Universidad Politcnica de Tlaxcala

8 A Ing. BIOTECNOLOGIA

Integrantes: Karla Yasmin Galindo Rodrguez Candy Paola Cano Barrera Gnesis Marina vila Sevilla Yordano Ramrez Barrera Ismael Garca Bello Rodolfo Ayotzin

Profesor: Amado Israel Grandes Blanco

Materia: Procesos de Bioseparacin

INTRODUCCION Granada La granada (Punica granatum L.) es el fruto del rbol llamado granado, perteneciente a las familia de la Punicceas. Es un pequeo rbol que apenas supera los seis metros, caducifolio y muy resistente a condiciones de sequa. Sus flores hermafroditas son anaranjadas casi escarlatas, muy grandes y vistosas. Su fruto es una gran baya, que en su interior contiene numerosas semillas llamadas arilos, de un espectacular color dorado que se vuelve granate brillante cuando madura. Su pulpa es jugosa con un sabor ligeramente cido. Las mejores granadas son aquellas que presentan un color rojo profundo a marrn y sin grietas ni roturas. Curiosamente, la zona donde le toca el sol es la que se vuelve de color amarillento y no rojo. Las que son pequeas normalmente estn secas, leosas y acres. Conforme ms grande sea el fruto, la pulpa ser ms jugosa y ms zumo tendr. La parte externa debe de estar bien lisa y brillante, exenta de marcas. Se dice que la fruta est madura cuando presionndola un poco emite un ruido metlico.

ANTOCIANINAS Las antocianinas tienen un carcter antioxidante, por lo que su consumo puede suponer un beneficio para la salud. Por cuanto disminuyen los niveles de colesterol (inhibiendo su sntesis), proveen proteccin contra las enfermedades cardacas y previenen ciertos tipos de cncer. Qumicamente son miembros del grupo de los polifenoles, tambin llamados vitaminas el siglo XXII por sus efectos beneficiosos. Los pigmentos vegetales se pueden clasificar en cuatro grandes grupos, dos liposolubles: clorofila y carotinoides, y dos hidrosolubles: las betalainas y los flavoniodes, los cuales, como ya se ha mencionado, se encuentran principalmente en flores y frutos. Las coloraciones de las antocianinas varan con el cambio de pH, de rojo en medio acido, pasando por amarillo, a violeta y azul en medio alcalino (Lock, 1994). Los colores rosa, rojo, azul, malva y violeta de las flores, frutas y verduras, se deben a la presencia de antocianinas. Las antocianinas, al igual que otras sustancias polifenolicas, se encuentran en la

naturaleza en forma de glucsidos, siendo conocidas sus agliconas como antocianidinas. Se trata de flavonoides, es decir, sustancias derivadas del ncleo flavano (Daz de Villegas, 1986).

Antecedentes: HISTORIA Y SIMBOLISMO El nombre cientfico de la granada, es Punica granatum. Punica le fue atribuido por los romanos, ya que este arbusto fue introducido en las zonas mediterrneas por los cartagineses durante las Guerras Pnicas y granatum a lo referente a la densidad de granos que est lleno el fruto. Es originaria del Oriente Medio, pero despus se extendi hacia el este de la China y al oeste de frica. Los rabes fueron los que la introdujeron en Espaa, citndola ya en el siglo XIII Gonzalo de Berceo en uno de sus poemas, donde la llama milgrana (milgranos), por la abundancia de sus semillas. Las granadas proliferaron sobretodo en el sur de la Pennsula, donde finalmente la ciudad de Granada tom este nombre. Con la conquista de Amrica, los colonos espaoles llevaron esta fruta al continente. No se sabe si este rbol se cultiv con xito en Nuevo Mxico en la poca colonial, pero actualmente, su cultivo s que est generalizado en las zonas de Sudamrica y el sur de Estados Unidos. Ha sido una fruta como un gran smbolo religioso, mtico y metafrico a lo largo del tiempo, y su historia, se remonta varios siglos antes de Cristo. Se la considera un smbolo de fertilidad, de nacimiento y de vida eterna por su gran nmero de semillas en su interior. JUSTIFICACION El proyecto surge por la necesidad de utilizar antioxidantes de origen natural por lo tanto nosotros elegimos obtenerlos a partir de la granada ya que estudios recientes han demostrado que tienen una mayor capacidad antioxidante con respecto a la uva, Jamaica y te verde. Se pretende ampliar el mercado de la granada en el estado de Tlaxcala dndole un valor agregado a este fruto y as contribuir a la economa de los agricultores.

