PESQUISA Research

DOI:10.4034/RBCS.2012.16.03.04

Revista Brasileira de Cincias da Sade Volume 16 Nmero 3 Pginas 303-310 2012 ISSN 1415-2177

Avaliao da Toxicidade Aguda e do Efeito Ansioltico de um Derivado Sinttico da Carvona

Evaluation of Acute Toxicity and Anxiolytic Effect of a Synthetic Derivative of Carvone

DAYANE ALVES COSTA1 GUILHERME ANTNIO LOPES DE OLIVEIRA2 JESSICA PEREIRA COSTA3 GEANE FELIX DE SOUZA3 DAMIO PERGENTINO DE SOUSA4 RIVELILSON MENDES DE FREITAS5

RESUMO Objetivo: Avaliar a segurana da ciano-carvona por meio de estudos de toxicidade aguda e o seu potencial ansioltico. Material e Mtodos : Camundongos Swiss machos foram tratados com ciano-carvona (v.o) em doses crescentes de 25 a 2000 mg/kg e observados durante 14 dias em relao s alteraes comportamentais e taxa de mortalidade. Posteriormente foram realizados exames hematolgicos, bioqumicos e anlise macroscpica dos principais rgos. Alm disso, outros grupos de animais foram tratados com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg, para avaliao da atividade locomotora, do efeito ansioltico e da coordenao motora. Resultados: No teste hipocrtico, devido ausncia de mortalidade, a DL50 no foi determinada. Os sinais clnicos foram discretos, reversveis e observados apenas nas maiores doses. Dessa forma, em relao s anlises hematolgicas e bioqumicas no foram verificadas alteraes significativas. Nos estudos comportamentais verificou-se uma reduo da atividade locomotora, um maior nmero de entradas nos braos abertos, bem como um maior tempo de permanncia nos braos abertos, sugerindo um possvel efeito ansioltico. Em relao ao teste do rota rod no foi verificada alterao no tempo de permanncia na barra giratria, bem como no foi detectado mudanas no nmero de quedas. Concluso: Este estudo demonstrou que a cianocarvona no apresenta toxicidade aguda, sugerindo um efeito ansioltico que precisa ser melhor investigado para a elucidao do seu mecanismo de ao. DESCRITORES Ansiedade. Monoterpeno. Toxicidade Aguda. Sistema Nervoso Central.
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SUMMARY Objective: To evaluate the safety of cyano-carvone by means of acute toxicity studies and to investigate its anxiolytic potential. Material and Methods: Swiss male mice were treated with cyano-carvone (v.o) in escalating doses from 25 to 2000 mg/kg and observed for 14 days as regards behavioral changes and mortality rate. After this time period, hematological, biochemical and morphological analyses of the main macroscopic organs were carried out. In addition, other groups of animals were treated with doses of 25, 50 and 75 mg/kg in order to assess locomotor activity, anxiolytic effect and motor coordination. Results: In the Hippocratic test, the compound did not cause any deaths among the mice, thus the LD50 was not determined and clinical signs that emerged were discrete, reversible and observed only in higher doses. Accordingly, hematological and biochemical analyses did not show significant alterations. In the behavioral analysis, it was found a reduction of locomotor activity and a greater number of entries in open arms, as well as a longer time spent with open arms, suggesting an anxiolytic effect. In the Rota-rod test it was observed no change in the permanence time on the spinning rod, as well as no changes were detected for the number of falls. Conclusion: This study demonstrated that cyano-carvone has no acute toxicity, and suggests a possible anxiolytic effect that needs to be further investigated in order to elucidate its mechanism of action.

DESCRIPTORS Anxiety. Monoterpenes. Acute Toxicity. Central Nervous System.

