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ISSN1678-0434 ISSN 1517-1981 Novembro, 2009 Outubro 2000

Aproveitamento do Caroo do Aa como Substrato para a Produo de Enzimas por Fermentao em Estado Slido

ISSN 1678-0434 Novembro, 2009

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa Instrumentao Agropecuria Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

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Aproveitamento do Caroo do Aa como Substrato para a Produo de Enzimas por Fermentao em Estado Slido

Cristiane Sanchez Farinas Rodrigo Rafael Mendona dos Santos Victor Bertucci Neto Jos Dalton Cruz Pessoa

So Carlos, SP 2009

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Instrumentao Agropecuria Rua XV de Novembro, 1452 Caixa Postal 741 CEP 13560-970 - So Carlos-SP Fone: (16) 2107 2800 Fax: (16) 2107 2902 http://www.cnpdia.embrapa.br E-mail: sac@cnpdia.embrapa.br Comit de Publicaes da Unidade Presidente: Dr. Luiz Henrique Capparelli Mattoso Membros: Dra. Dbora Marcondes Bastos Pereira Milori, Dr. Joo de Mendona Naime, Dr. Washington Luiz de Barros Melo Valria de Ftima Cardoso Membro Suplente: Dr. Paulo Srgio de Paula Herrmann Junior Supervisor editorial: Dr. Victor Bertucci Neto Normalizao bibliogrfica: Valria de Ftima Cardoso Tratamento de ilustraes: Valentim Monzane Capa foto: Gisele Vieira Ribeiro Editorao eletrnica: Manoela Campos 1a edio 1a impresso (2009): tiragem 300
Todos os direitos reservados. A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610). CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao. Embrapa Instrumentao Agropecuria

F225a

Farinas, Cristiane Sanchez Aproveitamento do caroo do aa como substrato para a produo de enzimas por fermentao em estado slido / Cristiane Sanchez Farinas, Rodrigo Rafael Mendona dos Santos, Victor Bertucci Neto, Jos Dalton Cruz Pessoa. So Carlos: Embrapa Instrumentao Agropecuria, 2009. 15 p. (Embrapa Instrumentao Agropecuria. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, ISSN 1678-0434; 30). 1. Engenharia Bioqumica. 2. Enzimas. 3. Aa. 4. Resduos agroindustriais. 5. Fermentao. 6. Biomassa vegetal. I. Santos, Rodrigo Rafael Mendona dos. II. Bertucci Neto, Victor. III. Pessoa, Jos Dalton Cruz. IV. Ttulo. V. Srie. CDD 21 ED 660.63

Embrapa 2009

Sumrio

Resumo ............................................................................................... 5 Abstract .............................................................................................. 6 1. Introduo ........................................................................................ 7 2. Material e Mtodos ............................................................................. 9 3. Resultados e Discusses ................................................................... 10 Concluses ........................................................................................ 14 Referncias ...................................................................................... 15

Aproveitamento do Caroo do Aa como Substrato para a Produo de Enzimas por Fermentao em Estado Slido
Cristiane Sanchez Farinas Rodrigo Rafael Mendona dos Santos Victor Bertucci Neto Jos Dalton Cruz Pessoa4

