INTRODUO

Animais transgnicos so aqueles cujo genoma foi alterado para incluir genes de outros animais ou outras espcies. Os genes seleccionados ou pedaos de DNA so transferidos por mtodos da Biologia Molecular. Assim, os animais transgnicos tm as suas propriedades hereditrias modificadas permanentemente, pela introduo de DNA recombinante nas suas clulas embrionrias. As tcnicas transgnicas tm sido aplicadas a diversas espcies incluindo ovelhas, vacas, galinhas, cabras, peixes, porcos e coelhos mas, os ratos tm sido, sem dvidas os animais mais utilizados e com maior sucesso.

O QUE UM ANIMAL TRANSGNICO? Uma definio de animal transgnico aquele com molculas de DNA recombinante exgenas introduzidas em seu genoma por interveno humana. A tcnica foi desenvolvida no final da dcada de 1970 em camundongos, o mamfero cujo genoma , at hoje, o mais facilmente manipulvel. Atualmente, a transgenia permite tanto a transferncia de DNA exgeno para o animal, atravs da tcnica de microinjeo pronuclear, quanto a alterao de DNA j existente no animal, atravs da recombinao homloga em clulas-tronco embrionrias (clulas ES do ingls embryonic stem). Como o nome sugere, a microinjeo pronuclear consiste na injeo de uma soluo de DNA, contendo o transgene de interesse, no proncleo de um vulo recm-fertilizado. Esta metodologia faz com que vrias cpias do transgene injetado se integrem em tandem em um stio aleatrio no genoma e sejam transmitidas de forma mendeliana. O transgene deve conter todos os elementos de um gene (promotor, regio codificante, stio de adio de cauda poli-A), porm, deve ser construdo por tcnicas de DNA recombinante de forma a responder alguma pergunta biolgica. Assim, o transgene pode ser utilizado para super-expressar um gene de interesse em tecidos especficos do camundongo ao avaliarmos as consequncias desta super-expresso, poderemos inferir a funo daquele gene. Por outro lado, o transgene pode ser utilizado para estudarmos regies promotoras, atravs da construo de um transgene com a regio em questo dirigindo a expresso de um gene reprter (lacZ ou GFP, por exemplo). Alm disso, a microinjeo pronuclear tem sido utilizada para a gerao de modelos animais para vrias doenas genticas dominantes, incluindo osteogenesis imperfecta, atravs da insero de um alelo mutado, o transgene, no genoma do camundongo. Apesar de ser uma importante ferramenta de pesquisa, esse mtodo apresenta algumas limitaes. Por causa do stio aleatrio de integrao do transgene, este poder no estar sob o controle de todos os elementos em cis (no mesmo cromossomo) que controlam a expresso do gene endgeno. Assim, a expresso temporal e espacial do transgene no seguir o padro de expresso do gene endgeno. Alm disso, no que diz respeito a modelos de doenas genticas, a introduo de um terceiro alelo, o transgene mutante, cria uma situao artificial no que diz respeito proporo entre os transcritos normais e mutantes. Enquanto uma pessoa com uma doena gentica dominante possui um alelo normal e um mutado, o camundongo transgnico possuir os dois alelos endgenos normais e diversas cpias do alelo mutante (transgene). Esta proporo pode ser crtica em doenas suscetveis a efeitos de dosagem gnica.

MTODOS E MATERIAIS

APLICAES DOS ANIMAIS TRANSGNICOS O aperfeioamento gentico de animais para fins cientficos, mdicos e econmicos ganhou enorme mpeto com a tcnica da transgnese. Produtos originrios de organismos transgnicos tendem a se tornar cada vez mais difundidos Joo B. Pesquero, Heloisa A. Baptista, Fabiana L. T. Motta e Suzana M. de Oliveira Nos ltimos anos, os avanos na biotecnologia sucederam-se a um ritmo frentico. Graas a eles, foi possvel dominar o processo de alterao gentica, a ponto de alterar o genoma animal, ou seja, o material responsvel pelas caractersticas hereditrias do ser vivo, e criar um organismo transgnico em laboratrio que pode possuir genes de outras espcies em seu genoma. Isso aconteceu porque o DNA - que contm a informao gentica - uma molcula que pode ser transferida de uma espcie a outra. O maquinrio celular responsvel por sua transcrio e traduo em protenas semelhante em todos os organismos vivos. Com as tcnicas descobertas nas ltimas dcadas, possvel manipular o DNA com o objetivo de alterar o genoma de forma controlada, criando diferentes espcies mutantes de camundongos, ratos, coelhos, porcos, ovelhas, cabras, ces, galinhas, macacos e vacas, dentre outras. Outra conseqncia positiva dessa nova ferramenta biotecnolgica foi promover o uso racional de animais de laboratrio em todo o mundo. A gerao de modelos transgnicos provocou uma reduo do nmero de animais utilizados na experimentao de forma geral, alm de tornar possvel a substituio de espcies geneticamente mais prximas do homem, como primatas, por animais menores geneticamente modificados para ter as caractersticas especficas que se deseja estudar. No futuro, essa tendncia de reduo na quantidade de animais empregados dever se acentuar em razo da maior especificidade dos modelos transgnicos desenvolvidos. Embora importantes questes ticas envolvendo o tema esperem soluo apropriada, as tcnicas de gerao de modelos transgnicos so muito promissoras comercialmente e nas diversas reas da pesquisa bsica e clnica mdica. Os animais transgnicos so definidos de vrias formas. Para a Federao Europia das Associaes de Cincia em Animais de Laboratrio, transgnico "um animal que possui seu genoma modificado artificialmente pelo homem, quer por meio da introduo, quer da alterao ou da inativao de um gene [uma seqncia definida de DNA]. Esse processo deve culminar 6

na alterao da informao gentica contida em todas as clulas desse animal, at mesmo nas clulas germinativas [vulos e espermatozides], fazendo com que essa modificao seja transmitida aos descendentes". O gene modificado pode ser proveniente da mesma espcie, de uma espcie diferente ou mesmo de bactrias ou plantas. Em qualquer dos casos, ele denominado transgene, e o processo de manipulao das tcnicas envolvidas nesse processo chamado transgnese. Existem vrios mtodos disponveis para a gerao de um animal transgnico. O mtodo a ser empregado depende do tipo de modificao gentica que se deseja realizar: introduo, modificao ou inativao de um gene.

