FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE PARASITOLOGIA GUIA DE PRACTICAS

PRACTICA N 1
DIAGNSTICO HELMINTOLGICO En el diagnstico de laboratorio y de campo de las helmintosis se puede utilizar una gran diversidad de mtodos y modificaciones individuales; la estandarizacin de las tcnicas de laboratorio veterinario, tales como recuento de huevos/larvas, recuento de vermes, recuento de larvas en el pasto, etc.es virtualmente inexistente, por lo tanto, la mayora de los servicios de diagnstico y unidades de enseanza e investigacin aplican sus propios protocolos y procedimientos. OBTENCION Y REMISION DE MUESTRAS DE HECES AL LABORATORIO Por la ubicacin topogrfica de los nemtodos gastrointestinales, el material a obtenerse sern las heces, para efectuar un diagnstico definitivo emitido por el Laboratorio de Parasitologa, de esta manera, la presencia o ausencia de los parsitos adultos, o de distintos estadios evolutivos, nos permitir efectuar un control o tratamiento adecuado. La primera consideracin es evitar la contaminacin de las heces con organismos de vida libre que puedan confundirse con elementos parasitarios. En animales mayores las heces deben tomarse directamente del recto. En animales menores, deben tomarse de una superficie limpia, si esto no es posible, debe tomarse la parte superficial de la deposicin que no haya tenido contacto con el suelo. La cantidad adecuada de heces es de unos 45 g (unas tres cucharadas soperas) para animales mayores y de 5 a 10 g (una a dos cucharadas de t) para animales menores. Como la concentracin de los elementos parasitarios en las heces flucta de da a da a menudo se obtienen mejores resultados obteniendo 3 muestras, da por medio. Esta estrategia se llama comnmente el examen seriado de las deposiciones y es recomendable particularmente en animales menores donde se tomas muestras ms pequeas

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN Y REMISION DE MUESTRAS DE HECES AL LABORATORIO MATERIALES o o o o o o o Mandiles o mamelucos especiales para el operador Botas de jebe Caja refrigerante (acero, u otro material) Materiales de sujecin (sogas, mochetas) Balde de plstico. Jabn carblico Guantes de polietileno que permita la introduccin de la mano (para grandes animales) y en caso de animales menores (compaa) recoger inmediatamente despus de la defecacin (propietario) o o Esptula de plstico. Recipientes adecuados, como : Bolsas de polietileno (10 cm de ancho) Embase de plstico o de vidrio de boca ancha con tapa con rosca Rotulo que debe llevar el frasco en el que debe constar: Nombre del Propietario o fundo Identificacin del animal Fecha y hora de la toma de muestra o Heces frescas

ALGUNOS CRITERIOS QUE DEBE TOMARSE EN CUENTA: 1. Nmero de Muestra: o Cuando la cantidades son mayores a 100 animales = 10% (5% animales en buenas condiciones y 5% de animales en bajas condiciones fsico sanitarias). o Cuando las cantidades son menores a 100 = Mnimo de 10 animales por rebao o manada (por grupo de edad). o Para el recuento de huevos en heces de majadas, se puede utilizar una tcnica compuesta, que consiste en:

 Muestrear 10 animales por rebao. Mezclar todas las muestras (de los individuos muestreados). De esta mezcla tomar 2 a 3 gramos de heces y relaizar el recuento. o Las muestras tomadas debern ser analizadas preferentemente de inmediato, es decir, dentro de 4 horas de recogida las muestras, sino se preservan; pueden guardarse por 24 a 48 horas en refrigeracin (en la costa se deber analizarse dentro de las 18 horas como mximo; y en la sierra dentro de las 48 horas como mximo, pero para perodos ms largos deben homogenizarse con soluciones que eviten la proliferacin de microorganismos contaminantes. Las soluciones fijadoras ms empleadas son: COMPOSICION o FORMOL AL 10%.:
- Formol comercial 40% - Agua destilada 1 parte 3 parte ------------4 partes 50 cc 950 cc 10 g

o F0RMOL SALINO
- Formol comercial 4% - Agua Destilada - Na Cl

o SUERO FISIOLOGICO
- NaCl - gua destilada 0.85 g 100 ml

o ALCOHOL POLIVINILICO (PVA) FIJADOR

- PVA en polvo - Solucin saturada de bicloruro de mercrio - Glicerina - Alcohol etlico (95%) - Alcohol actico glacial 25 g 312 ml 7.5 ml 176 ml 25 ml

Observaciones: Mesclar el bicloruro de mercrio, gliserina, cido actico glacial y el alcohol etlico cuidadosamente agregando el PVA, agitar por 10 minutos, calentar em bao maria a 75 - 80C por 5 10 minutos .

EXTENSION FECAL DIRECTA

METODO DIRECTO FUNDAMENTO Este mtodo, es muy rpida y sencilla de hacer, siempre y cuando los huevos de los helmintos se encuentran en grandes cantidades en las heces. Es posible que la pequea cantidad de heces tomada para la extensin, no contenga ningn huevo. Por consiguiente, si con este mtodo no hay evidencias del parasitismo, es aconsejable hacer los mtodos de concentracin. MATERIALES o o o o o o Muestra de heces Varilla de vidrio Laminas portaobjetos Laminillas cubre objetos Microscopio ptico. Agua desmineralizada y/o suero fisiolgico o lugol dbil.

PROCEDIMIENTO Y/O MTODOS 1. Tomar una pequesima cantidad de heces y depositar al centro de un portaobjeto limpio. 2. Poner 1-2 gotas ms de agua desmineralizada o suero fisiolgico y/o lugol dbil, sobre las heces y luego mezclarlo completamente, empleando la varilla de vidrio o palillo de madera. 3. Con la varilla o el palillo de madera apartar la suspensin o estructuras duras no disueltas anteriormente y quedarse con la parte lquida. 4. Cuidadosamente aplicar la laminilla cubreobjetos sobre la muestra preparada, evitando que se forme burbujas de aire. Tambin se puede efectuar un frontis, de manera que la extensin sea fina y transparente. 5. finalmente se deber examinar el rea bajo el microscopio ptico (10x a 40x), en forma sistemtica (depositar una gota de agua en el extremo del cubreobjeto, para evitar la desecacin y cristalizacin de la muestra).

Las preparaciones con suero fisiolgico se emplean para investigar la movilidad de formas vegetativas de protozoarios (trofozoitos) y larvas de nemtodos. El lugol inmoviliza a esta estructura y le da cierta coloracin que permite precisar mejor sus caractersticas morfolgicas. Examinar la preparacin a lo largo de un extremo del cubreobjetos, a continuacin se desplaza la platina del equivalente a la anchura de un campo y se contina examinando hasta que se haya cubierto todo el cubreobjetos. Para evitar la desecacin y cristalizacin de la muestra, se puede depositar una gota de agua en el extremo del cubre objetos MUESTRA EMPLEADA Para esta prctica se ha empleado muestra se heces de porcino, por tal razn es posible encontrar otras evidencias parasitarias, propias de esta especie animal RESULTADOS ESPERADOS Huevo tipo Trichuris

Huevo tipo Ascaris

Balantidium coli Es un ciliado cuyo hospedador principal es el cerdo. En la observacin de trofozotos, miden de 40 a 80 micras. En heces frescas pueden observarse los movimientos activos de los cilios.