Resumo
O estado do Par o principal responsvel pela produo nacional de aa, fruto do qual extrado um suco de alto teor energtico e nutricional. No entanto, cerca de 80% do total de aa processado transforma-se em resduo, ainda sem destinao econmica adequada, sendo jogados sem nenhum tratamento nos rios e lixes. Portanto, existe uma demanda para o desenvolvimento de processos visando o seu aproveitamento. Neste trabalho foi avaliada a viabilidade da utilizao do caroo de aa como substrato da fermentao em estado slido (FES) para a produo de enzimas de interesse industrial. Atravs da aplicao da metodologia de planejamento fatorial estatstico avaliou-se diferentes composies de meio nutricional para a produo de CMCase e xilanase no cultivo de Aspergillus niger em caroo do aa. As variveis estudadas foram as concentraes de peptona, de extrato de levedura, de carboximetilcelulose (CMC) e a umidade do meio. A maior atividade enzimtica de CMCase atingiu 3,60 U.g-1, ao final de 72 horas de cultivo a 32 C. Os melhores resultados para xilanase atingiram 3,89 U.g-1 nas mesmas condies utilizadas para CMCase. Esses resultados representaram uma melhor produtividade em funo do acrscimo de fontes indutoras de carbono e nitrognio, demonstrando que com uma adequada formulao das mesmas possvel viabilizar a utilizao do caroo de aa como substrato para a produo de enzimas. Palavras chave: aa, resduos agroindustriais, fermentao, enzimas, biomassa vegetal.
Engenharia Qumica, Dra., Pesquisadora, Embrapa Instrumentao Agropecuria, C.P. 741, CEP 13560-970, So Carlos/SP. cristiane@cnpdia.embrapa.br Biologia, Mestrando do Programa de Ps-graduao em Biotecnologia, Estagirio na Embrapa Instrumentao Agropecuria, C.P. 741, CEP 13560-970, So Carlos/SP. rrmsantos@yahoo.com.br Engenharia Eltrica, Dr., Pesquisador, Embrapa Instrumentao Agropecuria, C.P. 741, CEP 13560-970, So Carlos/SP. victor@cnpdia.embrapa.br 4 Fsica, Dr., Pesquisador, Embrapa Instrumentao Agropecuria, C.P. 741, CEP 13560-970, So Carlos/SP. dalton@cnpdia.embrapa.br

Evaluation of aa residues as substrate for enzyme production by solid state fermentation.

Cristiane Sanchez Farinas Rodrigo Rafael Mendona dos Santos Victor Bertucci Neto Jos Dalton Cruz Pessoa

Abstract
The state of Par is the major producer of aa, a fruit from which is extracted a highly energetic and nutritional juice. However, about 80% of the total processed aa becomes a waste with no adequate destination, being thrown into rivers and landfills. Therefore, there is strong need for the development of alternative processes that could make use of this residue. Here, we evaluated the feasibility of using aa residues as a substrate of solid state fermentation for the production of enzymes of industrial interest. By applying the methodology of factorial design, we evaluated different combinations of nutritional medium for the production of CMCase and xylanase in the cultivation of Aspergillus niger in aa residues. The variables studied were the concentrations of peptone, yeast extract, carboxymethylcellulose (CMC) and the humidity of the medium. CMCase activities up to 3.60 U.g-1 and xylanase activities up to 3.89 U.g-1 were obtained at the end of 72 hours of cultivation at 32 C. These results represented an improvement in terms of enzymatic productivity by the addition of sources of carbon and nitrogen, showing that with a proper medium formulation it is possible to use aa residues as a substrate for enzyme production. Key words: aa, agroindustrial residue, fermentation, enzymes, biomass.

