Coordenadoria de Biotecnologia Curso de Bioqumica

Prtica: Dosagem de Glicose: Mtodo do DNS e Acares Redutores Alunas: Juliana Esteves Patrcia Sbano Renata Gudergues Ryanna Rubstein Turma: Fm 161 Professores: Rafael Mesquita e Renato Carvalho Data da realizao da prtica: 03/11/2010 Data da entrega di relatrio: 17/11/2011

Avaliao:

I.

Introduo:

Os glicdios so macromolculas bioqumicas que desempenham as mais diversas funes, como reserva de energia, funes estruturais, podem ser co-fatores enzimticos, carreadores de eltrons, pigmentos, emulsificantes e mensageiros intracelulares, alm de regularem funes hormonais. Os glicdios podem ser classificados em nos seguintesd grupos: triacilgliceris, glicerofosfoliplios ou esteris. Os carboidratos, tambm chamados de acares, abrangem um dos maiores grupos de compostos orgnicos conhecidos na natureza, e juntamente com as protenas formam os principais constituintes dos organismos vivos, alm de servirem, assim como os glicdios, de fonte de energia, estando maior abundncia, para o homem. Apresentam estrutura de aldedos ou cetonas com hidroxilas ligadas aos carbonos ao longo da molcula. Estes, quando presentes nas clulas, geralmente se associam outras molculas, como lipdios ou protenas, formando glicoconjugados. Alm disso, em alguns carboidratos possvel encontrar nitrognio, fsforo ou enxofre na composio. Podem receber trs classificaes, levando-se em considerao o seu tamanho; Monossacardios, carboidratos simples que no podem ser hidrolisados a aucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdedos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o nmero de carbonos na cadeia. Em solues, monossacardeos de cinco ou mais tomos de carbono ocorrem como estruturas cclicas. A formao do anel d-se pela reao hemiacetal, isto , quando a carbonila reage com a hidroxila do carbono 5 formando uma ligao hemiacetal, essa reao gera dois estereoismeros diferentes em relao ao carbono 1, eles so designados ou dependendo da direo rotao especfica. Oligossacardios, polmeros compostos de resduos de monossacrdios unidos por ligaes hemiacetlicas, neste caso denominadas ligaes O-glicosdicas, em nmero que variam de duas, at, aproximadamente, dez unidades. So compostos importantes na determinao de estruturas de polissacardios. Polissacardios, macromolculas facilmente encontradas na natureza e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas funes. Formam-se a partir das ligaes glicosdicas geralmente com mais de 10 unidades de monossacardios ou seus derivados. As unidades monossacardias mais decorrentes so: D-glucose, D-manose, Dfrutoses, D e L-galactose, D-xilose e D-arabinose. Os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes suveis como os ons Fe3+ e Cu2+, em que o carbono do grupo carbonila oxidado a carboxila. Os acares capazes de reduzir um destes dois ons so chamados de acares redutores. A propriedade redutora dada pelo nmero de enediis formados na soluo. Para o glicdio formar enediis necessrio que tenha sua hidroxila heterosdica livre, podendo passar da estrutura cclica para estrutura aberta. Uma vez oxidado, o enediol leva o azul de metileno a se reduzir para azul de leucometileno que incolor. Com a agitao do tubo, o oxignio presente no ar oxida o azul de leucometileno. Esta caracterstica a base da reao de Fehling utilizada para detectar a presena destes acares e tambm determinar a concentrao do mesmo, atravs da medida da quantidade de agente oxidante que reduzido. O mtodo do DNS um mtodo utilizado na dosagem de acares redutores onde ocorre a oxidao do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o cido dinitrosaliclico; sal de Rochelle, (soluo de trtaro de sdio de potssio) que serve para prevenir o reagente da ao do oxignio dissolvido; fenol, que utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que um estabilizante da cor obtida na presena do fenol; hidrxido de sdio, que o redutor da ao da glicose sobre o cido dinitro-saliclico. Ocorre no mtodo do DNS a seguinte reao de oxidao:. Ocorre neste caso a reduo do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo forte) cido e a oxidao do monossacardeo, formando o 3-amino-5nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporo estequiomtrica. Portanto, pela determinao da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5nitrosalicilato, podese determinar a concentrao de acar redutor presente na soluo.

II.

Objetivos:
Dosagem de Glicose: Mtodo do DNS Acares Redutores:

III.

Material e Mtodos. III A. Material:

Dosagem de Glicose: Mtodo do DNS Acares Redutores: III B. Mtodos:

Dosagem de Glicose : Mtodo do DNS Com o auxlio de pipeta e pr-pipete, foram transferidas alquotas das solues reagentes para os tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo:
Tubo n B 1 2 3 4 5 6
o

gua Destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -

Soluo Padro de Glicose 10 mM 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -

Soluo Glicose [?] Desconhecida 1,0

Soluo DNS 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Aps isto, os tubos foram homogeneizados e levados para o aquecimento em banhomaria 100C durante 5 minutos. Esperou-se os tubos esfriarem, as solues contidas neles foram transferidas para tubos de ensaio maiores, e assim acrescentados 13 mL de gua a cada um dos tubos, obtendo ento, um volume final de 15 mL em todos eles. Tampou-se com Parafilm e homogeneizou-se com o auxlio de um vrtex. Em seguida, a soluo que continha neles foi tranferida para cubetas e levadas para a leitura espectrofotomtrica da absorbncia a 540 nM, utilizando o tubo branco para a calibrao do aparelho. Acares redutores Com o auxilio de pipeta e pr-pipete foram transferidas alquotas das solues reagentes para os tubos de ensaio enumerados, conforme a tabela abaixo:
Tubo n Soluo NAOH (mL) Soluo Glicose (mL) 3,0 3,0 Soluo Sacarose (mL) 3,0 H2O (mL) Soluo Alc. Azul de Metileno (gota) 1 1 1 1

1 2 3 4

3,0 3,0 3,0

3,0 3,0

Os tubos foram vedados com Parafil e homogeneizados. Aps isto, foram incubados temperatura ambiente e os resultados obtidos foram observados.