ADIO GNICA O mtodo mais utilizado na introduo de genes a transgenia por adio, atravs da qual inserida no genoma uma ou vrias cpias de um gene de interesse - da suas outras denominaes: adio gnica e modelo de superexpresso de genes. O gene adicionado pode ser endgeno ou exgeno. O primeiro tipo j existe no genoma do animal. Ele usado quando se quer produzir uma quantidade maior da protena codificada j existente, aumentando a quantidade de cpias dele no genoma. Genes exgenos, como o nome sugere, pertencem a outra espcie e so usados para fazer um animal produzir uma nova protena, ausente na forma desejada na espcie receptora. Uma caracterstica importante desse mtodo que a insero da seqncia de DNA no genoma animal aleatria. Assim, ela pode ser ineficaz ou at mesmo letal, uma vez que o local onde o gene ser integrado incerto. Na primeira possibilidade, o transgene pode se inserir em uma regio do cromossomo que dificulta ou inviabiliza a sua expresso, fazendo com que o animal no apresente o fentipo desejado. Na segunda, a insero aleatria pode provocar, por exemplo, a inativao de um gene essencial ao desenvolvimento na fase embrionria, com conseqente inviabilidade ou morte prematura do animal. Nesse caso, o fentipo do animal transgnico independente do transgene, ou seja, no foi causado por uma caracterstica do gene inserido, mas pelo local onde esse gene se integrou. Esse tipo de evento provoca o que os pesquisadores denominam "efeito no intencional" da transgnese. Por causa dessas possibilidades, a comparao de vrias linhagens transgnicas com a mesma modificao gentica imprescindvel para que se possa inferir a funo de um gene ou correlacion-lo a determinada doena. Por sua simplicidade e eficincia, a adio gnica foi o primeiro mtodo de transgenia desenvolvido. Hoje, vrias tcnicas so utilizadas para produzir animais transgnicos por 7

adio de segmentos de DNA ao genoma - entre elas, a microinjeo pronuclear de embries, a transferncia de DNA mediada por espermatozides, a infeco de embries por vetores retrovirais, a transferncia de DNA mediada por transposons (segmentos de DNA capazes de inserir cpias e si mesmos em outro local do cromossomo), a agregao ou injeo de clulas-tronco embrionrias geneticamente modificadas, a transferncia nuclear de clulas geneticamente modificadas e a transferncia de segmentos de cromossomos (cromossomos artificiais). Dentre todos esses procedimentos, a microinjeo pronuclear o mais utilizado. H mais de duas dcadas, realizado na grande maioria dos centros produtores de transgnicos por adio no mundo. Atravs dele, possvel introduzir seqncias longas de DNA de diferentes espcies no genoma de mamferos, produzindo altos nveis de expresso e integrao do transgene em clulas germinativas. Inicialmente, o DNA que se deseja inserir isolado, quantificado, purificado, amplificado (ou seja, numerosas cpias da seqncia so produzidas) e colocado em um tubo em uma soluo apropriada. A seguir, com um micromanipulador acoplado a um microscpio de alta resoluo, o DNA contendo centenas de cpias do transgene injetado diretamente em um embrio recmfertilizado. Os embries nessa fase possuem proncleos, que so os ncleos materno e paterno, provindos, respectivamente, do vulo e do espermatozide, antes que se unam para formar um nico ncleo contendo o genoma do novo indivduo. Aproveitando esse evento que facilita a integrao do novo DNA no genoma, a injeo do transgene feita em um desses proncleos, e espera-se ento que ocorra a integrao da nova seqncia. Aps a microinjeo, os embries so transferidos para o tero de uma fmea receptora pseudogrvida (um estado semelhante ao da gravidez que ocorre em alguns mamferos), que levar a termo o nascimento dos transgnicos. A taxa de integrao do DNA no genoma embrionrio baixa - cerca de 1% a 4%. Ou seja, apenas alguns animais nascidos carregaro o transgene integrado em seus cromossomos. Para identificar quais so os espcimes transgnicos, utiliza-se uma tcnica denominada genotipagem, por meio da qual se identifica a presena do transgene no genoma de todos os animais nascidos. A integrao do transgene por microinjeo, como dito anteriormente, ocorre de forma aleatria no genoma, e todas as clulas do animal so geneticamente modificadas, inclusive as germinativas, de modo que essa alterao ser transmitida aos seus descendentes. Todo animal transgnico positivo originado de um embrio microinjetado

classificado como fundador de uma linhagem transgnica nica, que difere de outro fundador quanto ao local de insero e ao nmero de cpias do transgene no genoma