PROTOCOLO UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CIP LA RAYA PROTOCOLO N . NOMBRE DEL PROPIETARIO.. PROFESIONAL TRATANTE.. LUGAR..FECHA ZONA GEOFRAFICA Y TOPOGRAFICA. CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS ANIMALES ESPECIE..RAZA..SEXO. .ESTADO NUTRICIONAL... TIPO DE CRIANZA.. RESUMEN DE LA HISTORIA CLINICA SINTOMAS . DIAGNOSTICO PRESUNTIVO O APARENTE... - DESPARASITACIONES PREVIAS: PRODUCTO UTILIZADO... DOSIS..FECHA DE TRATAMIENTO ENFERMEDADES CONCOMITANTES MORBILIDAD (%)MORTALIDAD (%) EXAMEN DESEADO OTROS DATOS TIPO DE CONSERVADOR. MEDIO DE TRANSPORTE. SISTEMA DE REFRIGERACION..

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FIRMA Y SELLO DEL REMITENTE

PRACTICA N 2 METODOS DE CONCENTRACION

Estos mtodos se utilizan para concentrar los elementos parasitarios (quistes, ooquistes, larvas, trofosoitos, huevos, etc.), que estn basados en el hecho por el cual la densidad de los huevos es considerablemente mayor que la del agua y restos fecales; por ello, si se suspenden las heces en una solucin con una densidad mayor que la de los huevos (por ej. En una solucin de azcar saturada), los huevos de los vermes flotan y se concentran en la superficie de la suspensin (principio de la tcnica de flotacin); si las heces se suspenden en agua los huevos sedimentarn ms rpidamente en la mayora de partculas fecales (principio de las tcnicas de sedimentacin); estas tcnicas permiten concentrar en un pequeo volumen los huevos o larvas existentes en una gran cantidad de heces, por lo que pueden ser identificados y contados al microscopio ms fcilmente; aparte de los huevos de helmintos, tambin flotan los ooquistes de protozoos (Eimeria, Toxoplasma, Isospora, Cystoisospora, Hammondia, Criptosporidium, stc.).

METODO DE FLOTACION
Este mtodo se fundamenta en la propiedad que tienen las estructuras parasitarias de flotar en la superficie de una solucin concentrada, aprovechando la gravedad especfica de una solucin, para hacer flotar las evidencias parasitarias fecales. Para la mayora de los huevos de helmintos, el peso especfico de la solucin deber estar entre: 1.10 y 1.20. Los huevos de mayor peso como el de Fasciola, Metastrngylus, Diphyllobothrium, Acantocefalos , flotan en soluciones cuyo peso especfico varan entre 1.30 y 1.35, como solucin saturada de sulfato de cinc, cloruro de cinc, sulfato de magnesio, etc., en las que sin embargo, sufren deformaciones, hacindolas irreconocibles, conforme mayor sea la densidad, los restos tambin flotan, por lo que la eficacia de la tcnica se reduce; por ello para detectar huevos de los ltimos grupos de parsitos son preferibles las tcnicas de sedimentacin.

Soluciones de flotacin comunes 1. Solucin saturada de sacarosa de Sheather o azcar (Densidad: 1.12 a 15C)
Azcar rubia Agua desmineralizada 1,280 g 1,000 ml

2. Solucin saturada de cloruro de sodio (Densidad: 1.19 a 20C)

Sal comn Agua desmineralizada Formol comercial (40%) 3. 360 g 1,000 ml 20 ml (o tambin: Fenol licuado = 10 ml)

Solucin saturada de nitrato de sodio (Densidad: 1.18 1.20)

Nitrato de sodio Agua desmineralizada 400 g 1,000 ml

4. Solucin saturada de sulfato de cinc (Densidad: 1.30 1.47) Sulfato de cinc Agua desmineralizada 700 g 1,000 ml

5. Solucin saturada de sulfato de magnesio (Densidad: 1.28 1.32) Sulfato de magnesio Agua desmineralizada 700 g 1,000 ml

Como preparar la solucin azucarada o o o Disolver el azcar en agua tibia, sin llegar a la ebullicin Filtrar (por una gasa) Agregar el formol comercial, para evitar la formacin de hongos y otros microorganismos Fundamento o Los huevos son ms pesados que el agua, pero la mayor parte de la materia fecal es ms pesada que los huevos. o De este modo, se mezclan las heces con una solucin que tiene una densidad flotante superior a los huevos, pero inferior a otros componentes de las heces. Ejemplo: 10 ml de agua pesa 10 gramos

 10 ml de solucin flotadora con una gravedad de 1.12 pesa 12 gramos. 10 ml de solucin flotadora con una gravedad de 1.19 pesa 19 gramos.

Algunas ventajas y desventajas de las soluciones flotadoras

La cristalizacin es lenta y los huevos mantienen su morfologa en esta solucin durante varios das o incluso ms; el inconveniente es que la solucin es sucia, pegajosa y atrae a las moscas y otros artrpodos; su viscosidad retrasa la flotacin de los huevos, por lo que es conveniente centrifugar Nota: Una vez que se han preparado y enfriado las soluciones de flotacin, llenar una probeta y ajustar la densidad mediante un hidrmetro; comprobar la densidad peridicamente.

Materiales
Solucin flotadora de sacarosa de Sheather Embudo (40-60 hilos por pulgada cuadrada) Mortero y su respectivo mango Laminas porta-objeto Laminas cubre o esptula Tubos de prueba de 10 ml Viales pequeos (frasquitos de penicilina) Vasos de precipitados Balanza de precisin

Procedimiento:
1 De la muestra remitida al laboratorio, pesar de 2 a 3 gr. de material fecal de cualquier especie y depositar en el mortero, para 2 macerar Agregar 10 a 15 ml de solucin flotadora, esto si las heces tienen forma de pelets, pero si son pastosas se puede

homogenizar con la ayuda de una vagueta

Filtrar a travs de un tamiz o un embudo con malla a un vaso de precipitacin

El filtrado se transfiere a los tubos de prueba o viales (frasquitos de penicilina), hasta que forme un menisco convexo, por

encima del borde del vial Colocar la laminilla cubre objetos en contacto con la superficie lquida (menisco) y espere unos 15 a 20 min. Luego transferir esta laminilla al portaobjetos para su observacin

Nota: En caso de no haber colocado la laminilla cubreobjetos, se llevarn 1 2 gotas de la superficie lquida hacia el portaobjeto y luego recin cubrir esta con la laminilla cubreobjetos. Cuando se quiere observar en forma inmediata se puede colectar el filtrado en tubos de centrifuga y se lleva a centrifugacin a 1.500 rpm, durante 2 minutos. Finalmente se lleva a la observacin microscpica, donde se observa a 10X, 40X 100X observacin se realizar llevando gotas de la superficie liquida hacia el porta-objetos y cubrir con laminilla cubreobjetos.

METODO DE LOS 50
Este es un nuevo mtodo que se viene efectuando en el laboratorio de parasitologa de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional del Altiplano, el mismo que ha demostrado tener una efectividad mayor al 95%. De esta manera, el anterior mtodo de flotacin antes indicada solamente sirve como referencia de lo que se realizaba anteriormente. PROCEDIMIENTO 1. De la muestra remitida al laboratorio, pesar 2 a 3 gramos de material fecal y depositar en el mortero. 2. Agregar en el mortero 15 a 20 ml de agua desmineralizada y desmenuzar las heces que estn en forma de pelets y, si las heces fueran pastosas, mezclar con una bagueta. 3. Tamizar el contenido a travs de un embudo con malla metlica, hacia un vaso de precipitado. 4. Transferirlo a un tubo de prueba de 15 ml de capacidad 5. Llevar a la centrifuga a 2000 rpm durante dos minutos. 6. Eliminar el sobrenadante. 7. Resuspender el sedimento con 15 ml de solucin azucarada saturada (en tres momentos diferentes) hasta conseguir una homogenizacin completa. 8. Completar el llenado del tubo con solucin flotadora hasta formar un menisco convexo en el borde superior del tubo. 9. Colocar una laminilla cubre objeto. 10. Llevar nuevamente a la centrifuga a 2000 rpm durante dos minutos. 11. Retirar cuidadosamente la laminilla cubreobjeto en forma recta hacia arriba. 12. Invertir la laminilla cubreobjeto, para luego depositar sobre ella lugol, luego homogenizar con suaves movimientos.

