicas Anlisis bioqumico de los procesos celulares controlados por genes concretos Anlisis microscpico

FENOTIPO

Anlisis del DNA

Gentica inversa (a veces denominado clonado posicional)

Gentica molecular aplicada: usa los principios del conocimiento de la estructura y funcin del DNA para investigar la base del fenotipo controlado por un genotipo determinado en condiciones normales y patolgicas.

reas y Mtodos de estudio

BSICAS MTODOS

Gentica clsica CITOGENTICA Gentica microbiana Gentica molecular Gentica de poblaciones

Cruzamientos exp. Citogenticos Microbiolgicas Biologa molecular Computacin

Matemticas/estadstica Gentica humana

APLICADAS

Medicina Agricultura y ganadera

COMPLEMENTARIEDAD Y ESTRUCTURA TRI-D DEL DNA

Factores de transcripcin: regulan la iniciacin de sntesis de RNA por unin a secuencias de DNA especficas en los promotores

SNTESIS DE DNA: REPLICACIN

FLUJO DE LA INFORMACIN GENTICA

SNTESIS DE RNA Y PROTENAS: TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN

Anlisis de c. nucleicos
Extraccin y purificacin Digestin con enzimas de restriccin Electroforesis en gel Transferencia de Southern e hibridacin Sntesis de cidos nucleicos Preparacin y sntesis de sondas marcadas Reaccin en cadena de la polimerasa Secuenciacin de DNA

EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE C. NUCLEICOS Homogenizacin fsicos (abrasin, sonicacin, congelacin, qumicos (detergentes como SDS) enzimticos (lisozima)

choque osmtico)

Separacin y purificacin sedimentacin (gradientes de sacarosa, glicerol o sales de Cesio) cromatografa (hidroxihapatito HAP) electroforesis (geles de agarosa o poliacrilamida PAGE) dilisis a travs de membranas (eliminacin de sales) extraccin con disolvantes orgnicos (fenol, cloroformo) precipitacin con alcoholes (etanol, isopropanol) digestin enzimtica (proteinasa K, pronasa, RNasa, DNAasa)

PRECAUCIONES EN LA EXTRACCIN DE DNA Y RNA Los extractos de c. nucleicos contienen nucleasas y ribonucleasas en alta concentracin. Inhibidores de nucleasas (c. Etilen-diamino-tetra-actico EDTA, quelante de iones Mg++).

Inhibidores de ribonuclesas (beta-mercaptoetanol, ditiotreitol DTT, cloruro o isoticianato de guanidinio, sales de vanadio.
Restos de detergentes en vidrio, restos de Rnasas, tratarlo con dietilpirocarbonato DEPC y someterlo a altas temperaturas.

Usar guantes, especialmente al trabajar con RNA.

EXTRACCIN DE DNA
Homogenizacin tejido e incubacin en (Tris-hidroximetilaminometano pH 7-8 TRIS 0.3M; Dodecil sulfato sdico SDS 0.5%; c. Etilen-diamino-tetra-actico EDTA 0.01 M; Proteinasa K 0.5 U/ul) a 65 C Eliminacin protenas por extraccin con disolventes orgnicos (Fenol saturado con TRIS pH 0.1 M pH 8; Cloroformo: alcohol isoamlico) Eliminacin RNA (RNAasa) Precipitacin (Etanol; Isopropanol en presencia de Na+: 0.3M NaAc, 0.2M NaCl)

Disolucin en TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 7.5)

Bromuro de metil-trimetil-amonio CTAB Chelex

CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE CsCl

CsCl 1 g/ml DNA EtBr 10 mg/ml: 80 ul/ml

45000-60000 rpm 16-24 h

EXTRACCIN DE RNA TOTAL

PURIFICACIN DE RNAm

UTILIZANDO PROPIEDADES DE LOS C. NUCLEICOS.

Espectrofotometra ultravioleta
Mximo de absorcin de c. nucleicos a 245-260 nm

Fluorescencia
Los ac. Nucleicos no presentan fluorescencia pero si se intercalan ciertas molculas intercalantes como el EtBr fluorescen al ser iluminadas con luz UV

Comportamiento en electroforesis
Dependiente de la matriz utilizada (agarosa o PAGE) y de las condiciones de electroforesis

ESPECTROFOTOMETRA
Densidad ptica (DO): es la absorbancia de una disolucin medida con un paso ptico de 1 cm a una determinada longitud de onda
DO260= 1 equivale a una concentracin de 50 ug/ml de DNAdc y unos 40 ug/ml de RNA o DNAcs Las protenas absorben a 280 nm, por lo que la relacin A260/A280 se utiliza para determinar la pureza de un ac. Nucleico.

Los polisacridos y pigmentos absorben a 230 nm, por lo que la relacin A230/A260 se utiliza para determinar contaminacin con stos y con RNA de alto peso molecular.

