Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro

Diversidade da Microbiota com Resistncia aos Antimicrobianos em Lagares de Azeite

Dissertao de Mestrado em Anlises Laboratoriais

Helder Giroto Paiva

Vila Real, 2009

Instituio Curso Ttulo Autor Orientadores

Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Mestrado em Anlises Laboratoriais Diversidade da Microbiota com Resistncia aos Antimicrobianos em Lagares de Azeite Helder Giroto Paiva Profa. Doutora Maria Jos Flix Saavedra Prof. Doutor Jos Albino Gomes Alves Dias

As doutrinas expostas neste trabalho so da exclusiva responsabilidade do autor

Este trabalho foi expressamente elaborado como dissertao original para o efeito de obteno do grau de Mestre em Analises Laboratoriais.

AGRADECIMENTOS
A dificuldade de realizao de uma tese depende das adversidades, mas tambm dos apoios que vo surgindo, ao longo do trabalho. Neste sentido, com muita satisfao que expresso aqui o mais profundo agradecimento a todos aqueles que tornaram possvel a realizao desta tese. Ao Professor Doutor Armando Mascarenhas Ferreira, na qualidade de Reitor da UTAD, o meu agradecimento pelas facilidades concedidas para a realizao deste trabalho. Professora Doutora Maria Jos Saavedra gostaria de expressar o meu agradecimento por me ter proporcionado a oportunidade de realizar este trabalho, pela orientao pessoal e cientfica, pelas pertinentes sugestes e crticas, assim como, por toda a inestimvel confiana, disponibilidade e incentivo. Ao Professor Doutor Jos Albino Gomes Alves Dias o meu agradecimento sincero, pelo interesse demonstrado na co-orientao deste trabalho, ensinamentos transmitidos e tempo generosamente dispensado. Ao Departamento de Cincias Veterinrias (DCV) e Departamento de Biologia e Ambiente (DeBA), pela disponibilizao dos meios necessrios para a realizao deste trabalho, assim como, por toda a simpatia e apoio de funcionrios e docentes deste departamento. s colegas mestres, Dr Anabela, Dr Carla e Dr Ermelinda agradeo e manifesto o meu reconhecimento pela amizade, disponibilidade e prontido, com que me apoiaram no decorrer desta fase. No posso tambm esquecer a sua simpatia que tornou o trabalho ainda mais agradvel. tcnica de laboratrio do DeBA, D Irene Fraga que foi inexcedvel na disponibilidade e que se tornou uma distinta amiga. Obrigado a todos os meus amigos pelos momentos partilhados. Aos meus pais e irmo, e restante famlia um agradecimento muito especial, por todo o seu amor, carinho e apoio incondicional, por tudo aquilo que representam para mim

Paiva, H. G.

FINANCIAMENTOS
A realizao deste trabalho foi possvel mediante o apoio financeiro da seguinte entidade:

CECAV - Centro de Estudos de Cincia Animal e Veterinria, Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro. CITAB - Centro de Investigao e de Tecnologias Agroambientais e Biolgicas, Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro.

Paiva, H. G.

VI

TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE

JORNADAS NACIONAIS

Paiva, H.G., Borges, A., Ribeiro, E., Fraga, I., Saavedra, M. J., Dias, A. A., 2009. Diversidade da microbiota/antibioresistncia e parmetros fsico-qumicos em efluentes de lagares de azeite de Trs-os-Montes e Alto Douro. Livro de resumos das 3as Jornadas de Biologia, Evoluo, UTAD-Vila Real, Portugal (Comunicao em painel).

Paiva, H. G.

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RESUMO
A produo de azeite em Portugal tem elevada importncia a todos os nveis, em Trs-os-Montes e Alto Douro assume um papel preponderante visto ser uma das regies de maior produo. Devido quantidade de azeitona que transformada todos os anos nesta regio, grandes quantidades de resduos de difcil tratamento so tambm produzidos. Tornou-se ento relevante a caracterizao deste efluente a nvel da diversidade da microbiota, do seu perfil de susceptibilidade, bem como dos parmetros fsico-qumicos do mesmo. Foram recolhidas amostras em 4 pontos (gua de lavagem da azeitona, gua da centrfuga, gua rua e bagao) num lagar de azeite de trs fases, tendo em vista determinar parmetros fsico-qumicos e isolamento microbiano. Isolaram-se 62 estirpes, 40 na gua de lavagem, 5 na gua da centrfuga, 10 na gua rua e 7 no bagao. Determinou-se o perfil de susceptibilidade a antibiticos pelo mtodo de Kirby-Bauer. A identificao dos isolados foi efectuada por biotipificao numrica (API 20E). Avaliaram-se ainda parmetros fsico-qumicos para a caracterizao destas amostras, tais como pH, cor, slidos suspensos totais, slidos totais, CQO, CBO5, fenis totais, carbono orgnico total, azoto e fsforo totais, azoto amoniacal e ntrico. Obtiveram-se 46 isolados de Gram negativo: Enterobacteriaceae (n=35), no Enterobacteriaceae (n=11); 14 isolados de Gram positivo e 2 leveduras. Verificou-se que 90% das estirpes bacterianas estudadas apresentaram multiresistncia, evidenciando a necessidade da sua monitorizao. De modo a perspectivar a possibilidade desta microbiota ser fonte de reservatrio de genes de resistncia. Em relao familia Enterobacteriaceae, a eritromicina, amoxicilina e fosfomicina foram os antibacterianos com menor eficcia, e para a famlia das no Enterobacteriaceae foi a eritromicina e a amoxicilina. Todos os isolados de Gram positivo foram resistentes vancomicina, teicoplanina, fosfomicina, meticilina e tetraciclina. Foram identificadas estirpes com perfil multiresistente nomeadamente, Hafnia alvei, Enterobacter cloacae e Erwinia spp.. Relativamente aos parmetros fsico-qumicos de realar que na maioria, a gua da centrfuga e a gua rua possuem valores superiores aos da gua de lavagem, tendo sido nesta onde se obteve maior nmero de isolados.

Paiva, H. G.

VIII

ABSTRACT
Olive oil production is highly important in Portugal at all levels. In Trs-osMontes e Alto Douro it assumes a preponderant role since it is one of the most productive regions. Due to the amount of olives transformed daily in this region, large volumes of hard to treat residues are also produced. It is therefore relevant to characterize this effluents microbial diversity and its antibiotic sensitivity, and also its physical and chemical parameters. Samples were collected at 4 stages (olive washing water, centrifuge water, olive mill wastewater and from the pomace) in a three-stage mill in order to obtain physical and chemical parameters and microbial isolation. 62 strains were isolated: 40 in the washing water, 5 in the centrifuge water, 10 in the mill wastewater and 7 in the pomace. The antibiotic sensitivity profile was tested with the Kirby-Bauer method. The identification of the isolate was done by bacterial identification (API 20E). Physical/chemical parameters such as pH, colour, total suspended solids, total solids, COD, BOD, total phenolic content, total nitrogen, total phosphorus, total organic carbon, ammoniacal nitrogen and nitrates were also evaluated to characterize these samples. 46 Gram-negative strains were isolated: Enterobacteriaceae (n=35), non Enterobacteriaceae (n=11); 14 Gram-positive strains and 2 yeasts. 90% of the bacterial strains showed multiresistance and this fact shows the necessity for their monitoring in order to assess the possibility for this microbiota to be a resistance gene source. Regarding the Enterobacteriaceae family, erythromycin, amoxicillin and fosfomicin were the least effective antibacterials while for non Enterobacteriaceae family, erythromycin and amoxicillin were the more ineffective. Every Gram-positive strains, vancomycin, teicoplanin, fosfomicin, miticilin and tetracycline were the least effective. Were identified strains with multiresistant namely: Hafnia alvei, Enterobacter cloacae and Erwinia spp. Regarding the physical/chemical parameters, it is worth noting that overall the centrifuge water and the mill wastewater have values higher than the washing water, where most microbial isolates were obtained.

Paiva, H. G.

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NDI CE GE RAL
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... V FINANCIAMENTOS ........................................................................................................... VI TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE ................................................... VII RESUMO ......................................................................................................................... VIII ABSTRACT ....................................................................................................................... IX NDICE GERAL .................................................................................................................. X NDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... XIII NDICE DE QUADROS...................................................................................................... XIV NDICE DE TABELAS........................................................................................................ XV 1. INTRODUO .................................................................................................................1 1.1. AZEITE........................................................................................................................2 1.2. PRODUO DE AZEITE ...............................................................................................3 1.3. PROCESSOS DE EXTRACO DO AZEITE ....................................................................6 1.3.1. Sistema de extraco tradicional ................................................................7 1.3.2. Sistema de extraco contnuo ....................................................................8 1.3.2.1. Sistema de trs fases ..........................................................................8 1.3.2.2. Sistema de duas fases.........................................................................9 1.4. BAGAO ....................................................................................................................10 1.5. GUA RUA ..............................................................................................................10 1.6. TRATAMENTO DA GUA RUA .................................................................................12 1.7. POPULAO MICROBIANA .......................................................................................13 1.8. AGENTES ANTIMICROBIANOS ..................................................................................14 1.8.1. Mecanismos de resistncia .........................................................................15 1.8.2. Mecanismo de actuao dos antimicrobianos ..........................................16 1.9. GRUPOS DE ANTIBITICOS .......................................................................................16 1.9.1. Actuao sobre a parede celular ...............................................................16 1.9.1.1. Antibiticos -lactmicos ................................................................16 1.9.1.2. Glicopeptdeos .................................................................................19 1.9.1.3. Fosfomicina .....................................................................................20 1.9.2. Actuao sobre a sntese proteica .............................................................20
Paiva, H. G.
X

1.9.2.1. Aminoglicosdeos ............................................................................20 1.9.2.2. Tetraciclinas .....................................................................................21 1.9.2.3. Cloranfenicol ...................................................................................22 1.9.2.4. Macrlidos .......................................................................................22 1.9.3. Actuao sobre a sntese dos cidos nucleicos .........................................23 1.9.3.1. Quinolonas .......................................................................................23 1.9.4. Antimetabolitos ..........................................................................................23 1.9.4.1. Sulfonamidas e trimetoprim .........................................................23 2. OBJECTIVOS ................................................................................................................24 3. MATERIAL E MTODOS ..............................................................................................26 3.1. COLHEITA DAS AMOSTRAS .......................................................................................27 3.2. DIVERSIDADE DA MICROBIOTA/ANTIBIORESISTNCIA ..........................................27 3.2.1. Processamento das amostras em laboratrio...........................................27 3.2.2. Obteno de cultura pura ..........................................................................28 3.2.3. Provas Morfo-fisiolgicas ..........................................................................28 3.2.3.1. Colorao de Gram ..........................................................................28 3.2.3.2. Prova da citocromo-oxidase ...........................................................29 3.2.3.2. Prova da catalase .............................................................................30 3.2.4. Biotipificao numrica .............................................................................30 3.2.4.1. Sistema de identificao numrico API 20E (bioMrieux 20100) . 30 3.2.5. Perfil de susceptibilidade aos antibiticos ................................................31 3.2.5.1. Teste de sensibilidade aos antibiticos ............................................31 3.2.6. Conservao das amostras .........................................................................32 3.3. DETERMINAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS ...........................................33 3.3.1. Determinao da carncia qumica de oxignio (CQO) .........................33 3.3.2. Determinao da carncia bioqumica de oxignio (CBO5) ..................34 3.3.3. Determinao do pH .................................................................................35 3.3.4. Determinao da cor .................................................................................35 3.3.5. Determinao dos fenis ...........................................................................36 3.3.6. Determinao dos slidos suspensos totais .............................................36 3.3.7. Determinao dos slidos totais ...............................................................37 3.3.8. Determinao do azoto e fsforo totais ...................................................37
Paiva, H. G.
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3.3.9. Determinao do azoto amoniacal e ntrico ............................................37 3.3.10. Determinao do carbono orgnico total (TOC) ..................................38 4. RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................................................39 4.1. DIVERSIDADE MICROBIOTA/ANTIBIORESISTNCIA .................................................40 4.1.1. Estirpes Isoladas .........................................................................................40 4.1.2. Provas morfo-fisiolgicas ..........................................................................42 4.1.2.1. Colorao de Gram, prova da oxidase e catalase .............................42 4.1.3. Identificao dos isolados Bacterianos Sistema de identificao numrico API 20E (bioMrieux20 100)..............................................................44 4.1.4. Perfil de susceptibilidade a agentes antimicrobianos..............................46 4.1.4.1. Perfil de susceptibilidade dos isolados de Gram negativo ...............46 4.1.4.1. Perfil de susceptibilidade dos isolados de Gram positivo................53 4.2. DETERMINAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS ...........................................54 4.2.1. Determinao da carncia qumica de oxignio (CQO)..........................54 4.2.2. Determinao da Carncia Bioqumica de Oxignio (CBO5).................55 4.2.3. Determinao do PH ...................................................................................55 4.2.4. Determinao da Cor .................................................................................56 4.2.5. Determinao dos Slidos solveis totais e slidos totais........................56 4.2.6. Determinao dos Fenis totais .................................................................58 4.2.7. Determinao do Carbono orgnico total (TOC)....................................58 4.2.8. Determinao do Azoto ..............................................................................59 4.2.9. Determinao do Fsforo ...........................................................................59 5. CONSIDERAES FINAIS .............................................................................................60 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................62 6.1 Referencias online ..........................................................................................68 ANEXOS ...........................................................................................................................70 Anexo 1. Meios de cultura .............................................................................................71 Anexo 2. Solues, reagentes e corantes ......................................................................73

Paiva, H. G.

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NDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 - leo vegetal extrado da azeitona. ........................................................................................... 3 Figura 1.2 - Capachos libertando a fraco lquida do bagao .................................................................... 8 Figura 1.3 - Exemplo de um lagar de 3 fases (maquinaria de extraco do azeite) ..................................... 9 Figura 1.4 - Bagao produzido pela extraco do azeite ........................................................................... 10 Figura 1.5 - gua rua no contentor .......................................................................................................... 11 Figura 1.6 - Representao dos locais de actuao dos diferentes grupos de antibiticos ........................ 14 Figura 1.7 - Estrutura qumica do anel -lactmicos ................................................................................. 17 Figura 1.8 - Estrutura qumica das Penicilinas .......................................................................................... 17 Figura 1.9 - Estrutura qumica das Cefalosporinas ................................................................................... 18 Figura 1.10 - Estrutura qumica dos Carbapenemos ................................................................................. 18 Figura 1.11 - Estrutura qumica dos Monobactmicos .............................................................................. 18 Figura 1.12 - Estrutura qumica dos inibidores de -lactamases ............................................................... 19 Figura 1.13 - Estrutura qumica da vancomicina....................................................................................... 20 Figura 1.14 - Estrutura qumica da fosfomicina ........................................................................................ 20 Figura 1.15 - Estrutura qumica dos Aminoglicosdeos ............................................................................ 21 Figura 1.16 - Estrutura qumica das Tetraciclinas ..................................................................................... 21 Figura 1.17 - Estrutura qumica do Cloranfenicol ..................................................................................... 22 Figura 1.18 - Estrutura qumica da Eritromicina ....................................................................................... 22 Figura 1.19 - Estrutura qumica das Quinolonas ....................................................................................... 23

Figura 4.1 - Percentagem de isolados pertencentes s Enterobacteraceae e no Enterobacteraceae ......... 42 Figura 4.2 - Sistema de identificao numrico API 20E para as 3 estirpes em estudo ............................ 45 Figura 4.3 - Mtodo de difuso em disco .................................................................................................. 46 Figura 4.4 - Perfil de susceptibilidade de Enterobacteriaceae .................................................................. 48 Figura 4.5 - Determinao da cor (465 nm) das amostras ......................................................................... 56 Figura 4.6 - Determinao dos slidos solveis totais .............................................................................. 57 Figura 4.7 - Slidos totais das vrias amostras em estudo ........................................................................ 57 Figura 4.8 - Fenis totais obtidos das amostras em estudo ........................................................................ 58

Paiva, H. G.

