MTODOS ELECTROFORTICOS

La electroforesis es un mtodo analtico en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su relacin tamao a carga elctrica, usndose como base una matriz gelatinosa. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son posicionadas en un campo

elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las

molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el (polo negativo) y ctodo aquellas

cargadas positivamente se desplazarn hacia el nodo (polo positivo), ver figura. El soporte sobre el que tiene lugar el desplazamiento de las especies es un gel de poliacrilamida, este tipo de anlisis se caracteriza porque: La migracin es proporcional a la carga neta, el tamao y la forma de la protena. Los geles son qumicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza inica. Los geles de poliacrilamida (PAGE) se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecruzador, la bis-acrilamida, en presencia de un iniciador (TEMED (N,N,N,N-tetrametilnediamina) y como catalizador el in persulfato (S2O8- ), que se aade en forma de persulfato amnico.

En funcin del estado de las protenas (nativo o desnaturalizacin) a lo largo del proceso electrofortico, stas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes: o En una electroforesis desnaturalizante, es la que somete a las protenas a migracin asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. o En una electroforesis nativa a las protenas se les somete a una migracin sin desnaturalizacin. En esta situacin las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Adems se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre protenas, separndose los complejos.

Los tipos de electroforesis, usadas en el Laboratorio Control de Dopaje son; Electroforesis en geles de poliacrilamida por Isoelectroenfoque (IEF-PAGE) y Electroforesis en geles de poliacrilamida por SDS-PAGE. Ver figura siguiente.

CERA

rhEPO

NESP DyEPO

Anlisis por IEF

Anlisis por SDS-PAGE

El uso de la electroforesis por IEF-PAGE est limitado a molculas que pueden estar cargadas positivas o negativamente. Protenas, enzimas y pptidos son molculas anfteras. La carga neta de una protena es la suma de todas las cargas positivas y negativas de la cadena lateral de aminocidos, pero la configuracin de la protena tambin juega un papel. Para protenas tales como glyco- o nucleoprotenas, la carga neta est tambin influenciada por el azcar o por el grupo funcional del cido nuclico. La degradacin de la fosforilacin tambin tiene una influencia sobre la carga neta. El

Isoelectroenfoque es uno de los mejores procedimientos para el aislamiento de protenas. El anlisis por electroforesis con SDS, se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes (beta-mercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro, SDS que desnaturaliza y recubre a la protena), y se separan como cadenas polipeptdicas aisladas. El SDS es un detergente de accin desnaturalizante que se une a las cadenas polipeptdicas

desnaturalizadas con una relacin de 1,4g de SDS por gramo de protena, unindose una molcula de SDS por cada dos aminocidos de la cadena. sta unin masiva de molculas de SDS bloquea la carga propia de la molcula de protena y le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa, haciendo que todas las protenas acomplejadas con SDS viajen hacia el nodo.