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1. Introduo
A agroindstria do aa uma das cadeias produtivas mais importantes para o estado do Par. Somente na cidade de Belm existem cerca de 3 mil estabelecimentos que comercializam o aa j processado, atendendo a um consumo dirio de 440 mil quilos do fruto (IBGE, 2007) e gerando um excedente de 365 toneladas por dia de lixo orgnico, constitudo principalmente de caroos, descartados em aterros sanitrios e cursos dgua. O desenvolvimento desta cadeia produtiva depende da correta destinao de todos os subprodutos gerados. Neste sentido, os subprodutos geralmente classificados como resduos podem ser encarados como passveis de valorao econmica, ganhando novos usos para a sociedade. Fornecedor do principal produto do extrativismo vegetal da Regio Norte, o aaizeiro (Euterpe oleracea) uma palmeira de origem amaznica que cresce em touceiras de at 25 estipes. Seu fruto uma importante fonte de nutrientes para grande parte da populao, principalmente a ribeirinha. Segundo dados do IBGE (2007), o Estado do Par responsvel por 86,8% da produo nacional de aa com 93.772 t/ano do fruto. Deste total 77.830 t/ano de resduo (caroo), ou seja, cerca de 80% do total produzido, ainda sem destinao econmica adequada, sendo jogados nos rios e lixes sem nenhum tratamento. Portanto, existe uma demanda para o desenvolvimento de processos visando ao aproveitamento de tais resduos. Principal subproduto da indstria de processamento do aa, o caroo uma semente oleaginosa, formada por um pequeno endosperma slido ligado a um tegumento que na maturidade rico em celulose (53,20%), hemicelulose (12,26%) e lignina (22,30%) (RODRGUEZ-ZIGA et al., 2008). Essas caractersticas fazem do caroo do aa uma importante fonte de biomassa lignocelulsica, podendo ser uma potencial alternativa de substrato slido para a obteno de enzimas de interesse comercial pelo processo de fermentao em estado slido (FES). A fermentao em estado slido definida como o processo de crescimento microbiano na superfcie de materiais slidos que apresentam a propriedade de absorver ou de conter gua, com umidade suficiente apenas para manter o crescimento e o metabolismo do microrganismo, isto , isento de gua livre (RAHARDJO et al., 2006). Por ser um processo com baixos nveis de gua residual, apresenta-se como um processo industrial limpo. Atualmente, as enzimas so utilizadas em vrias aplicaes industriais e a demanda por enzimas mais estveis, altamente ativas e especficas tem crescido rapidamente. Cerca de 60% das indstrias que vendem enzimas encontram-se na Europa, os outros 40% esto nos Estados Unidos e no Japo (BHAT, 2000).

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De acordo com os dados do Ministrio do desenvolvimento e comrcio exterior do governo federal, sobre o mercado de enzimas do Brasil, no ano de 2005, o total de importaes brasileiras foi de US$ 95,7 milhes, enquanto as exportaes foram de US$ 5,4 milhes, mostrando que o mercado brasileiro essencialmente importador, indicando uma desvantagem tecnolgica e estratgica em termos de produo e uso das enzimas no pas. Desta forma, a utilizao do caroo do aa como substrato para produo enzimtica poder tornar-se uma alternativa competitiva no mercado. Alm destas vantagens, a produo destas enzimas utilizando o caroo dispe-se tambm como uma maneira vivel de agregar valor a estes resduos, diminuindo assim o impacto ao meio ambiente. No entanto, no processo de FES, um grande nmero de variveis afeta o crescimento microbiano e a consequente produo de metablitos de interesse, dentre elas destaca-se a composio nutricional do meio de cultivo utilizado. Quando o fungo cultivado, uma suplementao deve ser realizada em termos das fontes de carbono, nitrognio e sais minerais. Entre as fontes de nitrognio as exigncias variam, sendo que vrios microrganismos utilizam compostos inorgnicos, como os sais de amnio e nitratos. Outros, entretanto, exigem fontes de nitrognio orgnico, como os hidrolisados de protena, como a peptona e o extrato de levedura. A peptona um produto da digesto enzimtica da carne, formada por polipeptdeos e oligossacardeos. O extrato de levedura contm todo o material solvel do autolisado das clulas de levedura, incluindo protenas, peptdios, aminocidos livres, nucleotdeos, vitaminas, oligossacardeos e minerais (KOLLAR et al., 1992). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade da utilizao do resduo da agroindstria do aa como substrato para a produo de enzimas por fermentao em estado slido atravs do cultivo de uma linhagem selecionada do fungo filamentoso Aspergillus niger. As enzimas selecionadas foram as celulases e hemicelulases, que possuem uma importante aplicao nos processos de converso da biomassa para a produo de biocombustveis, entre outras aplicaes nas industriais. No entanto, um dos obstculos para o uso dessas enzimas de forma mais ampla o seu custo elevado. A utilizao do caroo de aa como um substrato de baixo custo poder ser uma alternativa para sobrepor essa barreira. A influncia da composio do meio de cultivo na produtividade enzimtica foi avaliada atravs da aplicao da metodologia de planejamento experimental estatstico na seleo das variveis concentrao de Carboximetilcelulose (CMC), concentrao de extrato de levedura, concentrao de peptona e umidade inicial do meio.