MODIFICAO GENTICA DIRIGIDA Desde o incio, um dos principais objetivos da transgnese era produzir animais com alteraes especficas e controladas no genoma, tais como inativao de genes ou mutaes pontuais de aminocidos nas protenas codificadas por eles. Hoje isso possvel, porm a tcnica empregada para produzir esses animais mais complexa que a de adio gnica. Ao contrrio desta, o mtodo utilizado para a modificao e inativao de genes exige que se conhea sua localizao no genoma. Por isso, ele denominado modificao gentica dirigida ou controlada. Essa tcnica possibilita substituir um gene funcional por uma seqncia mutada que, uma vez introduzida, inativa o gene endgeno original, gerando um animal conhecido como modelo knockout. Da mesma forma, possvel alterar uma pequena seqncia do gene, gerando um modelo knockin que produzir uma protena modificada em vez da protena endgena intacta naturalmente presente no animal. O termo knockin se deve ao fato de, nessa tcnica, o gene endgeno ser retirado do genoma e substitudo por outro com uma pequena modificao. A analogia do genoma a uma biblioteca bastante adequada para entender os modelos de alterao gentica. Na transgnese por adio, imagina-se uma ou vrias cpias de um livro sendo colocadas aleatoriamente nas estantes, enquanto a inativao gnica (knockout) como a retirada permanente de um livro especfico da biblioteca ou ainda a modificao de apenas uma pgina desse livro e sua reposio na prateleira (modelo knockin). A modificao gentica dirigida ou controlada inclui uma etapa a mais que a adio gnica: a cultura de clulas-tronco embrionrias. Essas clulas so modificadas in vitro (fora do organismo vivo, em tubo de ensaio) por um processo denominado recombinao homloga - a troca de seqncias de DNA correspondentes entre cromossomos, que ocorre naturalmente no ncleo das clulas - e do origem a um animal com um gene inativado ou alterado. O princpio dessa tcnica a substituio de um gene-alvo por uma seqncia mutada que, uma vez introduzida, ir inativ-lo ou modific-lo. O primeiro grande xito dos pesquisadores, no final da dcada de 80, foi conseguir isolar e manter clulas-tronco indiferenciadas in vitro e, pouco mais tarde, com a injeo deles em embries receptores, produzir camundongos quimricos - formados por duas linhagens 9

de clulas geneticamente distintas, uma originria das clulas-tronco modificadas que foram injetadas (de animais de pelagem escura) e outra do blastocisto receptor (originadas de animais de pelagem clara). O animal resultante desse processo apresenta pelagem malhada. Isso provou definitivamente que essas clulas so capazes de iniciar o processo de diferenciao e produzir um indivduo completo. As clulas-tronco embrionrias so totipotentes, ou seja, capazes de gerar qualquer tipo de tecido. Elas so oriundas de embries na fase inicial de desenvolvimento, aps cerca de quatro dias da fertilizao do vulo. O embrio nessa fase denominado blastocisto e possui centenas de clulas-tronco na sua massa celular interna, que daro origem a todos os tecidos do organismo adulto. Com o domnio da cultura de clulas-tronco, o prximo passo foi descobrir como inativar ou modificar genes especficos nessas clulas. Esse feito foi conseguido com o uso da recombinao homloga. A seleo das clulastronco embrionrias com genoma mutado realizada, e finalmente as clulas modificadas so microinjetadas em embries de camundongo. Assim, possvel inativar de maneira sistemtica qualquer gene, desde que sua seqncia genmica seja conhecida. Atualmente, essa tcnica rotineiramente aplicada em camundongos, uma das nicas espcies - alm da humana - em que se domina totalmente o cultivo de clulas-tronco embrionrias. Para outras espcies, h dificuldade em manter indiferenciadas as clulastronco derivadas de embries em cultura.

APLICAES NA MEDICINA Uma aplicao fascinante da transgnese a utilizao de animais geneticamente modificados como modelos para o estudo das causas, da progresso, dos estgios e sintomas de doenas cardiovasculares, auto-imunes, neurolgicas e outras. Por permitir uma anlise detalhada da fisiopatologia de doenas, os estudos com transgnicos devem propiciar tambm o desenvolvimento de novas formas de tratamento, novos testes diagnsticos, agentes teraputicos mais eficazes e baratos, e o to esperado estabelecimento de protocolos de terapia gnica. Nesse sentido, utilizando a tcnica de knockout, nosso grupo foi capaz de demonstrar, em 2000, a importncia fisiopatolgica do receptor B1 da cinina, protena presente na membrana das clulas, que participa no processo de transmisso da dor e de inflamao. Atravs desse processo, recentemente descobrimos que essa protena tambm pode ser uma importante arma no tratamento da obesidade e dos distrbios metablicos. 10

O transplante de rgos e tecidos de animais em seres humanos, ou xenotransplante, foco de interesse por mais de um sculo. Existe carncia mundial de rgos para transplantes clnicos, e infelizmente muitos pacientes morrem na fila de espera. As vantagens do xenotransplante sobre os transplantes tradicionais incluem o suprimento ilimitado de rgos e a conseqente diminuio das filas de espera. Alm disso, como o rgo a ser transplantado coletado imediatamente, ele no prejudicado por efeitos post-mortem, como hemorragia e alteraes metablicas. Atualmente os pesquisadores desenvolvem porcos transgnicos cujos rgos podem ser seguramente utilizados para transplante em humanos. Para isso, preciso superar um difcil obstculo: o sistema imunolgico reconhece e destri todas as clulas que no possuem marcadores especficos humanos na sua superfcie, ocasionando o fenmeno da rejeio. Para contornar esse problema, foram criados porcos transgnicos portadores de um gene que codifica uma protena da superfcie de clulas humanas. Como resultado, esses porcos possuem rgos contendo marcadores de clulas humanas, o que impede que componentes do sistema imune do receptor ataquem e destruam o rgo transplantado. Paralelamente, outros grupos de pesquisa estudam uma estratgia diferente para minimizar a rejeio de rgos na xenotransplantao. Ela consiste em eliminar do genoma do porco, pelo mtodo de knockout, o gene que codifica a a -1,3galactosiltransferase, uma enzima presente na superfcie das clulas daquele animal que reconhecida pelo sistema imunolgico humano. Sem esta enzima, a primeira etapa na rejeio ao rgo transplantado no se deflagra. Nas doenas degenerativas do sistema nervoso, o transplante de neurnios fetais de porcos representa uma terapia em potencial. Porcos transgnicos expressando uma molcula humana que inibe as clulas T imunossupressoras foram gerados. Neurnios de embries que secretam a molcula in vitro foram transplantados em ratos e houve reduo de 50% na resposta proliferativa. Esses dados mostram que neurnios de porcos transgnicos podem ser usados para testes pr-clnicos em xenotransplantao. Apesar das boas perspectivas do xenotransplante, a utilizao do mtodo ainda precisa ser avaliada com cautela. Existe a possibilidade de os tecidos transplantados carregarem algum tipo de microorganismo latente que, uma vez introduzido no organismo receptor, origine uma infeco. A tcnica tambm suscita inmeros aspectos ticos que devem ser ainda bastante discutidos. Entretanto, mesmo em face dos problemas inerentes ao uso de uma nova terapia, tal tcnica parece bastante promissora e deve levar ao