XIII

NDICE DE QUADROS

Quadro 1.1 - Produo de azeite em Portugal ............................................................................................... 4 Quadro 1.2 - rea de cultivo oleico e respectiva percentagem das diferentes regies de Portugal .............. 5 Quadro 1.3 - Produo de azeite na regio de Trs-os-Montes (2006) ......................................................... 5 Quadro 1.4 - Percentagens relativas dos subprodutos gerados em funo do tipo de sistema de extraco . 7

Quadro 3.1 - Recolha das amostras ............................................................................................................... 27 Quadro 3.2 - Obteno de uma cultura inicial ............................................................................................... 28 Quadro 3.3 - Colorao de Gram .................................................................................................................. 29 Quadro 3.4 - Prova da citocromo-oxidase ..................................................................................................... 29 Quadro 3.5 - Prova da catalase ...................................................................................................................... 30 Quadro 3.6 - Sistema numrico API 20E ...................................................................................................... 31 Quadro 3.7 - Tcnica de difuso em agar com discos de antibiticos ........................................................... 31 Quadro 3.8 - Conservao das amostras ....................................................................................................... 32 Quadro 3.9 - Determinao CQO (Gama alta) .............................................................................................. 33 Quadro 3.10 - Determinao do CBO5.......................................................................................................... 35 Quadro 3.11 - Determinao da cor .............................................................................................................. 35 Quadro 3.12 - Determinao dos fenis ........................................................................................................ 36 Quadro 3.13 - Slidos suspensos totais ......................................................................................................... 36 Quadro 3.14 - Slidos Totais ........................................................................................................................ 37

Paiva, H. G.

XIV

NDICE DE TABELAS
Tabela 3.1 - Origem das amostras ................................................................................................................. 27 Tabela 3.2 - Grupos de antibiticos usados ................................................................................................... 32

Tabela 4.1 - Isolados bacterianos utilizados neste trabalho ........................................................................... 41 Tabela 4.2 - Estudo da Oxidase e Catalase .................................................................................................... 43 Tabela 4.3 - Provas bioqumicas do API20E (bioMrieux 20100) ................................................................ 45 Tabela 4.4 - Halos de inibio (mm) e categorias para avaliao do perfil de susceptibilidade das estirpes de Enterobacteriaceae ........................................................................................................................................ 47 Tabela 4.5 - Halos de inibio (mm) e categorias para avaliao do perfil de susceptibilidade das estirpes de no Enterobacteriaceae .................................................................................................................................. 52 Tabela 4.6 - Halos de inibio (mm) e categorias da avaliao do perfil de susceptibilidade nas estirpes de Gram positivo, neste estudo. .......................................................................................................................... 53 Tabela 4.7 - Determinao da carncia qumica de oxignio ........................................................................ 54 Tabela 4.8 - Determinao do CBO5 e comparao com CQO ..................................................................... 55 Tabela 4.9 - Determinao do pH nas diferentes amostras ............................................................................ 56 Tabela 4.10 - Carbono orgnico total ............................................................................................................ 58 Tabela 4.11 - Azoto amoniacal, nitratos e azoto total.................................................................................... 59 Tabela 4.12 - Fsforo total nas amostras em estudo ...................................................................................... 59

Paiva, H. G.

XV

1. INTRODUO

Introduo

1.1. AZEITE O azeite cujo nome foi legado pelos rabes (az + zait = sumo da azeitona) um leo vegetal extrado da azeitona, fruto de uma rvore de porte mdio - de vrias ramas e troncos retorcidos - muito resistente e com razes que podem atingir seis metros, conhecida como oliveira (Olea europaea L. var. europaea) (Figura 1.1). A sua qualidade depende da combinao de factores ambientais (clima e solo), genticos (variedade da azeitona), agronmicos (tcnicas de cultivo) e todas as operaes at ao seu envasilhamento. Este um produto muito verstil, utilizado de h muito pelas populaes mediterrnicas no seu regime alimentar e reconhecido pelas entidades competentes, como essencial para a sade e para um regime alimentar equilibrado. largamente apreciado na Europa e no mundo pelas suas propriedades nutritivas e organolpticas. difcil de apurar a data em que comeou o cultivo da azeitona mas pensa-se que tenha tido origem no Mdio Oriente cerca de 5000 anos e a sua importncia ao longo dos tempos resultou das mltiplas utilizaes que lhe foram dadas, para alm da alimentao, o azeite fui usado em medicina, higiene, beleza (banhos, champs, massagens), como combustvel para iluminao, lubrificante para ferramentas e alfaias agrcolas, impermeabilizao de fibras txteis, muito usado em rituais religiosos e monarcas (sacerdotes e reis eram ungidos com azeite). Na antiguidade os atletas eram ungidos por este lquido, e as folhas de oliveiras eram usadas para coroar os vencedores. Da madeira da oliveira faziam-se maos de carpinteiro e ceptros reais, alm de ser usada para aquecimento. Este produto rico em cidos gordos como o cido oleico que constitui 80% da sua composio, outro cido gordo presente o cido linleico (10%) possui ainda vitamina A e E, sendo que esta ltima tem propriedades antioxidantes O azeite contm tambm cidos gordos saturados. A este produto esto associadas propriedades organolpticas e de reduo de incidncia de doenas, tais como doenas coronrias, devido produo de DHL (bom colesterol), arteriosclerose e cancro (http://www.dq.fct.unl.pt).

Paiva, H. G.

Introduo

Figura 1.1. leo vegetal extrado da azeitona. Fonte: Paiva, H.G., 2009

1.2. PRODUO DE AZEITE

Actualmente cerca de 95% da superfcie olecola mundial est concentrada na Bacia Mediterrnica sendo os principais produtores Espanha, Itlia, Frana, Grcia e Portugal, correspondendo a 76% da produo mundial. A restante produo est distribuda entre a Tunsia, Turquia, Sria, Marrocos e Arglia sendo que as percentagens de produo quando comparadas com os principais produtores so diminutas. A produo mundial tem crescido e o saldo das ltimas 15 campanhas teve um aumento em 3,2% com uma mdia de 2 437 000 toneladas. A nvel da Unio Europeia a produo tem aumentado com a Espanha a liderar o ranking de pases produtores de azeite. A indstria extractiva de azeite representa um papel muito importante na economia dos pases mediterrnicos, pois esta uma das principais fontes de emprego e assim sendo, a principal actividade econmica em muitas regies destes pases (Lacroix, 2002; Torres, 2007). Os produtores de azeite nestes pases so cerca de 2,5 milhes representando cerca de 1/3 do total de produtores da UE havendo 1 160 000 em Itlia; 840 000 na Grcia; 380 000 em Espanha; 130 000 em Portugal e os restantes em Frana (Lacroix, 2002; Torres, 2007).

Paiva, H. G.

Introduo

Em Portugal temos vindo a recuperar a produo depois do decrscimo ocorrido na dcada de 60 at dcada de 80. Passamos de uma produo de 90 000 toneladas em mdia na dcada de 50 para as 35 000 toneladas nos anos 80 (http://www.casadoazeite.pt/). Na actualidade a nossa superfcie oleica est estimada em cerca de 340 000 ha, no entanto, em 1954 este indicador estava estimado em 570 000 ha,

tendo-se portanto verificado um acentuado decrscimo (Med. Agri. 2005 and U.N. Population statistics, 2006. Nos ltimos anos essa produo tem vindo gradualmente a aumentar (Quadro1.1).

Quadro 1.1. Produo de azeite em Portugal Campanha 96/97 97/98 98/99 99/00 00/01 01/02 02/03 03/04 04/05 05/06 06/07 Produo (1000t) 45 42 35 50 25 34 29 31 41 29 35

Fonte: Adaptado de http://www.casadoazeite.pt.

Como se pode observar no quadro 1.2, as principais regies oleicas em Portugal, com maior produo de azeite, esto situadas sobretudo no interior do pas, so o Alentejo (42%), Trs-os-Montes (20,1%) e a Beira Interior (18,4%), sendo nmero total de oliveiras estimado em 40 milhes (Med. Agri. 2005 and U.N. Population statistics, 2006). De acordo com as previses e devido a uma aposta na produo com o aumento de rea de cultivo oleico, a capacidade de produo de azeite deve aumentar at aos 60 000 toneladas em 2015.

Paiva, H. G.

Introduo

Quadro 1.2. rea de cultivo oleico e respectiva percentagem das diferentes regies de Portugal. Regio Alentejo Trs-os-Montes Beira Interior Ribatejo e Oeste Restante Total Superficie(ha) 150 000 70 000 60 000 40 000 20 000 340 000 Superficie(%) 44 21 18 12 6 100

Fonte: Adaptado de Med. Agri. 2005 and U.N. Population statistics, 2006.

A regio de Trs-os-Montes, como referido pelo observatrio agrcola, uma das regies com maior produo do pas juntamente com o Alentejo sendo que a regio transmontana possui cerca de 70 000 hectares de rea com olival que se traduz numa produo mdia de 13 000 toneladas por ano (http://www.observatorioagricola.pt). Esta produo est dividida pelos concelhos desta regio, tendo como maiores produtores Valpaos e Macedo de Cavaleiros, com uma produo em 2006 de 1 333 388 e 1 069 618 kg respectivamente. Os estudos do Ministrio da agricultura referem que a produo est dispersa por 27 Concelhos nos quais esto distribudos 122 lagares, com um total de 9 049 646 kg de azeite produzido em 2006 (Quadro 1.3) (http://www.inga.min-agricultura.pt).
Quadro 1.3. Produo de azeite na regio de Trs-os-Montes (2006) Concelho Macedo Cavaleiros Mirandela Vila Flor Valpaos Bragana Vila Nova Foz Ca S. Joo da Pesqueira Mogadouro Carrazeda de Ansies Vimioso Restantes Total Lagares que laboram 12 18 11 13 8 7 7 6 5 4 31 122 Azeite produzido (kg) 1 069 618 909 315 701 053 1 333 388 605 216 408 983 505 979 331 861 246 921 160 552 3 976 760 9 049 646

Fonte: http://www.inga.min-agricultura.pt Paiva, H. G. 5

Introduo

Sendo esta regio, uma das maiores produtoras de azeite, natural que este recurso represente uma grande importncia socioeconmica, pois combate a desertificao nas zonas mais desfavorecidas e ainda que sazonalmente este sector agrcola permite a manuteno de milhares de postos de trabalho. A salvaguarda do ambiente e da sade humana so objectivos referidos na proteco integrada do olival referidos no estudo de Malavolta e colaboradores (2002). O equilbrio ambiental tambm um aspecto que este cultivo propicia evitando a eroso pelo abandono das parcelas de terra que se no fosse este cultivo no teriam manejo.

1.3. EXTRACO DO AZEITE

O azeite uma gordura extrada a partir da azeitona, por processos naturais (mecnicos). O processo de extraco mais usado utiliza temperaturas de 50 a 60C, de modo a no alterar as caractersticas naturais desta gordura. O azeite presente na azeitona constitui uma reserva nutritiva que permite a sobrevivncia da semente durante o processo de germinao. Depois da apanha da azeitona, sobretudo a azeitona inteira, s e madura, pois so estas as que viabilizam o melhor azeite, procede-se ao transporte para o lagar para serem laboradas sob condies especiais, tais como, o arejamento para que mantenham as suas caractersticas impedindo deste modo que ocorra fermentao. O passo seguinte a seleco da azeitona, para que no se misture azeitona proveniente do solo com a da rvore, e ainda no se deve misturar azeitona s com azeitona degradada ou afectada por agentes patognicos. Posteriormente, a azeitona ventilada para que se separe da folha e lavada com gua corrente ficando assim pronta para o processo de extraco. A moenda da azeitona consiste na sua triturao atravs de ms (antigamente) ou martelos pneumticos (actualidade) para formar uma pasta que de seguida batida e que atravs da temperatura, aumenta o rendimento da extraco sendo assim mais fcil a separao do azeite da pasta. Aps a moenda efectua-se a extraco do azeite por separao das fases slida e lquida atravs de vrios mtodos, tais como: o sistema de extraco tradicional e o sistema de extraco contnuo (duas fases e de trs fases) (Kapellakis, 2008).

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Introduo

A azeitona contm alm do azeite ( 20%), os subprodutos: bagao (35%) e gua de vegetao (55%) que adicionada gua das lavagens (quer da azeitona, quer do azeite) constituiu a gua rua. O bagao e a gua rua combinam-se de forma diferente consoante o processo tecnolgico utilizado na extraco do azeite como se pode observar no quadro 1.4.

Quadro1.4. Percentagens relativas dos subprodutos gerados em funo do tipo de sistema de extraco. Tipo de sistema Azeite (%) Bagao (%) gua Rua (%) Bagao de duas fases (%)

Tradicional Trs fases Duas fases

17 18 18

47 43 -

36 39 4,5

77,5

Fonte: Adaptado de ANIDA

Os lagares de prensas hidrulicas apresentam o bagao mais seco (25% de humidade) e a menor quantidade de gua rua (0,5 - 0,6 m3/t de azeitona); os lagares de linha contnua de 3 fases (azeite, bagao e gua rua) apresentam bagaos hmidos (50% a 55%) e maiores quantidades de gua rua (1,3 1,4 m3/t de azeitona), porque o extractor centrfugo necessita de um volume de gua idntico ao da massa de azeitona que entra neste sistema, os lagares de linha contnua de 2 fases no apresentam bagao nem gua rua, mas uma combinao destes, que uma massa hmida (85% de humidade) designada por bagaos hmidos ou por lamassas e apresentado como ecolgico, por teoricamente no produzir gua rua, todavia, a carga poluente que resulta na gua rua transferida para o bagao, no sendo assim eliminada (Caputo et al., 2003; Kapellakis et al., 2008).

1.3.1. Sistema de extraco tradicional

o sistema mais antigo, usado na maior parte dos lagares at h poucos anos. usada a prensagem com ajuda da presso para separar o azeite juntamente com a gua rua (parte liquida) do bagao da azeitona (parte slida). Depois da batedura, a pasta de azeitona espalhada sobre os capachos (antigamente os discos porosos eram feitos de fibra vegetal e de plstico na actualidade) verticalmente e, para manter os capachos assim, estes so atravessados por uma agulha metlica. ento, exercida uma presso
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Introduo

na parte inferior, empurrando os capachos para cima e facilitando assim a libertao da fraco lquida do bagao, como se pode observar na figura 1.2. Os inconvenientes desta tcnica esto associados aos elevados custos de mo-deobra, e a descontinuidade do processo com a necessidade de levar mais tempo para a extraco, e ainda o facto de se utilizar materiais filtrantes leva a um acrscimo de custos de produo.

Figura 1.2. Capachos libertando a fraco lquida do bagao. Fonte: Adaptado de http://olhares.aeiou.pt

1.3.2. Sistema de extraco contnuo

Nestes sistemas, depois da batedura, a pasta de azeitona encaminha-se para uma centrfuga horizontal (decanter). Os dois sistemas de extraco contnua usam o mesmo princpio, que a separao das fases por fora centrfuga.