13. Depositar la laminilla coloreada sobre una lamina portaobjeto. 14. Observar en el microscopio a 10 X para la identificacin de huevos de parsitos y a 40 X para observar sus caractersticas morfolgicas .

INTERPRETACIN A menudo los resultados se expresan con +, ++, +++, para indicar la cantidad de estadios parasitarios. Sin embargo, esta es una apreciacin con una elevada dosis de subjetividad, que vara de una persona a otra. Por nuestra experiencia y correlacionando con los mtodos cuantitativos, hemos credo dar datos valores a los (+, ++, +++), para una mejor interpretacin con esta metodologa; los mismos que estn sujetos a las modificaciones, segn criterio del tcnico.

1 2 3 4

Ningn huevo en la muestra completa Negativa (-) 1 a 10 Huevos en toda la preparacin Infeccin moderada (+) 10 a 20 Huevos en toda la Infeccin mediana (++) preparacin 20 a ms preparacin huevos en toda la Infeccin masiva o grave.

IDENTIFICACIN DE HUEVOS DE NEMATODOS GASTROINTESTINALES DE RUMIANTES ESPECIE MORFOLOGA CARACTERSTICAS

o o Miden de 70 100 X 40 a 60 Son de forma ovoide Son incoloros Son de cscara fina (1 1.5 ) Poseen de 16 a 32 blastmeros en su interior. o o Miden de 156 X 76 Son de forma ovoide (con

Huevo tipo Strongylus

o o o

bordes romos)

N.

lamae

o o o

Son incoloros Son de cscara gruesa (1.5 3.0 ) Poseen de 4 a 8 blastmeros en su interior.

o o

Miden de 200 X 98 Son de forma ovoide (con

extremos aguzados)

N.

spatiger

o o o

Incoloros Tienen cscara gruesa 3.0 ) Poseen de 4 a 8 blastmeros en su interior (1.5

o o o o o o

Miden de 171 X 88 Son La de parte forma ovoide es (con ms

extremos aguzados)

N. filicollis

media

ensanchada que el N. spatuger Incoloros Tienen cscara gruesa 3.0 ) Poseen de 4 a 8 blastmeros en (1.5

su interior o o Miden de 176 X 88 Son de forma ovoide, con

Huevo de Lamanama chavezi

extremos romos: similar a los del tipo strongylus o o o o o Son incoloros Son de cscara gruesa (2.0 3.5 ) Poseen ms de 36 blastmeros Miden de 75 X 35 Son de forma ovoide, pero en los extremos poseen unos bien pardo tapones o o o Son de polares un color

manifiestos (forma de limn)

Huevo tipo Trichuris

amarillento Son de cscara gruesa (2.0 3.5 ) Son sin segmentar al ser puesto, protoplasmtica. o o Miden de 50 X 25 Son de forma ovoide, pero en los extremos poseen unos tapones o o o Son de polares un achatados pardo observndose

solamente una masa celular

(forma de tonel)

Huevo tipo Capillaria

color

amarillento Son de cscara gruesa (2.0 3.0 ) Son sin segmentar al ser puesto, proptoplasmtica. observndose

solamente una masa celular

Huevo de Moniezia expanza

o o o o Son incoloros Poseen una cscara gruesa Son de forma algo triangular En su interior poseen un aparato piriforme bfido y un embrin u oncosfera exacanto

o o

Miden de 50 a 60 Son incoloros Poseen una cscara gruesa Son de forma tetradrica o cuadrangular En su interior poseen un aparato piriforme con proyeccin roma y un embrin u oncosfera exacanto

Huevo de Moniezia benedeni

o o o

o o

Miden de 110 a 123 Son incoloros Son puestos 5 a en 30 forma de

Huevo de Thysanosoma actinoides

o o o

cpsulas ovgeras Poseen embriones exacantos, sin aparato piriforme A la unin de sus cpsulas, sta es contnua

o o o

Miden de 130 a 123 Son incoloros Son puestos 3 a en 5 forma de

Huevo de Helictometra giardi

capsulas ovgeras o o Poseen embriones exacantos, sin aparato piriforme A la unin de las cpsulas, estas no son contnuas

o o

Miden de tamaos diferentes Son de formas a las y colores

Pseudoparsito
o

diferentes parasitarias.

evidencias

Pueden ser semillas, restos de pastos, restos de gramineas etc.

PRACTICA N 3
METODOS CUANTITATIVOS POR MUESTRO FUNDAMENTO La concentracin de elementos parasitarios en las deposiciones depende primariamente del nmero de parsitos que existen en el hospedador, pero est influido grandemente por una gran cantidad de factores. Probablemente los ms importantes de parte del parsito son la especie, edad, proporcin de juveniles; y los factores ms importantes de parte del hospedador probablemente hospedador. Muchas veces es conveniente conocer la carga parasitaria. Para ello se realizan determinaciones cuantitativas, que proporcionan la intensidad del parasitismo, expresado en nmero de huevos por gramo de heces. Hay varios mtodos de coprologa cuantitativa. Uno de los ms conocidos es el que emplea la cmara de recuento, diseada por McMaster; que es el mtodo estndar de anlisis cuantitativo de huevos en heces (es una modificacin de la tcnica de flotacin). Existen diversas modificaciones de la tcnica, todas ellas basadas en el mismo principio; cada laboratorio son la edad, resistencia, y dieta del

debera establecer sus propias normas para realizar esta tcnica e interpretar los resultados obtenidos. La cmara de McMaster consiste en un portaobjetos que tiene pegado a 1.5 mm de altura un cubreobjetos, de menor anchura, que forma dos cmaras. Encima de cada cmara est grabada una cuadrcula, de 10 mm de lado, de tal modo que el volumen bajo cada cuadrcula es de 1 x 1 x 0.15 = 0.15 ml. CMARA DE MCMASTER

MTODO MC MASTER: PRIMERA MODIFICACION

MATERIALES o Microscopio o Balanza de precisin o Muestra de heces o Solucin saturada de sacarosa de Sheather o solucin azucarada o Cmara McMaster o Mortero con su respectivo mango o Bagueta de vidrio o Gotero o Frasco graduado o Embudo colador PROCEDIMIENTO 1. Homogenizar 3 grs. de heces en 42 ml de agua desmineralizada (utilizar mortero para heces duras).

2. Tamizar y filtrar para depositarlo luego en un tubo de prueba y llevarlo a centrifugar 3. Dejar sedimentar por 30 minutos centrifugar 1,000 rpm / por 1 minuto. 4. Eliminar el sobrenadante y remplazarlo con la solucin saturada de azcar (15ml), Agitar el tubo y con un gotero llenar la cmara de Mc Master. 5. Esperar por 3 o 5 minutos con el objetivo de que los huevos asciendan o floten a la superficie del lquido (cara inferior de la lmina superior de la cmara) 6. Llevar el microscopio, 7. Enfocar la superficie superior del lquido (donde se vean algunas burbujas microscpicas) donde puede verse las lneas de las cmaras bien enfocadas, luego efectuar el conteo dentro del recuadro de lectura, a un aumento de 10X. 8. Guiado por las lneas, cuente el nmero de elementos parasitarios en el cuadro de cada cmara. Mantenga registros separados para cada clase de elementos que pueda reconocer (tipo de huevo, quiste, u ooquiste). 9. De los nmeros que obtenga, calcule los hpg para cada elemento diagnstico.