Mestranda do Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas da Universidade Federal do Piau (UFPI), Teresina/Piau, Brasil. Graduando em Biomedicina e Bolsista de Iniciao Cientfica do Laboratrio de Pesquisa em Neuroqumica Experimental da Universidade Federal do Piau (UFPI), Teresina/PI, Brasil. Doutoranda do Programa de Ps-graduao em Cincias Mdicas da Universidade Federal do Cear (UFC), Fortaleza/CE, Brasil. Doutor e Professor do Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Sergipe (UFS), Aracaj/SE, Brasil. Doutor e Professor do Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da Universidade Federal do Piau (UFPI), Teresina/PI, Brasil.

http://periodicos.ufpb.br/ojs2/index.php/rbcs

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(R)-(-)-carvona (p-mentha-6,8-dien-2-ona) um monoterpeno representante do grupo qumico das cetonas. Esse monoterpeno o componente majoritrio do leo essencial da hortel (Mentha spicata L.) que pode ser obtido por hidrodestilao a partir das folhas desta planta. A carvona apresenta propriedades estomquicas e carminativas, sendo a esta tambm atribuda ao galactagoga e emenagoga. Na indstria farmacutica de cosmticos e alimentcia pode ser utilizada como flavorizante e saporificante (EHLERT et al., 2002).A ciano-carvona (1S, 2S, 5R) - 5-isopropenil-2-metil-3-oxo ciclohexanocarbonitrila ou cetonitrila (Figura 1) um derivado sinttico monoterpenico da (R)-(-)-carvona.

processo de sntese. A um balo contendo 12,5 g (83,50 mmols) de R-(-)-carvona em 37,5 mL de etanol a 0oC, adicionou-se lentamente uma soluo de 7,5 g (115 mmols) de KCN em 17,5 mL de gua. Em seguida, foi adicionado a esta mistura 5,5 mL de cido actico glacial em 1 hora. Agitou-se por mais 16 horas a 0oC. Depois, filtrou-se a mistura reacional e o precipitado foi lavado com gua/etanol (1:1). O produto recristalizado do etanol resultou em 13,28 g (75,02 mmols) de ciano-carvona com 90% de rendimento. A primeira etapa da reao foi realizada adicionando-se cianeto em meio aquoso a R-()-carvona a 0oC, sendo em seguida acrescentado cido actico mistura. Obteve-se o composto ciano-carvona com 90% de rendimento (Esquema 1).

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Figura 1: Estrutura qumica ciano-carvona (1S,4R,6S)-6-carbonitrile-8-p-menthen-2-one) ou cetonitrila.

Esquema 1: Processo de obteno do composto ciano-carvona.

Dessa forma o presente estudo avaliou a toxicidade aguda desta substncia, a fim de verificar a sua segurana para uma possvel aplicao pela indstria farmacutica na produo de novos frmacos para tratamento de doenas neurodegenerativas. Atualmente houve um aumento dos estudos envolvendo a avaliao de compostos sintticos e semisintticos, j que aproximadamente 85% dos frmacos disponveis na teraputica moderna so de origem sinttica (SOUSA, RAPHAEL, BROCKSOM, 2010), reforando a necessidade desse estudo. Diante do exposto o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade aguda por meio da anlise morfolgica macroscpica dos principais rgos, e dos parmetros hematolgicos e bioqumicos de camundongos. Alm disso, o presente estudo investigou o possvel efeito ansioltico em modelos experimentais, aps tratamento agudo com ciano-carvona.

Animais e Tratamento Camundongos Swiss machos com 2 meses de idade e peso variando de 25 a 30 g, provenientes do Biotrio Central do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Piau foram utilizados nos experimentos. Os animais receberam gua e dieta (Labina) ad libitum e foram mantidos sob condies controladas de iluminao (ciclo 12 h claro/escuro) e temperatura (26 1C). O projeto foi aprovado pelo Comit de tica em Experimentao com Animais da Universidade Federal do Piau (Nmero do protocolo 016/2011). Determinao da toxicidade aguda da cianocarvona Para os estudos de toxicidade aguda foram usados setenta camundongos Swiss machos (2 meses de idade; 25 a 30 g). Os animais foram divididos em sete grupos de 10 animais por grupo (n = 10/grupo). O grupo controle foi tratado com Tween 80 0,05% dissolvido em soluo salina 0,9% por via oral (v.o.; veculo). Os outros seis grupos foram tratados com ciano-carvona emulsionado no veculo nas doses de 25, 50, 75, 500, 1000 e 2000 mg/kg (v.o.).