1.3.2.1. Sistema de trs fases

Neste processo, adicionada pasta de azeitona, gua com temperatura at 30C antes de ser centrifugada no decanter. A separao conseguida devido s diferenas de densidade do azeite e bagao e devido fora centrifuga que o decanter produz com a rotao. Assim, o bagao e a gua rua migram para a parte mais exterior do cilindro enquanto o azeite fica prximo do eixo de rotao. Neste sistema so separadas as trs fases sendo que a separao no perfeita, mas ainda assim o bagao arrastado por um parafuso sem fim para um lado do decanter enquanto a gua rua e o
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azeite so separados na outra extremidade. Como esta separao no perfeita, sendo possvel encontrar gua rua e bagao no azeite, e azeite nas outras duas fases, a separao definitiva d-se numa centrfuga vertical que difere da horizontal pela maior rotao, que assim consegue um rendimento superior. Nesta centrfuga so colocados o azeite para retirar as impurezas e depois desta separao tambm a gua rua colocada para retirar o azeite ainda presente (Figura 1.3). As vantagens deste sistema so a automatizao do processo que implica menos mo-de-obra e a garantia de higiene, pois o manejo menor. Outra das vantagens a implantao de lagares ecolgicos, com adies de pequenas quantidades de gua, reduzindo assim a quantidade de gua rua, bem como a reutilizao destas guas por diferentes processos. Apesar destas vantagens, a este equipamento est inerente um elevado custo de aquisio do mesmo e subsistem dvidas se este processo mantm a estabilidade das caractersticas organolpticas do azeite.

Figura 1.3. Exemplo de um lagar de 3 fases (maquinaria de extraco do azeite). Fonte: Paiva, H.G., 2009.

1.3.2.2. Sistema de duas fases

Este sistema difere do anterior, pelo facto de no necessitar que se adicione tanta quantidade de gua pasta de azeitona, resultando assim apenas duas fases, uma correspondendo ao bagao com gua rua e outra correspondendo ao azeite, assim
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resulta um bagao com elevado teor de humidade e de pior qualidade que o de trs fases. O leo do bagao pode ser submetido a uma secagem para que possa ser extrado e usado para diferentes fins. As vantagens so similares s do sistema de trs fases, todavia, tem a desvantagem de o bagao necessitar de ser desidratado para ser utilizado posteriormente (http://www.e-toon.net).

1.4. BAGAO O bagao constitudo pela polpa e caroo das azeitonas depois de prensadas ou depois de ir centrfuga horizontal. Contm algum leo como resduo, devido ao processo de extraco no ser completamente eficiente (Figura 1.4). Na maioria das vezes, este sub-produto queimado antes ou depois de se extrair o leo do bagao atravs de solvente, este leo pode ser adicionado ao azeite. O bagao depois de desidratado utilizado tambm como combustvel slido em caldeiras de diferentes tipos (Matos, 2006).

Figura 1.4. Bagao produzido pela extraco do azeite. Fonte: Paiva, H.G., 2009.

1.5. GUA RUA A gua rua, tambm denominada por sangra, outro dos subprodutos da extraco do azeite, sendo este um lquido escuro com um cheiro desagradvel e

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constitudo pela gua de vegetao da azeitona e gua que adicionada durante o processo de extraco como se pode observar na figura 1.5 (Chamkha et al., 2001). No passado, as guas ruas eram lanadas directamente nos cursos de gua mais prximos ou para a rede de esgotos. Actualmente esta situao est a alterar-se e cada um dos lagares tem o seu prprio processo de tratamento, ainda que todos sejam bastante diversificados, pois o Ministrio do Ambiente, Ordenamento do Territrio e Desenvolvimento Regional, no recomenda nenhum tratamento especfico. Este apenas indica a construo de uma lagoa para depsito das guas ruas, no indicando que fim lhes dar. Assim, devido legislao vigente sobre resduos industriais, no permitido encaminhar as guas ruas para os cursos de gua, sem pelo menos um tratamento prvio, quer fsico-qumico ou biolgico que complementa o anterior. Alguns lagares fazem a diluio das guas ruas e utilizam-nas na fertilizao dos solos ou em compostagem segundo o Despacho conjunto n626/2000.

Figura 1.5. gua rua no contentor. Fonte: Paiva, H.G., 2009

Nos pases Mediterrnicos, a gua rua um dos principais problemas ambientais pelo facto de apresentar elevada cargo orgnica (biopolmeros), incluindo protenas, acares, taninos, polifenis, polialcois, pectinas, lpidos e uma ampla variedade de compostos aromticos simples resultantes da degradao das paredes celulares durante o processo de extraco do azeite, como por exemplo o tirosol, hidroxitirosol, p-hidroxifenil (Liebgott et al., 2008; Chamkha et al., 2001).

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Estes pases produzem por ano cerca de 30 milhes de metros cbicos de gua rua sendo que parte desse valor produzido em Portugal (140 000 m3) e uma subparte produzida em Trs-os-Montes e Alto Douro (40 000 m3). Estes valores causam preocupao ambiental j que possivelmente, pelo menos parte desta grande quantidade de gua rua no devidamente tratada o que invariavelmente produz agresses graves fauna e flora existente em redor do depsito das guas ruas (Matos, 2006; Amaral et al., 2007).

1.6. TRATAMENTO DA GUA RUA

Os efluentes de um lagar de azeite so constitudos pelo bagao da azeitona e gua rua. Este um dos efluentes vegetais mas difcil de tratar devido aos slidos volteis, matria orgnica, e elevadas concentraes de compostos fenlicos resistentes degradao biolgica (Assas et al., 2002). Como resultado da composio da gua rua, a carncia qumica de oxignio (CQO) situa-se entre 80 e 200 g/L e a carncia bioqumica de oxignio (CBO5) vai desde 50 a 100 g/L, querendo isto dizer que pode ter de 200 a 400 vezes mais carncia qumica e bioqumica do que os tpicos saneamentos municipais (Cossu et al., 1993; Chamkha et al., 2001). Devido a estas propriedades, no fcil que esta se degrade por si prpria sem tratamento, e devido aos riscos que este efluente acarreta, muitos pases restringiram o depsito da gua rua em solos agrcolas, para que assim se evite efeitos txicos sobre o meio ambiente. Parte desta toxicidade colmatada com um tratamento qumico e fsico prvio, sofrendo posteriormente um tratamento biolgico com a finalidade de reduzir a matria orgnica, polifenis e taninos presentes na gua rua. Compostos fenlicos de baixo peso molecular possuem um efeito txico sobre a germinao de sementes (Aliotta et al., 2002), sobre os organismos aquticos (Paixo et al., 1999; Yesilada et al., 1999; Fiorentino et al., 2003) e sobre bactrias (Yesilada, 1998). Para diminuir esta toxicidade e permitir uma degradao mais rpida, tm sido propostos mtodos fsico-qumicos de pr-tratamento como tratamento electroqumico (Urmal et al., 1996; Israilides et al., 1997), destruio foto-catalitica de compostos orgnicos e inorgnicos usando um espectro radiao ultravioleta (Marques et al., 1997)

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Introduo

e ainda pelo processo de oxidao avanada por ozono com radiao ultra violeta (Benitez et al., 1997). Outros estudos tm sido feitos com vista ao tratamento biolgico deste efluente, por digesto anaerbia ou aerbia ainda que este ltimo possa ser inibido pelos compostos corados recalcitrantes (Hamdi, 1996; Zouari e Ellouz 1996; Rozzi e Malpei 1996). Alm deste tratamento, a reduo do contedo fenlico pode ser reduzido atravs do uso de fungos lenhinolticos como os gneros Geotrichum spp., Aspergillus spp. e a espcie de Candida tropicalis (Fadil et al., 2003) que so particularmente resistentes oxidao que os polifenis provocam com a peroxidase ou usando bactrias comerciais mutantes adaptadas a esse ambiente txico (Wlassics et al., 1992).

1.7. POPULAO MICROBIANA Devido carga orgnica e ao pH cido ser de esperar que a populao microbiana sofra presso selectiva. Estudos realizados revelaram a presena de bactrias aerbias pertencentes aos gneros Comamonas spp., Ralstonia spp., Pseudomonas spp. e Sphingomonas spp. neste efluente e inclusive degradam compostos aromticos de baixo peso molecular que so um dos principais problemas associados toxicidade das guas ruas (Di Gioia et al., 2002, Ntougias et al., 2006). Outros estudos com o mesmo objectivo revelaram a presena de diversas bactrias metabolicamente diferentes, algumas delas pertencentes aos gneros Bacillus spp. e Clostridium spp., os quais possuerm bactrias gram-positivo, anaerbias e formadoras de esporos (Liebgott, et al., 2008, Jones et al.,2000). Outros autores referenciaram tambm a presena de grupos de bactrias mesofilicas, catalase negativa, anaerbicas facultativas e microaeroflicas como Propionibacterium (Kussmon et al., 2001). Ensaios realizados em centrfugas de duas fases a pH alcalino por Ntougias e colaboradores (2006) revelaram populaes bacterianas pertencentes aos gneros Bacillus spp., Nesterenkonia spp., Idiomarina spp, Halomonas spp. e Nesterenkonia spp. A pH neutro, os isolados foram associados aos gneros Corynebacterium spp., Novosphingobium spp., Serratia spp., Rhodobacter spp., Pseudomonas spp. e Ochrobactrum spp.

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Ammar e colaboradores (2005) isolaram neste efluente, estirpes de Klebsiella oxytoca e Citrobacter diversus e mostraram que degradam compostos aromticos monomricos simples. Para estudos de eficcia na destruio de duas espcies de fungos em solos agrcolas, Yangui e seus colaboradores (2008) usaram vrias estirpes de bactrias encontradas em gua rua, como pertencentes ao gnero Bacillus spp., e as espcies Burkholderia caryophylli e Pseudomonas fluorescens.

1.8. AGENTES ANTIMICROBIANOS As diferenas entre as clulas procariotas (bactrias) e clulas eucariotas (animais) so exploradas para que as molculas de antibitico sejam mais eficientes na sua actividade, e tambm na procura de solues que no sejam txicas para os animais nos quais, estes frmacos so administrados (Sousa, 2006). Cada antibitico tem uma actuao especfica na clula bacteriana, pois cada tipo de antibitico tem um peso molecular distinto, uma estrutura qumica diferente e actua em diferentes locais na clula (Figura 1.6). Ento cada antibitico tem que ser entendido individualmente.

Figura 1.6. Representao dos locais de actuao dos diferentes grupos de antibiticos. Fonte: Adaptado de http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/14agquimicos.htm. Paiva, H. G. 14

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Devido a esta especificidade dos antibiticos relativamente aos agentes patognicos, as bactrias possuem resistncia inata aos outros antibiticos no fazendo assim parte do espectro de aco do antibitico. A resistncia bacteriana ocorre devido a
caractersticas codificadas geneticamente, podendo ser intrnseca ou adquirida. A resistncia adquirida resulta de alteraes na estrutura e na fisiologia celular, causadas por

mudanas na gentica normal do microrganismo. Estas alteraes podem ocorrer devido a mutaes genticas, aquisio de genes de outros microrganismos ou pela associao de ambas. A resistncia intrnseca resulta da gentica normal dos microrganismos. Todas as estratgias de resistncia nas bactrias so codificadas por um ou mais genes, os quais podem estar presentes no genoma de vrios microrganismos, que podem ou no pertencer ao mesmo gnero (Dropa, 2006). Os plasmdeos, transposes e integres so o veculo que facilita a transmisso desses genes de resistncia, tornando esse estudo muito complexo (Rhodes et al., 2000; Kmmerer, 2004). Existem variadssimos mecanismos de resistncia a antibiticos por parte das bactrias que podem ser referenciados. De seguida vo ser apresentados alguns dos mecanismos gerais de resistncia bem como os principais grupos de antibiticos usados no teste de susceptibilidade tal como o seu modo de aco.

1.8.1. Mecanismos de resistncia

Os mecanismos de resistncia podem ser de vrios tipos, dos quais se destacam, a inactivao enzimtica que se pode definir como um mecanismo que as bactrias possuem para inactivar os antibiticos, retirando-lhes as suas propriedades antibacterianas. Outro mecanismo de resistncia a diminuio da concentrao intra-celular impermeabilizando os invlucros bacterianos, impedindo que os antibiticos atravessem a membrana citoplasmtica para exercer as suas propriedades (Sousa, 2006). A diminuio da concentrao intra-celular por efluxo do antibitico (Bombas de efluxo), so outro mtodo que as bactrias usam para expulsar ou isolar na membrana as molculas nocivas para as mesmas, impedindo a aco antibacteriana. As bactrias podem ainda modificar o alvo dos antibiticos, criando molculas semelhantes ao alvo mas sem afinidade para o antibacteriano (Giroud et al., 1988; Gilman et al., 1996; Sousa e Ferreira, 1998).

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Introduo

1.8.2. Mecanismo de actuao dos antimicrobianos

Os antimicrobianos podem agir de diferentes formas para exercer a sua actividade, alterando a permeabilidade da membrana citoplasmtica das bactrias, por via de alteraes da estrutura fsico-qumica da mesma, o que desregula o meio intracelular da bactria. Existem ainda antimicrobianos capazes de inibir ou interferir a sntese da parede celular. A aco dos antimicrobianos junto dos ribossomas das bactrias podem bloquear a aco do RNA mensageiro, o que provoca a inibio da sntese de protenas podendo este bloqueio ser irreversvel. A actuao dos antimetabolitos outro dos modos de actuao dos antimicrobianos e baseia-se no facto de estes competirem com os metabolitos impedindo o normal funcionamento da clula, incluindo a sua diviso. Os antimicrobianos podem ainda inibir a sntese de cido nucleicos, inibindo a enzima RNA polimerase que catalisa a transcrio da informao gentica contida no RNA mensageiro (Murray et al., 2004; Sousa et al., 1998; Jackson et al., 1998;).

1.9. GRUPOS DE ANTIBITICOS

1.9.1. Actuao sobre a parede celular

1.9.1.1. Antibiticos -lactmicos

Os antibiticos -lactmicos so constitudos por diferentes compostos que tm em comum o facto de possurem um anel -lactmico (Figura 1.7) responsvel pela actividade antimicrobiana. Os -lactmicos inibem a sntese da parede celular, na formao do peptidoglicano. Estes apenas exercem a sua funo em bactrias em crescimento, sendo desprovidos de actividade contra bactrias sem parede celular ou contra outros microrganismos eucariotas (Sousa et al., 2006; Marn e Gudiol, 2003; Murray et al., 2004; Mims et al., 2001).

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Figura1.7. Estrutura qumica do anel -lactmicos Fonte: Marn e Gudiol, 2003.

Este grupo de antibiticos constitudo por penicilinas, cefalosporinas, carbapenemos, monobactmicos e inibidores de -lactamases (Sousa et al., 2006; Murray et al., 2004). As penicilinas (Figura 1.8) so isoladas a partir do fungo Penicillium natatum (Quinn et al., 2005,). Constitudos por um anel -lactmico unido a um anel tiazolidina e uma cadeia lateral, que varia de penicilina para penicilina, conferindo-lhes diferentes propriedades. As penicilinas unem-se s chamadas Penicillin-Binding-Proteins (PBP) indispensveis para a formao e integridade da parede celular bacteriana (Caramona et al., 2001; Koneman et al., 2001; Marn e Gudiol, 2003; Sousa et al., 2006).

Figura 1.8. Estrutura qumica das Penicilinas Fonte: Marn e Gudiol, 2003.

