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La gripe aviar pone de relieve la necesidad de nuevas tcnicas de vacunacin que permitan el rpido diseo y la produccin de vacunas seguras

y eficaces. Una plataforma ideal sera capaz de inducir anticuerpos protectores y potentes respuestas inmunes celulares. Estas ventajas potenciales de las vacunas de ADN no son aprovechadas debido a una falta de eficacia en estudios con animales grandes y en los ensayos en humanos. An quedan preguntas respecto a la utilidad potencial de la respuesta inmune celular contra el virus de la gripe en los primates. En este estudio, mediante la optimizacin de constructo y la electroporacin in vivo de antgenos codificados por ADN sintticos, se observ la induccin de respuestas inmunes celulares y humorales de reaccin cruzada individualmente capaces de proporcionar proteccin contra la infeccin por virus de la gripe en el macaco rhesus. Estos estudios avanzan el campo de las vacunas de ADN y proporcionan una nueva vacuna, ms tolerable con amplia inmunogenicidad de virus de la gripe aviar. Este enfoque parece importante para una mayor investigacin, incluyendo estudios con humanos. el virus de la gripe H5N1 infecta principalmente las vas respiratorias inferiores (LRT) de los seres humanos, incluidos los neumocitos de tipo II y de los macrfagos alveolares. Esta infeccin conduce a difundir edema agudo, dao alveolar, y la induccin de cytokinemia severa resultante de la infeccin de macrfagos alveolares (5, 7). Restriccin de la LRT probablemente contribuye a la incapacidad del virus para pasar fcilmente de persona a persona, que requiere un alto nivel de replicacin en el URT para permitir la aerosolizacin y la transmisin de las partculas virales. La infeccin de macacos se asocia con la patologa en la LRT como resultado de la replicacin viral en los neumocitos tipo I en lugar de neumocitos de tipo II, como se vio en la infeccin humana y este seria uno de los impedimentos a la hora de emparejar los resultados. El modelo de NHP es muy relevante para el estudio de la induccin de las respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales y la comparacin de diferentes rutas de inmunizacin para lograr estos resultados. El efecto de la vacunacin sobre la infeccin por virus H5N1 se ha estudiado, usando virus inactivado para inducir respuestas inmunes humorales de proteccin en NHPs. Si bien estas respuestas demostraron inhibicin de la replicacin, las cargas virales iniciales en estos desafos fueron relativamente bajos, y el impacto de estas respuestas en la patologa pulmonar sigue sin estar claro. La combinacin de vacuna de ADN (pComb) y la vacuna PNP-nico plsmido. Brevemente, las secuencias de consenso se generaron mediante la alineacin de mltiples secuencias primarias (obtenido a partir de la base de datos) y la eleccin del aminocido ms comn en cada posicin para generar una secuencia sinttica, pero que conserva las caractersticas de las secuencias componentes elegidas. Las secuencias fueron entonces optimizados para el uso de codones, la estructura del ARN, y el contenido de GC y se sintetizaron. Los genes sintticos fueron subclonados en un vector de expresin. La alta patogenicidad de la cepa del virus de influenza aviar de A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), que se utiliz para el desafo del mono, se obtuvo de los Centros para el Control y Prevencin de Enfermedades (Atlanta, GA). Los macacos fueron alojados, de acuerdo con las normas de la Asociacin Americana para la Acreditacin del Cuidado de Animales de Laboratorio. Los animales se dejaron aclimatar durante al menos 30 das en cuarentena antes de cualquier inmunizacin. Cuatro grupos de cinco macacos rhesus fueron inmunizados en las semanas 0, 4, y 8