MATERIAL E MTODOS Obteno da ciano-carvona A ciano-carvona foi obtida a partir do seguinte

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Durante 14 dias de observao e a cada 2 dias foram observados os animais de todos os grupos. Durante esse perodo os seguintes parmetros relacionados ao comportamento dos animais foram observados o estado de conscincia e a disposio, a coordenao motora, tnus muscular, reflexos, atividade do sistema nervoso central e a atividade do sistema nervoso autnomo. Aps o tratamento agudo os animais foram observados durante 14 dias consecutivos. Aps o dcimo quarto dia de observao os animais foram anestesiados com pentobarbital sdico (40 mg/kg, i.p.) e em seguida foi feita coleta de sangue por rompimento do plexo retro-orbital com auxlio de capilar de vidro dos grupos tratados com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg (CC 25, CC 50, CC 75, respectivamente). Anlise dos parmetros bioqumicos e hematolgicos Os parmetros bioqumicos avaliados foram glicose, uria, creatinina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), colesterol total e triglicerdeos. Os ensaios foram realizados em aparelho automtico. A anlise hematolgica foi realizada imediatamente aps a coleta por meio do analisador automtico de clulas hematolgicas. Os parmetros determinados foram eritrcitos, leuccitos, plaquetas, hemoglobina, hematcrito, ndices hematimtricos e contagem diferencial de leuccitos. Determinao dos efeitos da ciano-carvona na atividade locomotora de camundongos A atividade locomotora dos animais foi verificada por meio de um campo aberto feito de acrlico com paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x 15 cm e dividido em 9 quadrantes iguais (ARCHER, 1973). Os animais foram divididos em cinco grupos. O grupo controle foi tratado com Tween 80 0,05% dissolvido em soluo salina 0,9% e o grupo controle positivo foi tratado com diazepam (2 mg/kg) .Os outros trs grupos foram tratados com CC 25, CC 50 e CC 75, todos por via oral. Aps 30 minutos dos tratamentos, os animais, um por vez, foram colocados no centro do campo aberto onde o nmero de cruzamentos com as quatro patas (atividade locomotora espontnea; ALE), nmero de comportamento de autolimpeza (grooming) e o nmero de levantamentos (rearing), o teste foi realizado durante 5 minutos. Determinao dos efeitos ansiolticos da cianocarvona em camundongos Neste experimento foram utilizados cinco grupos.

O grupo controle foi tratado com Tween 80 0,05% dissolvido em soluo salina 0,9% e o grupo controle positivo foi tratado com diazepam (2 mg/kg) por via oral. Os outros trs grupos foram tratados com CC 25, CC 50 e CC 75 (v.o.). Trinta minutos aps os tratamentos cada animal foi colocado no centro do labirinto, colocada em direo ao brao aberto e observado por um perodo de cinco minutos, registrando-se o nmero de entradas e o tempo total de permanncia nos braos, abertos e fechados. Determinao da coordenao motora dos camundongos tratados com ciano-carvona O teste do rota rod avalia o efeito do relaxamento muscular ou incoordenao motora produzidos por drogas nos animais (CARLINI, BURGOS,1979). Neste experimento foram utilizados cinco grupos com oito camundongos por grupo. O primeiro grupo foi tratado com veculo (v.o.), o segundo grupo com diazepam (2 mg/kg) e os demais grupos foram tratados com CC 25, CC 50 e CC 75 (v.o.). Para este teste, os camundongos foram colocados com as quatro patas sobre uma barra de 2,5 cm de dimetro, elevada a 25 cm do piso, em uma rotao de 17 rpm, por um perodo de 3 minutos. Foram registrados o tempo de permanncia na barra giratria, em segundos (s), e o nmero de quedas, com trs recondues, no mximo. Anlises estatsticas Os valores foram expressos como mdia erro padro da mdia (E.P.M.). As diferenas entre os grupos foram determinadas atravs da Anlise de Varincia (ANOVA), seguida, quando detectada diferena, pelo teste t-Student-Newman-Keuls como post hoc teste. O nvel de significncia para rejeio da hiptese de nulidade foi sempre de p<0.05.