As cefalosporinas (Figura 1.9) so produzidas pelo fungo Cefalosporium acramonium (Quinn et al., 2005). Estas so estruturalmente semelhantes as penicilinas, que apresentam o anel -lactmico ligado a um anel dihidrotiazolina. Este grupo de antibiticos pode ser dividido em quatro geraes, tendo em conta o seu espectro de ampliao e a sua resistncia s -lactamases, enzimas que alguns microrganismos produzem e que degradam o anel -lactmico (Sousa et al., 1998). Estes antibiticos esto agrupados em quatro categorias (1, 2, 3 e 4 gerao) A actividade para Gram negativo vai aumentando com as geraes mas vai-se perdendo alguma da actividade para o Gram positivo. (Caramona et al., 2001; Sousa, 2006; Quinn et al., 2005).
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Figura 1.9. Estrutura qumica das Cefalosporinas Fonte: Marn e Gudiol, 2003.

Os carbapenemos (Figura 1.10) so produzidos por Streptomyces cattleya. Este grupo de antibiticos possui um largo espectro de actividade devido resistncia que a maioria das -lactamases apresenta. So activos contra Gram negativo, positivo e anaerbios. (Sousa, 2006; Caramona et al., 2001).

Figura 1.10. Estrutura qumica dos Carbapenemos Fonte: Marn e Gudiol, 2003.

Os monobactmicos (Figura 1.11) so produzidos por bactrias Gram negativo Chromobacterium violaceum, apresentam um anel -lactmico simples (Sousa et al., 1998; Marn e Gudiol, 2003), com resistncia s -lactamases das bactrias Gram negativo.

Figura 1.11. Estrutura qumica dos Monobactmicos Fonte: Marn e Gudiol, 2003.

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Os inibidores de -lactamases associados a penicilinas ou a cefalosporinas inactivam as -lactamases, permitindo que os antibiticos preservem a sua actividade contra as bactrias (Koch, 2003). A aco dos inibidores pode ser competitiva ou no competitiva, conforme estes competem pelo centro activo do antibitico com a enzima. Na figura 1.12 temos como exemplos a estrutura qumica dos inibidores: cido clavulnico, sulbactam e tazobactam (Koch, 2003; Marn e Gudiol, 2003). As associaes que se fazem so: amoxacilina e ticarcilina com o cido clavulnico; o sulbactam associado ampicilina e cefoperazona (cefalosporina de terceira gerao) (Sousa, 2006). Os inibidores so compostos semelhantes aos antibiticos -lactmicos que inactivam as -lactamases protegendo os -lactmicos. (Koneman et al., 1999)

Figura 1.12. Estrutura qumica dos inibidores de -lactamases Fonte: Marn e Gudiol, 2003.

1.9.1.2. Glicopeptdeos

Os Glicopeptdeos so antimicrobianos de estrutura complexa (Figura 1.13), bactericidas e o seu espectro de aco abrange bactrias Gram positivo aerbias e anaerbias. O seu principal modo de aco atravs da inibio da sntese da parede celular, causando portanto a morte celular (Sousa, 2006).

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Figura 1.13, Estrutura qumica da vancomicina Fonte: http://web.monroecc.edu/bedelbach/

1.9.1.3. Fosfomicina

A fosfomicina (Figura 1.14) um antibitico bactericida, que actua a nvel da parede celular bacteriana, inibindo a formao do peptidoglicano. Este agente antibacteriano inibe a formao do UDP-N-acetilglucosamina-enolpiruvato e activo contra bactrias Gram negativo e Gram positivo.

Figura 1.14. Estrutura qumica da fosfomicina Fonte: http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno.

1.9.2. Actuao sobre a sntese proteica

1.9.2.1. Aminoglicosdeos

Os aminoglicosdeos (Figura 1.15) so produzidos a partir da bactria Streptomyces griseus, todas as substncias pertencentes a esta classe de antibiticos como a estreptomicina so constitudas por um anel aminociclitol que tem origem no inositol, lidado por ligaes glicosdicas a acares aminados (Sousa et al., 1998).

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Figura 1.15. Estrutura qumica dos Aminoglicosdeos Fonte: http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno.

Estes antibiticos so usados para bactria Gram negativo, afectando a sntese proteica ao inibirem a funo da subunidade 30S ribossomal da bactria (Quinn et al., 2005).

1.9.2.2. Tetraciclinas

As tetraciclinas (Figura 1.16) so produzidas pelo fungo Streptomyces aureofaciens. So antibiticos compostos por um ncleo hidroxinaftaceno formado por quatro anis de benzeno que se encontram unidos (Perez-Trallero e Iglesias, 2003; Sousa, 2006). So antibiticos bacteriostticos que impossibilitam a sntese proteica, unindose subunidade 30S dos ribossomas evitando a juno do aminoacil-RNAtransferencia aos ribossomas, (Sousa et al., 1998; Quinn et al., 2005). Estas substncias so activas contra bactrias Gram positivo e Gram negativo (Sousa, 2006).

Figura 1.16. Estrutura qumica das Tetraciclinas Fonte: Perez-Trallero e Iglesias, 2003.

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Introduo

1.9.2.3. Cloranfenicol

O cloranfenicol produzido pelo fungo Streptomiyces venezuelae, mas pode ser sintetizado artificialmente (Prescott, 1996). um antibitico bacteriosttico inibidor da sntese proteica unindo-se subunidade 50S do ribossoma. (Sousa et al., 2006). Tem amplo espectro, activo contra bactrias Gram positivo e bactrias Gram negativo (Sousa et al., 1998; Quinn et al., 2005). O cloranfenicol (Figura 1.17) bloqueia o processo de transpeptidao, inibindo desse modo a sntese proteica. Esse bloqueio feito atravs da ligao do antibitico s subunidades 50S dos ribossomas bacterianos.

Figura 1.17. Estrutura qumica do Cloranfenicol Fonte: Sousa, 2006.

1.9.2.4. Macrlidos

Os macrlidos so produzidos a partir do fungo Streptomyces eruthraeus. A eritromicina o exemplo do macrlito mais conhecido (Figura 1.18). So antibiticos com um anel lactnico (Quinn et al., 2005; Sousa, 2006). Possuem aco semelhante s penicilinas e possuem tambm resistncia s -lactamases. So activos contra vrios organismos Gram positivo e Gram negativo. Dependendo da sua concentrao, podem ser bactericidas ou bacteriostticos, que inibem a sntese proteica atravs da sua unio, reversvel subunidade 50S dos ribossomas bacterianos.

Figura 1.18. Estrutura qumica da Eritromicina Fonte: Sousa, 2006. Paiva, H. G. 22

Introduo

1.9.3. Actuao sobre a sntese de cidos nucleicos

1.9.3.1. Quinolonas

Os quinolonas so antibiticos de amplo espectro, derivados do cido nalidxico. Estes antibiticos podem ter uma aco bactericida ou bacteriosttica dependendo das condies de anaerobiose (Sousa et al., 1998). (Figura 1.19). Para alm das quinolonas, existem tambm as fluroquinolonas, que apresentam compostos flurados na sua estrutura e que tem um espectro de aco mais alargado que as quinolonas (Als, 2000; Quinn et al., 2005). Estes agentes antibacterianos actuam inibindo a DNA girase, enzima essencial na preparao do DNA, por separao das cadeias, para replicao (Sousa et al., 1998).

Figura 1.19. Estrutura qumica das Quinolonas Fonte: Als, 2003.

1.9.4. Antimetabolitos

1.9.4.1. Sulfonamidas e trimetoprim

Estes compostos actuam sobre as bactrias por inibio competitiva com o acido p-aminobenzoico (PABA), dadas as semelhanas entre as duas. Ao interferir com a utilizao do PABA, impede as bactrias de produzirem os cidos nucleicos que so essenciais ao seu crescimento e multiplicao. Estes agentes antibacterianos exercem actividade contra Gram negativas e Gram positivas, por mecanismo bacteriosttico (Sousa, 2006).

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2.OBJECTIVOS

Objectivos

A resistncia a antibiticos uma problemtica global. Os efluentes domsticos, agro-industriais, actividade pecuria e humana contribuem para esta realidade. A microbiota (bacteriana) presente em efluentes de lagares de azeite, pouco conhecida, no que concerne resistncia a diferentes grupos de antibiticos.

Assim, os principais objectivos deste estudo so: Obter uma coleco de gneros bacterianos nesta matriz. Avaliar a susceptibilidade de estirpes bacterianas. Relacionar os parmetros fsico-qumicos obtidos dos efluentes de lagares de azeite com a diversidade da microbiota.

Paiva, H. G.

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3.MATERIAL E MTODOS

Material e Mtodos

3.1. COLHEITA DAS AMOSTRAS

As amostras foram recolhidas num lagar de azeite do concelho de Alij em quatro pontos distintos da linha de extraco (gua de lavagem, centrifuga, gua rua e bagao) de acordo com a tabela 3.1. O seu processamento foi efectuado no laboratrio de Microbiologia do Departamento de Cincias Veterinrias e no laboratrio de Bioqumica do Departamento DEBA (UTAD) da Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro.

Tabela 3.1. Origem das amostras Data 21/01/09 21/01/09 21/01/09 21/01/09 Referncia 1A 2A 3A 4A Nome gua de lavagem gua da centrfuga gua rua Bagao

As amostras foram recolhidas no lagar conforme metodologia descrita no quadro 3.1, e transportadas rapidamente para processamento nos respectivos laboratrios.

Quadro 3.1. Recolha das amostras 1. 2. 3. As amostras foram recolhidas com frascos e luvas esterilizados directamente do interior do lagar; Estas foram transportadas no prprio dia temperatura de 4C para o laboratrio; Durante o tempo de espera para o processamento das amostras, estas foram mantidas a baixa temperatura e com os frascos selados.

3.2. DIVERSIDADE DA MICROBIOTA/ANTIBIORESISTNCIA

3.2.1 Processamento das amostras em laboratrio

As amostras foram semeadas em meios selectivos e diferenciais como descrito no quadro 3.2 Para os gneros Aeromonas e Pseudomonas o meio utilizado foi GSP (Glutamate Starch Phenol - Merck 10230) (Anexo1-meio 2): i)GSP suplementado com antibitico (meropenemo 1mg/mL); ii) GSP sem antibitico; MacConkey (Merck 05465) (Anexo 1-meio 3) para Gram negativo; Endo, (Merck 04044) (Anexo 1-meio 6) meio para

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Material e Mtodos

E. Coli; Manitol (Mannitol salt phenol-red agar - Meck 105404) (Anexo 1-meio 7), meio para Staphylococcus spp.; Chromocult, (Merck 10426) (Anexo 1-meio 8) meio para Enterobacteriaceae; Slanetz, (Slanetz e Bartley Oxoid CM377) (Anexo 1-meio 5), meio para Enterococcus spp.; e Rosa Bengala ( Rose Bengal Chloramphenicol Agar-RBCA) para leveduras.(Anexo 1-meio 8)

Quadro 3.2. Obteno de uma cultura inicial 1. De cada ponto de recolha (1 A, 2 A, 3 A e 4 A), com uma zaragatoa esterilizada semeou-se a amostra nos meios de cultura j anteriormente referidos. 2. Incubaram-se as placas numa estufa a 30C (GSP com e sem antibitico); e a 37C (Endo, MacConkey, Rosa Bengala, Manitol, Chromocult e Slanetz) durante 24 horas.

3.2.2. Obteno de culturas puras

Um dos procedimentos fundamentais em microbiologia a obteno de cultura pura. A partir de colnias isoladas, a cultura pura foi obtida por expanso clonal. Posteriormente realizou-se a prova da colorao de Gram, da catalase e da oxidase como testes complementares para a identificao fenotpica dos isolados.

3.2.3. Provas morfo-fisiolgicas

Para

identificar

os

microrganismos

foram

elaboradas

algumas

provas

nomeadamente: colorao pelo mtodo de Gram; provas do metabolismo respiratrio (oxidase e catalase).

3.2.3.1. Colorao de Gram

A colorao de Gram um dos mtodos de colorao mais aplicados em Microbiologia. Trata-se de um mtodo de colorao diferencial que permite dividir as bactrias em duas classes (Gram positivo e Gram negativo). uma ferramenta essencial na classificao e diferenciao de bactrias (Quadro 3.3).

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Material e Mtodos

Quadro 3.3. Colorao de Gram. 1. Esfregao: Lmina microscpica limpa e desengordurada; Ansa esterilizada a chama, deixe arrefecer; Colocar uma gota de soro fisiolgico na lmina; Espalhar o inculo, numa camada fina; Deixar secar ao ar, ou numa chama muito fraca; 2. Fixao: Colocar a lmina chama, a uma altura a que a mo suporte o calor; Passar a lmina pela chama, cerca de trs vezes e deixe arrefecer; 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11 Corante inicial violeta de metilo (1 minuto) (Anexos II - Soluo 1); 1 Lavagem gua; Mordente lugol (30 segundos) (Anexos II - Soluo 2); Diferenciao lcool; 2 Lavagem gua; Corante de contraste vermelho neutro (1 a 2 minutos) (Anexos II - Soluo 3); 3 Lavagem gua; Secar entre duas folhas de papel de filtro; Observar objectiva de X 100 com leo de imerso.

3.2.3.2. Prova da citocromo-oxidase A prova da citocromo oxidase baseia-se na capacidade que algumas bactrias produzirem a enzima oxidase, enzima importante no sistema de transporte de electres durante a respirao aerbia. A citocromo oxidase catalisa a oxidao de um citocromo reduzido pelo oxignio molecular, originando uma molcula de gua e uma de citocromo oxidase. Esta prova permite-nos diferenciar duas grandes famlias de bactrias, as Enterobacteriaceae (oxidase negativa) e as no Enterobacteriaceae (oxidase positiva)
(Quadro 3.4).
Quadro 3.4. Prova da citocromo-oxidase. 1. 2. 3. Colocar uma tira de papel de filtro sobre uma tampa de uma placa de Petri; Aplicar duas a trs gotas do reagente oxidase sobre a tira (Anexos II - Soluo 4); Com uma pipeta de Pasteur retirar uma pequena poro de colnia e colocar sobre a tira de papel de filtro; 4. Se houver mudana de cor (junto zona em que se colocou a poro de colnia) a reaco positiva.

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Material e Mtodos

3.2.3.2. Prova da catalase

A catalase uma enzima hemoproteica que contm ferro e decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio. A actividade da catalase manifesta-se na maior parte das bactrias aerbias, mas apenas algumas anaerbias. Esta prova realiza-se inoculando uma poro de cultura da estirpe que se pretende estudar em perxido de hidrognio, consoante o quadro 3.5.

Quadro 3.5. Prova da catalase 1. Numa lmina desengordurada e passada previamente ao bico de Busen, colocar uma gota de gua oxigenada; 2. 3. De um meio sem sangue, recolher uma colnia e colocar sobre a gota de gua oxigenada; Ao verificar efervescncia diz-se que a reaco positiva, ou seja, revela-se a produo de catalase;

3.2.4. Biotipificao numrica

A identificao de algumas estirpes foi efectuada pelo sistema de biotipificao numrico API 20E (bioMrieux 20100) para isolados pertencentes s Enterobacteriaceae.

3.2.4.1. Sistema de identificao numrico API 20E (bioMrieux 20100)

O API 20E uma variante das provas bioqumicas em miniatura, usada para identificar Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram negativos. um sistema de 20 microtubos individualizados, em que cada um contm um meio de cultura desidratado. A suspenso bacteriana realizada em soro fisiolgico que corresponde 0,5 na escala de MacFarland (NaCl 0,85%). A metodologia utilizada, quadro 3.6, foi o procedimento definido pelo fabricante. Os resultados so observados atravs da alterao da cor dos meios de cultura, directamente ou atravs da adio de reagentes.

