2.- CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo se pueden clasificar: 1.

- Segn el fin al que estn destinados:

Medios generales: en los cuales se desarrollan una amplia variedad de microorganismos sin condiciones nutritivas especiales. Ej: agar nutritivo o caldo nutritivo. Medios selectivos o inhibidores: inhiben por completo el crecimiento de bacterias distintas de las que se quieren aislar y que existen en la muestra. La selectividad del medio se consigue con la adiccin de sustancias como sales biliares( inhiben las formas cocaceas gram +) o la zida sdica( slo permite el crecimiento de las gram+). Los antibiticos son otras sustancias que transforman los medios de cultivo en selectivos. Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de algn tipo de bacteria que se encuentra minoritariamente en una mezcla de varias bacterias. Ej: caldo de selenito y tetrationato que se usan para en aumento de Salmonellas que existen en el contenido intestinal. Medios de diferenciacin: se usan para poner de manifiesto a las bacterias que dan positiva alguna prueba bioqumica y que estn presentes en la mezcla. Ej: bacterias glucosa + o glucosaMedios de identificacin: son aquellos que se utilizan para estudiar la accin de un solo tipo de bacterias frente a un determinado sustrato. Se diferencian del anterior en que se siembran con bacterias pertenecientes a un slo clon. Se utiliza para la identificacin de bacterias. Medios de multiplicacin: son aquellos que poseen una composicin determinada y ptima que permiten el mximo aumento celular bacteriano en el mnimo tiempo. Son muy usados en la preparacin de vacunas y Acs. Medios de conservacin: son aquellos cuya composicin favorece el mantenimiento de los microorganismos que en l se siembran y que posteriormente se incuban entre 2-4 C. Algunos medios de conservacin incluyen glicerol y se guardan en el congelador(-20C), estos medios han sido desplazados por la liofilizacin. Existe una variacin de los medios de conservacin que son los medios de transporte cuya finalidad es mantener el estado viable aunque sin reproduccin(mnimamente) de los microorganismos presentes en la muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que estn minoritariamente presentes. Los ms utilizados son: de Stuart, Amies, Cary-Blair. 2.- Segn su consistencia.

Medios Lquidos: Tambin llamados caldos. No llevan ninguna sustancia gelificante, se usa principalmente para enriquecimiento o identificacin. Su recipiente puede ser un frasco, una botella o un tubo. Medios semislidos: Contienen una proporcin menor del 5% de agente gelificante. Medios slidos: Se denominan agares. Contienen agentes gelificantes en proporciones considerables. Los medios slidos se pueden dividir en: Inicialmente lquidos: segn su reversibilidad de estado hay 2 tipos: Reversibles: despus de solidificar pueden volver a licuar. Tienen fcil conservacin. Los agentes gelificantes incorporados son agar, suero, etc. Irreversibles: no se pueden volver a licuar. Como sustancias solidificantes contienen huevo, suero, etc.

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Inicialmente slidos: en funcin de la naturaleza qumica del agente solidificante se distinguen 2 tipos: Orgnicos: como tubrculos. Inorgnicos: como silicatos. Los medios slidos pueden estar contenidos en frascos, botellas o tubos, pudiendo aparecer stos:

en horizontal: usado en siembra de picadura inclinado: se emplean en identificacin, obtencin de masa de microorganismos y almacenamiento (colonias). Una variante es el pico de flauta. Tambin los medios slidos suelen estar contenidos en placas, siendo las ms utilizadas las placas de Petri.

3.- PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO

FUNDAMENTO: La manipulacin adecuada de determinados agentes nutritivos permite obtener una fuente de alimentacin y ambiente adecuado para que puedan crecer y desarrollarse los microorganismos en las condiciones idneas. REACTIVOS: Ingredientes del medio de cultivo, NaOH (1%) y HCl (1%). MATERIALES: Vaso de precipitados de 250/500 cc., erlenmeyer de 250/500 cc., placa petri, pipetas de 10 y 25 ml, papel indicador de pH, tubos de cultivo, autoclave, algodn graso, papel de aluminio y balanza. TCNICA:

Eleccin de los ingredientes: Slo cuando se elabora un medio de cultivo a partir de los
elementos que los componen. Este paso es poco frecuente debido a la comercializacin de los medios.