Objetivo: Extraccin y estabilizacin de antioxidantes de origen natural para su aplicacin en industria farmacutica. Metodologa: DETERMINACION DE FENOLICOS TOTALES La concentracin de fnolicos totales solubles presentes en las diferentes fracciones, se determino con base en el mtodo de Folin-Ciocalteau descrito por Aberson y Simon, 2001. El reactivo folin-Ciocalteau es una mezcla de cidos de coloracin amarilla. Estos compuestos se reducen al interaccionar con los compuestos fenlicos dando origen a xidos de coloracin azul, los cuales exhiben una amplia absorcin de luz, con un mximo a 760nm. La intensidad de la absorcin de la luz a esa longitud de onda, es proporcional a la concentracin de compuestos fenlicos. Determinacin en extractos de granada: Se colocan en un tubo de ensayo 50l de extracto y 2.5 ml de reactivo de Folin-Ciacalteau. Se mezclaron perfectamente y despus de 3 minutos, se incorporaron 5ml de carbonato de sodio (Na2CO3) al 20% y dejan en obscuridad durante 20 minutos despus se toman las lecturas de absorbancias en el espectrofotmetro a 760nm. Las pruebas se realizaron por triplicado. Resultado: El valor de Absorbancia obtenido para cada una de las muestras evaluadas, se sustituyo en la ecuacin de la curva estndar de acido glico.

CONCENTRACION PPM 0 50 100 150 200 250

1.4 1.2 1 ABS 760nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 100

ABS A 760 nm 0 0.28 0.5 0.78 0.96 1.18

Y= 0.0043X+ 0.0694 R2= 0.9957

ABS A 760 nm Linear (ABS A 760 nm)

200

300

Concentracion

AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3

ABS 0.5839 0.4713 0.3795 ABS 0.7376 0.7233 0.7471 ABS 0.519 0.5727 0.7774

Longitud de onda 760nm

Media 0.47823333

Concentracin PPM 119.6511628 93.46511628 72.11627907 Concentracin PPM 155.3953488 152.0697674 157.6046512 Concentracin PPM 104.5581395 117.0465116 164.6511628

Longitud de onda 760nm

Media 0.736

Longitud de onda 760nm

Media 0.62303333

APIZACO AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3 TLAXCALA AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3

ABS 1.3169 1.3063 1.2466 ABS 0.8615 0.9217 0.7772 ABS 1.0385 1.1427 0.9153

Longitud de onda 760nm

Media 1.28993333

Concentracin PPM 290.1162791 287.6511628 273.7674419 Concentracin PPM 184.2093023 198.2093023 164.6046512 Concentracin PPM 225.372093 249.6046512 196.7209302

Longitud de onda 760nm

Media 0.85346667

Longitud de onda 760nm

Media 1.03216667

ABS 1.3475 2.1171 1.3475 ABS 0.538 0.4067 0.411 ABS 0.501 0.524 0.4441

Longitud de onda 760nm

Media 1.60403333

Concentracin PPM 297.2325581 476.2093023 297.2325581 Concentracin PPM 108.9767442 78.44186047 79.44186047 Concentracin PPM 100.372093 105.7209302 87.13953488

Longitud de onda 760nm

Media 0.4519

Longitud de onda 760nm

Media 0.4897

DETERMINACION DE ANTOCIANINAS MONOMERICAS TOTALES La determinacin de antocianinas monomericas totales se llevo a cabo de acuerdo a la metodologa descrita por Giausti y Wrolstad (2001). Esta se basa en las transformaciones estructurales que sufren las antocianinas monomericas con un cambio en el ph; estos compuestos adquieren la conformacin de catin flavillo (color rojo intenso) a ph 1 y la forma hemicetal (incolora) a ph 4.5. Determinacin en extractos granada: Para las determinaciones en los extractos de granada, en un tubo de ensayo se colocaron 7ml de solucin buffer ph=1 y en otro tubo, se colocaron 7ml de solucin buffer=4.5.