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2 Material e Mtodos
Microrganismo O agente de fermentao foi uma linhagem do fungo filamentoso Aspergillus niger da coleo da Embrapa Agroindstria de Alimentos, RJ. Condios do microrganismo armazenados em solo estril e sob condies de congelamento foram reativados em gelose inclinada com meio bsico e incubados por 7 dias a 32C (COURI e FARIAS, 1995). Os condios da etapa de ativao foram utilizados para a inoculao em meio de sabugo de milho, utilizado para produo do inculo da fermentao. Preparao do Inculo Utilizou-se 1 mL da suspenso de condios em Tween 80 para a inoculao do meio de sabugo de milho. Os meios de sabugo de milho inoculados foram incubados por 5 dias a 32C, segundo Couri e Farias (1995). A concentrao de condios necessria para a inoculao foi determinada em cmara de Neubauer aps a devida diluio da suspenso obtida. O volume de inculo para fermentao foi calculado visando uma concentrao final de 107condios/g de substrato. Condies da Fermentao O caroo do aa foi modo, tendo suas granulometrias padronizadas em peneira de Mesh 20. Pesaram-se dez gramas do substrato em frascos do tipo Erlenmeyer de 125 mL. Os frascos foram esterilizados e ento inoculados. Aps 72 horas de fermentao a 32C, procedeu-se etapa de extrao do complexo enzimtico. As amostras foram extradas com tampo acetato de sdio 0,2 mol/L, pH 4,5, incubando os frascos em shaker a 120 rmp e 32C por 1 hora. Os extratos enzimticos recuperados foram armazenados a -18 C para posterior anlise da atividade enzimtica. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Planejamento experimental Os experimentos de fermentao foram realizados segundo um planejamento fatorial completo envolvendo quatro variveis independentes: concentraes de peptona, extrato de levedura e carboximetilcelulose (CMC) e a umidade inicial do substrato. Assim, foram realizados 19 ensaios, incluindo as 3 repeties do ponto central. Os valores utilizados na preparao dos diferentes meios de complemento so apresentados na Tabela 1.

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Tabela 1. Valores utilizados de concentrao de peptona, extrato de levedura, CMC e umidade do meio.
Variveis Peptona (g/L) Extrato de levedura (g/L) Carboximetilcelulose (CMC) (%) Umidade (%) -1 2 1 0,5 40 0 8 5 1,5 60 1 14 9 2,5 80

Atividades enzimticas As atividades enzimticas de CMCase e xilanase dos extratos obtidos foram quantificadas e os resultados das anlises foram expressos como unidades de atividade por massa de substrato inicial seco. A atividade endoglucansica CMCase, tem como substrato a CMC (Sigma, EUA). Uma unidade de atividade CMCase corresponde a 1 mol de grupos redutores liberados por minuto de reao em pH 4,2 a 50C. A atividade da xilanase foi medida em termos de produo de acares redutores a partir de xilana comercial (Sigma, EUA). Uma unidade de atividade xilanase corresponde a 1 mol de xilose liberado por minuto em pH 4,2 a 50C. A quantificao de grupos redutores foi realizada pelo mtodo DNS (MILLER, 1959) e as atividades expressas em unidade internacional por grama de fermentado seco (U/g).

