DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE.

MVZ Vctor Manuel Prez Mrquez

INTRODUCCIN. La enfermedad de Newcastle (ENC) es una enfermedad infectocontagiosa causada por un virus perteneciente al gnero Rubulavirus en la familia Paramyxoviridae. El virus contiene ARN de cadena sencilla con sentido negativo. El virus de la ENC (VENC) afecta diferentes especies de aves incluyendo a los pollos, pavos, aves acuticas, silvestres y aves exticas, ocasionando prdidas econmicas muy importantes a la industria avcola. SIGNOS CLNICOS Y LESIONES. Los signos clnicos y las lesiones varan considerablemente por lo que no se consideran patognomnicos. Beard y Hanson clasificaron los virus de la ENC basados en los signos clnicos en cinco patotipos: - Viscerotrpico Velognico (VV): Presentacin de Doyle, virus que producen una infeccin letal y aguda en pollos de cualquier edad caracterizada por lesiones hemorrgicas en el tracto digestivo, - Neurotrpico Velognico (NV): Presentacin de Beach, virus que producen una infeccin aguda frecuentemente letal en pollos de cualquier edad con signos respiratorios y nerviosos, - Mesognico: Presentacin de Beaudette, virus que producen mortalidad baja, signos nerviosos y respiratorios, - Lentognicos: Presentacin de Hitchner, virus que producen infecciones respiratorias ligeras o no aparentes los cuales son usados como vacunas de virus vivo, - Entricos - asintomticos : Virus que infectan el intestino sin producir signos clnicos. La Campaa Nacional en Mxico tiene como objetivo erradicar el VENC en su presentacin velognica, por lo tanto en esta pltica se discutirn principalmente el diagnstico, aislamiento y caracterizacin de dichos patotipos. Los virus muy patognicos producen la enfermedad en forma sbita y con una mortalidad muy elevada sin signos clnicos aparentes. En general, los pollos afectados con el VENC velognico pueden presentar alteraciones respiratorias como boqueo, estornudo, ronquera y exudado nasal; se puede presentar edema de la cabeza, edema facial y de las barbillas; las aves excretan diarrea de color verde (velognicos viscerotrpicos); la produccin de huevo puede bajar drsticamente hasta 0% y los huevos puestos son de mala calidad; se observa depresin y anorexia; signos nerviosos como temblores, tortcolis, parlisis, movimiento circular, espasmos clnicos terminales y muerte. La mortalidad en pollos totalmente susceptibles puede ser hasta del 100%. Las lesiones que se pueden encontrar son una inflamacin severa de la trquea y de los sacos areos, lesiones focales hemorrgicas o necrticas en la

mucosa del intestino especialmente en el tejido linfoide como las tonsilas cecales y el divertculo de Meckel. Se pueden presentar hemorragias en la superficie de la mucosa del proventrculo o de la molleja. En aves en produccin se pueden observar folculos hemorrgicos, deformes y acinturonados as como atresia folicular y hemorragias en el tero.