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estabelecimento de uma metodologia, trazendo novas esperanas para aqueles que aguardam h tempos na fila dos transplantes.

PECURIA E INDSTRIA H at pouco tempo, os pecuaristas dispunham de poucos mtodos para produzir animais com caractersticas fsicas desejadas. Para aumentar a produo de leite ou acelerar o crescimento corpreo, utilizava-se o cruzamento seletivo ou ainda hormnio de crescimento. Porm, o cruzamento seletivo extremamente lento e dispendioso, alm de ser um processo que no garante os resultados desejados, e o uso de hormnios altamente criticado, uma vez que deixa resduos no produto animal consumido pelo homem. As novas tcnicas de biologia molecular tornaram possvel a introduo de caractersticas desejveis nos animais, em menos tempo e com mais preciso. Como exemplo, citamos a gerao de vacas transgnicas que do mais leite ou leite com menos lactose ou com menos colesterol, porcos e bovinos que produzem mais carne, ovelhas com mais l. Tambm h experimentos que tentam desenvolver porcos e outros animais resistentes a doenas como a gripe influenza. No entanto, conhecem-se poucos genes que conferem resistncia a doenas em animais domsticos. A indstria mundial vem utilizando cada vez mais as novas tecnologias de transgnese, a fim de desenvolver produtos para os mais diversos fins. A indstria farmacutica, por exemplo, aplica um processo denominado "humanizao de camundongos" para a utilizao desses modelos animais no desenvolvimento de novas drogas. Por meio desse processo, um gene retirado do genoma do animal pela tcnica de knockout e, em substituio, um gene humano inserido pelo mtodo de adio gnica. Essa tcnica deve facilitar enormemente o desenvolvimento de novos medicamentos, barateando os custos e diminuindo o tempo para uma nova droga chegar s farmcias. Outra importante aplicao da transgenia animal a produo de animais conhecidos como biorreatores. Estes so geralmente animais domsticos de mdio e grande porte, utilizados para a produo de protenas recombinantes humanas de grande interesse biolgico e comercial, como enzimas, hormnios e fatores de crescimento. Em geral a protena de interesse expressa no leite do animal, tornando sua produo mais barata e eficiente. Em 1997, o primeiro bovino transgnico, a vaca Rosie, produzia leite enriquecido com a protena humana lactoalbumina. Esse leite transgnico mais nutritivo para humanos que o leite natural, e poderia ser introduzido na alimentao de crianas com carncia de 12

nutrientes especficos. H tambm pesquisas em curso voltadas para a produo de leite transgnico contendo as protenas necessrias para o tratamento de doenas como fenilcetonria, enfisema hereditrio e fibrose cstica. Por exemplo, o Instituto A. I. Virtanen, da Finlndia, gerou um bovino contendo um gene cuja protena correspondente promove o crescimento de hemcias em humanos. Em razo do impacto e da complexidade tica da criao de animais transgnicos para o consumo humano, a Comisso do Codex alimentarius (Lei alimentar ou Cdigo alimentar, em latim), estabelecida conjuntamente pela FAO (Organizao das Naes Unidas para a Agricultura e a Alimentao) e pela OMS (Organizao Mundial da Sade), est trabalhando em colaborao com vrios pases, dentre eles o Brasil, com o objetivo de criar normas de aplicao internacional visando a segurana de alimentos produzidos a partir desses animais. Recentemente foi aprovada pela Agncia Europia de Medicina a produo pioneira de antitrombina humana pela empresa americana GTC Biotherapeutics, valendo-se de cabras transgnicas como biorreatores. O novo medicamento se chama Atryn e ser comercializado no prximo ano na Gr-Bretanha e em outros pases europeus. A antitrombina uma protena presente no sangue com propriedades anti-coagulantes e antiinflamatrias, que pode ser utilizada no tratamento de portadores de uma doena gentica rara conhecida como deficincia hereditria de antitrombina. A deficincia de antitrombina torna seus portadores vulnerveis a tromboses, que se caracterizam pela formao ou desenvolvimento de cogulos sangneos. Pelo fato de a antitrombina ser purificada do sangue humano, uma grande vantagem dessa nova tecnologia evitar contaminaes atravs do material dos doadores. Alm dessa protena, a mesma empresa j possui outros produtos que devero em breve ser colocados no mercado, dentre eles a antitripsina alfa-1 humana recombinante, usada no tratamento de certas formas de enfisema, e uma nova vacina transgnica contra a malria. A empresa holandesa Pharming dever produzir vrias protenas no leite de vaca para tratamento de doenas como o Rhucin, um inibidor de C1 esterase recombinante para o tratamento de angiedema hereditrio; e a lactoferrina humana, uma protena com propriedades antiinflamatrias, alm de fibrinognio e colgeno. Em 2001, dois cientistas da Nexia Biotechnologies, do Canad, introduziram genes responsveis pela produo de protenas de teia de aranha nas clulas das glndulas mamrias de cabras lactentes. As cabras comearam ento a produzir a seda no leite e, atravs da extrao e manufatura dos fios de polmeros do leite, desenvolveu-se um material leve, flexvel e resistente que poderia ser utilizado na confeco de uniformes militares, fios de microssutura para cirurgia e cordas de raquete de tnis. 13