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Material e Mtodos

Quadro 3.6. Sistema numrico API 20E 1. Preparar a cmara de incubao, colocando aproximadamente 5ml de gua destilada nos alvolos para criar uma atmosfera hmida. Aps retirar a galeria do invlucro hermtico, coloca-la na cmara; 2. Para preparao do inoculo deve abrir uma ampola contendo 5ml de soluto fisiolgico estril, sem aditivos. Colher com uma pipeta, uma nica colnia bem isolada do meio. Efectuar uma suspenso bacteriana homogeneizando cuidadosamente as bactrias do meio; 3. Encher os tubos e cpulas dos testes CIT, VP e GEL com a suspenso bacteriana utilizando a pipeta que serviu para a colheita; 4. 5. De seguida encher unicamente os tubos (e no as cpulas) dos restantes testes; Criar uma anaerobiose nos testes ADH, LDC, ODC, H2S e URE enchendo as cpulas com leo de parafina; 6. Fechar a caixa de incubao e levar a incubar a 30 durante cerca de 24 horas.

3.2.5. Perfil de susceptibilidade aos antibiticos

3.2.5.1. Teste de sensibilidade a antibiticos

Os antibiogramas foram efectuados segundo as normas CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute, 2007), permitindo interpretar a susceptibilidade aos antimicrobianos. Cada estirpe foi classificada como sensvel (S), intermdia (I) ou resistente (R) de acordo com o dimetro do halo de inibio que se obtm. O quadro 3.7 descreve a tcnica de difuso em agar Mueller-Hinton, o qual usado para avaliar a susceptibilidade de cada uma das estirpes aos agentes antimicrobianos.

Quadro 3.7. Tcnica de difuso em agar com discos de antibiticos 1. Preparou-se uma suspenso bacteriana de cada estirpe em estudo a partir de 3 4 colnias em soro fisiolgico estril. A suspenso deve ter uma turvao equivalente a metade do grau 1 da escala de MacFarland; 2. 3. 4. 5. 6. Mergulhou-se uma zaragatoa na suspenso bacteriana retirando o excesso; Semeou-se em placas de agar Mueller-Hinton; Aplicou-se os discos dos antibiticos sobre a superfcie do meio de cultura, aps a secagem do inoculo; Incubou-se a 37C, durante 18 horas; Com uma rgua mediu-se os dimetros dos halos de inibio de crescimento para cada antibitico.

Neste trabalho usaram-se vrios grupos de antibiticos (Oxoid) para bactrias de Gram positivo e de Gram negativo os quais podem ser observados na tabela 3.2.

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Material e Mtodos

Tabela 3.2. Grupos de antibiticos usados -lactmicos: Piperacilina (PRL100g), Piperacilina/Tazobactam (TZP110g), Amoxicilina (AML10g), Amoxicilina/cido Clavulnico (AMC30g), Ticarcilina (TIC75g), Ticarcilina/cido Clavulnico (TIM85g), Cefalotina (KF30g), Cefotaxima (CTX30g), Cefoperozona (CFP30g), Aztreonamo (ATM30g), Imipenemo (IMP10g), Meropenemo (MEM10g), Ceftazidima (CAZ30g), Ceftriaxona (CRO30g), Oxacilina (Ox30g), Cefoxitina (FOX30g) e Meticilina (MET5g); Aminoglicosdeos: Amicacina (AK30g), Canamicina (K30g), Gentamicina (CN10g) e Estreptomicina (S10g), Neomicina (N10g) e Netilmicina (NET30g); Quinolonas: cido Nalidxico (NA30g), Ciprofloxacina (CIP5g), Moxifloxacina (MXF5g) e Levofloxacina (LEV5g); Tetraciclinas: Tetraciclina (TE30g), Oxitetraciclina (OT30g); Fenicois: Cloranfenicol (C30g); Sulfanamidas: Co-trimoxazol (SxT25g); Macrlidos: Eritromicina (E15g); Fosfomicina: Fosfomicina (FOS50g); Nitrofuranos: Nitrofurantona (F15g) Glicopeptdeos: Teicoplanina (TEC30g), Vancomicina (VA30g); Estreptogramina: Quinopristina-dalfopristina (QD15g); Ansamicina: Rifampina (RD5g); Lincosamida: Clindamicina (DA2g).

3.2.6. Conservao das amostras

Os isolados obtidos foram conservados, em criotubos, seguindo-se a metodologia do quadro 3.8, para poderem ser utilizadas em prximos trabalhos.

Quadro 3.8. Conservao das amostras 1. 2. 3. 4. Incubou-se a cultura no meio de BHI (Brain Heart Infusion): Incubou-se a 30C durante cerca de 24h; Posteriormente pipetou-se 300l de glicerol a 70% para cada criotubo na cmara de fluxo laminar; Finalmente, conservou-se as aliquotas de BHI (Anexos I - Meio 1) com glicerol a 15% a -70C.

Nota: Sempre que necessrio, semear as estirpes nos meios de cultura.

Paiva, H. G.

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Material e Mtodos

3.3. DETERMINAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS

3.3.1. Determinao da carncia qumica de oxignio (CQO)

A carncia qumica de oxignio (CQO) exprime a quantidade de oxignio necessria para a oxidao da matria orgnica e inorgnica oxidvel (S2-, SO32-, S2O42-, No2-, Fe2+) em condies definidas. A oxidao realizada com dicromato de potssio (K2Cr2O7) com temperatura controlada durante um determinado intervalo de tempo segundo o Standard Methods e na presena de um catalisador (Quadro 3.9).
Quadro 3.9. Determinao CQO (Gama alta) 1. Soluo de digesto: Adicionou-se 500 mL de gua destilada; 10,216 g de K2Cr2O7 seco a 150C durante duas horas; 167 mL de H2SO4 concentrado e 33,3 g de HgSO4 e prefez-se o volume total de 1000 mL. 2. Reagente de cido sulfrico (H2SO4) Dissolveu-se 6,6 g de Ag2SO2 em 1000 mL de H2SO4. 3. Padro de hidrogeno fetalato de potssio (KHP) Deixou-se secar o KHP at ao peso constante a 120C. Dissolveram-se 850 mg de KHP num balo volumtrico com gua destilada at perfazer o volume de 1000 mL. O valor terico de KHP de 1000ug O2/mL, ou seja 1000 mg/L. 4. Preparao dos padres Prepararam-se padres de 100, 300, 600, 900, 1200 e 1400 mg/L a partir da soluo de KHP de concentrao 1000 mg/L O2 para bales volumtricos de 100 mL. 5. Tratamento dos padres e amostras Aos padres foi adicionado a soluo de digesto e preparou-se tambm um branco, adicionou-se 1,5 mL de soluo de digesto e 3,5 mL de cido sulfrico. A cada um dos tubos dos padres foi adicionado 2,5 mL do respectivo padro e agitou-se de seguida. Para as amostras adicionaram-se a mesma quantidade. 6. Digesto Os tubos foram agitados antes de serem colocados no digestor durante 120 minutos a 150 C. 7. Determinao do CQO Aps o arrefecimento dos tubos l-se a absorvncia do branco e dos padres (a 600 nm) sendo, se seguida, traada a recta padro. Finalmente, l-se a absorvncia das amostras e por substituio na equao da recta padro determinou-se o seu valor de CQO (mg/L O2). Para e determinao deste parmetro realizaram-se 3 repeties.

Paiva, H. G.

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Material e Mtodos

Utilizou-se o kit de gama alta COD 1500 (WTW) constitudo por tubos com rosca (16 x 100 mm) contendo a soluo de digesto (dicromato de potssio, cido sulfrico e sulfato de mercrio). Como padro, utilizaram-se 5 solues de hidrogeno fetalato de potssio, correspondentes aos seguintes valores tericos de carncia qumica de oxignio: 100, 300, 500, 700 e 1000 mg O2 dm-3. Todas as diluies (padres e amostras) foram efectuadas em bales volumtricos de 100 cm3. O volume de padro ou amostra aplicado aos tubos foi de 2 cm3. A digesto decorreu num reactor CR 2010 (WTW) temperatura de 150C durante 2 h. Aps arrefecimento fez-se a leitura da absorvncia a 600 nm num espectrofotmetro Spectronic 21 (Bausch & Lomb), devida presena do io Cr(III) produzido pela oxidao.

3.3.2. Determinao da carncia bioqumica de oxignio (CBO5) A carncia bioqumica de oxignio (CBO) exprime a quantidade de oxignio necessria para oxidar a matria orgnica biodegradvel, por meio de uma populao microbiana mista (Quadro 3.10). As amostras so incubadas a 20C, durante cinco dias (CBO5). Os padres So preparados a partir de 1g/L de glucose com 1g/L de cido glutmico gua de diluio (5 mL de soluo de fosfato)

Pesou-se 8,493 g de monohidrogenofosfato de sdio (Na2HPO4.12H2O) e 2,785 g de hidrogenofosfatode potssio (KH2PO4) e dissolveu-se em gua destilada completando-se at ao volume de 1000 mL, homogeneizando bem a soluo. A gua de diluio foi composta por 1mL de soluo de sulfato de magnsio 20g/L; 1mL de soluo de cloreto de clcio 25g/L; 1mL de soluo de cloreto de ferro 1,5 g/L; 1mL de soluo de cloreto de amnio 2 g/L e 991 mL de gua arejada. Procedimento experimental

Paiva, H. G.

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Material e Mtodos

Quadro 3.10. Determinao do CBO5 1. Deixou-se que as amostras atingissem temperaturas entre 15 e 20C e adicionou-se 1 gota por cada 50 mL de amostra, soluo de aliltioureia (inibidor de nitrificao). 2. 3. 4. Usaram-se garrafas de OXITOP no volume de 164 mL com diferentes diluies. Preparou-se um branco colocando 164 mL de gua de diluio em vez da amostra. Encheu-se as garrafas de determinao com o volume apropriado de amostra e colocou-se uma barra magntica no seu interior. 5. 6. Colocaram-se dois comprimidos de NaOH dentro da rolha, com a ajuda de uma pina. Colocaram-se as garrafas na plataforma de agitao s escuras e aguardaram-se 5 dias a 20 de temperatura. 7. Leram-se os valores do CBO passados os 5 dias e aplicaram-se as formulas.

Vb= F Lgua de diluio CBO5= F x Lamostra x diluio da amostra Vb Vb-Valor do branco F- factor de correco das garrafas oxitop consonte o volume utilizado tabelado= 10 Lgua de diluio- leitura da gua de diluio ao fim de 5 dias. Lamostra- Leitura da amostra ao fim de 5 dias.

3.3.3. Determinao do pH

O pH foi directamente lido na gua rua filtrada no aparelho pH meter Alpha 500. 3.3.4. Determinao da cor

A determinao da cor foi realizada segundo a metodologia apresentada no quadro 3.11.

Quadro 3.11. Determinao da cor. 1. 2. Fez-se a diluio da amostra filtrada em tampo fosfato em pH 7,6 200mM Fez-se a diluio 50 e 100x e leu-se no espectofetometro a 465nm 1200 l de tampo fosfato com 300 l de amostra perfazendo um volume final de 1500l.

Paiva, H. G.

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Material e Mtodos

3.4.5. Determinao dos fenis

A determinao dos fenis foi realizada segundo a metodologia apresentada no quadro 3.12.

Quadro 3.12. Determinao dos fenis 1. Num balo de 50 ml, colocaram-se 2 ml da soluo aquosa de polifenis, 2,5 ml de folin-ciocalteau e 5 ml de carbonato de sdio 20 % (m/m) e leva-se ao trao com H2O destilada. 2. Colocou-se uma hora em repouso no escuro e passada essa hora leu-se a absorvncia a 765 nm

Recta padro Fez-se um padro 1 g/L (soluo me) Diluiu-se o cido cafico para um balo volumtrico de 100 ml com H2O A partir desta soluo fizeram-se seis padres com concentraes de 0,025; 0,050; 0,125; 0,200; 0,300; 0,400 mg/ml e aplicou-se a seguinte formula: Ci xVi=Cf x Vf

3.3.6. Determinao dos slidos suspensos totais

Os slidos suspensos totais so definidos como a quantidade de slidos dissolvidos na amostra lquida. Depois de uma filtragem podem-se calcular por subtraco dos slidos que no so solveis.

Quadro 3.13. Slidos suspensos totais. 1. Filtraram-se pelo sistema milipore 10 ml de gua de lavagem e tambm de gua rua; da centrfuga foi impossvel filtrar devido ao tamanho das partculas. 2. Pesaram-se as placas de petri antes de se colocarem os 10 ml de gua de lavagem e de gua rua filtrada. 3. 4. Levaram-se estufa a 105C durante 24 horas. Retiraram-se da estufa com a ajuda de uma pina para dentro do exsicador at atingir a temperatura ambiente. 5. 6. Pesou-se numa balana analtica. Fez-se a diferena entre o peso total (placa mais o filtrado) e o peso da placa para retirar o valor dos slidos suspensos.

Paiva, H. G.

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Material e Mtodos

3.3.7. Determinao dos slidos totais Os slidos totais so definidos pela quantidade em mg de partculas slidas no volume de 1 ml.

Quadro 3.14. Slidos Totais 1. Colocaram-se directamente 5 ml de gua de lavagem, 5 ml de gua da centrfuga, e 5 ml de gua rua em diferentes placas de petri previamente pesadas. 2. 3. Levaram-se estufa a 105C durante 24 horas. Retiraram-se da estufa com a ajuda de uma pina para dentro do exsicador at atingir a temperatura ambiente. 4. 5. Pesou-se numa balana analtica. Fez-se a diferena entre o peso total (placa mais o valor da gua seca) e o peso da placa para retirar o valor dos slidos totais.

3.3.8. Determinao do azoto e fsforo totais

Digesto de alquota com cido sulfrico e determinao por espectofotometria de absoro molecular: Azoto pelo mtodo de Berthelot, Fsforo pelo mtodo do molibdalato de amnio.

O fsforo inorgnico reage com o molibdalato de amnio, formando fosfomolibdalato de amnio, que reduzido a azul de mobdilnio, cuja intensidade da cor proporcional concentrao de ies fsforo presentes na amostra

3.3.9. Determinao do azoto amoniacal e ntrico

Determinao da amostra em fresco, por espectofotometria de absoro molecular: Azoto amoniacal pelo mtodo de Bertholod, Azoto ntrico aps reduo em coluna de cdmio.

Paiva, H. G.

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Material e Mtodos

3.3.10. Determinao do carbono orgnico total (TOC) A determinao foi realizada por detector de infra-vermelhos prximos (NIRD), aps combusto de alquota da amostra fresca a 850C e desconto do teor de carbono inorgnico(CO3-).

Paiva, H. G.

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4.RESULTADOS E DISCUSSO

Resultados e Discusso

4.1. DIVERSIDADE DA MICROBIOTA/ANTIBIORESISTNCIA

4.1.1. Estirpes isoladas

As sementeiras foram realizadas em vrios meios de cultura, selectivos e diferenciais: GSP com e sem antibitico (meropenemo); MacConkey; Endo; Manitol; Chromocult; Slanetz e Rosa Bengala, de forma a conhecer a microbiota associada a esta matriz. Os isolados obtidos durante a realizao deste trabalho so provenientes de quatro pontos diferentes da linha de extraco (gua de lavagem, gua da centrifuga, gua rua do e bagao) de um lagar de azeite do concelho de Alij. Da amostragem efectuada obtiveram-se 62 isolados, dos quais 40 so provenientes do ponto 1A (gua de lavagem), 5 do ponto 2A (gua da centrfuga), 10 do ponto 3A (gua rua) e 7 do ponto 4A (bagao). s estirpes isoladas foi atribuda uma referncia constituda por letras e nmeros. O primeiro nmero corresponde ao ponto de amostragem por ordem do processo de extraco do azeite. As letras maisculas seguintes correspondem ao meio de cultura em que se fez a sementeira e as letras minsculas esto relacionadas com a cor ou aparncia das colnias na placa, fazendo assim a diferenciao.

