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UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHO CAMPUS DE BOTUCATU

Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biocincias IBB

Curso de Nutrio Disciplina de Microbiologia Geral de Alimentos

Professores
Ary Fernandes Jnior* Eduardo Bagagli Joo Manuel Grisi Candeias Josias Rodrigues Maria de Lourdes R. S. da Cunha Rodrigo Tavanelli Hernandes* Sandra de Moraes Gimenes Bosco* Vera Lcia Mores Rall

Tcnico Acadmico
Luiz Alquati

Aluno(a):____________________________________________________________ * Docentes responsveis pela disciplina

ndice
Cuidados a serem seguidos nas aulas prticas................................................................ 3

CICLO DE BACTERIOLOGIA Roteiro 1 Morfologia, colorao e estrutura da clula bacteriana................................. Roteiro 2 Meios de cultura e condies fsicas de cultivo bacteriano........................... Roteiro 3 Ao de um fator intrnseco de alimento sobre as bactrias......................... Roteiro 4 Higienizao das mos.................................................................................. Roteiro 5 Efeito dos agentes fsicos e qumicos sobre as bactrias............................. Roteiro 6 Escherichia coli e Salmonella spp................................................................. Roteiro 7 Bacillus cereus............................................................................................... Roteiro 8 Staphylococcus aureus.................................................................................. 3 5 7 8 8 9 10 10

CICLO DE MICOLOGIA Roteiro 9 Aspectos macro e microscpicos de fungos.................................................. 10 Roteiro 10 Reproduo assexuada e sexuada de fungos............................................. 13 Roteiro 11 Fungos deteriorantes em alimentos............................................................. 16 Roteiro 12 Fermentao................................................................................................ 16

Roteiro 13 Deteco de fungos em alimentos............................................................... 17

CUIDADOS A SEREM SEGUIDOS NAS AULAS PRTICAS

1. No deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos prticos so realizados. 2. No fume e no coma no laboratrio. Evite levar boca qualquer objeto (lpis, rtulo, dedo, etc.). 3. No use frascos do laboratrio para tomar gua. 4. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a mesa ou assoalho, ferimentos de qualquer espcie, aspiraes da cultura na boca, etc.). 5. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 6. Lave bem as mos com desinfetante antes de deixar o laboratrio. 7. Antes de iniciar suas atividades e depois de termin-las, limpe com desinfetante o seu local de trabalho.

Nota: OBRIGATRIO o uso de avental durante os trabalhos prticos. Aps o trmino das aulas prticas o avental deve ser guardado em sacola plstica. Evite sair de avental

pelo Campus e pelas ruas da cidade.

Roteiro 1 - Morfologia, colorao e estruturas da clula bacteriana

1. Mtodo de Colorao de Gram Este mtodo de colorao diferencial permite a separao das bactrias em dois grandes grupos: Bactrias Gram POSITIVAS que se coram de AZUL Bactrias Gram NEGATIVAS que se coram de VERMELHO Tcnica: - Com o auxlio de uma ala de nquel-cromo flambada (esterilizada), colocar duas gotas de salina na lmina limpa; - Flambar novamente a ala e, depois de esfri-la, transferir uma parte de crescimento bacteriano para uma lmina e misturar com a salina; - Deixar secar; - Fixar o esfregao, passando a lmina 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen; - Deixar a lmina esfriar e cobrir o esfregao com a soluo de violeta genciana por um minuto; - Escorrer a violeta genciana, cobrir o esfregao com lugol e esperar mais um minuto; - Escorrer o lugol e descorar o esfregao pelo lcool. Para isto, deixe a lcool cair gota a gota sobre a lmina inclinada. Considerar o esfregao suficientemente descorado quando o lcool no retirar mais corante; - Lavar em gua corrente; - Cobrir o esfregao com a soluo de fucsina e esperar 30 segundos; - Lavar a lmina em gua corrente e secar com o auxlio de um papel de filtro. - Observar ao microscpio com a objetiva de imerso e desenhar.

Exerccio 1 Faa esfregaos e core-os pela tcnica de Gram.