No Brasil, nosso grupo de pesquisa, em colaborao com a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa), a Universidade de Braslia (UnB) e o Hospital de Apoio de Braslia, produziu no leite de camundongos transgnicos o fator IX humano, uma protena responsvel pela coa-gulao do sangue. Essa protena ausente nos hemoflicos, dificultando a coagulao nos portadores da doena. As pesquisas iniciais foram realizadas em camundongos, mas o objetivo final dos pesquisadores da Embrapa desenvolver vacas clonadas transgnicas expressando o gene humano para esse fator no leite. Outra instituio de ensino e pesquisa brasileira que tem se destacado no uso de animais para produo de protenas humanas modificadas a Universidade Estadual do Cear, que visa produzir cabras transgnicas expressando no leite o fator de estimulao de colnias de granulcitos (G-CSF), uma protena utilizada para estimular a produo de glbulos brancos e recrutar clulas-tronco da medula ssea. A G-CSF usada no tratamento de pacientes com sistema imunolgico debilitado.

O FUTURO DA TRANSGNESE As alteraes genticas animais desenvolvidas ao longo das ltimas trs dcadas provocaram uma grande revoluo no campo da biologia, permitindo a anlise de vrios aspectos da funo gnica in vivo. As pesquisas biomdicas baseadas nas alteraes genticas na modelos animais oferecem esperana para a cura das principais doenas que afligem a humanidade. O uso de animais transgnicos em pesquisas um aspecto central na direo dessa concretizao e, alm disso, oferece a possibilidade de reduzir o nmero de animais nas experimentaes. Portanto, o uso apropriado dos modelos de animais transgnicos propicia as ferramentas necessrias para o desenvolvimento da cincia, com grande potencial para gerar benefcios altamente significativos nos campos mdico, biotecnolgico e comercial. Entretanto, apesar de todas essas vantagens conferidas por essa tcnica revolucionria, muitos ainda relutam em aceit-la. Por exemplo, esse tipo de cincia visto por alguns como uma interferncia na ordem "natural" das coisas. Porm, transferncias de genes entre espcies s vezes ocorrem na Natureza. Outros oponentes receiam que a proliferao dos organismos geneticamente modificados tenha conseqcias globais nefastas. No entanto, at o momento no existe qualquer indcio que apie esse temor. Como pesquisadores dessa intrigante rea do conhecimento, e em consonncia com a comunidade cientfica, acreditamos que o homem pode e deve extrair vantagens das 14

novas tecnologias disponveis, se as devidas precaues forem tomadas, de modo a melhorar a qualidade de vida das pessoas.

JUSTIFICATIVAS A transgenia animal a criao de indivduos contendo genes heterlogos de interesse, sem a necessidade de intercruzamento. Este objetivo alcanado aps a transfeco da celular, o que permite que a seqncia exgena seja inserida no material gentico do hospedeiro. Sua justificativa consiste no estabelecimento, em curto prazo e a um custo menor, de caractersticas no alcanadas facilmente por outros meios, como a obteno da conformao correta de protenas de interesse.

A aplicao de animais transgnicos ampla e inclui estudos bsicos, como: Pesquisas mdicas, como modelos de enfermidades humanas para a

identificao e estudo de fatores envolvidos em sistemas homeostticos;

Em toxicologia, como organismos destinados a testes biolgicos;

Na produo industrial, para obter protenas especficas;

Na agricultura e zootecnia, para o melhoramento da carne e de outros produtos de origem animal; e

Na gerao de animais resistentes a doenas.

Novos modelos animais vm sendo utilizados tambm para avaliar mecanismos patognicos, procedimentos teraputicos e de diagnstico, nutrio e doena metablica, alm de eficcia de novas drogas desenvolvidas.