A descrio do nmero de isolados obtidos por amostra e meio de cultura, assim como, a sua referncia est apresentada na tabela 4.1. Pela anlise da tabela, verifica-se que o ponto de amostragem correspondente gua de lavagem apresentou o maior nmero de isolados (n=40) sendo a maioria das estirpes obtidas no meio de cultura Chromocult. A gua da centrfuga foi onde se obteve um menor nmero de isolados (n=5) tendo-se isolado estirpes apenas em chromocult e rosa bengala. Para a gua rua e o bagao foram obtidos 10 e 7 isolados respectivamente.

Paiva, H. G.

40

Resultados e Discusso

Tabela 4.1. Isolados bacterianos utilizados neste trabalho.

Ponto de amostragem

Meio de cultura

Isolados 1ACClp; 1ACCre;1ACCb; 1ACClg; 1ACCIPM2vaz; 1ACCIPM2lt; 1ACCIPM1az; 1ACCIPMlg; 1ACCIPM1l; 1ACCIPM2l; 1ACCIPM1lp

Total

CC

11

ENDO

1ENDOrcg; 1ENDOre; ,1ENDOrcp

GSP(c/antibitico)

1AGSPCl; 1AGSPCr; 1AGSPCa; 1AGSPCrc; 1AGSPCre; 1AGSPCc

1A (gua de lavagem) GSP(s/antibitico)

1AGSPSrc; 1AGSPSre; 1AGSPSMEMrc; 1AGSPSMEMrg; 1AGSPSMEMr1; 1AGSPSMEM; 1AGSPSMEMr 1AMAClac+; 1AMAClac+m; 1AMAClac+b; 1AMAClac+ba

MAC

MAN

1AMANa; 1AMANa1; 1AMANa3, 1AMANa2

RB SLZ

1ARBr 1ASLZbep;1ASLZbe1; 1ASLZbe3; 1ASLZbe2

1 4

CC 2A (gua da centrfuga) RB

2ACCbg1; 2ACCbp; 2ACCbg2

2ARB1; 2ARB2

CC

3ACCbg; 3ACCbp; 3ACCL/bg1; 3ACCL/bp2; 3ACCL/bp1

ENDO 3A (gua rua do decanter)

3AENDOrp; 3AENDOrg

GSP(c/antibitico)

3AGSPCr

GSP(s/antibitico)

3AGSPSr

RB

3ARBr

CC 4A(Bagao) RB

4ACCbg1; 4ACCbp; 4ACCbg2

4ARB1; 4ARB2; 4ARB3; 4ARB4

62

Legenda: CC- Chromocult; MAC- MacConkey; MAN- Manitol; RB- Rosa Bengala; SLZ- Slanetz; GSPGlutamato Amido Vermelho de Fenol. Paiva, H. G. 41

Resultados e Discusso

4.1.2. Provas morfo-fisiolgicas

A todas as estirpes obtidas (n=62), foi efectuada a colorao de Gram bem como as provas da oxidase e catalase.

4.1.2.1. Colorao de Gram, prova da oxidase e catalase

Pelo mtodo de Gram foi possvel verificar que dos 62 isolados obtidos, 46 eram Gram negativo, 14 Gram positivo e 2 leveduras. Relativamente aos isolados de Gram positivo observou-se que todos isolados apresentaram catalase e oxidase negativa. Em relao aos isolados de Gram negativo verificou-se que estes pertenciam a dois grupos: Enterobacteriaceae e no Enterobacteriaceae, consoante sejam oxidase negativa ou oxidase positiva, respectivamente. Como se pode observar na figura 4.1, a percentagem das estirpes pertencentes s Enterobacteriaceae (oxidase negativa - 78,3 %) superior das no Enterobacteriaceae (oxidase positiva - 21,7%).

21,7% Positiva Negativa 78,3%

Figura 4.1 Percentagem de isolados pertencentes s Enterobacteraceae e no Enterobacteracea.

Dos 35 isolados pertencentes s Enterobacteriaceae, 30 revelaram-se catalase positiva e 5 catalase negativa. Todas as estirpes (n=11) pertencentes s no Enterobacteriaceae apresentaram catalase positiva. Na tabela 4.2 esto referidos os isolados obtidos bem como a respectiva prova da oxidase e catalase.

Paiva, H. G.

42

Resultados e Discusso

Tabela 4.2. Resultado da prova da Oxidase e Catalase

Ponto de amostragem

Meio

Isolados

Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

Oxidase + + + + + + + + + + + -

CC

ENDO

GSP(c/antibitico) 1A(gua de lavagem)

GSP(s/antibitico)

MAC

MAN

RB

SLZ

1ACCb 1ACClg 1ACClp 1ACCre 1ACCIPMlg 1ACCIPM1az 1ACCIPM1l 1ACCIPM1lp 1ACCIPM2l 1ACCIPM2lt 1ACCIPM2vaz 1AENDOrcg 1AENDOrcp 1AENDOre 1AENDOrg 1AGSPCa 1AGSPCl 1AGSPCr 1AGSPCrc 1AGSPCre 1AGSPCc 1AGSPSrc 1AGSPSre 1AGSPSMEMr 1AGSPSMEMr1 1AGSPSMEMrc 1AGSPSMEMrg 1AGSPSMEMrp 1AMAClac+ 1AMAClac+b 1AMAClac+ba 1AMAClac+m 1AMANa 1AMANa1 1AMANa2 1AMANa3 1ARBr 1ASLZbe1 1ASLZbe2 1ASLZbe3 1ASLZbep

Paiva, H. G.

43

Resultados e Discusso

Tabela 4.2. Oxidase e Catalase (continuao) CC 2ACCbg1 2ACCbg2 2ACCbp 2ARB1 2ARB2 3ACCbg 3ACCl/bg1 3ACCbp 3ACCl/bp1 3ACCl/bp2 3AENDOrp 3AGSPCr 3AGSPSr 3ARBr 4ACCbg1 4ACCbg2 4ACCbp 4ARB1 4ARB2 4ARB3 4ARB4 + + + + + + + + + + + + + + -

2A (gua da centrfuga)

RB

CC 3A (gua rua) ENDO GSPC GSPS RB

CC 4A (Bagao) RB

Legenda: CC- Chromocult; MAC- MacConkey; MAN- Manitol; RB- Rosa Bengala; SLZ- Slanetz; GSPGlutamato Amido Vermelho de Fenol.

4.1.3. Identificao dos isolados bacterianos pelo sistema de identificao numrico API 20E (bioMrieux 20 100)

A identificao dos isolados 1AGSPSMEMrp e 1ACCIMP2lt referentes ao ponto 1A e do isolado 3ACCbp referente ao ponto 3A (gua rua), pertencentes s Enterobacteriaceae, foi realizada por biotipificao numrica, utilizando o sistema de identificao API 20E. Estas estirpes foram seleccionadas para identificao pelo facto de estarem includos nos locais de amostragem com maior nmero de isolados bacterianos e pelo seu perfil multiresistente. Pela anlise da tabela 4.3 podemos verificar que o isolado com a referncia 1AGSPSMEMrp, foi identificado como Erwinia spp., atravs do cdigo 2005121 obtido pelo sistema numrico. Com base no perfil bioqumico apresentado pelos isolados 1ACCIPM2lt e 3ACCbp estes foram identificados como Enterobacter cloacae (3305573) e Hafnia alvei (5304012), respectivamente.

Paiva, H. G.

44

Resultados e Discusso

Tabela 4.3. Provas bioqumicas do API 20E (bioMrieux 20 100)

Provas Bioqumicas

ONPG

MAN

AMY

MEL

ADH

ODC

RHA

GLU

ARA + +

LDC

TDA

URE

GEL

SOR

SAC

INO

IND

CIT

H2S

Referncia

1AGSPSMEMrp

1ACCIPM2lt

3ACCbp

Legenda: ONPG- Galactosidade; ADH- Arginina; LDC- Lisina; ODC- Ornitina; CIT- Citrato; H2S- Tiosulfato de sdio; URE- Ureia; TODA- Triptofano; IND- Indol; VP- Pirovato de sdio; GEL- Gelatina; GLU- Glucose; MAN- Manitol; INO- Inositol; SOR- Sorbitol; RHA- Ramnose; SACSacarose; MEL- Melibiose; AMY- Amigdalina; ARA- Arabinose; (+) prova positiva; (-) prova negativa.

Na figura 4.2, esto apresentadas as imagens do sistema de identificao das estirpes seleccionadas para a biotipificao numrica.

a)

c)

b)

Figura 4.2 Sistema de identificao numrico API 20E para as 3 estirpes em estudo Legenda: a)1AGSPSMEMrp; b) 1ACCIPM2lt; c) 3ACCbp Fonte: Paiva, H. G. 2009

Paiva, H. G.

45

OX -

VP

Resultados e Discusso

4.1.4. Perfil de susceptibilidade a agentes antimicrobianos

O estudo do perfil de susceptibilidade de 32 estirpes, de um total de 62 isolados, a agentes antimicrobianos foi realizado pelo mtodo de difuso em disco (Figura 4.3) de acordo com o quadro 3.6 (Material e Mtodos). Para as estirpes de Gram negativo (n=28) foi seleccionado previamente um conjunto de 28 antibiticos pertencentes a diferentes grupos, tais como: -lactmicos; aminoglicosdeos; quinolonas; tetraciclinas; fenicis; macrlidos; sulfanamidas e fosfomicina. Das 28 estirpes de Gram negativo, 7 pertenciam famlia das no Enterobacteriaceae, enquanto que as restantes (n=21) eram Enterobacteriaceae. A susceptibilidade das estirpes de Gram positivo (n=4) foi avaliada para18 agentes antimicrobianos, de vrios grupos, entre os quais, nitrofuranos, fenicis, fosfomicina, glicopeptdeos, aminoglicosdeos, ansamicinas, macrlidos, -lactmicos, tetraciclinas, estreptograminas, quinolonas e lincosamidas.

Figura 4.3. Mtodo de difuso em disco. Fonte: Paiva, H. G. 2009

4.1.4.1. Perfil de susceptibilidade dos isolados de Gram negativo

Os resultados do perfil de susceptibilidade aos agentes antibacterianos das estirpes pertencentes famlia das Enterobacteriaceae encontram-se apresentados na tabela 4.4.

Paiva, H. G.

46

Resultados e Discusso Tabela 4.4. Halos de inibio (mm) e categorias para avaliao do perfil de susceptibilidade das estirpes de Enterobacteriaceae.
AMOSTRA 1ACClg 1ACCre 1ACClp 1ACCIMP1az 1ACCIMP2lt 1ACCIMP2vaz 1AMAClac+b 1AMAClac+m 1AENDOrcg 1AENDOrcp 1AENDOrg 1AGSPCl 1AGSPCa 1AGSPCrc 1AGSPMEMrc 1AGSPMEMr1 1AGSPMEMrp 3ACCbg 3AENDOrp 3AGSPSr 3ACCbp AML *I17 R *S 18 S18 R R I 16 R *S20 R
12

AMC S18 S *S22 S20 R R S24 R *S24 S

24

TIC S23 R
14

TIM Nd S
24

PRL S26 S
30

TZP S24 S
32

ATM S26 S S30 S26 S S S36 S S S S S S30 S

30

MEM S S S S27 S27 S30 S S S S S S S S R9 R8 R

8

IPM S26 S S S29 S25 S28 S S S S S S S30 S

32

KF I16 S
28

FOX S24 S S26 S24 R R S24 S

26

CAZ I16 S
30

CTX S24 S S34 S27 S25 S S38 S S S

26

CRO S30 S S36 S28 S26 S26 S34 S S S

34

CFP S27 S S30 S26 S26 S24 S30 S S S

26

FEP S30 S S S29 S28 S28 S34 S S36 S

24

FOS S32 R S S *S20 *S20 R12 S S20 R *S S S26 S

22

NA S28 S
29

CIP S26 S S30 S28 S30 S S28 S S S S S S S

28

AK S18 S
30

CN S26 S
21

TOB S20 Nd Nd S17 S16 S16 S30 S

38

K Nd S
28

S R S
25

E R8 R R R7 R R R15 R
12

C S24 S
32

STX S26 S
33

ST I16 S25 S21 I18 S20 S22 S22 S26 S S20 I18 S22 S20 I16 S24 S S S S I18 S22

S28 S24 S22 S26 S20 S S28 S

22

S25 S25 S24 S S22 S Nd S

22

S26 S23 S24 S26 S32 S S24 S S34 S28 S28 S

22

S28 S24 S24 S26 S30 S S S S S S28 S

26

I15 S18 R R S18 S *S30 R

14

S22 S26 S22 S26 S24 S

22

S26 S24 S23 S24 S26 S S26 S

28

S24 S18 S18 S20 S28 S S S

28

S26 S18 S18 S18 S22 S S S

22

S26 I17 S18 S18 Nd S S S

24

I14 I12 I12 I13 S20 S S34 S

22

S26 S23 I16 S20 S26 S S20 S

24

S26 S24 S26 S S40 S S R S32 S S28 S

30

*S20 S
22

S20 S
20

S22 S
32

*R12 R
13

*S20 I16 R R S25 S22 S

24

*S30 S18 S22 S

20

S32 S S11 R S20 I18 I

18

Nd S26 Nd Nd S20 I16 R

14

*I16 S18 S22 S

20

*S S S22 S R13 R10 R

11

*S S S20 S
18

S S I22 I
16

S S S30 S
22

S S S30 I
18

S S Nd S
22

S S S28 S
26

S S28 S22 S
26

S26 S22 S18 S

22

S18 S20 S22 S

18

S30 S24 Nd Nd S19 R R

10

S26 S20 S17 S

20

R R10 R R
10

I13 S24 S24 S

22

S26 S26 S
26

S21 I20 I
18

S21 I20 I
18

R R R S S S32 S

S24 S23 S
23

R14 R10 R
12

R R R S S
20

R R R
12

I18 I19 I
18

R11 R10 R
12

R R R S S S28 S

I13 R8 R
12

R R R S S S24 *S26

I19 I17 I
18

R14 R12 R
13

I13 R12 I
14

R8 R R S S S18 S30

R7 R R S S S20 *S30

R16 R14 R
15

S26 S S I
16 22

S23 S28 S S S S24 S

S S
18

S S
18

S S
30

S Nd Nd S26

S S S28 S

S S S30 S

S S S S

S S S32 S

S S
22

*S R
14

S S S26 S

S S S32 S

S S S28 S

*S S R R12

S S S30 S

S S S22 S

S S S22 S22

S S S24 S38

R R
10

S19 S22

S20 S24

S24 S32

I16 *S19

S22 *S22

I16 S20

R14 R10

S18 I16

Legenda: AML-amoxicilina; AMC-amoxicilina + cido clavulnico; TIC-ticarcilina; TIM-ticarcilina + cido clavulnico; PRL-piperacilina; TZP-piperacilina + tazobactan; ATM-aztreonamo; IPM-imipenemo; KF-cefalotina; FOX-cefoxitina; CAZ-ceftazidima; CTX-cefotaxima; CRO-ceftriaxona; CFP-cefoperazona; FEP-cefepima; FOS- fosfomicina; NA-cido nalidxico; CIPciprofloxacina; AK-amicacina; CN-gentamicina; TOB-tobramicina; K- Canamicina; S-estreptomicina; E-eritomicina; C-cloranfenicol; SXT-trimetoprim/sulfametoxazol; TE-tetraciclina; R resistente; Iintermdio; Ssensvel; NDno determinado; * Mutantes em todo o halo; ** alguns mutantes; o halo influenciado pelo inibidor; halo irregular.