Lmina A Forma:________________ Gram:_________________

Lmina B Forma:________________ Gram: ________________

Lmina C Forma:________________ Gram: ________________

Lmina D Forma:________________ Gram: ________________

Lmina E Forma:________________ Gram: ________________

Exerccio 2 Observar lminas em preparaes especficas para visualizao de cpsulas e esporos de bactrias. Desenhar:

Cpsulas

Esporos

Roteiro 2 - Meios de cultura e condies condies fsicas de cultivo bacteriano

A) Meios de Cultura Para o cultivo e identificao das bactrias so utilizadas solues e substncias nutritivas, denominadas meios de cultura que podem ser classificados com base na sua composio, quanto ao seu estado fsico e quanto capacidade seletiva e diferencial que apresentam. Quanto composio: 1. Meios Sintticos: quando as substncias que os compem so quimicamente definidas e a concentrao e caractersticas de cada ingrediente so conhecidas com exatido. 2. Meios Simples: quando constitudos somente de substncias essenciais para o crescimento de algumas bactrias. 3. Meios Complexos: quando se adicionam ao meio simples, substncias orgnicas complexas. Quanto ao Estado Fsico: 1. Meios Lquidos: tambm denominados caldos.

2. Meios Slidos: quando se adiciona ao caldo l,5% a 2% de gar. 3. Meios Semi-slidos: quando se adiciona gar ao caldo, na concentrao igual ou menor que 0,5%. Quanto capacidade seletiva e diferencial: 1. Meios Enriquecidos: so meios simples adicionados de certas substncias como, por exemplo, soro e sangue. Estes meios servem para o cultivo de bactrias que necessitam de substratos complexos. Ex.: meios de gar sangue, e de gar chocolate. 2. Meios Seletivos: so meios de cultura contendo substncias que impedem o crescimento de certas bactrias, sem inibir o crescimento de outras. Ex.: Meios de MacConkey, de Tetrationato, de Verde Brilhante. 3. Meios Diferenciais: so aqueles que contm substncias que indicam a expresso de uma caracterstica particular de uma bactria, permitindo sua diferenciao de outras. Exemplos: a) gar sangue. O sangue adicionado ao meio de cultura indica se uma bactria hemoltica ou no. Nesse caso, o meio alm de enriquecido tambm diferencial. b) gar MacConkey. A lactose adicionada ao meio, juntamente com um indicador de pH, permite distinguir as bactrias que fermentam esse acar das que no o fermentam. 4. Meios de Enriquecimento: so aqueles que inibem o crescimento de certas bactrias e favorecem o crescimento de outras. Ex.: meios de tetrationato e de selenito que permitem maior crescimento de bactrias do gnero Salmonella. 5. Alm desses, existem outros meios de cultura, como por exemplo, meios para conservao de bactrias, meios para a contagem do nmero de bactrias, etc. B) Condies Fsicas de Cultivo Alm do meio de cultura, outros fatores devem ser levados em considerao para o cultivo de bactrias, tais como: 1. pH do meio de cultura: deve ser geralmente em torno de 7.0. 2. Temperatura de crescimento: geralmente 37C Quando a temperatura ideal de crescimento das bactrias fica entre: 10 a 20C, elas so denominadas de psicrfilas; 20 a 40C, so denominadas de mesfilas; 50 a 60C so denominadas termfilas. Algumas bactrias apresentam temperatura ideal de crescimento superior a 60C. Neste caso so denominadas de hipertermoflicas 3. Teor de Oxignio: a) Bactrias aerbias estritas: so aquelas que s crescem na presena de oxignio. b) Bactrias anaerbias estritas: crescem somente na ausncia de oxignio. c) Bactrias anaerbias facultativas: crescem tanto na presena como na ausncia de oxignio. d) Bactrias microaerfilas: crescem somente em atmosfera com baixo teor de oxignio.