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Uma grande preocupao na produo agropecuria inclui os gastos relacionados com o controle e o tratamento de doenas infecciosas, o que tem sido estimado em cerca de 1020% dos custos de produo total. Alm disso, uma das caractersticas da criao de animais consiste na aglomerao dos mesmos, o que permite a rpida disseminao dos patgenos. Animais transgnicos gerados para serem mais resistentes a uma determinada doena constituem ento uma alternativa interessante para o problema. Vrios genes esto sendo testados para a gerao de transgnicos resistentes s patologias. Estudos iniciais foram realizados em camundongos. Um dos testes nesta espcie foi o de obter animais com menor propenso a desenvolver mastite. Com este objetivo, clulas de camundongos foram transfectadas com o gene da lisostafina. Esta protena possui potente atividade contra Staphylococcus sp, um dos agentes etiolgicos freqentemente envolvidos em casos de mastite. Os animais transgnicos foram testados contra o desafio por esta bactria. Os camundongos, cujas clulas da glndula mamria eram capazes de secretar protenas antibacterianas, mostraram-se mais resistentes infeco em comparao com aqueles que no tinham essa capacidade. Isto demonstra o potencial da transgenia na criao de animais resistentes. Caso contrrio, o uso desse tipo de antibacterianos por via oral ou outra forma de administrao no utilizada, pois perde sua atividade aps destruio na via digestiva ou h uma resposta imune mediada contra ela. No animal transgnico, esta protena no ser reconhecida como exgena. Camundongos transgnicos ainda foram testados quanto ao seu potencial em resistir a infeces virais. Para isto, clulas destes animais foram transfectadas com os alelos do gene MXl. Este gene codifica uma protena que interfere na replicao do vrus de influenza, prevenindo o crescimento, tanto in vitro como in vivo. Esta protena ainda tem a mesma ao contra vrus de RNA fita simples, como outros da famlia Orthomixoviridae. A metodologia utilizada para prevenir a infeco pelo vrus da Influenza consistiu na observao de que a citocina interferon beta tem seus nveis de expresso aumentados aps a infeco. Esta protena estimula o sistema imunolgico de forma a polarizar a resposta contra o ataque viral. A associao desta informao com as caractersticas da ao antiviral da protena MXI foi a responsvel pela metodologia adotada na construo gentica para a criao de animais resistentes. Colocando-se o gene MXI sob o comando de um promotor induzido por interferon, o gene ativado somente no local de infeco, impedindo assim a propagao do vrus. Este processo, denominado de imunizao intracelular, aliado transfeco de uma linhagem 16

germinativa, gerou camundongos transgnicos que expressavam a protena MXI. A introduo deste gene em camundongos susceptveis os tornou resistentes ao ataque viral. A resistncia contra doenas infecciosas extremamente importante para os animais de produo e, por isso, testes de transgenia em espcies alvos tambm tm sido realizados. Em aves, a expresso da capa viral do vrus da Leucose em alguns de seus receptores protegeu esses animais do desafio com o vrus em questo, sugerindo a possibilidade de se conseguir a resistncia viral nesta espcie animal. Gado transgnico tambm foi testado quanto sua susceptibilidade ao ataque viral. Para isso, utilizaram-se mtodos que permitiram atingir altos nveis de expresso do interferon beta e a expresso de anticorpos contra um determinado agente etiolgico. Estas metodologias demonstraram resultados promissores. Em sunos, a metodologia utilizada para criar animais resistentes ao ataque viral foi a mesma da adotada em camundongos. A expresso da protena MXI induzida pelo interferon teve sucesso em duas linhagens transgnicas. Apesar disso, este modelo adotado tambm um bom exemplo dos problemas enfrentados na produo de animais transgnicos resistentes doenas. A introduo de um nico gene pode no ser totalmente eficaz. No caso da protena MXI, sua ao diferenciada de acordo com o estgio celular, resultando em uma eficcia diferente na proteo das clulas alvo. Alm disso, a expresso dessa protena suprimida aps meses, processo cuja causa ainda no foi esclarecido.

ANIMAIS TRANSGNICOS: O COMEO DE UMA NOVA ERA? A tecnologia transgnica (ou transgenia) uma ferramenta que permite a modificao gentica de animais ou plantas pela introduo de material gentico de outra origem (DNA exgeno; como por exemplo genes provenientes de outros animais, plantas ou bactrias) no material gentico destes organismos. O uso desta tcnica pode trazer muitos benefcios, dentre quais os mais almejados so o melhoramento da eficincia pecuria, a construo de modelos genticos para o estudo de doenas, a fabricao de bioprodutos pela indstria farmacutica ou ainda a obteno de melhorias ou maior conhecimento em diversos outros campos de pesquisa. O termo animal transgnico vem sendo empregado desde o incio da dcada de 80. Os camundongos foram os primeiros mamferos nos quais a transgenia foi conseguida com sucesso. Dentre os animais de produo, os sunos, coelhos e ovinos foram os primeiros 17

a serem geneticamente modificados, em 1985. A partir de ento, animais transgnicos de diversas outras espcies, como bovinos, caprinos, aves e peixes foram produzidos com sucesso e finalidades distintas. No campo agropecurio, a grande vantagem que se espera com a transgenia o aumento da produo animal, tal qual se objetiva com a seleo natural porm, com intensidades maiores e prazos menores. Em 1990, por exemplo, foram produzidos sunos com resistncia influenza e, em 1999, camundongos transgnicos pra produo da protena alfa-lactalbumina, o que possibilitou aumento da produo de leite e suas prognies cresceram 8,7% mais rpido do que as de camundongos normais. Alm disso, j existem alguns animais de produo que produzem leite contendo enzimas (como a lactoferrina, lisozima humana ou lisostafina) que possuem a funo esperada de proteger tanto os consumidores de leite quanto a glndula mamria dos animais que as produzem contra infeces bacterianas, como a mastite. Outro exemplo de grande potencial para utilizao da transgenia na pecuria a possibilidade de produzir animais com musculatura dupla. Essa caracterstica naturalmente encontrada nas raas Belgian blue e Piemonts poderia ser reproduzida em outras raas atravs da tecnologia de modificao gentica. Essa proposta foi idealizada depois que cientistas, no final da dcada de 90, conseguiram em laboratrio inativar o gene da protena miostatina de camundongos, o que conferiu a estes animais a caracterstica de musculatura dupla, ou seja, o crescimento muscular destes animais foi de duas a trs vezes maior quando comparado ao de animais no modificados. Mais recentemente foram publicados estudos nos quais ovinos e bovinos foram modificados geneticamente para serem, de certo modo, resistentes encefalopatia espongiforme bovina (BSE, do ingls bovine spongiform encephalopaty), popularmente conhecida como Doena da Vaca Louca. Embora a resistncia doena ainda precise ser demonstrada, esta abordagem mostra que a transgenia pode ser uma importante aliada na erradicao da BSE nos animais de produo. Na medicina, a tecnologia de produo de animais transgnicos j sugerida desde os anos 80, e seu valor tem se tornado cada vez mais evidente. Uma das primeiras aplicaes propostas foi a utilizao destes animais geneticamente modificados para a produo de protenas teraputicas (remdios), as quais seriam extradas principalmente do leite destes animais. Independentemente da transgenia, a produo de remdios ou frmacos a partir de animais ou bactrias comeou a ser realizada h muito tempo. Um exemplo clssico a produo de insulina, para o tratamento de pessoas diabticas, que comeou ocorrer nos anos 20 a partir da extrao desta protena de pncreas de sunos. 18