Pesada de cada uno de los ingredientes. Hidratacin: El agua usada en la reconstitucin debe ser destilada o desionizada y calentada a
50-60C. Se coloca en un vaso de precipitado la mitad del agua a la que se le aaden los ingredientes o el medio de cultivo homogenizando con una varilla agitadora y manteniendo la exposicin al calor. Los medios lquidos no necesitan llevar a ebullicin en su preparacin, mientras que los medios slidos deben llevarse a ebullicin pues necesitan una T de 98-100C para disolverse. En la preparacin del medio slido se recomienda que antes de iniciar el calentamiento se deje reposar el agua precalentada durante 5-10 minutos para provocar un esponjamiento del agente gelificante que facilitar la disolucin.

Ajuste de pH: Se hace imprescindible cuando se parte de ingredientes por separado. Se mide el
pH y si este no es el adecuado se ajusta con las disoluciones de NaOH y HCl.

Distribucin: Para la esterilizacin se distribuir el medio de cultivo en recipientes que permitan

un buen proceso de esterilizacin y procurar que los recipientes sean los definitivos para llevar a cabo el cultivo. Se plantean dos posibilidades:

Medios en tubo: con una pipeta de boca ancha o un dosificador se depositan en cada tubo la cantidad de medio de cultivo correspondiente a 10-20 cc., segn la capacidad del tubo. Se tapa con una

torunda de algodn graso que se cubre a su vez con papel de aluminio y se lleva a esterilizar. Tambin se puede utilizar tubos con tapn de rosca. Con ello se consigue esterilizar recipiente y medio de cultivo por lo que ste estar dispuesto para ser sembrado y almacenado hasta su uso, ya que los tubos constituyen el recipiente definitivo.

Medios en placa: Se vierte el medio en un erlenmeyer no debe ocupar ms de 2/3 de la capacidad total pues la ebullicin en el autoclave hara que el medio rebasase. Antes de esterilizar se tapa con algodn graso y aluminio. Esterilizacin: Se realiza a 121C durante 15 minutos. Para volmenes mayores de 250cc. se aumenta el tiempo. Vertido en placa: Tras la esterilizacin se homogeniza moviendo en sentido rotatorio. El vertido en placa se debe realizar cuando la T sea prxima a la gelificacin 45-55C (puede mantener la mano sobre el recipiente).Con ello se evita la excesiva formacin de agua de condensacin en la tapa de las placas. Para el llenado se usan pipetas estriles de boca ancha o un dosificador estril, siendo este ms adecuado para evitar la obstruccin del agar. Las placas estriles por lo que la tcnica de vertido debe realizarse en condiciones de esterilidad. El volumen de muestra que debe depositarse en la placa ser segn el espesor de la capa deseada y las dimensiones de la misma ( de 2.5-3 mm, un poco ms de la mitad de la placa). Enfriamiento: Medios lquidos: Tal como se extraen del autoclave se dejan enfriar. Medios slidos: Depender de donde se encuentre el medio, as -Tubos: enfriar a T ambiente en posicin vertical (para conseguir agar horizontal) u oblicuo (para conseguir agar inclinado). - Placas: tras el vertido debe asegurarse que no existen burbujas ejerciendo movimientos rotatorios (las burbujas se quitan con el asa esterilizada).