AISLAMIENTO DEL VENC. La confirmacin del diagnstico se basa en el aislamiento del VENC y la caracterizacin de la cepa infectante. El embrin de pollo es el sistema biolgico ms apropiado para el aislamiento del VENC por su sensibilidad, disponibilidad y manejo en los laboratorios. Se recomienda que los embriones sean obtenidos de parvadas libres de anticuerpos contra el VENC. El VENC se aisla frecuentemente del tracto respiratorio o intestinal, a partir de hisopos de trquea, hisopos de cloaca, heces fecales o contenido intestinal. Tambin se aisla fcilmente de pulmones, bazo, tonsilas cecales y cerebro. Las muestras debern ser enviadas al laboratorio con prontitud y colocadas en medios de cultivo o soluciones con amortiguadores y antibiticos si son muestras de trquea o de intestino. Las muestras se envian congeladas o refrigeradas en contenedores apropiados por mensajera express. Si no se cuenta con medios apropiados de transporte se puede enviar mdula sea de la que aun permaneciendo varios das a 30 C se ha podido aislar el VENC. Las muestras se pueden trabajar por separado haciendo una mezcla o pool de rganos y tejidos; otra de trqueas y finalmente de intestino o contenido intestinal. Cada muestra se macera o se resuspende, se centrifuga y se aaden antibiticos al sobrenadante y/o se pasa por filtro de 450 nm. Se inoculan 5-6 embriones de pollo de 9-11 das de edad con 0.1-0.2 ml del sobrenadante va cavidad amnioalantoidea. Los embriones son incubados a 37 C y se examinan diariamente. La presencia del virus en el fludo o lquido amnioalantoideo (FAA) se determina con glbulos rojos de pollo mediante la hemaglutinacin caracterstica que posee el VENC. Se debe determinar que la hemaglutinacin no es producida por bacterias contaminantes en el fluido. Despues de observar la hemaglutinacin y confirmar la ausencia de bacterias, se utilizan antisueros policlonales monoespecificos contra el VENC; el virus de la Influenza aviar, un suero de referencia sin anticuerpos y si es necesario otros antisueros de acuerdo con la historia clnica. Si la muestra contiene VENC, la hemaglutinacin ser inhibida nicamente con el antisuero monoespecfico contra el VENC determinndose mediante una aglutinacin en placa y/o con el mtodo de inhibicin de la hemaglutinacin.

CARACTERIZACIN DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE

Existen diferentes procedimientos in vivo e in vitro para caracterizar al VENC. En los ensayos in vivo se determina la patogenicidad del VENC en embriones de pollo y en pollos de diferente edad. Para los anlisis in vitro el VENC se puede caracterizar en cultivos celulares (capacidad del VENC para producir placas); con anticuerpos monoclonales y con tcnicas de biologa molecular determinando la secuencia de aminocidos (directamente o por deduccin) en el sitio del corte enzimtico del precursor de la protena viral de fusin o F0. Los tres ensayos de patogenicidad ms utilizados son: 1) la media del tiempo de mortalidad en embriones de pollo (MDT, mean death time), 2) Indice de patogenicidad en pollitos de un dia de edad por va intracerebral (ICPI, intracerebral pathogenicity index) y 3) Indice de patogenicidad en pollos de 6 semanas de edad por va endonenosa (IVPI, intravenous pathogenicity index). 1) Media del tiempo de mortalidad en embriones de pollo (MDT). En este anlisis se determina la capacidad del VENC para producir mortalidad en el embrin de pollo utilizando diluciones del FAA de 10-5 a 10-10 y dos grupos de 5 embriones inoculados en la maana y en la tarde respectivamente por cada dilucin. La MDT es la media del tiempo en horas en la cual la dilucin ms alta del AAF (conteniendo el VENC) mata el 100% de los embriones inoculados. La interpretacin del ensayo es: Virus velognicos Presentan una MDT menor de 60 horas, Virus mesognicos Presentan una MDT de 60 a 90 horas, Virus lentognicos Presentan una MDT mayor de 90 horas. La MDT es una prueba muy til para determinar la virulencia del VENC aunque puede ser imprecisa especialmente cuando se usa con virus aislados de especies aviares diferentes a los pollos. 2) Indice de patogenicidad en pollitos de un dia de edad por va intracerebral (ICPI). Se utilizan 10 pollitos susceptibles de un da de edad inyectndolos por va intracerebral con el AAF diluido 1:10 el cual deber tener un ttulo mnimo de 16 unidades hemaglutinantes (UHA). Los pollitos son observados diariamente y a los ocho das se registran los resultados asignando un valor de 0 si el pollo permanece sano, 1 si el pollo se enferma y 2 si el pollo muere. Un valor de ICPI de 1. 5 2.0 significa que el VENC es velognico; de 1.0 1.5 es mesognico y 0.5 lentognico. Aunque este ensayo es adecuado para evaluar la virulencia del VENC en algunos casos no se obtiene una diferenciacin tan clara entre los patotipos. 3) Indice de patogenicidad en pollos de 6 semanas de edad por va endonenosa (IVPI). Se usan 10 pollos susceptibles de 6 semanas de edad inyectndolos por va endovenosa con el AAF diluido 1:10 el cual deber tener un ttulo mayor que 16 UHA. Los pollos son observados diariamente y a los 10 das se registran los resultados asignando un valor de 0 si el pollo permanece sano, 1 si el pollo se enferma, 2 si presenta parlisis y 3 si el pollo muere. Las cepas lentognicas y algunas mesognicas muestran un IVPI de 0 y el valor de IVPI para las cepas virulentas ser cercano a 3.0.