por va intramuscular e intradrmica. ADN fue inyectado en el msculo cudriceps (im) o la piel (ID), seguido de la electroporacin in vivo. Los animales se sangraron cada 2 semanas para la recogida de datos. Inhibicin de la Hemoaglutinacin (IHA) La IHA, es una tcnica que podr ser utilizada para la deteccin de niveles de Ac especficos en el suero de un paciente que ha sido infectado con el nuevo virus. Si da positivo con el Ac monoclonal que viene en el mismo equipo de diagnstico hay que confirmar el resultado. Microneutralizacin (NV) Los Ac neutralizantes especficos presentes en el suero de un paciente pueden neutralizar o reducir la infectividad del virus. Esta neutralizacin de la infectividad se visualiza mediante la reduccin del nmero de placas virales (unidades formadoras de placas, UFP) que se obtienen luego de enfrentar un nmero fijo de UFP frente a diluciones del suero del paciente en estudio y posterior infeccin de monocapas celulares. La reduccin del nmero de UFP virales detectadas en presencia del suero de un paciente es indicador de la presencia de Ac especficos en el mismo. En contraste con los ensayos de HAI, que ponen a prueba la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unin del virus-receptor, ensayos de microneutralizacin ponen a prueba la capacidad de los anticuerpos para inhibir la infeccin real in vitro. Histopatologia. no se produjeron Muertes tempranas entre los animales en el estudio, todos los animales sobrevivieron hasta el punto de tiempo de autopsia prevista. Los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de pentobarbital de sodio. Evaluaciones histopatolgicas fueron realizados por el patlogo veterinario en el hgado, el bazo, trqueas, las amgdalas, el corazn y los pulmones de los 20 macacos. Para cada animal, se analizaron al menos 5 campos. Los primates se inmunizaron tres veces con la vacuna pComb por im o i.d. electroporacin o i.m. pNP un plsmido que induce slo la inmunidad celular. Ensayos de HAI se realizaron en clado 1 y en los virus H5N1 divergentes de clado 2 para comparar la capacidad de nuestra vacuna sinttica para inducir respuestas de anticuerpos pertinentes y de reaccin cruzada en los primates, adems de la comparacin de las vas de inmunizacin para inducir tales respuestas. Como se detalla en la Tabla, despus de la segunda inmunizacin, 100% de macacos tanto en ambos grupos desarrollaron ttulos de IHA contra un virus de clado 1. Cada uno de estos animales tambin desarrollaron ttulos de IHA contra un virus divergente clado 2.3.4. Adems, 4 de 5 macacos en tanto el i.m. y i.d. grupos tenan niveles detectables de inhibicin frente a un 2,2 virus de clado. La inhibicin de un virus de clado 2.1 fue detectable despus de la segunda inmunizacin, aunque a un nivel inferior. Ensayos de microneutralizacin tambin se realizaron en los sueros despus de la tercera inmunizacin. Tanto i.m. y electroporacin Id indujeron ttulos relativamente altos de microneutralizacin contra un virus de clado 1; Id la inmunizacin indujo niveles ms altos de clado-emparejado y neutralizacin cruzada-clado contra todos los clados en la mayora de los macacos. Adems, d.i. la inmunizacin indujo neutralizacin significativa de clado 2.3.4 virus en 4 de 5 macacos. Se analiz la capacidad de la i.m. y i.d. vas de inmunizacin para inducir la respuesta inmune celular como se determina por el IFN-g ensayos de ELISPOT. Se incluy un grupo inmunizado i.m. con slo pNP con el fin de determinar el impacto de la respuesta inmune celular en ausencia de anticuerpo durante la exposicin viral. La Figura 1a muestra los resultados de la IFN-g ELISPOT ensayo de 2 semanas despus de la tercera