EXERCCIOS A) Necessidades nutritivas de algumas bactrias Comparar a intensidade de crescimento de 3 culturas bacterianas distintas (A, B e C) em trs meios lquidos com diferentes composies qumicas: caldo sinttico, caldo comum e caldo glicosado. Anotar o resultado na tabela abaixo
Crescimento

em caldo

A Comum Sinttico Glicosado

Cultura B

B) Dependncia do oxignio para o crescimento bacteriano. Observar o ponto de crescimento de trs culturas bacterianas em caldo simples e tiogel e, em funo da dependncia de O2.
Culturas

Crescimento no caldo simples

Local de crescimento no meio de tiogel Superfcie Toda extenso do Base do Meio Meio

A D F

Roteiro 3 - Ao de um fator intrnseco de alimentos sobre as bactrias

1. Com o auxlio da ala de nquel-cromo, passar um pouco de cultura de Escherichia coli para uma soluo de salina esterilizada e agitar. 2. Umedecer uma zaragatoa na mistura, retirando o excesso na parede do tubo. Passar a zaragatoa na superfcie de uma placa de gar PCA (Plate Count agar). 3. A seguir, colocar uma fatia de alho no centro da placa e Incub-la, por uma noite, na estufa. 4. Observar halo de inibio do crescimento ao redor do alho.

Roteiro 4 - Higienizao das mos

1. Umedea uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Aps retirar o excesso de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mos; 2. Passe a zaragatoa em rea correspondente metade de uma placa com gar nutriente; 3. Umedea uma segunda zaragatoa em lcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da outra mo; 4. Aguarde 2 minutos para que haja ao do anti-sptico; 5. Passe ento, nessa rea, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando cuidado para no ultrapassar a rea higienizada. Inocule, passando a zaragatoa na superfcie da outra metade da placa com gar nutriente; 6. Incube a placa na estufa, durante uma noite. 7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo. Sem lcool-iodado 0,1% Com lcool-iodado 0,1%

Roteiro 5 - Efeito dos dos agentes fsicos e qumicos sobre as bactrias

A) Ao da temperatura sobre culturas bacterianas, de acordo com o tempo. MATERIAL NECESSRIO - Cultura A em gar inclinado. - Tubo contendo 1 ml de soluo salina esterilizada. - Placa de Petri contendo gar nutriente. - Banho-maria a 60C TCNICA 1. Transfira, com a ala de nquel-cromo, um pouco do crescimento da cultura A para um tubo contendo 1 ml de soluo salina. 2. Agite o tubo brevemente e semeie uma alada da suspenso no quadrante correspondente ao tempo zero, da placa de gar nutriente. 3. Coloque o tubo em banho-maria a 60C e, aos 10, 20 e 30, retire amostras da suspenso, semeando nos respectivos quadrantes da placa de Petri. 4. Incubar a placa na estufa a 37C at o dia seguinte. 5. Observe as variaes no crescimento da cultura em cada quadrante da placa, registrando os resultados com sinais positivos (+ a ++++), na tabela abaixo. Intensidade de crescimento em 10 20

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B) Ao de um produto qumico, disponvel comercialmente, sobre culturas bacterianas, de acordo com o tempo. MATERIAL NECESSRIO: - Tubo contendo o produto qumico, em condies de uso, segundo recomendaes do fabricante. - Cultura A e B no esporuladas. - Cultura C, esporulada TCNICA: 1. Adicione,1,0 ml de cultura a 10 ml do produto qumico e misture bem. 2. Imediatamente e, aps 10, 20 e 30, retire amostras da mistura e inocule em quadrantes de placas de gar nutriente. 3. Deixe a placa na estufa at o dia seguinte. 4. Observe as placas, registrando as variaes na intensidade do crescimento. Cultura 0 A B C Intensidade do crescimento em 10 20

30

Roteiro 6 - Escherichia coli e Salmonella

Observar os meios de Cultura gar MacConkey, EPM, Mili e Citrato de Simmons, semeados com as bactrias A e B. Aps a leitura das provas bioqumicas, relacionar os resultados e, por comparao com a tabela, identificar qual corresponde a E. coli e a Salmonella:
Bactria E. coli Salmonella
1 2

Citrato + ou -

Glicose + +

Gs + ou +

Urease -

Provas 1 H2S FDA + -

Mov. + ou +

LDC + ou +

Indol + -

Lactose + -

FDA: Fenil-alanina desaminase Mov.: Movimento 3 LDC: Lisina descarboxilase

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Roteiro 7 - Bacillus cereus

1. Observar placas de gar Mossel semeadas com a cultura de Bacillus cereus e descrever as caractersticas das colnias. 2. Corar, pelo mtodo de Gram, esfregaos das culturas C, D e E, observar ao microscpio e desenhar 3. Prova da catalase. Com a ala, pegar pequena quantidade do crescimento e colocar numa lmina de vidro. Pingar algumas gotas de gua oxigenada. Verificar a reao e anotar o resultado.