RESULTADOS E DISCUSSO As diversas aplicaes da carvona e seus derivados como a ,-epoxi-carvona, ciano-carvona que podem ser utilizados como fragrncias, saporificantes, flavorizantes e agentes antimicrobianos (GONALVES et al., 2010, SOUSA et al., 2007), bem como pela sua relevncia no campo da medicina, justificam o interesse neste monoterpeno de origem sinttica, uma vez que pode-se detectar efeitos que podem ser explorados pela indstria farmacutica provavelmente com menores custos e menor incidncia de reaes adversas (ALMEIDA et al., 2008, CARVALHO, FONSECA, 2006, KUNANUSORN et al., 2011). Neste estudo no foi possvel determinar a dose

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letal 50% (DL50) da ciano-carvona devido ausncia de morte dos animais durante os 14 dias aps a administrao da droga. A ciano-carvona no alterou de forma significativa a massa corprea dos animais, bem como no produziu mudanas no consumo de gua, rao e na produo de excretas. Aps a administrao oral de ciano-carvona foram observadas discretas alteraes nos parmetros, como estado de conscincia e disposio, sistema motor e muscular, que se revelaram diminudos, bem como os animais apresentaram respirao ofegante, agitao, sudorese, grunido e piloereo. Durante o tratamento essas alteraes foram normalizadas, e no foram observados sinais clnicos de toxicidade e nenhuma morte foi registrada (Tabela 1). Aps o perodo de observao os animais foram eutanasiados e dissecados para anlise morfolgica macroscpica dos principais rgos. Durante essa anlise no foi observadas alteraes morfolgicas macroscpica no estmago, fgado, rins, pulmes, crebro e corao dos camundongos tratados com as doses estudadas do composto sinttico ciano-carvona durante o perodo de 14 dias de observao. A avaliao da toxicidade aguda demonstrou que a ciano-carvona no produziu alteraes de importncia clnica. Nos estudos comportamentais nenhum animal morreu e poucos apresentaram alteraes comportamentais decorrentes da administrao dessa substncia. A avaliao hematolgica realizada aps tratamento agudo com a CC 25, CC 50 e CC 75 no apresentou alterao nos glbulos vermelhos. Em relao ao hematcrito e aos ndices hematimtricos (VCM, HCM e CHCM) tambm no houve mudana significativa aps o tratamento agudo com as doses de 25, 50 e 75 mg/kg de ciano-carvona por via oral (Tabela 2). Outros trabalhos corroboram com o estudo, uma vez que outros monoterpenos tambm demonstram ausncia de toxicidade pela avaliao dos parmetros hematolgicos (HARIRI et al., 2011, HOSSEINZADEH, TALEBZADEH, 2005). Nenhuma alterao nos leuccitos (WBC) foi detectada. Os resultados dos exames hematolgicos so resumidos na Tabela 2. Em relao ao WBC no houve nenhuma mudana significativa, assim como nos neutrfilos contados (p>0,05), semelhantes a outros estudos encontrados com extratos e substncias isoladas que podem ser usados de forma segura e com eficcia no SNC (OLIVEIRA et al., 2008). A Tabela 3 demonstra o efeito do tratamento agudo com ciano-carvona nas doses de 25, 50 e 75 mg/ kg (v.o.) nos parmetros bioqumicos do soro obtido de camundongos aps 14 dias de observao. A cianocarvona nas doses administradas no alterou de forma significativa os nveis plasmticos dos parmetros