3 Resultados e Discusses
Uma das principais barreiras para o desenvolvimento de processos de converso da biomassa em biocombustveis pela rota enzimtica o alto custo das enzimas. Portanto, de grande interesse o estudo de alternativas que possam reduzir tal custo. A FES uma tecnologia j bastante estabelecida para a produo de enzimas e possui como vantagens um menor custo de operao e a possibilidade da utilizao de resduos agroindustriais como substrato. No entanto, para o desenvolvimento de processos de produo de enzimas por FES necessita-se realizar a definio das condies operacionais e nutricionais de forma a favorecer a produo dos metablitos de interesse. Desta forma, utilizou-se a metodologia de planejamento experimental para avaliar a influncia das variveis concentrao de peptona, de extrato de levedura, de CMC e da umidade do meio na produtividade enzimtica. O objetivo desse estudo foi determinar a viabilidade da utilizao do caroo de aa como substrato da FES. O processo foi analisado com base nas atividades de CMCase e xilanase obtidas ao final de 72 horas de fermentao, sendo que esse perodo foi selecionado a partir de resultados anteriores (RODRGUEZ-ZIGA et al., 2008). Os valores utilizados no planejamento e os resultados obtidos das respostas esto apresentados na Tabela 2.

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Tabela 2. Diferentes composies do meio com os valores codificados e os resultados das atividades enzimticas.
Peptona -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 0 0 0 Levedura -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 1 0 0 0 CMC (%) -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 0 0 0 Umidade (%) -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 CMCase (U/g) 0,51 1,11 1,56 3,38 0,75 1,70 2,57 3,60 1,46 1,61 1,13 2,68 1,09 1,24 1,54 1,79 2,24 2,14 2.60 Xilanase (U/g) 0,85 1,85 1,87 4,75 0,92 2,02 2,30 4,67 1,75 2,03 1,11 2,53 0,75 1,54 1,18 3,06 1,50 1,89 1,77

Ensaio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (C) 18 (C) 19 (C)

Os efeitos das variveis independentes foram avaliados inicialmente em termos da atividade de CMCase. Somente as concentraes de peptona e levedura se mostraram estatisticamente significativas a 95% de confiana (Tabela 3). O coeficiente de correlao (0,8879) e o teste F (1,9 vezes o valor do F tabelado) se mostraram satisfatrios. Tabela 3. Estimativa dos efeitos para a atividade de CMCase.
Efeito (U/g) Mdia (1) Peptona (2) Levedura (3) CMC (%) (4) Umidade (%) 1,826 0,812 1,099 0,104 -0,330 Erro padro 0,097 0,212 0,212 0,212 0,212 t(8) 18,782 3,834 5,185 0,491 -1,555 p-valor 0,000 0,005 0,001 0,636 0,158

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1.20 1.00 0.80 Efeitos (U/g) 0.60 0.40 0.20 0.00 -0.20 -0.40 -0.60 Peptona Levedura CMC Umidade

Fig. 1. Histograma dos efeitos principais das variveis independentes sobre a produtividade de CMCase em caroo de aa. A maior produo da enzima CMCase (3,60 U/g) foi obtida em condies de maior concentrao de peptona e extrato de levedura no meio. No entanto, a anlise da superfcie de resposta (Fig. 2) indica que maiores produtividades podem ser atingidas com o aumento dos valores dessas variveis.

Fig. 2. Superfcies de respostas para a atividade de CMCase em caroo de aa. Ensaios comparativos realizados nas mesmas condies do ponto central e utilizando o farelo de trigo como substrato levaram a uma produo de CMCase de 11,62 U/g. Apesar desse valor ser superior aos valores obtidos usando o

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caroo do aa como substrato, o fato de termos a disponibilidade do caroo a baixo custo pode ser uma vantagem. Em relao enzima xilanase, as concentraes de peptona e levedura e a umidade do meio se mostraram estatisticamente significativas a 95% de confiana (Tabela 4). O coeficiente de correlao (0,9613) e o teste F (5,93 vezes o valor do F tabelado) se mostraram satisfatrios. Tabela 4. Estimativa dos efeitos para a atividade de xilanase.
Efeito (U/g) Mdia (1) Peptona (2) Levedura (3) CMC (%) (4) Umidade (%) 2,017 1,466 1,221 -0,038 -0,660 Erro padro 0,075 0,164 0,164 0,164 0,164 t(8) 26,740 8,916 7,427 -0,229 -4,015 pvalor 0,000 0,000 0,000 0,825 0,004