Roteiro 8 - Staphylococcus aureus

Observar algumas caractersticas de diferenciao do gnero Staphylococcus e da espcie S. aureus Observar placas de gar sangue semeadas com Streptococcus e Staphylococcus Fazer a prova da catalase Observar um testes positivo e um negativo para a prova da coagulase

Roteiro 9 Aspectos macro e microscpicos de fungos

A cultura de um microrganismo refere-se capacidade que este tem de crescer em meios nutritivos artificiais. Esse crescimento evidenciado macroscopicamente pela formao de uma unidade estrutural, denominada colnia. As colnias de determinados fungos geralmente apresentam morfologias tpicas, quando estes so semeados em meios com a mesma composio qumica e submetidos s mesmas condies de incubao. Atravs dos seus aspectos macroestruturais de uma colnia, possvel sugerir a espcie fngica presente na cultura. Sendo assim, o conhecimento do aspecto macro-morfolgico das colnias de extrema utilidade para a sugesto da identificao preliminar de determinada espcie fngica. Na observao das caractersticas culturais de determinado fungo, pode-se considerar alguns aspectos, resumidos abaixo, os quais podem tambm ser encontrados no livro de SIDRIM, JJC, BRILHANTE, RSN, ROCHA, MFG. (Cap. 8 Aspectos Gerais de fungos filamentosos e dimrficos na apresentao filamentosa. In: SIDRIM, JJC, ROCHA, MFG. Micologia Mdica a luz de autores contemporneos. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004, p. 83-86). So estes:

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a) tamanho da colnia: pode ser bastante varivel na dependncia da quantidade e qualidade de substrato ofertado e da espcie fngica. Por exemplo, os fungos zigomicetos apresentam velocidade de crescimento rpido e suas colnias tendem a ocupar toda a superfcie da placa. O mesmo ocorre com as espcies do gnero Aspergillus quando cultivadas a 35oC. J o fungo Piedraia hortae apresenta crescimento muito lento, sendo sua colnia restrita ao centro da placa de Petri. b) bordas: na periferia das colnias fngicas podem ser observados muitos desenhos que vo desde morfologias bem delimitadas at achados de projees irregulares que lembram franjas. Alm disso, tambm pode ser observada, nas bordas das colnias uma variao da colorao em relao ao centro. Esse achado pea-chave para indicar o possvel patgeno implicado, como por exemplo, nas colnias de Sporothrix schenckii, onde se observa que as bordas tornam-se escuras com o envelhecimento da cultura. c) textura: , talvez, o mais importante achado utilizado na caracterizao de uma colnia fngica. A textura descreve a altura das hifas areas. As colnias podem ser classificadas quanto textura em diversos tipos: colnias algodonosas: aquelas que se assemelham com algodo, colnias furfurceas: aquelas que lembram um punhado de substncia farincea espalhada em uma superfcie, colnias penugentas: aquelas nas quais se evidenciam estruturas que lembram penas de aves dispersas na superfcie do meio, colnias arenosas ou pulverulentas: aquelas que lembram areia de praia, colnias veludosas: aquelas que apresentam o aspecto de tecido aveludado, colnias membranosas: aquelas que so bem aderidas superfcie do meio de cultura, recobrindo-o como uma pelcula, colnias glabrosas: aquelas com aspecto compacto, coriceo, podendo ter superfcie lisa ou irregular e sempre com ausncia de filamento, ou seja, no algodonosa, colnias cremosas: aquelas que apresentam aspecto visual cremoso, sendo comumente observados no grupo das leveduras e da maioria das colnias bacterianas. d) relevo: diz respeito topografia da colnia e pode ser: colnias cerebriformes: apresentam topografia de altos e baixos, fazendo circunvolues que lembram as observadas no crebro, colnias rugosas: nada mais so do que variaes da cerebriforme, porm as pregas topogrficas so menos evidentes, sendo as vezes radiais partindo do centro da colnia, colnias apiculadas: caracterizam-se pela presena de uma salincia na parte central lembrando um pequeno cume, colnias crateriformes: so aquelas que se aprofundam no meio de cultura, assumindo o aspecto de cratera. e) pigmentao: quando se fala em pigmentao de uma colnia fngica deve-se levar em considerao alguns aspectos primrios: - se o pigmento encontrado na superfcie da colnia ou no reverso,