No comeo dos anos 80 a insulina passou a ser sintetizada a partir de cultivos de bactrias, o que resultou em preos mais acessveis e maior disponibilidade no mercado. Desde ento, diversas outras protenas, inclusive o hormnio de crescimento humano, tem sido obtidos com o uso de bactrias especficas. Apesar dessa evoluo, a utilizao de animais transgnicos poderia ser o prximo passo para intensificar o potencial de produo de diversos frmacos. Tomando-se novamente a insulina como exemplo, o uso de animais transgnicos que produzissem a insulina no leite permitiria que este frmaco fosse extrado do leite, purificado e chegasse ao consumidor com um preo muito inferior comparado aos produzidos pelos outros mtodos mencionados. Um dos principais fatores envolvidos no barateamento desses produtos seria o volume de produo, que aumenta muito nos animais transgnicos. Hoje a produo e extrao de frmacos do leite de animais transgnicos, chamados de biorreatores, j est bem estabelecida. Centenas de protenas de interesse mdico e farmacutico j esto sendo produzidas e testadas no mundo. O primeiro frmaco produzido e extrado do leite de biorreatoresfoi o ATryn, lanado pela empresa norteamericana GTC Biotherapeutics. O ATryn um agente anticoagulante (uma protena antitrombina recombinante) purificado do leite de cabras biorreatoras, necessrio para pessoas com uma doena gentica rara a deficincia antitrombina hereditria que os torna vulnerveis trombose. Apesar das inmeras aplicaes da transgenia em modelos animais, um grande fator limitante da tcnica sua baixa eficincia. A tcnica de transgenia mais antiga, porm mais utilizada, a microinjeo de DNA no pr-ncleo de embries. No entanto, alm desse mtodo ter obtido pouco progresso, a taxa de nascimento dos animais baixa, em parte devido grande perda gestacional destes embries, por razes ainda no totalmente compreendidas. De todos os embries produzidos, 0 a 2% resultam em animais nascidos vivos e com a modificao desejada (transgnicos). Alm disso, a produo mdia dos animais vivos e transgnicos tambm baixa. Uma tcnica que vem apresentando grandes vantagens sobre as outras a de transferncia nuclear (clonagem) utilizando clulas geneticamente transformadas como doadoras de ncleo. Nesta tcnica, os ncleos das clulas doadoras, como por exemplo fibroblastos, so introduzidos no ocitos que tiveram seu material gentico retirado. Os conjuntos ocito-clula so submetidos fuso eltrica, para que suas membranas celulares se fundam, e assim o material gentico da clula ser utilizado pelo ocito como se fosse seu. Em seguida, a ativao qumica realizada, a partir de quando se d o incio do desenvolvimento a embrio. 19

Desde o nascimento da ovelha Dolly (que no transgnica), a clonagem vem sendo explorada como uma tcnica mais eficaz de produo de animais transgnicos. Utilizada como ferramenta da transgenia, a transferncia de ncleos mostrou-se muito mais eficiente do que a microinjeo em animais de produo. A grande vantagem da tcnica a possibilidade de manipulao e estudo da clula a ser clonada, antes da produo do animal transgnico. Deste modo, os pesquisadores podem estudar a integrao do transgene nas clulas e escolher somente as clulas que apresentem a modificao e o gentipo desejado. O objetivo maior evitar anomalias e problemas gestacionais, aumentando a sobrevivncia de embries, fetos e animais nascidos. Alm disso, os animais gerados por clonagem de clulas modificadas geneticamente sero todos transgnicos, pois portaro em todas as suas clulas a mesma modificao inicial que estava presente na clula doadora de ncleo; ao contrrio de outras tcnicas, que podem produzir animais mosaicos, que podem no passar suas novas caractersticas para a prole. De maneira geral, a transgenia oferece novas possibilidades bastante atraentes. Apesar dos desafios ainda serem intrigantes, os resultados j esto aparecendo. A aceitao destes produtos provenientes da engenharia gentica deve em pouco tempo alcanar a total aceitao pblica, se tornando uma promessa de grande impacto benfico nas necessidades humanas e animais, tanto mdicas quanto de produo. Desde que bem utilizada e com tica, a transgenia mais uma tcnica que vem para somar, que capaz de gerar novos conhecimentos e ajudar a aumentar a produo de alimento e de frmacos, tornando o acesso esses subprodutos mais vivel todos os cidados.