bioqumicos. Os resultados obtidos para os parmetros glicose, uria, creatinina e triglicerdeos em nosso estudo esto de acordo com os valores de referncia. Conforme podemos constatar aps realizao da anlise estatstica, que demonstrou ausncia de diferenas estatisticamente significativas entre os grupos tratados com as diferentes doses da CC e o grupo controle tratado com veculo. Posteriormente foi avaliado os efeitos ansiolticos no teste do campo aberto (Tabela 4) e as doses de 25, 50 e 75 mg/kg da ciano-carvona no alterou o nmero de groomings quando comparado ao grupo controle (p>0,05). Por fim, reforando o emprego da cianocarvona como possvel agente ansioltico em novas formulaes farmacuticas foi observado que as doses de 25, 50 e 75 mg/kg reduzem o nmero de rearing de 85,3% (6,80 0,86), 83% (6,00 0,70) e 86% (5,00 1,88), quando comparado ao grupo controle (35,38 1,86; p<0,05), respectivamente. Em comparao ao grupo diazepam (13,29 2,81; p<0,05) tambm foi verificada uma diminuio significativa no nmero de rearings. Dados semelhantes foram encontrados para outros monoterpenos como o citrol, mirceno e limoneno (VALE et al., 2002). Quando o animal colocado em uma ambiente estranho h uma diminuio do apoio do animal sobre as patas traseiras (rearing) variando de acordo com o estresse sofrido pelo animal (BARBOSA et al., 2008) aumentando as tentativas e aes de levantar-se, assim a droga testada diminuiu o nmero de rearings, sugerindo que a ciano-carvona possui um possvel efeito ansioltico. Dessa forma, verificamos uma reduo no nmero de cruzamentos de 54,32, 52,06 e 44,49% nas doses de 25 mg/kg (40,60 9,61), 50 mg/kg (42,60 4,55) e 75 mg/kg (49,33 5,01), quando comparado ao controle (88,86 3,09; p< 0,001), respectivamente. Para avaliar um possvel efeito sedativo da ciano-carvona, camundongos adultos foram tratados com as mesmas doses que produziram efeito ansioltico nos modelos empregados e foram submetidos ao teste do rota rod (Tabela 5), que consiste em colocar camundongos sobre uma barra giratria a uma velocidade constante e verificar o tempo de permanncia (TP) por meio da capacidade do animal equilibrar-se sobre a mesma. Em nenhuma das doses testadas (25 mg/kg: TP = 174,1 3,19 s; 50 mg/kg: TP = 174,9 3,68 s; 75 mg/kg: TP = 174,7 1,66 s) houve alterao no TP em segundos (s) sobre a barra giratria sugerindo que no induz mudanas na atividade locomotora dos animais quando comparado ao grupo controle (TP = 175,3 1,29 s; p>0,05). Tambm no foi verificada nenhuma alterao no nmero de quedas nos grupos tratados com cianocarvona nas doses de 25, 50 e 75 mg/kg por via oral

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Tabela 1: Efeitos da administrao aguda por via oral da ciano-carvona em camundongos durante 14 dias de observao.

Tabela 2. Parmetros hematolgicos de camundongos Swiss, tratados com ciano-carvona por via oral.

Parmetros hematolgicos obtidos de camundongos machos Swiss tratados por via oral com 0,1 ml/10g de Tween 80 0,05% dissolvido em soluo salina 0,9% (Controle, n = 10) e ciano-carvona nas doses 25, 50 e 75 mg/kg e observados durante 24 horas (n = 10 por grupo). Os valores representam a mdia E.P.M. do nmero de animais usados nos experimentos. n representa o nmero de animais em cada grupo. TABELA 3. Parmetros bioqumicos obtidos do soro de camundongos Swiss, tratados com ciano-carvona por via oral.

Parmetros bioqumicos obtidos do soro de camundongos machos Swiss tratados por via oral com Tween 80 0,05% dissolvido em soluo salina 0,9% (Controle, n = 10) e ciano-carvona nas doses 25, 50 e 75 mg/kg e observados durante 24 horas (n = 10 por grupo). Os valores representam a mdia E.P.M. do nmero de animais usados nos experimentos. n representa o nmero de animais em cada grupo.

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Tabela 4: Efeitos da ciano-carvona no teste de campo aberto em camundongos.

Os valores foram expressos como a mdia E.P.M. para o nmero de cruzamentos com as quatro patas, nmero de grooming e o nmero de rearing dos animais utilizados nos experimentos. ap<0,01 (ANOVA seguido de t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste), quando comparado ao grupo controle. bp<0,001 (seguido de t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste), quando comparado ao grupo diazepam.

Tabela 5: Efeitos da ciano-carvona no teste do rota rod em camundongos.