Paiva, H. G.

47

Resultados e Discusso

Os resultados globais do perfil de susceptibilidade obtido para as estirpes de Enterobacteriaceae apresentam-se na figura 4.4. Atravs da anlise da figura verifica-se que 32% dos isolados so resistentes amoxicilina (aminopenicilina). Da associao das penicilinas com os inibidores de -lactamases, verificou-se que o cido clavulnico, teve um efeito positivo, tanto para a associao com a amoxicilina como para a ticarcilina, no entanto para o inibidor tazobactam, no se verificou qualquer sinergismo quando associado com a piperacilina, dado que a percentagem (8%) no se alterou. Por comparao do perfil de susceptibilidade da amoxicilina isoladamente e em associao com o cido clavulnico, observou-se que os valores de resistncia baixaram de 32% para12%. Para a ticarcilina observou-se tambm uma diminuio significativa da resistncia, baixando dos 8% para os 4%.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

MEM

KF

AMC

TIC

AK

IPM

FOS

PRL

CFP

CAZ

CTX

FEP

ATM

FOX

SXT

NA

CIP

AML

Resistente

Intermdio

CRO

Sensvel

Nd

Figura 4.4. Perfil de susceptibilidade de Enterobacteriaceae.

Pela anlise destes resultados, possvel observar que a adio de inibidores de lactamases inibiu a resistncia s penicilinas testadas em mais de metade dos isolados.

Paiva, H. G.

TOB

TIM

TZP

CN

48

TE

Resultados e Discusso

Relativamente ureidopenicilina testada (piperacilina) observou-se uma elevada susceptibilidade (92%). O aztreonamo, monobactmico, mostrou 12% de resistncia nas estirpes em estudo. Para os carbapenemos testados os resultados foram distintos, dado que todos os isolados se apresentaram susceptveis ao imipenemo, enquanto que para o meropenemo, 12% das estirpes se revelaram resistentes, designadamente os isolados (1AGSPMEMrc, 1AGSPMEMrp, 1AGSPMEMrl). Este resultado particularmente importante, uma vez que este antibitico usado como ltimo recurso em estirpes clnicas multirresistentes. Sendo estas estirpes provenientes da gua de lavagem da azeitona, pode considerar-se que os genes que conferem resistncia a estes antibiticos esto disseminados pelo meio ambiente. A estirpe 1AGSPMEMrc apresenta tambm resistncia ao aztreonamo (monobactmico), cido nalidxico (quinolona), aos aminoglicosdeos (amicacina, tobramicina e streptomicina) e ao macrlido (eritromicina). De referir tambm a resistncia maioria das cefalosporinas testadas. O isolado 1AGSPMEMrp resistente ticarcilina + cido clavulnico o que no era esperado, uma vez que este no apresenta resistncia ticarcilina. Era espectvel que o inibidor tornasse o antibacteriano mais eficaz, facto que no se verificou nesta estirpe. Esta situao est descrita em vrios estudos para o gnero Aeromonas spp, onde existem vrios mecanismos de resistncia, em simultneo, aos - lactmicos (Saavedra et al., 2004, 2006). Este foi ainda resistente ao aztreonamo (monobactmico), fosfomicina, cido nalidxico (quinolona), eritromicina (macrlido), s cefalosporinas, excepto ceftriaxona, bem como maioria dos aminoglicosdeos testados. A estirpe 1AGSPMEMrl possui tambm um perfil multirresistente, uma vez que para alm da resistncia ao meropenemo, tambm apresenta a todas as cefalosporinas (excepo da ceftriaxona), fosfomicina, cido nalidxico, aminoglicosideos e eritromicina, como se pode observar na tabela 4.4. Num estudo realizado em amostras de gua de consumo na Turquia por Koksal e seus colaboradores (2007) verificaram tambm alguma resistncia ao mesmo antibitico bem como elevada resistncia eritromicina, amoxicilina com cido clavulnico e ceftazidima.

Paiva, H. G.

49

Resultados e Discusso

A amoxicilina revelou reduzida eficcia. Pelo contrrio os antimicrobianos com maior actividade foram o imipenemo seguido da piperacilina e piperacilina com inibidor tazobactan. Foram testadas cefalosporinas de 1, 2, 3 e 4 gerao. Em relao cefalotina (cefalosporina de 1 gerao), verificou-se uma percentagem de resistncia de 28%, sendo esta tambm a percentagem observada para a cefalosporina de 2 gerao (cefoxitina). cefotaxima, ceftazidima e cefoperazona (cefalosporinas de 3 gerao) revelaram percentagens de resistncia de 12%. De referir que para a ceftriaxona, nenhuma estirpe foi resistente. A cefepima (cefalosporina de 4 gerao) revelou resistncia de 12%. Das cefalosporinas testadas, a que revelou maior ineficcia foi a cefalotina e a cefoxitina, e a mais eficaz foi a ceftriaxona. Neste trabalho, com as estirpes em estudo verificou-se que a ceftriaxona (cefalosporina de 3 gerao) teve maior actividade que a cefepima (cefalosporina de 4 gerao). Este estudo mostrou resistncia das estirpes bacterianas relativamente fosfomicina de 31%. Dentro do grupo das quinolonas, a ciprofloxacina, uma fluroquinolona, foi mais eficiente que o cido nalidxico (9% das estirpes foram resistentes), espectro de aco superior ao das quinolonas no fluoradas. Dos resultados obtidos para os aminoglicosdeos utilizados, verificou-se resistncia de 12% para a amicacina e tobramicina, 3% para a gentamicina, 8% para a canamicina e 18% para a estreptomicina. Para o cloranfenicol, a trimetoprim/sulfametoxazol e a tetraciclina obtiveram percentagens semelhantes de susceptibilidade, variando de 70% a 98% a percentagem de isolados com sensibilidade, demonstrando a eficcia destes frmacos. de referir que a eritromicina (macrlido) foi o antimicrobiano ao qual as estirpes apresentaram 100% de resistncia. Esta elevada frequncia de resistncia para a eritromicina est de acordo com os estudos em isolados do gnero Aeromonas spp. (Chaudhury et al., 1996; Saha e Pal, 2002; Radu et al. 2003) sendo que o primeiro trabalho um estudo realizado em ambiente clnico e ambiental, e os outros em amostras de peixe.

Paiva, H. G.

50

Resultados e Discusso

Com a excepo dos isolados 1ACCIMP1az, 3ACCbg, 1ACClp, 1AGSPCl, todas as estirpes da famlia das Enterobacteriaceae testadas apresentaram um perfil de multiresistncia aos antibiticos utilizados. Num estudo realizado por Lima-Bittencourt e colaboradores (2007) em gua doce bem como num trabalho em guas ambientais de Baquero e colaboradores (2008), a resistncia a mltiplos antibiticos foi comummente observada. Avaliar o risco do aparecimento de estirpes bacterianas multiresistentes em diferentes matrizes, tendo uma monitorizao associada, pode auxiliar o controlo da disseminao de genes de resistncia e consequentemente evitar riscos para a sade pblica. Muito se tem desenvolvido em termos de novos antibiticos eficazes sobre bactrias resistentes. A presena de bactrias com multiresistncia um facto conhecido em ambiente clnico (Patersson, 2006; Watkinson et al., 2007) Em relao ao perfil de susceptibilidade das bactrias da famlia das no Enterobacteriaceae (Tabela 4.5) de referir que todos os isolados provm do ponto de recolha gua de lavagem e todos eles se revelaram multiresistentes. Verificou-se que a associao de inibidores (cido clavulnico e tazobactam) s penicilinas amoxicilinas e piperacilina respectivamente se revelou eficaz visto ter-se verificado uma recuperao da actividade destas. Os antimicrobianos mais ineficazes foram a eritromicina e a amoxicilina, aos quais todos os isolados lhes foram resistentes. O isolado 1AMAClac+ba foi o mais resistente aos antibiticos, sendo resistente amoxicilina, amoxicilina + cido clavulnico, estreptomicina, eritromicina, cloranfenicol e tetraciclina.

Paiva, H. G.

51

Resultados e Discusso

Tabela 4.5. Halos de inibio (mm) e categorias para avaliao do perfil de susceptibilidade das estirpes de no Enterobacteriaceae.

AMOSTRA

AML

AMC

TIC S24 I15 S10 R9 S26

TIM S25 R13

PRL S25 S26 S26 S24

TZP S26 S25 S26 S22

ATM S29 S30 S30

MEM S27

IPM S25 S22 S28 S28

KF R8 S22 S27 S23

FOX

CAZ S27 S19 S20 S26 S28

CTX S28 S26 S28

CRO S28 S24 S34 S26

CFP S24 S24 S30 S24

FEP S26 S26 S28 S30

FOS S21 S19

NA S24 S24 S24 S22

CIP S30 I20 S32 S30

AK S21 S21 S20 S22 S26

CN S19 S18 S18 S18 S24

TOB S18 S21 S22 S20 S22

K S20 S20

S S15 R10 S15 I14 S16

E R8 R8

C S25

SXT S26 S30 S30 S28

TE S21

1ACCIMP1lg

R R10

R S22 S22 S26 S20

R S22 S24 S25 S24

1AMAClac+ba

R S28 S24

R S20 S22 S26

1AENDOre

Nd I18

R S20 R8

Nd S20 S20

R R7 R14

1AGSPCre

R R12

1AGSPSrc

**S

1AGSPSre

S24

R8

I16

S24

S24

S22

S26

S26

*S21

S26

S20

S20

S20

S21

I14

R9

S24

S26

S22

1AGSPMEMrg

*R8

S25

S26

S24

S25

S28

S27

S25

S26

S26

S28

S26

S28

**S20

S24

S29

S19

S17

S17

I17

I13

R8

S18

S25

S20

Legenda: AML-amoxicilina; AMC-amoxicilina + cido clavulnico; TIC-ticarcilina; TIM-ticarcilina + cido clavulnico; PRL-piperacilina; TZP-piperacilina + tazobactan; ATM-aztreonamo; IPM-imipenemo; KF-cefalotina; FOX-cefoxitina; CAZ-ceftazidima; CTX-cefotaxima; CRO-cetriaxona; CFP-cefoperazona; FEP-cefepima; FOS- fosfomicina; NA-cido nalidxico; CIPciprofloxacina; AK-amicacina; CN-gentamicina; TOB-tobramicina; K- Canamicina; S-estreptomicina; E-eritomicina; C-cloranfenicol; SXT-trimetoprim/sulfametoxazol; TE-tetraciclina; R resistente; Iintermdio; Ssensvel; NDno determinado; * Mutantes em todo o halo; ** alguns mutantes; o halo influenciado pelo inibidor; halo irregular.

Paiva, H. G.

52

Resultados e Discusso

4.1.4.2. Perfil de susceptibilidade dos isolados de Gram positivo

Foi realizado, o estudo do perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos a 4 isolados de Gram positivo. De acordo com a tabela 4.6, os isolados que apresentaram maior resistncia aos antibiticos em estudo foram a 1ASLZbep2 e 1ASLZbep3, revelando resistncia a 7 antibiticos, enquanto os isolados 1ASLZbep e 1ASLZbep1 foram resistentes a 6 antibiticos. Os quatro isolados so resistentes fosfomicina, teicoplanina e vancomicina (glicopeptdeos); meticilina (-lactmico) e tetraciclina. Trs das quatro estirpes revelaramse resistentes ciprofloxacina (quinolona). Aos antimicrobianos, nitrofurantuna (nitrofuranos); cloranfenicol (fenicol); neomicina e gentamicina (aminoglicosdeos); eritromicina (macrlido) e quinopristina-dalfopristina (estreptogramina) verificou-se 100% de sensibilidade por parte de todos os isolados. Os resultados para os glicopptideos revelam elevada importncia pelo facto de serem provenientes de amostras ambientais, corroborados em outros trabalhos (Schwartz et al., 2003) com isolados obtidos de guas residuais, guas de superfcie e guas de consumo. Presentemente, a resistncia antimicrobiana um importante problema de sade pblica, sobretudo a nvel hospitalar e a emergncia de bactrias resistentes continua a ser uma preocupao mundial.

Tabela 4.6. Halos de inibio (mm) e categorias da avaliao do perfil de susceptibilidade nas estirpes de Gram positivo, neste estudo.
AMOSTRA 1ASLZbep 1ASLZbe1 1ASLZbe2 1ASLZbe3 F S26 S28 S28 S32 C S24 S34 S28 S30 FOS R R R R TEC R R8 R9 R8 N S20 S28 S26 S26 RD S26 I18 S24 R16 VA R R R R E S32 S S38 S MET R R R R TE R8 R R14 R8 QD S28 S32 S28 S32 LEV I14 I16 R12 I14 CIP I20 R12 R R10 CN S24 S34 S26 S27 DA I16 S28 S26 S26 S S21 S18 S26 S20 OT R14 I18 S20 I16

Legenda: F-nitrofurantoina; C-cloranfenicol; FOS-fosfomicina; TEC-teicoplanina; N-neomicina; RDrifampina; VA-vancomicina; E-eritromicina; MET-meticilina; TE-tetraciclina; QD-quinopristinadalfopristina; LEV-levofloxacina; CIP-ciprofloxacina; CN-gentamicina; DA-clindamicina; S-estreptomicina; OT-oxitetraciclina

Paiva, H. G.

53

Resultados e Discusso

Estudos realizados em ambiente clnico (French, 2005) detectaram resistncia vancomicina e teicoplanina, referindo que as espcies deste gnero por vezes resistem a todas as terapias disponveis, o que torna este gnero, quando resistente aos glicopeptdeos, de importncia em sade pblica (humana e animal).

4.2. DETERMINAO DOS PARMETROS FSICO-QUMICOS

4.2.1. Determinao da carncia qumica de oxignio (CQO)

A quantidade de oxignio necessrio para oxidar a matria orgnica e inorgnica presente nos efluentes foi determinada em gua de lavagem, gua da centrfuga e gua rua. Ao bagao, por impossibilidade tcnica no foi possvel fazer o estudo. Antes da determinao, efectuou-se uma diluio de 100 vezes a cada amostra, pois s com esta diluio se obteve valores aceitveis, quando relacionados com a recta padro de ftalato de potssio. A gua da centrfuga foi a que obteve maior carncia qumica de oxignio (130,9 g O2L-1) seguindo-se de perto com 125,0 g O2L-1 a gua rua tal como Sassi e colaboradores (2005) que no seu estudo obtiveram um valor semelhante. Noutros casos foram doseados valores inferiores como por exemplo 53,5 g O2L-1 (Matos, 2006). A que obteve menor CQO foi a gua de lavagem com 16,4 g O2L-1 como se pode verificar na tabela 4.7.