A Figura 3 apresenta os efeitos principais das variveis estudadas sobre a atividade de xilanase. Tanto as concentraes de peptona, quanto de levedura apresentaram efeitos positivos, indicando que um incremento nessas variveis levou a maiores produes da enzima xilanase. A varivel umidade apresentou um efeito negativo, indicando que incrementos nessa varivel levou a um decrscimo na produtividade e a varivel CMC no se mostrou significativa dentro da faixa estudada. Os maiores nveis de xilanase foram de 4,75 U/g.
1.60 1.40 1.20 1.00 Efeitos (U/g) 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 -0.20 -0.40 -0.60 -0.80 Peptona Levedura CMC Umidade

Fig. 3. Histograma dos efeitos principais das variveis independentes sobre a produtividade de xilanase em caroo de aa.

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Da mesma forma que para a enzima CMCase, foram realizados ensaios comparativos utilizando o farelo de trigo como substrato para produo de xilanase, resultando em valores de 14,56 U/g na condio do ponto central. A anlise da superfcie de resposta para a xilanase (Fig. 4) indica que maiores produtividades podem ser atingidas com o aumento dos valores dessas variveis.

Fig. 4. Superfcies de respostas para a atividade de xilanase em caroo de aa. Por ser um ser um resduo agroindustrial com oferta crescente e pelos resultados obtidos, o caroo do aa mostrou-se promissor como fonte de biomassa lignocelulsica para a produo de enzimas de interesse para a cadeia produtiva de biocombustveis. Novos estudos complementares direcionados suplementao do meio com o incremento das concentraes de peptona e levedura devem ser realizados buscando-se a otimizao e o escalonamento industrial do processo.

Concluses
Neste trabalho avaliou-se a viabilidade da utilizao do caroo de aa como substrato para a produo das enzimas por FES. Nos testes realizados, o caroo do aa apresentou-se promissor quanto a sua utilizao como fonte de biomassa para produo de enzimas celulases e hemicelulases. No entanto, estudos complementares para um ajuste dos parmetros operacionais do processo fermentativo esto sendo realizados visando a otimizao da produo destas enzimas, de forma a contribuir para a cadeia produtiva de biocombustveis e valorao da cadeia do aa.

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Referncias
BHAT, M. K. Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnology Advances, New York, v. 18, p. 355-383, 2000. COURI, S.; FARIAS, A. X. Genetic manipulation of Aspergillus niger for increased synthesis of pectinolytic enzymes. Revista de Microbiologia, So Paulo, v. 26, n. 4, p. 314-317, 1995. IBGE. Produo da extrao vegetal e da silvicultura: Belem - PA, Brasil, 2007. Disponvel em: http://www.ibge.gov.br/servidor_arquivos_est/default.php?caminho=./pub/Prod ucao_Agricola/Producao_da_Extracao_Vegetal_e_da_Silvicultura_[anual]/2007>. Acesso em: 05 ago. 2009. KOLLAR, R.; STURDUK, E.; SAJBIDOR, J. Complete fractionation of Saccharomyces cerevisiae biomass. Food Biotechnology, New York, v. 6, n. 3, 225-237, 1992. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicilic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Biochemistry, New York, v. 31, p. 426-428, 1959. RAHARDJO, Y. S. P. et al. Modeling conversion and transport phenomena in solid-state fermentation: A review and perspectives. Biotechnology Advances, New York, v. 24, p. 161-179, 2006. RODRGUEZ-ZIGA, U. F; FARINAS, C. S.; BERTUCCI NETO, V. ; LEMO, V. Produo de Complexos Lignoceluliticos em Substratos Derivados de Resduos Agroindustriais por Fermentao Semi-slida. In: WORKSHOP DE BIOCATLISE E BIOTRANSFORMAO, 4., 2008, So Carlos. Livro de resumos... So Carlos, SP: Instituto de Qumica de So Carlos, 2008. p. 107. resumo expandido. Anais.

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