Os valores foram expressos como a mdia E.P.M. do nmero de quedas e tempo de permanncia em segundo do nmero de animais utilizados nos experimentos. ap<0,01 (ANOVA seguido de t-Student-NeumanKeuls como post hoc teste), quando comparado ao grupo controle.

quando comparado ao grupo controle (p>0,05), sugerindo que este monoterpeno no produz efeito relaxante muscular e no altera a coordenao motora. Por outro lado, o diazepam usado como droga de referncia foi capaz de reduzir o tempo de permanncia e de aumentar o nmero de quedas, demonstrando sua capacidade de provocar relaxamento muscular. Dessa forma, podemos sugerir que o composto avaliado

apresenta um possvel efeito sedativo, semelhante ao diazepam no teste do campo aberto, mas por outro lado demonstra um melhor potencial farmacolgico de importncia clnica, uma vez que no altera a coordenao motora. Para determinar o possvel efeito ansioltico da ciano-carvona foi utilizado o teste de labirinto em cruz elevado (Tabela 6). O labirinto em cruz elevado foi

Tabela 6: Efeito da ciano-carvona no teste do labirinto em cruz elevado em camundongos.

Os valores foram expressos como a mdia E.P.M. do nmero de entradas nos braos abertos (NEBA); da porcentagem de entradas nos braos abertos PEBA (PEBA); do tempo de permanncia nos braos abertos (TPBA); e da porcentagem de tempo de permanncia nos braos abertos (PTBA) do nmero de animais utilizados nos experimentos. ap<0,01 (ANOVA seguido de t-Student-Neuman-Keuls como post hoc teste), quando comparado ao grupo controle.

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realizado aps trinta minutos administrao da cianocarvona (25 e 50 e 75 mg/kg) ou diazepam (2 mg/kg), a estatstica revelou efeitos significativos da cianocarvona sobre a porcentagem de entradas para os braos abertos na maior dose testada (75 mg/kg) houve um aumento de 33,05%, quando comparado ao grupo controle. Apesar de que no houve alterao significativa na percentagem de entradas nos braos abertos nas menores doses (25 e 50 mg/kg), quando comparado ao grupo controle (p>0,05; Tabela 6). Os efeitos sobre a explorao de braos abertos aps o tratamento com a ciano-carvona na maior dose sugere um possvel efeito ansioltico sobre o SNC. Resultados demonstram que as doses de 25 e 50 mg/kg no altera os parmetros NEBA, PEBA, TPBA e PTBA, avaliados no teste do labirinto em cruz elevado quando comparados ao grupo controle. Por sua vez a dose de 75 mg/kg de ciano-carvona aumentou de forma significativa todos os parmetros avaliados em comparao ao grupo controle. Alm disso, esse aumento foi semelhante ao observado com o grupo tratado com diazepam (droga de referncia), sugerindo que a dose de 75 mg/kg apresenta efeitos ansiolticos, com menor efeito sedativo e relaxante muscular. No entanto, futuros estudos devem ser realizados com o uso de drogas antagonistas de diferentes sistemas para esclarecer o seu mecanismo de ao ansioltico.

CONCLUSO O estudo realizado sobre a toxicidade aguda em camundongos demonstrou que a ciano-carvona nas doses avaliadas no produz alteraes hematolgicas e bioqumicas durante o perodo de 14 dias de observao, bem como no produz alterao morfolgica nos principais rgos. Com base nos estudos comportamentais podemos sugerir um possvel efeito ansioltico para a ciano-carvona. No entanto, mais estudos sobre a toxicidade subcrnica e crnica da ciano-carvona so necessrios, bem como novos estudos em modelos experimentais de ansiedade fazendo uso de antagonistas so necessrios para garantir seu uso de forma segura em problemas relacionados sade humana, principalmente na ansiedade.

AGRADECIMENTOS Este trabalho teve apoio tcnico do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), da Coordenao de Aperfeioamento de pessoal de nvel tcnico (CAPES) e da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Piau (FAPEPI).

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Correspondncia Rivelilson Mendes de Freitas Universidade Federal do Piau UFPI, Departamento de Bioqumica e Farmacologia, Campus Universitrio Ministro Petrnio Portella, Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas. Bairro Ininga Teresina Piau Brasil Cep: 64.049-550 E-mail: rivelilson@pq.cnpq.br

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R bras ci Sade 16(3):303-310, 2012