PROBLEMAS TICOS A expanso das intervenes biotecnolgicas no tem decorrido sem discusso. As primeiras dvidas surgiram em 1974, num artigo do norte-americano Paul Berg, publicado pela revista Nature, em que se expressam srias preocupaes em relao s consequncias que poderiam resultar da introduo no meio ambiente de

microorganismos geneticamente manipulados. O documento alertou a comunidade cientfica e acabou por gerar um debate acalorado entre investigadores, polticos e a opinio pblica internacional em torno da questo dos "efeitos" dos produtos biotecnolgicos. Os grupos defensores dos direitos dos animais criticam a Engenharia Gentica como sendo uma tecnologia cruel para os animais. 20

O pblico em geral manifesta a sua preocupao face a esta tecnologia. Essa inquietao diz respeito a questes ticas quando se introduzem genes humanos no material gentico de um porco inevitvel questionarmo-nos sobre o facto do porco ter o direito de no ser mais do que um porco. Ter o Homem o direito de manipular geneticamente os outros seres vivos? Devem ou no os animais geneticamente manipulados reproduzir-se? Quem poder garantir que os alimentos que consumimos no foram manipulados com um gene de um ser humano? H tambm preocupaes em relao segurana do consumo de alimentos que resultam de animais transgnicos. A desconfiana das pessoas e a apreenso que experimentam face a produtos alimentares com novas caractersticas tem sido particularmente marcada pelos crescentes indcios dos efeitos cancergenos de vrios aditivos alimentares. Relativamente aos ambientalistas, a preocupao no que respeita Engenharia Gentica no tanto a tcnica em si mas sim a imprevisibilidade das suas consequncias ecolgicas, para mais quando essa tcnica surge associada a fortes interesses econmicos, maus conselheiros no que toca a prudncia. Surgem ainda algumas preocupaes quando possibilidade de perdas da variabilidade gentica. O temor associado manipulao gentica ilustrado pela parbola do Dr. Frankenstein. Querer criar a criatura perfeita a partir de pedaos de outras pode resultar numa mostruosidade e, o que pior, numa mostruosidade incontrolvel. Ningum tem dvidas que as implicaes da Engenharia Gentica so difceis de prever e s a longo prazo as consequncias se faro sentir. De acordo com o Professor de Engenharia Gentica, Rui Vidal, da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa "A tecnologia gentica demasiado prometedora para ser rejeitada partida, com base na desconfiana". Este investigador acredita que "a populao precisa de ser esclarecida e de receber educao sobre manipulao gentica" opinio que, alis, partilhada por grande nmero de cientistas e investigadores. Para alm do incremento da informao ao pblico em geral, igualmente importante a instituio de Comits para estudo dos problemas e das implicaes ticas da biotecnologias, estimular a discusso pblica e criar regulamentao a nvel governamental que legisle sobre esta matria.

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Entretanto, decorrem as investigaes no domnio da criao de seres transgnicos, as grandes companhias farmacuticas competem para ver qual ser a primeira a ganhar o lucrativo mercado dessa indstria e o pblico questiona-se sobre o facto desta nova e radical tecnologia ser ou no aceitvel. De acordo com Anne Lavery uma coisa certa: Uma pessoa que tenha um transplante de corao de porco nunca mais olhar da mesma maneira para uma sanduche de carne de porco.

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CONCLUSO Os benefcios do uso de animais transgnicos para o bem-estar do ser humano so amplos, na medida que eles auxiliam pesquisas que geram maior conhecimento de biologia humana. Esses conhecimentos, por sua vez, podem se traduzir em melhora de qualidade de vida humana. Mas os benefcios mais diretos e biotecnolgicos do uso de animais transgnicos podem ser divididos em pelo menos trs grupos: agricultura, medicina e indstria. Na agricultura, a transgenia permite a criao de animais de grande porte com caractersticas comercialmente interessantes, cuja produo por tcnicas clssicas de cruzamentos e seleo so extremamente demoradas. Assim, existem vacas transgnicas que produzem mais leite, ou leite com menos lactose ou colesterol, porcos e gado transgnicos com mais carne e ovelhas transgnicas que produzem mais l. Alm disso, h um grande esforo no sentido de se produzir animais resistentes a doenas, como a gripe suna ou a febre aftosa em bovinos. Porm, isso depender da identificao de genes responsveis pela resistncia a essas doenas. As aplicaes mdicas so vrias e incluem o polmico xenotransplante, ou seja, o transplante de rgos animais para o ser humano. Estima-se que, a cada ano, so necessrios 5 mil rgos para transplantes nos Estado Unidos, e essa demanda no atendida por doadores. A transgenia vem sendo utilizada para a criao de porcos imunocompatveis com o ser humano atravs da tcnica de nocaute, foi produzida uma linhagem de porcos que no expressa uma protena imunognica em seres humanos, e, atualmente, est sendo testado o transplante de coraes desses animais para macacos. No entanto, importante ressaltar que, se por um lado o xenotransplante resolveria a questo da disponibilidade de rgos para transplantes, ele cria uma outra questo sria de biossegurana, criando o risco de transmisso de patgenos sunos para o ser humano. Alm disso, a transgenia em animais de grande porte vem sendo utilizada para a produo de frmacos. Produtos como insulina, hormnio de crescimento e fator de coagulao podem ser obtidos do leite de vacas, cabras ou ovelhas transgnicas. Finalmente, a aplicao da transgenia na indstria, de forma equivalente na medicina, visa criao de bio-reatores, animais transgnicos de grande porte produzindo uma protena de interesse comercial em algum tecido de fcil purificao. Um exemplo a cabra transgnica que produz em seu leite uma protena da teia de aranha. A purificao em grande escala desses polmeros a partir do leite permite a criao de um material leve e flexvel com enorme resistncia, que poder ser usado em aplicaes militares (coletes e uniformes a prova de bala) e mdicas (fio de sutura), entre outras.

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REFERNCIAS

http://www.prof2000.pt/users/mhelena/transgenicos.html http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio27/animais http://www.beefpoint.com.br/radares-tecnicos/reproducao/animais-transgenicos-ocomeco-de-uma-nova-era-63217/ http://www.portaleducacao.com.br/biologia/artigos/16643/animaistransgenicos#ixzz2UcgWPBLI

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