Interpretacin
a) . Si en 45 ml.3 g/heces 15 mlX X= 1 g b) Si en 15 ml.1g/heces 0.15 mlX X= 0.01 g c) Entonces: o 0.15 ml. Representa la centsima parte de 15 ml. o 0.01 gr. Representa la centsima parte de 1gr./heces

d)

Finalmente el factor de correccin para cada rea de lectura ser 100: pero cuando la lectura se efecta en las 2 reas el factor ser 50.

Pero tambin se puede utilizar una frmula, la misma que es de la forma siguiente: HPG: (N de huevos en 1 rea) + (N de huevos en el 2 rea) X 100 2 HPG: (N de huevos en 1 rea) + (N de huevos en el 2 rea) X 50 HPG: (N de huevos en 1 rea) X (100) e) Como control, es conveniente llenar ambas cmaras con la misma solucin y contar separadamente cada cmara. Si la diferencia es ms de 15% uno puede suponer que los elementos parasitarios no estaban homogneamente repartidos en la superficie original.

METODO MCMASTER: SEGUNDA MODIFICACION PROCEDIMIENTO

1. Homogenizar 2 grs. de heces en 28 ml de solucin saturada de azcar (hasta completar un volumen de 30 ml.) 2. Filtrar el homogenizado a travs de un tamiz (embudo colador), u otro recipiente, que generalmente es un tubo de 15 ml. 3. Agitar ese filtrado con bagueta de vidrio y con un gotera llenar la cmara de Mc.Master 4. Esperar por 3 o 5 minutos con el objetivo de que los huevos asciendan o floten a la superficie del lquido (cara inferior de la lmina superior de la cmara) 5. Llevar el microscopio, 6. Enfocar la superficie superior del lquido (donde se vean algunas burbujas microscpicas) donde puede verse las lneas de las cmaras bien enfocadas, luego efectuar el conteo dentro del recuadro de lectura, a un aumento de 10X.

7. Guiado por las lneas, cuente el nmero de elementos parasitarios en el cuadro de cada cmara. Mantenga registros separados para cada clase de elementos que pueda reconocer (tipo de huevo, quiste, u ooquiste). 8. De los nmeros que obtenga, calcule los hpg para cada elemento diagnstico. INTERPRETACION: d) . Si en 30 ml.2 g/heces 15 mlX X= 1 g e) Si en 15 ml.1g/heces 0.15 mlX X= 0.01 g

f)

Entonces: o o 0.15 ml. Representa la centsima parte de 15 ml. 0.01 gr. Representa la centsima parte de 1gr./heces

d)

Finalmente el factor de correccin para cada rea de lectura ser 100: pero cuando la lectura se efecta en las 2 reas el factor ser 50.

Pero tambin se puede utilizar una frmula, la misma que es de la forma siguiente: HPG: (N de huevos en 1 rea) + (N de huevos en el 2 rea) X 100 2 HPG: (N de huevos en 1 rea) + (N de huevos en el 2 rea) X 50 HPG: (N de huevos en 1 rea) X (100) Para recomendar o no un tratamiento, es necesario correlacionar el numero de huevos por gramo de heces (HPG), con el estado de salud del animal.

Sin embargo, el HPG es de un valor relativo pudiendo ser significativo y esta condicionada a los sntomas clnicos de los animales su historia. Nivel alimentario, edad, sexo, raza, medio ambiente, la patogenicidad de los parsitos y otras caractersticas propias del hospedador y parasito. Por otro lado, en la interpretacin debe tener presente que las formas inmaduras ocasionan daos considerables y estas no estn considerados en el montaje de huevos. Sin embargo, se han reportado relaciones entre patogenicidad y huevos por gramo de heces en ovinos y bovinos
PARSITOS GENERO OVINOS MODERADA SEVERA BOVINOS MODERADA SEVERA

Haemonchus sp. Ostertagia spp. Trichostrongylus axei Trichostrongylus spp. Cooperia spp. Nemathodirus spp. Bunostomum spp. Oesophagostomun spp. Chabertia sp. Strongyloides sp. Nematodos mezclados Fasciola hepatica

2000 3500 200 1000 100 500 50-100 1000 200 1000 50-200

8000 2000 3000 500-2000 300-600

200 600 200 50 300 200-500

1000 500 400-800 500-1000 3000-10000 300-500 1000 700 30-50

20-200 3000 150-500 300-1000 1000 2000 200-400 200-500 10-25

Pero en general en el montaje se consideran valores significativos los siguientes: o Huevos tipo strongylus ..1.000 HPG o Huevos tipo nematodirus...600 HPG o Huevos tipo Ascaris (neoascaris).800 HPG o Huevos tipo Trichuris..800 HPG o Ooquistes de Eimeria 800 1000 OPG Valores superiores a los indicados, significan que los animales deben recibir tratamiento, debido a que existen manifestaciones clnicas. Sin embargo deber tenerse muy en cuenta el tipo de explotacin, as como los sistemas de manejo principalmente, referidos a las comunidades campesinas, donde la implementacin de las dosificaciones principalmente en alpacas y llamas, mayores de dos aos, serian funestos si es que su implementacin esta solo

referido a desparasitar y no se toma en consideraciones el binomio MEDICAR Y ROTAR., As como se rompera la resistencia natural de esta especie y se creara nueva dependencia a los frmacos.

EFECTIVIDAD DE LA TECNICA DE MAC MASTER

En los Camlidos Sudamericanos, la efectividad de esta tcnica para los strongylidos es: Con 01 examen : de 0 a 41.67% de efectividad Con 03 exmenes : de 800 91.67% de efectividad Con 06 exmenes: de 100% de efectividad

Para Eimerias es: Con 01 examen : de 0 a 41.6 % de efectividad Con 03 exmenes : de 77 a 87.50 de efectividad Con 05 exmenes : de 86.670 95.83% de efectividad Con 08 exmenes : de 100% de efectividad

Para vacunos: son necesarios 15 exmenes seriados, para tener una efectividad del 100%

CORRECCION A LA CUENTA DE LOS HUEVOS EN HECES

Para heces blandas, el factor ser..1.5 Para heces muy blandas, el factor ser .2.0 Para heces diarreicas, el factor ser4.0

PRACTICA N 4 METODO CUANTITATIVO POR MUESTREO STOLL MODIFICADO FUNDAMENTO

El fundamento de este mtodo es la misma que la del mtodo de McMaster; es decir, permite efectuar un anlisis cuantitativo de huevos en heces (es una modificacin de la tcnica de flotacin), con lo cual podemos determinar el grado de infeccin parasitaria, para recomendar o no un tratamiento, y correlacionarlo el numero de huevos por gramo de heces (HPG) con el estado de salud del animal. Sin embargo, el HPG con el mtodo de Stoll, sigue siendo un valor relativo pudiendo ser significativo; y esta condicionada a los sntomas clnicos de los animales su historia, nivel alimentario, edad, sexo, raza, medio ambiente, la patogenicidad de los parsitos y otras caractersticas propias del hospedador y parasito. Este mtodo es til para casos de huevos de peso elevado, as como, cuando no se disponga de cmaras McMaster.

MATERIAL
o o o Pipeta de 0.5 ml graduada del dcimo una jeringa de tuberculina de 0.5 ml de capacidad. Lamina porta objetos Lamina cubre objetos

o o o o o o o o

Muestra de heces positiva Balanza Solucin saturada de azcar Mortero con su respectivo mango Frasco graduado Embudo colador Bagueta de vidrio Microscopio

PROCEDIMIENTO
1. Homogenizar los 2 gr de heces en 28 ml de solucin saturada de azucarada, hasta completar un volumen de 30 ml 2. Filtrar el homogenizado, a travs de un tamiz (embudo colador) a otro

recipiente que generalmente es un tubo de 15 ml. 3. Agitar este filtrado con la ayuda de una bagueta de vidrio y con la ayuda de la pipeta graduada o la jeringa de tuberculina, separar 0.15 ml. 4. Depositar en el porta objeto y cubrir con una o dos laminillas cubre objetos, llevando luego al microscopio. 5. Efectuar el contaje en todo el campo de la(s) laminilla cubreobjetos, a un aumento de 10X, y los resultados se expresan en forma de HPG.