Posteriormente, se aadieron 200 l de extracto de granada a cada tubo, se cubrieron con papel parafilm y se agitaron. Para cada solucin, se midi la Absorbancia a 520nm (longitud de onda de mxima Absorbancia de las antocianinas) y a 700nm en un espectrofotmetro UV-visible usando agua destilada como blanco. La Absorbancia final se calculo de acuerdo a la siguiente ecuacin:

RESULTADOS AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3 Antocianinas monomericas 62.50425963 55.13003212 53.16357145

0.8137 0.7177 0.6921

56.9326211 4.92433844

0.6589 0.4483 0.5389

50.61331777 34.43610617 41.39553338

42.1483191 8.11483571

0.8848 0.9195 0.8217

67.96579688 70.63127286 63.11877859

67.2386161 3.80867253

RESULTADOS AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3 Antocianinas monomericas 42.85501591 35.54454474 49.49182067

0.5579 0.46273 0.6443

42.6304604 6.976349

0.6169 0.5661 0.6287

47.38709323 43.48489784 48.2935087

46.3884999 2.55510783

0.7804 0.7883 0.8714

59.94632446 60.55316193 66.93647762

62.4786547 3.872493

MEDICION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE La actividad antioxidante se determino mediante tecnologa ABTS desarrollada por Re et al. (1999) y modificada por Kuskoski et al. (2004). Determinacin en extractos de granada: Se diluyeron 150 L de radical ABTS con 15mL de etanol absoluto en un vaso de precipitado cubierto con papel aluminio, para obtener una Absorbancia de 0.70 +- 0.20 a 754nm en un espectrofotmetro UV-visible. Resultados:

PRUEBA DE ABTS EN GRANADA APIZACO ABS. SOLUCION TRABAJO 0.698nm

AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3 TLAXCALA AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3

ABS 0.2146 0.3289 0.2694 ABS 0.0329 0.0937 0.2539 ABS 0.1391 0.0286 0.0491

Longitud de onda 734nm

Resultados % de inhibicin Media 69.25501433 61.17956065 52.87965616 61.40401146 Resultados % de inhibicin 81.82903534 95.28653295 86.57593123 63.62464183 Resultados % de inhibicin Media 80.07163324 89.64660936 95.9025788 92.96561605

Longitud de onda 734nm

Longitud de onda 734nm

ABS 0.3082 0.2808 0.1737 ABS 0.1274 0.0416 0.0378 ABS 0.0517 0.279 0.0952

Longitud de onda 734nm

Resultados % de inhibicin Media 55.84527221 63.57688634 59.77077364 75.11461318 Resultados % de inhibicin Media 81.747851 90.12416428 94.04011461 94.58452722 Resultados % de inhibicin Media 92.59312321 79.66093601 60.0286533 86.36103152

Longitud de onda 734nm

Longitud de onda 734nm

PACHUCA AGUA 1 2 3 METANOL 1 2 3 ETANOL 1 2 3 ABS 0.2955 0.1122 0.3333 ABS 0.2031 0.1551 0.1551 ABS 0.1194 0.0269 0.0409 Longitud de onda 734nm Resultados % de inhibicin Media 57.66475645 64.61318052 83.92550143 52.24928367 Resultados % de inhibicin Media 70.9025788 75.48710602 77.77936963 77.77936963 Resultados % de inhibicin Media 82.89398281 91.06017192 96.14613181 94.14040115

Longitud de onda 734nm

Longitud de onda 734nm