Determinacin de la secuencia de aminocidos en el sitio del corte enzimtico del precursor de la protena viral de fusin o F0. La protena viral de fusin F es muy importante para la patogenicidad del VENC. La protena F inicia la fusin del virus con la membrana plasmtica de la clula husped permitiendo as el paso del virus para iniciar el ciclo de la multiplicacin viral. La protena F es sintetizada como un precursor denominado F0. El precursor F0 origina dos protenas (F2 y F1) mediante un corte realizado por proteasas celulares del pollo mostrando entonces su actividad de fusin. La determinacin de la secuencia de aminocidos que se encuentran en la regin del precursor F0 en donde se realiza el corte enzimtico permite diferenciar a las cepas muy virulentas del VENC de las cepas con baja virulencia. Las cepas de baja virulencia (lentognicos) presentan una arginina (R) en el sitio 116 (donde la enzima corta la unin peptdica) y una arginina (R) o una lisina (K) en el sitio 113. En cambio la mayora de las cepas velognicas y mesognicas tienen una arginina (R) en el sitio 116 ms una arginina (R) o una lisina (K) en la posicin 115 y arginina (R) en las posiciones 112 y 113. Tambin en el sitio 117 las cepas ms virulentas tienen una fenilalanina (F) y las de baja virulencia una leucina (L). La tcnica que se utiliza para determinar la secuencia de aminocidos se denomina RT-PCR ( RT Reverse Transcriptase; PCR Polymerase Chain Reaction) y bsicamente es como sigue : 1) Aislamiento del RNA viral de FAA o de tejidos o contenido intestinal de pollo, 2) Uso de la enzima transcriptasa reversa (RT) para convertir el genoma viral de RNA a DNA utilizando primers o iniciadores forward y reverse basados en la secuencia conocida de nucletidos que codifican la protena Fdel VENC, 3) Amplificacin del DNA mediante la reaccin en cadena de la polimerasa ( PCR), 4) Obtencin del producto gentico generado por la PCR utilizando electroforesis en gel de agarosa, 5) Determinacin de la secuencia de nucletidos en el producto gentico generado con un secuenciador automatizado, 6) Prediccin de la secuencia de aminocidos y de la estructura de la protena con un programa de computacin asi como la generacin de un rbol filogentico de diferentes virus de la ENC obtenindose la correspondiente comparacin.