INTERPRETACION
Es idntico al mtodo de MC Master, o sea:
Si en 30 ml.2 gr/heces 15 mlX Si en 15 ml.1gr/heces 0.15 mlX X= 0.01 gr. X= 1 gr.

Entonces:

o 0.15 ml. Representa la centsima parte de 15 ml. o 0.01 gr. Representa la centsima parte de 1gr./heces Finalmente el factor de correccin para el rea de lectura ser 100 Pero tambin se puede utilizar una frmula, la misma que es de la forma siguiente: HPG: (N de huevos en el rea de lectura) X (100)

METODOS CUANTITATIVOS POR MUESTREO DENNIS MODIFICADO. FUNDAMENTO

Es un mtodo de sedimentacin lenta, basado en la mayor densidad de los huevos de los tremtodos que el detritus que se hallan en las heces, lo que permite concentrarlos en el sedimento tras repetidos lavados. La adicin de un colorante de contraste al sedimento permite destacar el color amarillento dorado de los huevos. En general es un mtodo que diseado especialmente para Fasciola, cuyos huevos requieren de un tratamiento cuidadoso y no se le debe someter a presiones por ejemplo de centrfuga, que tiende a destruirlo. Aunque tambin, con este mtodo se puede detectar huevos de Paramphystomum y Metastrngylus.

MATERIALES
o o o o o Solucin detergente a una proporcin de 1: 1000 (1 gr de detergente por un litro de agua desmineralizada). Mortero (si las heces estn en forma de pelets) Embudo metlico de 3.5 pulgadas de dimetro, con un filtro metlico de 60 a 80 hilos por pulgada (si se v a utilizar tubos de prueba) Tubos de prueba de 75 ml. o copas de precipitacin Una bagueta de vidrio

o o o o o

solucin de lugol parasitologico (lugol fuerte) Placa petri con fondo rayado a intervalo de 0.5 cm de distancia Gradilla para tubos (si se usa tubos o copas de precipitacin) Muestra de heces 100 gr Microscopio estereoscpico.

PROCEDIMIENTO
1. De una muestra de 100 gr. bien mezclada, tomar en un mortero 3 gr de heces. 2. Homogenizar o triturar las heces con 50 ml de solucin detergente (si es pastosa) o desmenuzarlo en el mortero (si es en forma de pelets), agregando progresivamente los 50 ml. de solucin de detergente, tratando de no hacer espuma 3. Con la ayuda de un embudo, tamizar a un tubo de prueba o vaso de precipitacin 4. Dejar sedimentar por 15 minutos (10 a 12) y luego eliminar el sobrenadante. 5. Resuspender el sedimento con otros 50 ml. de solucin de detergente y repetir el paso anterior 2 a 3 veces mas hasta obtener un liquido claro 6. Luego de eliminado el ltimo sobrenadante agregar al sedimento 4 a 6 gotas de lugol parasitologico. 7. Verter la solucin a una placa petri y observar al microscopio o tambin al estereoscopio. 8. El resultado se puede expresar en N de huevos por gramo de heces. 9. El hallazgo de 300 a 600 HPG en ovinos y entre 100 a 200 en vacunos, indica una infeccin probablemente patgena, que requiere la aplicacin de un fasciolicida.

INTERPRETACIN
1. Si encontramos 10 huevos de Fasciola heptica En 3 gr./ heces --------10 huevos 1 gr./heces----------- X X= 3 huevos /gr/heces.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE LA FASCIOLA HEPATICA Y SUS FORMAS EVOLUTIVAS

Fasciola hepatica 1. El tamao es variable, dependiendo su estado de desarrollo: . Adultas: 20 a 30 mm X 3 a 8 mm. . Juveniles: 10 a 20 mm X 1 a 3 mm. . Inmaduros: 5 a 10 mm X 0.8 a 1 mm.
1. Cuerpo aplanado, en forma de hoja, con proyeccin cnica anterior, luego se ensancha en forma de hombros, para luego en la parte posterior adelgazar a una forma puntiaguda. Color pardo amarillento o caf pardusco. La parte dorsal (epidermis), est cubierto de espinas crneas. En la cara ventral se observa 2 ventosas: una oral y otra ventral, ambas se encuentran separadas de 3 a 5 mm., y en medio de estas el poro genital comn y el cirro que es muy pequeo. Se observa tambin una zona blanquecina central, ocupada casi en su totalidad por los testculos que son muy ramificados; a los lados tiene un color gris que son las glndulas vitelgenas. Detrs de las glndulas vitelgenas se encuentran los intestinos ramificados, que toman un color oscuro, por la presencia de sangre digerida en su interior. En el tercio anterior se observa tambin las flexuosidades que forma el tero, a manera de roseta, llena de huevos, de un color amarillo intenso. Por detrs del tero se observa una zona redondeada ocupada por la glndula coclear.

2. 3. 4.

Caractersticas de los huevos de Fasciola 1. Son de tamao grande, es decir miden de: 150 X 80 . 2. Son de un color caf amarillento. 3. Son de forma ovalada. 4. En uno de los polos presenta un pequeo oprculo. 5. En su interior se encuentra gran cantidad de clulas vitelgenas poligonales. Y en medio de estas clulas se observa un ovulo fecundado, oscuro y situado ms cerca de uno de los polos, y que ms tarde va a dar origen al embrin o larva miracidio. 6. En su interior no existe cmara de aire, por estar llenas de clulas vitelgenas.

Caractesticas del Miracidio 1. Miden en promedio de 130 X 30 . 2. Son de forma piriforme, con el extremo anterior ms ancho que el posterior. 3. El cuerpo est cubierto de por una capa de cilios o pestaas vibrtiles (rgano de locomocin). 4. En su extremo anterior, ms ancho, se observa una prolongacin cnica, aguda, desprovista de cilios, el que se le denomina el espoln ceflico o papila protoplasmtica. Y cerca del extremo anterior se observa dos manchas oculares, cuyo pigmento oscuro tiene forma de una pequea letra x que es de naturaleza sensorial Caractersticas del Esporozoito 1. Es una pequea bolsa de tejido, sin forma especial, pero se indica que generalmente son de forma alargada o irregular. 2. Mide aproximadamente 150 . 3. Su interior se encuentra llena de clulas germinales voluminosas, cuya multiplicacin origina a las redias. Cractersticas de las Redias 1. Miden de 1.3 a 1.6 mm de longitud. 2. Tienen forma alargada, y se parece bastante aun pequeo gusano. 3. Estn provistas de boca, una faringe musculosa y un corto intestino ciego. 4. Poseen 2 protuberancias que se proyectan de los lados y forman los denominados collares.

5. Presentan 2 apndices laterales en la porcin posterior, a manera de flecos. 6. En su interior hay gran nmero de clulas germinales, cuya multiplicacin origina las redias hijas o las cercarias.

Caractersticas de las Cercarias 1. El cuerpo mide de 0.25 a 0.35 mm. 2. Tienen una porcin anterior gruesa, tambin denominada cuerpo discoidal. 3. Poseen 2 ventosas claramente observables. 4. Poseen una cola larga, cuyo tamao es el doble del cuerpo, mediante cuyo movimiento pueden nadar.