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- se o pigmento encontrado tanto na superfcie quanto no reverso da colnia, - se o pigmento ou no difusvel no meio de cultura, - se o pigmento est presaente apenas nos esporos e ausente nas hifas, como observado na maioria das espcies de Aspergillus e Penicillium, ou em ambos (hifa e esporos), como observado nas espcies de fungos causadores de cromoblastomicose (Ex. Fonsecae pedrosoi). Observa-se uma grande variedade de cores na pigmentao fngica que passam pelos tons de verde, amarelo, vermelho e castanho at ao preto. Importante ressaltar que esta caracterizao fenotpica da colnia visando a auxiliar na identificao de determinada espcie fngica apresenta algumas limitaes, principalmente devido ocorrncia de variaes destas caractersticas dentro de uma mesma espcie, devido tanto a efeito ambiental, como tambm da subjetividade do observador. Dessa forma, deve-se sempre ter em mente que, embora a colnia fngica possa sugerir, indicar e muitas vezes at acertar o caminho da identificao, no se deve, contudo, considera-la como nica ou principal forma de identificao fngica. Quando empregada como nico critrio pode levar a diagnsticos pouco precisos ou errneos. Os aspectos microscpicos so observados em materiais fngicos (fragmentos de cultura, esfregaos, raspados, etc) sobre lmina, com ou sem lamnula e colorao. As lminas so inicialmente observadas no menor aumento e a seguir nos aumentos maiores, sem necessariamente empregar a objetiva de imerso.

ASPECTOS MACROSCPICOS DAS CULTURAS DE FUNGOS

a) finalidade: auxiliar na identificao das colnias fngicas b) fundamento: Os estudos macroscpicos devem ser baseados nas seguintes caractersticas: tamanho, bordas, textura, relevo (na frente e verso da colnia) e pigmentao

Exemplo:

Frente: Frente: colnia de fungo (Filamentoso (Filamentoso ou Leveduriforme Leveduriforme) eveduriforme), de textura (algodonosa (algodonosa, aveludada aveludada, pulverulenta pulverulenta, glabra glabra, cremosa cremosa, etc), etc), de relevo (cerebriforme, (cerebriforme, rugoso, crateriforme, apiculado, apiculado, liso) liso) de colorao (...), (...), com bordos (regulares ou irregulares). irregulares). Verso: (presena ou ausncias) de fendas ou dobras, e (ausncia ou presena) de pigmento difusvel no meio de cultura.
Exerccio 1 - Descrever as caractersticas coloniais das culturas de Aspergillus sp. e Sacharomyces sp., conforme o modelo que segue, e desenhar as caractersticas microscpicas dos mesmos fungos no espao abaixo.

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Aspergillus sp.

Saccharomyces cereviseae

Roteiro 10 Reproduo assexuada e sexuada de fungos

1) Em relao aos fungos zigomicetos apresentados a seguir solicita-se:

- tipo de reproduo apresentada: assexuada ou sexuada - nome das estruturas apontadas - observar a lmina no microscpio e desenhar as estruturas observadas

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Mucor spp.

reproduo: (

) assexuada (

) sexuada

estrutura 1: ________________________ estrutura 2: ________________________

Rhizopus spp.

reproduo: (

) assexuada (

) sexuada

estrutura 1: ________________________ estrutura 2: ________________________ estrutura 3: _________________________

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Pilobollus crystallinus nas fezes de cavalo

reproduo: (

) assexuada (

) sexuada

estrutura 1: ________________________ estrutura 2: ________________________ estrutura 3: _________________________

Qual a relao deste fungo com a luz? ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________

Como esse fungo elimina seus esporos no ambiente? ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________

2) Preparar lmina das lamelas de cogumelos para observao de basdios e basidisporos. Desenhe no local abaixo as estruturas observadas.