IV.

Resultados:
Dosagem de Glicose: Mtodo do DNS

Aps a realizao dos procedimentos especificados no roteiro de prtica, obtivemos os seguintes resultados de absorbncia:
Tubo n
o

gua Destilada

B 1 2 3 4 5 6

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -

Soluo Padro de Glicose 10 mM 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -

Soluo Glicose [?] Desconhecida 1,0

Soluo DNS

Abs.

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

0 0,178 0,383 0,579 0,807 0,966 0,292

A partir do valor da absorbncia e da concentrao de cada tubo, conseguimos desenhar uma curva padro da glicose e, assim, calcular o valor da concentrao de glicose desconhecida. - Clculos para obteno da quantidade de glicose em cada tubo: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Tubo 5

A partir do grfico construdo, achamos a equao da reta em funo da absorbncia e da massa de PNP

Como a reta passa pela origem, e como y representa o valor da absorbncia e x a massa, temos:

a pode ser calculado com a utilizao de dois pontos da reta:

por fim, achamos a equao da reta:

Dessa forma, a concentrao de glicose desconhecida ser de:

Observe o grfico obtido em anexo.

Acares Redutores: Aps a incubao dos tubos de ensaio temperatura ambiente, observou-se que a colorao dos tubos 2 e 4 permaneceu azul escura e a do tubo 2 apresentava um azul mais claro. O tubo 1 tornou-se incolor, sendo que, ao ser agitado, tornava-se azul mas logo voltava a ser incolor.

V. Discusso:
Dosagem de Glicose: Mtodo do DNS O mtodo do DNS se fundamenta na reduo do cido 3,5-dinitro saliclico em cido 3amino-5-nitro saliclico por conta da ao de acares redutores. Dessa forma, a D-glicose foi utilizada e se oxidou, resultando em cido D-glucnico, de acordo com a reao abaixo:

Ao medirmos as absorbncias foi possvel notar que esses valores so diretamente proporcionais s concentraes de glicose obtida em cada tubo. Isto ocorre porque, quanto maior a concentrao de glicose, maior ser a formao do cido 3-amino-5nitro saliclico, que o responsvel pela cor alaranjada das solues e, consequentemente, pelas medidas de absorbncia. A partir deste mtodo no possvel dosar a sacarose, pois este heteropolissacardeo no apresenta carbono anomrico livre para ser oxidado, ou seja, os carbonos anomricos da sacarose encontram-se como constituintes da ligao glicosdica entre suas subunidades impedindo-a de oxidar-se. S seria possvel dosar a sacarose pelo mtodo do DNS se a ligao glicosdica fosse desfeita por alguma alterao no meio ou pela ao de algum reagente. Deste modo, teramos as concentraes das subunidades e poderamos relacion-las, atravs de clculos, concentrao da sacarose.

Acares Redutores: Os acares redutores so aqueles que possuem o carbono anomrico livre e so capazes de reduzir ons de Prata e de Cobre em soluo alcalina, logo todos os monossacardeos so redutores. Essa propriedade de alguns glicdios est relacionada formao da estrutura enediol, que uma funo altamente redutora em meio alcalino proporcionando a interconvero de aldoses e cetoses. A glicose, em meio alcalino, rapidamente se transforma em enediol, uma estrutura intermediria que leva a formao de D-frutose e D-manose. No tubo 1, uma vez oxidado, o enediol reduz o azul de metileno a azul de leucometileno que incolor. Quando o tubo de ensaio agitado, o oxignio presente no ar age na soluo oxidando o azul de leucometileno e assim reduz a D-glicose, e a soluo se torna azul escura, porm logo aps a agitao sessar esta torna-se incolor novamente, pois o oxignio proveniente do ar no reage mais com a soluo, e o azul de metileno novamente reduzido. No tubo 2, provavelmente houve alguma formao de enediol que reduziu um pouco do azul de metileno azul de leucometileno, tornando a soluo azul mais clara. J que a soluo no era alcalina, pois nela no foi adicionada a base NaOH, no houve uma formao muito grande de enediol. O tubo 2, ao qual havia sido adicionada a sacarose, permaneceu na mesma colorao do tubo que no recebeu glicdio algum, isto se d pois a sacarose no um acar redutor, uma vez que seu cabono anomrico est envolvido na ligao glicosdica, logo no est livre. Sendo assim, a sacarose, mesmo em meio alcalino, no capaz de formar enediol e o indicador azul de metileno no reduzido.

VI. Referncias bibliogrficas

LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry vol. I. 4th Edition. W H FREEMAN & Co., 2004. <http://bioquimica.ufcspa.edu.br/pg2/pgs/nutricao/quimicanut/glicidios.pdf> Acessado em 15/11/2010 <http://www.biology-online.org/dictionary/Enediol> Acessado em 15/11/2010 <http://www.revistas2.uepg.br/index.php/exatas/article/viewFile/772/677> Acessado em 15/11/2010 < http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm> Acessado em 15/11/2010