Caractersticas de las Metacercarias 1. Miden aproximadamente 0.25 mm de dimetro 2. Sobre las hojas de las plantas, se les puede apreciar como pequeos puntitos a la observacin directa. 3. son de forma esfricos o redondeadas. 4. Son de color blanco nacarado o amarillento.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DEL HOSPEDADOR INTERMEDIARIO DE LA Fasciola hepatica CARACTERSTICAS DE: Lymnaea truncatula
1. Tiene un tamao pequeo que vara de 0.3 a 1 cm. 2. Poseen un color pardo que va del tono claro al oscuro. 3. Viven generalmente en el lodo (caracol aerobio del lodo), aunque tambin se les puede encontrar en el aguadulce. 4. Su caparazn o concha del caracol tiene un nmero de espirales de 5 a 6 vueltas, los mismos que son profundas entre ellas y tienen forma de torre, son de punta

roma, y son bastante aplanadas. 5. El primer espiral, comenzando de la parte anterior corresponde a la entrada de la caparazn, la misma que se encuentra aproximadamente a la mitad de la altura de toda la concha. 6. Son dextrgenas, o sea que giran en el sentido de las agujas del reloj

GUIA DE PRACTICAS N 5 METODO PARA RECUPERAR E IDENTIFICAR LARVAS DE NEMATODES FUNDAMENTO

La obtencin de L1 a partir de muestras fecales por procedimientos de migracin larvaria como el Baerman Wetzel, es un procedimiento habitual. Para lo cual las muestras deben tomarse directamente del recto de un nmero representativo de animales del rebao. No hay acuerdo total sobre si el nmero de larvas en heces guarda correlacin con el de vermes adultos en el pulmn. Un reducido nmero de L1 en heces, incluso su ausencia, no siempre se traduce por falta de infeccin, puesto que puede haber perodos inaparentes e incluso, en casos de evolucin aguda pulmonar, las manifestaciones obedecen a larvas o fases inmaduras. Hay variaciones muy marcadas en relacin con el nmero de L1 por gramo de heces; se admite que 40 a 50 larvas indican infecciones dbiles, mientras que si superan las 100 larvas, significa infeccin grave para los terneros.

MTODO DE BAERMAN
Su fundamento es la migracin de las larvas desde la materia fecal hacia la fase acuosa. Para su realizacin se utiliza el aparato de Baerman que consiste en un embudo grande sostenido por un soporte. El pico del embudo se halla provisto de un corto tubo de goma que se cierra mediante una pinza de Mohr o un clamp. Se utiliza para demostrar la presencia de larvas (L1) de strongylidios bronco pulmonares de ovinos, bovinos, camlidos sudamericanos y caprinos, as como larvas de metastrongylos en porcinos. Las heces se deben de tomar directamente del recto, suelo y tejidos. Es el mtodo de eleccin ms eficiente para recobrar larvas infectivas.

MATERIALES
1. Aparato de Baerman 2. Gasa mdica 3. Un pabilo

4. Papel filtro circular de 15 cm de dimetro 5. Tubo de centrfuga cnico. 6. Centrfuga. 7. Tubo de goma de seccin pequea para hacer sifn. 8. Solucin de azul de metileno al 1%. 9. Porta y cubreobjetos o placa Petri rayada en su base. 10. Microsciopio 11. Muestra de heces, tomadas directamente del recto.

PROCEDIMIENTO
1. Pesar 10 a 10 g de heces recientes (20 a 30 g), tambin porciones de tejido pulmonar o filtrado del muestreo del forraje. 2. Colocar la muestra en una doble capa de gasa medica. 3. Anudar las puntas y disponerla a manera de una bolsa amarrada, con un pedazo de pabilo. 4. Depositar la bolsa en el embudo y cubrirlo con agua tibia (26C) 5. Esperar de 18 a 24 horas, para que las larvas migren al medio lquido y por gravedad se depositen en el fondo del tubo de jebe presionado por clamp. 6. Abrir el clamp o pinza de Morht y colectar los primeros centmetros cbicos en un tubo de prueba (10 ml). 7. Sedimentar por 10 minutos o centrifugarlo a 1500 rpm/ por 2 minutos y en el sedimento buscar larvas. 8. Al sedimento de la centrifugacin se le agrega unas gotas de la solucin de azul de metileno que colorea las larvas de Dictyocaulus filaria de un color fucsia a magenta y a las de Dictyocaulus viviparus de un tono lila-violceo. Las larvas de los nemtodos gastrointestinales y de vida libre no se tien metacromticamente como las anteriores, lo cual junto a las tpicas caractersticas morfolgicas permiten reconocer fcilmente a las L1. 9. Si por alguna razn hay demasiado sustancia contaminante que no permita un estudio fcil y detallado de las larvas, se proceder a preparar un nuevo equipo de Baerman, pero esta vez colocar en la superficie del agua tibia un papel filtro, donde se deber depositar cuidadosamente el material que se desea limpiar y esperar otras 12 horas, para recolectar las larvas que activamente han atravesadoel papel de filtro.

OTROS MTODOS PRCTICOS

En caso de utilizar heces de ovinos, caprinos o camlidos, cuyas heces son de forma de pelets, se procede como sigue: 1. Colocar una masa de heces sobre un portaobjetos (en forma de bola comprimida). 2. Realizar una depresin en el centro de la masa fecal, hasta formar un espacio en forma discoidal de 5 cm de dimetro. 3. Agregar varias gotas de agua tibia sobre la muestra. 4. Colocar el porta objetos cerca de una fuente calorfica, que puede ser frente a una ventana con sol o en una estufa, hasta que la larva emigre hacia el lquido. Si fyera necesario agregar mayor cantidad de agua. 5. Despus de 15 a 20 minutos, retirar las heces, colocar un cubreobjeto y observar a un menor aumento Para heces de bovinos y equinos, que normalmente son blandas o para heces diarreicas de ovinos, se procede de acuerdo a la siguiente tcnica. 1. Colocar una cierta cantidad de heces en una placa petri. 2. Mediante una esptula, comprimir las heces hasta formar un disco de 1 cm de espesor. 3. Realizar una depresin en el centro de la masa fecal, por medio de una bagueta de vidrio. 4. Llenar esta cavidad de agua tibia y dejar 15 a 20 minutos, agregando mayor cantidad de agua cuando se crea conveniente. 5. Con un gotero, extraer las gotas que existan en la depresin y llevarla a un portaobjeto, colocar un cubreobjeto y observar a un menor aumento.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE LAS LARVAS DE PRIMER ESTADO (L1) DE LOS NEMTODES PULMONARES
Gnero y especie Dictyocaulus filaria Mide de 550 a 580 y alrededor de 20 de ancho Prominencia protoplasmtica anterior o botn ceflico Sus clulas intestinales se encuentran llenas de grnulos gruesos de materias alimenticias y de aspecto ms oscuro y asimtrica Cola con terminacin cnica roma Larvas de primer estadio (L1)

Dictyocaulus viviparus
Miden de 280 a 360 . Carece de prominencia protoplasmtica en su extremo anterior Granulaciones intestinales oscuras y gruesas Cola con terminacin en punta

Muellerius capillaris Miden de 250 a 300 de largo Extremo posterior ondulado Terminacin de la cola puntiaguda, con un espoln o espina dorsal bien marcado Pocos grnulos

Protostrngylus rufescens Miden de 200 a 200 de largo y de 16 a 18 de ancho Grnulos alimenticios pequeos Extremo posterior presenta una cola cnica con aspecto ondulante.