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Roteiro 11 11 Fungos deteriorantes em alimentos

FINALIDADE: - observar as caractersticas macroscpicas dos fungos que esto deteriorando os alimentos, - observar o efeito dessa deteriorao provocado no alimento, - observar as estruturas microscpicas dos fungos envolvidos no processo de deteriorao. Procedimento: Com auxlio de fita adesiva (Durex), encostar levemente na superfcie da cultura fngica sobre o alimento e depois transferir essa fita para uma lmina contendo uma gota de lactofenol azul-algodo. Observar as caractersticas microscpicas dos fungos. Desenhar as estruturas observadas.

Roteiro 12 12 Fermentao
FINALIDADE: - observar a produo de CO2 a partir da fermentao da glicose realizada por Saccharomyces cereviseae.

Procedimento: Em uma garrafa PET adicionar caldo de cana e a levedura S. cereviseae. Fechar a garrafa com uma bexiga. Observar a produo de CO2 pelo enchimento da bexiga.

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Roteiro 13 13 - Deteco de fungos em alimentos

FINALIDADE: avaliar a carga fngica presente nos diferentes tipos de alimentos.

Alimentos avaliados: granola, paoca, farinha de milho, farinha de mandioca e leite

Procedimento: - pesar 10 gramas do alimento (leite= pipetar volume de 10 mL) e colocar em frasco contendo 90 mL de soluo salina estril (diluio 1:10 10-1). A partir da diluio 1:10, coletar, com auxlio de pipeta sorolgica estril, um volume de 1,0 mL e transferir para tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina estril (diluio 1:100 10-2). A partir da diluio 1:100, coletar um volume de 1,0 mL e transferir para outro tubo contendo 9,0 mL de soluo salina estril (diluio 1:1000 10-3). Homogeneizar bem em cada diluio e desprezar os 1,0 mL restantes, conforme esquema ilustrado a seguir:

Transferir 1,0 mL de cada diluio e cultivar pour-plate com agar Sabouraud, Mycosel e DRBC fundidos. Para a amostra de leite utilizar tambm o meio CHROMagar Candida. Homogeneizar bem, esperar solidificar, identificar as placas e incubar a 25oC. Observar o comportamento do crescimento fngico nos diferentes meios de cultura.

A interpretao dos resultados ser realizada na prxima aula prtica.

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Interpretao dos resultados

Proceder a contagem das colnias de fungos e anote nos quadros abaixo. Fazer a estimativa do nmero de UFC (Unidades Formadoras de Colnias) por grama e/ou mL de alimento.

Grupo 1: granola Agar SAB 1:10 1:100 1:1000

Agar Mycosel 1:10 1:100 1:1000

Agar DRBC 1:10 1:100 1:1000

Grupo 2: paoca Agar SAB 1:10 1:100 1:1000

Agar Mycosel 1:10 1:100 1:1000

Agar DRBC 1:10 1:100 1:1000

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Grupo 3: farinha de milho

Agar SAB 1:10 1:100 1:1000

Agar Mycosel 1:10 1:100 1:1000

Agar DRBC 1:10 1:100 1:1000

Grupo 4: farinha de mandioca

Agar SAB 1:10 1:100 1:1000

Agar Mycosel 1:10 1:100 1:1000

Agar DRBC 1:10 1:100 1:1000

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Grupo 5: leite

Agar SAB 1:10 1:100 1:1000

Agar Mycosel 1:10 1:100 1:1000

Agar DRBC 1:10 1:100 1:1000

Chromagar Candida 1:10 1:100 1:1000

Voc j agradeceu a um fungo hoje?!