ELECTROFORESIS DE CIDOS NUCLEICOS Factores en electroforesis: Matriz o soporte reticulado y grado de reticulacin
Disolucin tampn de electroforesis (Tris-Borato, Tris-Acetato) Campo elctrico (50-100 V en agarosa, hasta 1000 V en PAGE de secuenciacin) Temperatura

Estructura y naturaleza de las molculas a separar (carga, tamao y forma)

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

1-10 V/cm

% Concentraci n Rango pb 0.5 1000-30.000 0.7 800-12.000 1.0 500-10.000 1.2 400-7000 1.5 200-3000 2.0 50-2000
Xileno de cianol 5 Kb Azul de bromofenol 0.5 Kb

Tris-Borato-EDTA Tris-Acetato-EDTA

5000 pb 1000 pb 600 pb 200 pb

EFECTO DE LA CONFORMACIN DEL DNA EN LA MOVILIDAD ELECTROFORTICA

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE (PFGE)

Separacin de hasta 2 Mb

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Acrilamida [CH2=CHCONH2]n N,NMetilen-bis-acrilamida (CH2=CHCONH2)2CH2

% Gel PAA Rango pb 3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 1000-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100
En presencia de Persulfato amnico y TEMED (N.N,N, N tetra-metil-etilen-diamina) Geles de secuenciacin desnaturalizantes (incorporan urea y formamida)

DESNATURALIZACIN DEL DNA

1. Composicin de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza inica

Tm de un oligo de 10-20 bases a 1 M Na+ en C = 2(n A + T) + 4(n G + C)

RENATURALIZACIN DEL DNA

Temperatura Fuerza inica Concentracin de DNA Tiempo de reaccin Agentes desnaturalizantes: Formamida Urea

TRANSFERENCIA DE SOUTHERN E HIBRIDACIN

1. HCl 0.2N 2. NaOH 0.5N, NaCl 1.5M 3. Tris-HCl buffer pH 7.4, NaCl 1.5M 4. 20xSSC (NaCl 3M, Citrato Na 0.3M)

TRANSFERENCIA NORTHERN HIBRIDACIN

FRAGMENTACIN DE AC. NUCLEICOS

Mtodos fsicos fuerza de cizalla ondas de presin por ultrasonido Mtodos qumicos hidrlisis cida hidrlisis bsica Mtodos enzimticos endonucleasas inespecficas endonucleasas especficas

EL SISTEMA DE MODIFICACIN-RESTRICCIN BACTERIANO

Sistema tipo I Sistema tipo II Sistema tipo III

Los enzimas de restriccin tipo II son protenas homodmericas y reconocen secuencias de DNA palindrmicas

BamHI

G ' GATCC

SITIO INESPECFICO

SITIO ESPECFICO

TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIN

ENZIMAS DE AC. NUCLEICOS EN APLICACIONES GENTICAS

LIGASAS: formacin del enlace fosfo-di-ster

SECUENCIACIN DE DNA

KARY MULLIS Y LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Dos cebadores (oligonucletidos cortos de DNA de cadena simple) utilizados para amplificar un segmento definido de DNA genmico.

Premio Nobel 1993

Ventajas de la PCR: especificidad y sensibilidad

MECANISMO Y COMPONENTES DE LA PCR

DNA a amplificar (diana) primers (18-25 nts) DNA polimerasa termoestable dNTPs

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Desnaturalizacin

Hibridacin primers

Extensin (sntesis DNA)

Produccin PCR = (cantidad DNA inicial) x (1 + % eficiencia) n ciclos

Eficiencia: % de conversin de DNA molde a producto por ciclo P. ej. con una eficiencia del 70% se obtiene 1 g a partir de 1 pg en unos 26 ciclos
CICLOS
1
2 4

COPIAS
2
4 16

10
15 20 25 30

1,024
32,768 1,048,576 33,554,432 1,073,741,824

POLIMERASAS TERMOESTABLES

Pol termoestables:
activas despues de repetidamente a 95C ptimo a 75C

Taq: Thermus aquaticus Tli: Thermococcus litoralis Pfu: Pyrococcus furiosus Tth: Thermus thermophilus

DISEO DE PRIMERS PARA PCR

Longitud de los primers (usualmente 18-24 nts) Temperaturas de fusin Tm (usualmente 44-55% G-C) No complementariedad entre los dos primers en los extremos 3 (problema de dmeros de primer)
No lazos intracatenarios (carecer de secuencias palindrmicas) Distancia entre primers (ideal entre 150-500 pb pero hasta 20 Kb)

EFECTO DE LA TEMPERATURA DE HIBRIDACIN EN LA PRODUCTIVIDAD, SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

PAR METRO Temperatura hibridacin

CONDICIONES DE LA PCR OPTIMIZABLES

ALTERACI N Incremento Decremento EFECTO Aumenta especificidad Aumenta sensibilidad y productividad Alta decrece especificidad Baja insuficiente productividad Dilema eficiencia y tasa de error Baja incrementa especificidad Alta incrementa sensibilidad

DNA polimerasa

Concentraci n

Tipo de Taq Concentraci n de Mg++ Variaci n

Ciclos

Temp. desnaturaliaci n N mero ciclos Duraci n extensi n

Alta incrementa especificidad pero actividad Taq decrece Solo subir a ms de 35 si menos de 103 moleculas de partida Incrementa sensibilidad en PCR larga

SNTESIS DE DNAc Sntesis de DNAc primera cadena requiere: RNAm

dNTPs primer (oligodT, pDn6 al azar o especfico de un gen) Transcriptasa reversa rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante) RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves) RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)

SNTESIS DE LA SEGUNDA CADENA USANDO AUTOPRIMING

LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERA CON TRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR)

Combina la reaccin de formacin de DNAc y la amplificacin por PCR. Puede ser de un solo enzima (rTth) o en dos reacciones (primero usando p. ej. AMV-RT y despus Taq polimerasa para amplificar el DNAc.

APLICACIONES BSICAS DE LA RT-PCR

RACE: Amplificacin rpida de extremos de DNAc RT-PCR cuantitativa

Aislamiento de transcritos que estn presentes a diferentes niveles en dos poblaciones de RNAm differential display suppresion substraction hybridization