CULTIVO DE HECES PARA OBTENER LARVAS INFECTIVAS DE NEMATODES

FUNDAMENTO
El control de la nematodiasis gastrointestinal en rumiantes, no se puede desarrollar sin el dominio del ciclo evolutivo de los parsitos, el cultivo en el laboratorio de sus formas evolutivas, infectantes y por consiguiente la diferenciacin de ellos. Sin embargo, en la prctica, la determinacin del tipo de infeccin parasitaria tiene mucha importancia, dado el diferente poder patgeno de las especies y su desigual sensibilidad frente a la accin de los diversos antihelmnticos. El anlisis de materia fecal de los ovinos, caprinos, bovinos, y camlidos, efectuado solamente en base a la cantidad de huevos de nemtodes gastrointestinales, no es completo por que no nos permite diferenciar en muchos casos las especies de parsitos presentes. Varios de ellos tienen huevos microscpicamente muy parecidos y slo los cultivos de larvas, a partir del material en examen, nos permite determinar el porcentaje de cada tipo de larvas presentes, estableciendo as, luego, la cantidad de huevos de cada grupo por gramo de materia fecal. El principio bsico es dejar que los huevos presentes en las heces evolucionen y puedan alcanzar el estado larval, hasta volverse infectante.

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS A CONSIDERAR

Las caractersticas morfolgicas se realizan para orientar la ubicacin y clasificacin dentro de un grupo o de una especie. 1. La envoltura de la segunda muda vaina, nos sirve como punto de referencia para la clasificacin de las larvas infectantes de nemtodos gastrointestinales de los rumiantes. 2. Los orificios naturales (boca, ano) de la larva propiamente dicha estn encerrados por la vaina de la segunda muda que no se ha desprendido, pero son igualmente visibles y nos sirve de puntos de referencia y diferenciacin. 3. La cavidad bucal de las L3 es menor que la de L2, siendo caracterstica para ciertas especies o faltando en otras (por ejemplo en los Trichostrongylus).

4. El esfago de la larva infectante es filiforme, sin pronunciada deformacin bulbosa y sin aparato valvular. 5. Las clulas intestinales dorsales y ventrales, de diferentes formas (triangulares, rectangulares o pentagonales) son bien diferenciables. La cantidad de stas, es caracterstica para cada especie. 6. La cola de la vaina larval, a la distancia que media entre el ano de la larva y la punta de la vaina de la cola. 7. Para la diferenciacin, tambin tiene importancia considerar el largo total de la larva (vaina) y en ciertos casos el del esfago.

CULTIVO DE LARVAS DE NEMATODES GASTROINTESTINALES

Existen varios mtodos de cultivo de larvas, partiendo de huevos de nematodos, que se encuentran en calidad y cantidad variable en las heces, o a partir de huevos obtenidos de hembras maduras de parsitos. Todos los mtodos se basan sobre los mismos principios: permitir que maduren y eclosionen los huevos de nematodos y que desarrollen las larvas, gracias a condiciones favorables, evolucionando hasta larvas infectantes. El xito del cultivo depende de tres factores: humedad, temperatura adecuada y oxigenacin

METODO DE CORTICELLI Y LAI (MODIFICACIN DE ROBERTS Y O'SULLIVAN) Materiales

Placa petri de 10 cm de dimetro Placa petri de 15 cm de dimetro Estufa (tambin se puede hacer al medio ambiente, entonces el tiempo requerido ser mayor). Muestra fecal positivo a nematodos.

Cultivo de larvas de nematodes gastrointestinales

1. En una placa petri pequea (10 cm. Dimetro) colocar aproximadamente 10 grs. de heces. 2. Luego colocar dentro de otra mayor (15 cm dimetro) con agua a altura de 1 cm, La caja menor va sin tapa, la grande, de tal manera que se dispone de una cmara hmeda 3. Encubar en la estufa oscurecida, a temperatura de 24 a 27C durante 7 a 8 das, o en temperatura ambiente (10 a 15C) durante 10 das. Diariamente destaparlo para oxigenarlo durante 1 a 2 horas por da, para airear el cultivo, y adems se deber reponer el agua que se haya evaporado. (El tiempo depende de la especie de nematodos, generalmente para los huevos tipo strongylus es de 10 a 12 das y para los nematodirus y la lamanema de 3 a 4 semanas). 4. Transcurrido este lapso de tiempo, invertir la placa pequea con cultivo en la placa mayor, que queda parcial mente sumergida. 5. Dejar en tal situacin por unas 12 a 24 horas (siempre dentro de la estufa) para permitir la migracin de las larvas hacia la parte liquida. 6. Por sedimentacin o centrifugacin se concentran las larvas. En caso de nematodirus y lamanema, se colectaran los huevos en este momento ya con larvas infectivas, mediante el mtodo cualitativo de concentracin. Los huevos colectados se depositan en un frasco al que se le adiciona perlas de vidrio de 3 a 4 mm de dimetro y mediante la agitacin romper mecnicamente los huevos y dejar en libertad a la larva infectiva. O tambin se puede utilizar un estmulo trmico, sometiendo el cultivo a temperaturas mayores (36 a 38 C) o mediante un cambio brusco alternado, -2C y 21C. De ambas maneras se logra la eclosin de las larvas infectantes incluidas en los huevos.

Recuperacin de larvas de cultivo

En casi todos los mtodos la recuperacin de larvas se obtiene utilizando el clsico aparato de Baerman. Por su hidrotropismo positivo las larvas pasan del material de cultivo al agua. Procedindose de la forma siguiente: 1. El material cultivado se coloca dentro de una bolsita de gasa sumergida en un embudo con agua entibiada.

2. Las larvas caen al fondo y son recolectadas a las 24 horas y posteriormente centrifugadas 3 a 4 minutos a 1,500 revoluciones por minuto

Examen de las larvas recuperadas

El material en examen debe ser lo ms limpio posible, desprovisto de partculas extraas que obstaculicen el campo visual. Para poder apreciar los detalles morfolgicos de las larvas se las debe inmovilizar, utilizando solucin yodoiodurada, las larvas mueren, pero quedan algo incursadas; sin embargo la coloracin de contraste que ellas toman, facilita la observacin de los detalles morfolgicos y permite diferenciar a las larvas infectantes, de los nematodes y larvas de vida libre. Las primeras protegidas por la vaina de la segunda muda, se conservan mas claras, en cambio los ltimos se colorean ntegramente de color marrn claro u oscuro.

Clasificacin
Cooperia (oncophora, punctata, axei)

La mayora de nematodes que infectan a los rumiantes pueden ser diferenciables en base a sus caractersticas constantes, como las mediciones totales y parciales de rganos. As el mtodo de Wertejuk y de Corticelli y Lai, se basan sobre las diferencias morfolgicas de las larvas, principalmente sobre el largo de la cola de la vaina.De esta forma existen tres principales grupos: 1. Larvas con cola de vaina corta Trichostrongylus (axei, colubriformis, vitrinas) Ostertagia (circumcincta, ostertagi)

2. Larvas con cola de vaina mediana Haemonchus (contortus , placei)

3. Larvas con cola de vaina larga Nematodirus (spatiger, filicollis) Oesophagostomum (radiatum, venulosum) Chabertia ovina

4. Larvas con otras caractersticas

Strongyliodes papillosus Bunostomum spp

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE LAS LARVAS INFECTIVAS (L3)

Caractersticas morfolgicas de los Trichostrongylus . Medida del largo total 583 a 785 . Medida del largo del esfago 138 a 181 . Medida del largo cola vaina larval 80 a 110 . La extremidad anterior es muy simple, sin cavidad bucal . Poseen 16 clulas intestinales . La cola de la larva termina en 1 2 protuberancias . Cola de la vaina larval, corta, cnica, aguda

Caractersticas morfolgicas de las Ostertagias . Medida del largo total 780 a 978 . Medida del largo del esfago 140 a 185 . Medida del largo cola vaina larval 122 a 170 . La extremidad anterior presenta una cavidad bucal . Poseen 16 clulas intestinales . Cola de la vaina larval, alargada, puntiaguda, con una desviacin a la altura de la punta de la cola de la larva.