Tabela 4.7. Determinao da carncia qumica de oxignio. Amostras Lavagem Centrfuga gua rua CQO (g O2L-1) 16.4 130,9 125,0 Desvio padro 3,3 2,3 1,4

Sendo o limite mximo de CQO admitido em guas residuais de 150 mg O2 L-1 estes efluentes amostras transcendem esse valor, logo no podem ser rejeitados nos cursos de gua sem prvio tratamento. Tal como no estudo de Amaral e colaboradores (2008), o valor de CQO para a gua de lavagem muito inferior aos valores de CQO para a gua da centrfuga e gua rua, tendo estas duas amostras valores muito aproximados.

Paiva, H. G.

54

Resultados e Discusso

4.2.2. Determinao da Carncia Bioqumica de Oxignio (CBO5) Neste parmetro determinou-se a quantidade de oxignio necessrio para oxidar a matria orgnica biodegradvel, por meio de uma populao microbiana mista, em condies aerbias, ao fim de 5 dias. Este estudo mostrou diferenas entre as amostras como se pode observar na tabela 4.8. Utilizando-se diferentes diluies, observou-se 15 g O2L-1 para as duas diluies da gua da centrfuga, 24,0 g O2L-1 e 25,0 g O2L-1 respectivamente para as diluies de 300 e 500 vezes da gua rua, valor aproximado do obtido num estudo realizado por Matos (2006) no qual o valor obtido para a amostra de gua rua foi 17,4 g O2L-1.
Tabela 4.8. Determinao do CBO5 e comparao com CQO. Amostra Lavagem 1 1 1 0 Centrifuga Agua Rua 0 2 1 2 2 1 1 0 3 2 3 2 2 2 0 4 3 4 3 2 3 1 6 3 5 4 4 5 3 8 5
CBO5 (g O2L-1) CQO (g O2 L-1)

4,4 4,8 15,0 15,0 24,0 25,0

16,4

130,9 125,0

Para a gua de lavagem foram usadas diluies inferiores (110 e 120 vezes) tendo como resultado 4,4 e 4,8 gO2L-1 respectivamente, estes resultados vo de encontro ao estudo realizado em 2008 por Amaral e colaboradores num estudo em efluentes de lagares de azeite realizado no Nordeste de Portugal, no qual tambm a gua rua obteve valores acima das restantes amostras ficando com o segundo valor mais alto a gua da centrfuga. O valor da gua rua deste trabalho quando comparado com o estudo de Sassi e colaboradores (2005) mais de o dobro. Sendo o limite mximo de CBO5 permitido por lei 40 mgO2L-1, este efluente necessitam de tratamento para remoo da carga poluente.

4.2.3. Determinao do pH

Para este parmetro, obtiveram-se os resultados que se podem observar na tabela 4.9 e que vo de acordo com estudos anteriores (Matos, 2006; Sassi et al., 2005) mas ficam longe dos valores obtidos por Amaral e seus colaboradores em 2008 num estudo realizado
Paiva, H. G. 55

Resultados e Discusso

com amostras de lagares de azeite no Nordeste de Portugal obtiveram valores volta de 6 na gua de lavagem, cerca de 5 na gua da centrfuga e na gua rua, valor tambm obtido por Paredes e colaboradores em 1999 para a gua rua (5,17).

Tabela 4.9. Determinao do pH nas diferentes amostras Amostra Lavagem Centrfuga gua rua Tratamento Filtrada Bruta Bruta Filtrada Bruta pH 4,09 4,07 4,53 4,48 4,47

4.2.4. Determinao da Cor

Relativamente a este parmetro, estimado por absorvncia (A465), possvel verificar na figura 4.5 que a amostra que obteve maior colorao foi a gua da centrfuga (16,3 de absorvncia), seguido da gua da rua (9,4) e da gua de lavagem (1,7).

18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 lavagem centrifuga gua rua

Figura 4.5. Determinao da cor (465 nm) das amostras.

4.2.5. Determinao dos Slidos solveis totais e slidos totais

Em relao aos slidos solveis totais, os resultados mostram que a amostra que contm maior quantidade de slidos solveis a gua rua, tendo cerca de 5 g L-1 de matria seca valor que difere em pouco do valor obtido por Matos (2006) no qual obteve 6,4 g L-1, da gua de lavagem obteve-se volta de 1,3g L-1. Relativamente gua da centrfuga no foi possvel a filtrao, portanto no se obtiveram resultados (figura 4.6).
Paiva, H. G. 56

Absorv.(465 nm)

Resultados e Discusso

Slidos solveis totais g L-1

6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 lavagem gua rua

Figura 4.6. Determinao dos slidos solveis totais.

Para os slidos totais, como se pode observar na figura 4.7, obtiveram-se volta de 32 g L-1 de matria seca para a gua da centrfuga sendo a amostra com maior teor de slidos totais.

40,00 Slidos Totais (g L-1) 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 lavagem centrifuga gua rua

Figura 4.7. Slidos totais das vrias amostras em estudo.

Da gua rua obteve-se volta de 11 g L-1 de matria seca, valor que semelhante ao obtido por Matos (2006) e muito inferior ao determinado por Sassi e colaboradores em 2005, os quais obtiveram 70 g L-1. Paredes e colaboradores (1999) trabalharam com uma gua rua que possua o dobro de slidos totais (22,1 g L-1). A gua de lavagem apresenta um valor muito inferior (1,5 g L-1 de matria seca), na mesma orde de grandeza do verificado no estudo de Amaral e colaboradores (2008).

Paiva, H. G.

57

Resultados e Discusso

4.2.6. Determinao dos Fenis totais

Como demonstra a figura 4.8 relativamente a este parmetro, a gua rua apresenta um valor de 3,5 mg mL-1, destacando-se do valor obtido no trabalho realizado por Matos (2006), no qual o valor obtido para a gua rua foi de 0,78 mg mL-1. Esta foi a amostra com maior concentrao de fenis seguindo-se a gua da centrfuga com valores aproximados de fenis de 1 mg mL-1 e por ltimo a gua de lavagem da azeitona com 0,5 mg mL-1.
4,0 3,5 Fenois (mg mL-1) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 lavagem centrifuga gua rua

Figura 4.8. Fenis totais obtidos das amostras em estudo

4.2.7. Determinao do Carbono orgnico total (TOC)

Este parmetro doseia a concentrao em carbono orgnico presente num efluente. Obtiveram-se valores distintos para as duas amostras em estudo (gua de lavagem e gua rua), j que a gua da centrfuga, por impedimentos tcnicos no foi possvel analisar. A gua rua apresenta valores muito acima da gua de lavagem (respectivamente 25,1g L-1 e 6,3g L-1) como observvel na tabela 4.10.

Tabela 4.10. Carbono orgnico total Amostra Lavagem gua rua

TOC (g C L-1) CV (n=5) %

6,3 25,1

1,9 0,7

O valor da gua rua foi cerca de metade do valor que Sassi e seus colaboradores (2005) obtiveram. A partir desta anlise, os valores esperados do CQO (tabela 4.7), seriam
66,8 g

O2 L-1 para a gua rua e 16,8g O2 L-1 para a gua de lavagem da azeitona, os valores

Paiva, H. G.

58

Resultados e Discusso

que de facto se verificaram para a gua de lavagem foram coincidentes com o esperado, mas relativamente gua rua, o resultado esperado foi cerca de metade do valor obtido 4.2.8. Determinao do Azoto

Em relao ao azoto presente nas amostras, a gua de lavagem revelou possuir mais azoto amoniacal (NH4+) que a gua rua, respectivamente 2,94 e 0,61 mg L-1. Por sua vez a gua rua possui maior quantidade de nitratos (NO3-) que a gua de lavagem, embora a diferena seja pequena, 0,64 e 0,41 mg L-1. Os valores obtidos em relao ao azoto total orgnico (Kjeldahl) revelam maior quantidade de azoto na gua rua com 186 mg L-1 face aos 32,4 mg L-1 da gua de lavagem (tabela 4.11), valor para a gua rua superior ao obtido num estudo realizado por Paredes e colaboradores (1999) no qual a gua rua tinha 88 mg L-1. Amaral e colaboradores (2008) obtiveram valores de 0,9 mg N L-1 para a gua de lavagem e 2,1 mg N L-1 de azoto amoniacal para a gua rua. Em relao aos nitratos, Amaral e colaboradores (2008), obtiveram valores nfimos neste trabalho.
Tabela 4.11. Azoto amoniacal, nitratos e azoto total. Amostra Lavagem gua rua NH4+ (mg N L-1) 2,94 0,61 NO3- (mg N L-1) 0,41 0,64 Azoto total (mg N L-1) 32,4 186

4.2.9. Determinao do Fsforo

Pela anlise da tabela 4.12 possvel verificar relativamente ao fsforo total contido nas amostras em estudo, que a gua rua com 238,2 mg L-1, possui maior quantidade que a gua de lavagem (35,4 mg L-1). No estudo de Amaral (2008) foram obtidos 3,35 e 69,9 mg L-1 para a gua de lavagem e gua rua respectivamente.Estes valores so muito inferiores aos obtidos neste trabalho.

Tabela 4.12. Fsforo total nas amostras em estudo. Amostra Lavagem gua Rua Fsforo total (mg L-1) 35,4 238,2

Paiva, H. G.

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CONSIDERAES FINAIS

Consideraes Finais

As caractersticas fsico-qumicas destes efluentes, podem propiciar a proliferao de populaes bacterianas com resistncia s condies do meio. Deste modo, a sobrevivncia neste tipo de efluente poder favorecer a seleco de estirpes que apresentam em simultneo, multiresistncia aos antibiticos. Porm, a sua presena em efluentes de lagares de azeite tanto quanto do nosso conhecimento no foi estudado. Neste estudo foi possvel coleccionar uma grande quantidade de isolados bacterianos, multiresistentes, demonstrando a sua vasta disperso. Dos isolados da coleco de Enterobacteriaceae (n=21) possvel afirmar que a maioria revelou resistncia aos antibiticos em estudo. De referir que os antibiticos com menor actividade foram a eritromicina e a amoxicilina. Em relao aos isolados no Enterobacteriaceae (n=7), todos revelaram multiresistencia aos antimicrobianos em estudo, sendo que a amoxicilina e a eritromicina foram os de menor actividade. Os isolados de Gram positivo (n=4) Enterococcus spp. apresentaram resistncia vancomicina e teicoplanina. Por biotipificao numrica (API 20E) foram identificados os isolados de Hafnia alvei em gua rua, Enterobacter cloacae e Erwinia spp. em gua de lavagem. Relativamente aos aspectos fsico-qumicos foi possvel verificar que a gua rua e a gua da centrifuga apresentam os valores mais elevados na maioria dos parmetros excepto o azoto amoniacal, que foi a gua de lavagem que obteve valor superior gua rua. Estes dados podero explicar as diferenas na quantidade de isolados bacterianos provenientes dos 3 tipos de efluentes do lagar, j que foi na gua de lavagem que foram obtidos mais isolados (n=40). A gua rua possui um maior nmero de isolados relativamente gua da centrfuga, embora as anlises fsico-qumicas revelem maior nvel de toxicidade na gua rua. Neste caso, as diferentes temperaturas do processo de extraco do azeite podero explicar as diferenas observadas. De salientar que alguns isolados apresentaram resistncia ao meropenemo (carbapenemo), antibitico de uso hospitalar de ltimo recurso. Podemos constatar que os genes de resistncia esto amplamente disseminados por variadssimos ambientes, dos quais, ambientes naturais (efluentes de lagares de azeite) sem relao com ambientes hospitalares.

Paiva, H. G.

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[acedido a 15/04/09] a 15/04/09]

http://web.monroecc.edu/bedelbach/ [acedido

Paiva, H. G.

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ANEXOS

Anexos

Anexo 1. Meios de cultura

Meio 1 BHI (Brain Heart Infusion) (Oxoid CM0225)

Composio: 12,5g de infuso de crebro de vitela slida, 5,0g de infuso de carne de corao; 10,0g de proteose de peptona; 2,0g de glucose; 5,0g de cloreto de sdio e 2,5g de fosfato disdico.

Meio 2 Agar GSP (Glutamate Starch Phenol) (Merck 10230)

Composio: 10,0g de L(+)-glutamato de sdio; 20,0g de amido solvel; 2,0g de dihidrogeno fosfato de potssio; 0,5g de sulfato de magnsio; 0,36g de vermelho de fenol e 12,0g de agar-agar.

Meio 3 Agar MacConkey (Merck 05465)

Composio: 17g de peptona de casena; 3g de peptona de carne; 5g de cloreto de sdio; 10g de lactose; 1,5g de mistura de sais biliares; 0,03g de vermelho neutro; 0,001g de cristal de violeta e 13,5g de agar-agar.

Meio 4 Mueller-Hinton agar (Oxoid CM0337)

Composio: 300g de infuso de carne desidratada; 17,5g de casena hidrolisada; 1,5g de amido e 17g se agar-agar.

Meio 5 - Slanetz e Bartley (Oxoid CM377)

Composio: 20 g de triptose; 5 g de extracto de levedura; 2 g de glucose 4 g de K 2HPO42H2O; 0,4 g de azida de sdio; 0,1 g de cloreto de tetrazolio: 10 g de agar.

Paiva, H. G.

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Anexos

Meio 6 - Endo (Merck 04044)

Composio: 10 g de peptona; 2,5 g de di-potssio hidrogeno fosfato; 10g de lactose; 3,3 g de sulfito de sdio anidro; 0,3 g de pararosanilina e 12,5g de agar-agar.

Meio 7 - Manitol (Merck 105404)

Composio: 10g de peptona; 1g de extracto de carne; 75g cloreto de sdio; 10g D(-) manitol; 0,0025 g de fenol vermelho e 12g de agar agar.

Meio 8 - Rose Bengal Chloramphenicol Agar (RBCA) (Oxoid CM0549)

Composio: 5 g de peptona;10 g de glucose;0,05 g de rosa bengala; 0,1 g de cloranfenicol; 15,5 g de agar; 1 g de dihidrogenofosfato de potssio e 0,5 g de Sulfato de magnsio.

Meio 9 - Canamicina Esculina Azida Agar (CEAA) (Oxoid CM591 + SR92)

Composio: 20 g de casena enzimtica hidrolisada; 5 g de extrato de levedura; 5 g de cloreto de sdio; 1 g de citrato de sdio; 1 g de esculina; 0,5 g de citrato frrico de amnio; 0,15 g de azida sdica e 12g de agar.

Paiva, H. G.

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Anexos

Anexo 2. Solues, reagentes e corantes

Soluo 1 Violeta de metilo (Merck 15945) Violeta de Metilo (Cristal de Violeta) 5g/1 gua destilada 1000ml Soluo 2 Lugol ( Vaz Pereira 1348) Iodo sublimado 10g Iodeto de Potssio 20g gua destilada 1000ml Soluo 3 Vermelho Neutro (Merck 1376) Vermelho Neutro 1g cido Actico a 1% 2ml gua destilada a 1000ml Soluo 4 Reagente de oxidase (Merck 8.21102.0025) Dihidroclorido de tetrametil-p-fenilenodiamina 0,1g gua destilada 10ml Soluo 5 Soro Fisiolgico Cloreto de Sdio (Merck 6404.1000) 17g gua destilada 2000ml Soluo 6 Reagente Kovaks Dimetilamino-benzaldeodo (Merck 1.03058.0100) 5g/1 lcool amlico (Merck 2302106) 75ml cido Clordrico (Merck K25658617) 25ml Soluo 7 Reagente de voges-proskauer VP1 Hidrxido de Potssio a 40% 20ml gua destilada 50ml

Paiva, H. G.

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Anexos

Soluo 8 Reagente de voges-proskauer VP2 Naftol 5g lcool Absoluto 100ml Soluo 9 Glicerol (Panreac 122329) Glicerina 87%

Paiva, H. G.

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