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OBSERVACIONES AL MTODO: Si no se dispone de autoclave se pueden esterilizar los medios en bao mara hirviente o en olla a presin durante 30 min. repitiendo la operacin durante 3 das consecutivos. Los ingredientes o medios deshidratados se protegern de la humedad, la luz y el calor. Los recipientes deben ser de plstico o vidrio opaco y cierre hermtico. No deben abrirse en ambientes hmedos y deben desecharse cuando se apelmacen. Se controlar peridicamente su fecha de caducidad. Los medios hidratados y esterilizados tienen un tiempo limitado de conservacin, en general pueden conservarse 4-6 semanas en condiciones adecuadas. El problema ms frecuente es la deshidratacin, se tendr en cuenta las siguientes recomendaciones:

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almacenar en nevera a 4C, tambin a Tamb. aunque su duracin es ms limitada. no deben guardarse a T menor de 0C (T de congelacin) pues altera la estructura del gel. protegerlos de la luz, para ello envolver el recipiente en papel de aluminio los tubos con cierre hermtico son ms recomendables que las torundas de algodn los medios para verter en placa se conservan mejor en el frasco original aunque pueden quedarse en ellos teniendo en cuenta: se deben refrigerar inmediatamente despus de su solidificacin se protegern frente a desecacin precintando con cinta adhesiva su borde lateral o envolviendo varias en bolsa de plstico

se recomienda mantener en posicin invertida para evitar que se caiga sobre el medio el agua de condensacin Los medios conservados en refrigerador deben ser atemperados antes de su empleo con estufas de cultivo o a T ambiente. No utilizar nunca medios con excesiva deshidratacin, la cual se manifiesta:
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en medios lquidos, por aumento de concentracin o disminucin de volumen en medios slidos, por disminucin de espesor, agrietamiento, retraccin, cambio de color, etc. Algunos medios son conservados en estado slido en el recipiente original y luego son refundidos para su distribucin. Las precauciones a tener en cuenta son:

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no deben realizarse con medios cidos, ya que se alteran sus caractersticas (el agar se hidroliza al calentarse en medios cidos) si se mantienen fundidos periodos de tiempo mayores de 60 minutos, la calidad del medio disminuye considerablemente es aconsejable refundir al bao mara o autoclave durante 30 minutos, nunca aplicar calor directamente 4.- ELIMINACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Cualquier medio de cultivo sobre todo si ha sido sembrado, es un posible foco de contaminacin debiendo eliminarlo tras su utilizacin. Los medios de cultivo se pueden descontaminar: 1.- Inundacin en solucin desinfectante: Se cubre la superficie con esta solucin y se deja unas 12 horas. Se utiliza cuando no hay autoclave. 2.- Esterilizacin en autoclave 3.- Incineracin: se utiliza para microorganismos muy patgenos. Solo despus de la descontaminacin del medio de cultivo se proceder a la limpieza de sus recipientes (cuando stos son recuperables). 5.- CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El 4% de los medios de cultivo de los lotes se controlan en estufas durante 5-7 das a una temperatura de 37C, durante este tiempo debe verificarse el color del medio preparado as como la gelificacin, los precipitados atpicos, etc. en el caso de advertir variaciones atpicas se desechan los lotes. Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de controles antes de considerarlos aptos: 1.- Control de esterilidad (explicado anteriormente). 2.- Control de calidad, se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que le caracterizan. Para su comprobacin se utilizan por lo menos dos grmenes distintos:

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uno que crece en ese medio o da + una determinada prueba. Otro que no crece en ese medio o da - la prueba. 3.- Control de caducidad, para ponerlo en prctica es necesario que en el momento de emplaque se rotule en un lugar de la placa adems del medio, la fecha de preparacin.

Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias hetertrofas, aerobiasy anaerobias facultativas, mesfilas, capaces de crecer en un medio rico(YED). El ensayo se basa en contar el n de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha sembrado un volumen de agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubacin a 37 C. Este ensayo slo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la muestra de agua, pero NO IDENTIFICAmicroorganismos concretos. Al incubar a 37C se seleccionan bacterias de origen fecal(adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 C nos dara una idea de la flora autctona. TERCERA PRCTICA NMP DE COLIFORMES TOTALES 1. Definicin El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo esta conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales. La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo verde bilis brillante, el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra que crezcan en presencia de sales biliares. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo EMB el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de fermentar la lactosa. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva. La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo bilis verde brillante, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y

diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.