En algunos casos no se ha encontrado una correlacin estricta entre los resultados obtenidos por todos estos mtodos y el grado de virulencia presentado por diferentes cepas del VENC. Sin embargo, actualmente se est generando una gran cantidad de informacin experimental que permitir definir el mtodo ms preciso y confiable para determinar la virulencia de las cepas del VENC y que tenga una aceptacin internacional. En 1999 durante la 67th Sesin General del Comit Internacional de la Oficina Internacional de Epizootias se aprob la siguiente definicin de la enfermedad de Newcastle: La enfermedad de Newcastle se define como una infeccin de las aves causada por un paramyxovirus aviar serotipo 1 (APMV-1) que cumpla con uno de los siguientes criterios para la virulencia: a) Que el VENC presente un ndice de patogenicidad intracerebral (ICPI) en pollitos de un da de edad (Gallus gallus) de 0.7 o mayor o b) La presentacin de mltiples aminocidos bsicos en el VENC (determinado directamente o por deduccin) en la parte C-terminal de la protena F2 y una fenilalanina en la posicin 117 que es la parte N-terminal de la protena F1. El trmino mltiples aminocidos bsicos significa que al menos deben encontrarse tres argininas o lisinas en las posiciones 113 y 116. En el caso de que no se encuentre esta secuencia entonces la cepa de VENC se caracterizar determinando el ICPI en pollitos de un da de edad. En esta definicin, los aminocidos se numeran a partir de la parte N-terminal de la secuencia de aminocidos deducida de la secuencia de nucletidos del gene F0. Las posiciones 113-116 corresponden a los residuos 4 a 1 a partir del sitio del corte enzimtico. SEROLOGA. La serologa se usa para demostrar una infeccin con el VENC o para monitorear una respuesta vacunal. Los mtodos ms utilizados son la inhibicin de la hemaglutinacin (HI) , el sistema ELISA y la virus suero neutralizacin. nicamente se describir la inhibicin de la hemaglutinacin (HI). En Mxico, el mtodo de HI se realiza usando volmenes de 0.025 ml, 10 UHA de VENC, glbulos rojos de pollo al 0.5% y microplacas con fondo en U o en V. Sin embargo, Alexander y varios investigadores en 1983 (Vet. Rec. 113: 64, 1983) estandarizaron un mtodo de HI para el virus de la bronquitis infecciosa y tambin la OIE en su publicacin OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines del 2000 del captulo de la ENC establecen que se utilicen volmenes de 0.025 ml, 4 unidades hemaglutinantes de VENC y glbulos rojos de pollo al 1% as como el uso de microplacas con fondo en forma de V.

Si una parvada no se vacuna y se obtienen ttulos positivos contra el VENC usando la HI significa que las aves se han expuesto al VENC aunque no proporciona dato alguno sobre la virulencia de la cepa infectante. En pollo de engorda con signos clnicos de la ENC y mortalidad alta se ha encontrado un aumento en los ttulos desde log2 4 hasta log2 10 a los 7 das de presentarse el brote. RESPUESTA VACUNAL. En pollos con una dosis de vacuna virus activo (vivo) se pueden obtener ttulos desde log2 4 hasta log2 6. Si la parvada ha recibido una combinacin de vacunas virus activo e inactivado-emulsionado entonces se podrn encontrar ttulos de log2 9 - log2 11. Allan y cols. desafiaron pollos con la cepa velognica Herts 33 encontrando una correlacin entre los ttulos de anticuerpos obtenidos por HI y la correspondiente proteccin. Estos datos no deben tomarse como parmetros rigurosos o como una referencia universal ya que en las granjas existen diferentes factores que modifican la respuesta al desafo de las aves vacunadas.
TITULO DE ANTICUERPOS LOG2 RESPUESTA

2 o menos 2 - 5 4 - 6 2 - 8 9 - 11

100 % mortalidad 10 % mortalidad 0 % mortalidad Disminucin en la produccin de huevo. Proteccin en la produccin de huevo.

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA: Alberts B. et al. How Cells are Studied, captulo del libro: Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc. 1983. Alexander, D.J. Newcastle disease diagnosis. In: Newcastle disease. D.J. Alexander, ed. Kluwer Academic Press. pp. 147-160. 1988. Calnek B. W., Barnes, H. J., Beard C., W., McDougald L.R., and Saif Y.M. eds. Diseases of Poultry, 10th ed. Iowa State University Press, Ames, Iowa. 1997. Collins, M.S., J.B. Bashiruddin, and D.J. Alexander. Deduced amino acid sequence at the fusion cleavage site of Newcastle disease virus showing variation in antigenicity and pathogenicity. Arch. Virol. 128: 363-370. 1993. OIE Manual of Standards for Diagnostics Tests and Vaccines. Office International des Epizooties. 2000.

Prober et. al. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chainterminating dideoxynucleotides. Science 238: 336-341. 1987. Rawn David. Recombinant DNA Technology, captulo del libro : Biochemistry, Neil Patterson Publishers. 1989. Sanger F. et. al. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. 1977. Smith L. et. al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321: 674-678.1986. Swayne D.E., Glisson J.R., Jackwood M.W., Pearson J.E. and Reed W.M. A Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, 4th ed. American Association of Avian Pathologists, University of Pennsylvania, 1998.