Caractersticas morfolgicas de los Haemonchus . Medida del largo total 600 a 805 . Medida del largo del esfago 119 a 175 . Medida del largo cola vaina larval 119 a 149 . La extremidad anterior presenta una cavidad bucal ovalada. En muchos casos a la altura de la cavidad bucal se observa una pequea plaqueta quitinosa oscura . Poseen 16 clulas intestinales . Terminacin de la cola larval cnica, e muchos casos

arrugada . Cola de la vaina larval, que adelgaza gradualmente, termina en una prolongacin filamentosa.

Caractersticas morfolgicas de las Cooperias . Medida del largo total 666 a 899 . Medida del largo del esfago 140 a 175 . Medida del largo cola vaina larval 97 a 157 . La extremidad anterior presenta una cavidad bucal en forma de pera . Poseen 16 clulas intestinales . En el sitio donde empieza el esfago existe una cinta fibrosa (2 puntos refringentes), que se observa como un solo punto ovalado y grande (caracterstico para cooperias). . Terminacin de la cola larval obtusa, redondeada . Cola de la vaina larval, recta, reducindose en una terminacin filamentosa.

Caractersticas morfolgicas de los Nematodirus . Medida del largo total 940 a 1204 . Medida del largo del esfago 182 a 252 . Medida del largo cola vaina larval 269 a 370 . La extremidad anterior presenta una cavidad bucal, en forma de tubo recto . Poseen 8 clulas intestinales . Cola de la vaina larval, es larga, en forma de ltigo

Caractersticas morfolgicas de los Oesophagostomun . Medida del largo total . Medida del largo del esfago 704 a 857 133 a 160

. Medida del largo cola vaina larval con paredes engrosadas.

209 a 269

. La extremidad anterior presenta una cavidad bucal recta . Poseen una vaina gruesa, floja y ondulada . Poseen 16 a 32 clulas intestinales . Son bastante anchas . Toman el aspecto incursado, despus de la fijacin. . Cola de la vaina larval, alargada y filamentosa

Caractersticas morfolgicas de la Chabertia ovina . Medida del largo total . Medida del largo del esfago . Medida del largo cola vaina larval Oesophagostomun . Poseen 28 a 32 clulas intestinales de forma rectangular 608 a 889 140 a 178 131 a 220

. Morfolgicamente son muy parecidos a los

Caractersticas morfolgicas del Strongyloides sp. . Medida del largo total . Medida del largo del esfago . Medida del largo cola vaina larval 520 a 710 200 a 275 122 a 170

. Esfago muy largo (1/3 del total de la larva y de color claro) . Intestino bastante corto formado por clulas no diferenciables, con oscuras granulaciones. . Cola de la larva Terminal trifurcada (vista de costado parece bifurcada).

Caractersticas morfolgicas de los Oesophagostomum . Medida del largo total . Medida del largo del esfago . Medida del largo cola vaina larval 704 a 857 133 a 160 209 a 269

. Cavidad bucal recta, de paredes engrosadas. . Est provista de una vaina gruesa y floja, que forma bien visible ondulaciones.

. Esfago bastante largo, con ensanchamiento en la parte Posterior. . Poseen 16 a 32 clulas intestinales poco evidentes . Cola de la vaina larval muy fina, larga en proporcin con el largo total de la larva. . Terminacin de la cola de la larva, obtusa.

METODO HARADA Y MORI Fundamento

Es otro mtodo, que se utiliza para efectos de realizar el cultivo de heces para obtener larvas infectivas de nemtodes. Este mtodo es particularmente til en caninos, para obtener larvas de Ancylostoma caninum y Uncinaria stenocephala.

Materiales
Tubo de prueba de 20 ml de capacidad. Tiras de papel filtro (30x150 mm) Esptula Estufa Gradilla o soporte para tubos.

Procedimiento
1. Extender una pequea cantidad de heces en la tira de papel, dejando limpio 4 5 cm de un extremo para sumergirlo en el agua 2. Introducir la tira de papel por el extremo limpio en el tubo de prueba, que tenga 2.5 a 3 cm de agua destilada, filtrada o hervida. El extremo de la tira no deber tocar el fondo del tubo. 3. Tapar el tubo con un tapn de jebe o de corcho.

4. Conservar el tubo durante 8 a 10 das a temperatura ambiente, protegida por un tapn, pero destapndolo diariamente por unos minutos para oxigenarlos. En este tiempo las larvas de strongyloides pueden llegar a ser infectivas filariformis y/o adultos y tos trichostrongylidos a larvas infectivas. 5. Retirar el papel 6. En el lquido buscar las larvas.

METODO DE LA DOBLE W PARA CALCULAR LARVAS INFECTIVAS EN LOS CAMPOS DE PASTOREO Fundamento
Existen tcnicas que permiten determinar el grado de infectividad de las hierbas por larvas de nemtodes (habitualmente nemtodes pulmonares o gastrointestinales); estas tcnicas se utilizan para efectuar estudios epidemiolgicos, cuando se necesita conocer la dinmica de acumulo de larvas en el pasto (nmero de L3 por kilogramo de materia verde). Sin embargo, el recuento de larvas en el pasto no es en s mismo un indicador directo de los brotes de gastroenteritis parasitaria, pero es un indicador del grado de contaminacin de los campos de pastoreo; el que nos permite efectuar un manejo adecuado de los pastizales como la rotacin adecuada de los campos de pastoreo. Este mtodo, se utiliza solo para ovinos y vacunos a excepcin de los camlidos sudamericanos.

Materiales
Bolsas de polietileno Baldes y copas de sedimentacin de 500 ml. Equipo del mtodo de Baerman (opcional)

Procedimiento

1. Recorrer 2 W opuestas en el rea de pastoreo, donde se desea averiguar la fauna helmntica parasitaria.

2. La longitud en pasos de cada W dividirla entre 100 o 50, dependiendo de la extensin del campo y la densidad de la vegetacin. 3. El resultado indicara el nmero de pasos y espacios a recorrer, a cuyo final se colectar la muestra de pastos. Ej. Longitud de 1w = 1000 pasos, 1000 / 100=10; luego cada 10 pasos se colectara la muestra de forraje. 4. La coleccin del forraje consiste en tomar un puado de la parte foliar de los 4 costados en que se detiene el coleccionista y depositarlas en bolsa de polietileno. Al final se disponen las muestras de una a otra muestra (w), procesndolas independientemente y el resultado es el promedio de ambas w. 5. Del forraje muestreado se pesa y se deposita en un balde, se cubre con agua corriente (tibia), y se lava vigorosamente. 6. Se deja sedimentar por alrededor de 1 hora, luego del cual se transfiere el forraje a un a un segundo balde, donde se vuelve a lavar y sedimentar por otra hora, despus de la cual se retira y descarta el forraje. 7. El sedimento de uno y otro balde, se tamiza por malla de 30 hilos por pulgada (se coloca a una gasa medica amarrndola y pasar a la copa de Baerman). 8. El filtrado se deposita en la copa de sedimentacin por alrededor de 1 hora y el sedimento se procesa mediante el mtodo de Baerman, para recuperar las larvas.

9. En el sedimento existir larvas de vida libre, larvas parasitarias de primer y segundo estadio (esfago rabditiforme), y larvas infectivas parasitarias (L3) (esfago filariforme y muda retenida), Para efectos de facilitar el estudio se adiciona unas gotas de lugol dbil que mata y colorea a las del esfago rabditiforme y colorea menos y mantiene alguna motilidad a las del esfago filariforme. 10. Los resultados se expresan en nmero de larvas por kilogramo de forraje.