inmunizacin: im inmunizacin con electroporacin o con solo pNP la respuesta inmune celular inducida fuertes a cada antgeno administrado en el cctel. En contraste, d.i. la inmunizacin con la electroporacin induce respuestas ms dbiles. Tambin se muestran las respuestas promedio en el tiempo, siendo cada punto de tiempo 2 semanas despus de la vacunacin previa. Macacos no tratados no mostraron respuestas especficas de antgeno en cualquier momento durante el estudio. Se observaron diferencias significativas en la patologa pulmonar entre macacos inmunizados y de control. Los principales cambios histopatolgicos evidentes en secciones de pulmn de ambos macacos vacunados y de control tratados con el vector incluyeron mnimo a moderado neumona intersticial. Macacos de control exhiben una patologa significativa, con la inflamacin celular peribronchobronchiolar y la infiltracin de clulas inflamatorias mixtas (principalmente linfocitos, eosinfilos y macrfagos) que se extendan en septos alveolares adyacentes, adems de edema significativo. Los macacos inmunizados tanto i.m. y i.d. con pComb mostr proteccin significativa de la inflamacin, la infiltracin, y el edema: animales vacunados tenan poco o ningn edema microscpico, la infiltracin peribronchobronchiolar, o la inflamacin. Curiosamente, sin embargo, los macacos vacunados con pNP solo mostraron inflamacin y edema moderado pero altamente disminucin de los niveles de infiltracin. No haba ninguna patologa significativa detectada en el hgado, el bazo, trqueas, amgdalas, y los corazones de cualquiera de los grupos. Las estrategias actuales para la vacunacin contra el virus de la gripe se basan en la induccin de anticuerpos especficos de serotipo para prevenir la infeccin. Uno de los retos iniciales encontradas en el desarrollo de vacunas contra el virus de la gripe H5N1 era la incapacidad para inducir fiable seroconversin del antgeno diana (hemaglutinina H5). Las vacunas de ADN evitan este problema mediante el aprovechamiento de la maquinaria celular del husped. Sin embargo, la induccin de la seroconversin en los primates con las vacunas de ADN ha demostrado ser difcil. Adems, este problema se agrava por la diversidad de los virus H5N1 circulantes, que han demostrado ser difciles de orientar con una sola vacuna. El estudio combin la nueva estrategia de la electroporacin in vivo con vacunas sintticas consenso entregados por cualquiera de las im o i.d. inmunizacin. Sin embargo, no se han realizado estudios sistemticos sobre el impacto de la ruta de la vacunacin de las vacunas de ADN entregadas por la electroporacin in vivo en el tipo de respuestas inmunes generadas en NHP y en el impacto que estas respuestas tienen sobre la infeccin primaria. En nuestro caso, hemos demostrado que la proteccin significativa contra la enfermedad grave puede ser ofrecido por im convencional la inmunizacin, adems de la Id ms fcil de administrar. La induccin de ttulos protectores de anticuerpos contra el virus en todos los animales, vacunados tanto im Id y, despus de dos inmunizaciones mostr que el ADN se transcribe y se traduce en un antgeno que lleva eptopes funcionalmente relevantes y que la electroporacin in vivo es un medio eficiente de administracin de dicha vacuna. Curiosamente, cada una de estas respuestas mostraron una tendencia al alza en el grupo de la vacuna Id. Estas respuestas resultaron capaces de reducir tanto la replicacin viral y las causas principales de dificultad respiratoria visto en individuos infectados por el virus de influenza (edema, la inflamacin, y la infiltracin). Una amplia investigacin con modelos animales pequeos, adems de varios anlisis en los seres humanos, sugiere que la inmunidad celular podra desempear un papel en la proteccin de la morbilidad y la mortalidad asociadas con la infeccin por virus de la gripe. Contribuyendo a la idea detrs de este enfoque son la naturaleza altamente conservada de la nucleoprotena del virus de influenza, regiones conservadas dentro de otros antgenos del virus de la gripe, y la naturaleza de las clulas T. En nuestro estudio, a diferencia de que para las respuestas de anticuerpos, el nivel de induccin de

respuestas inmunes celulares era considerablemente mayor en im-macacos vacunados. Ambos pComb im y pNP im produjeron respuestas de magnitud y amplitud frente a antgenos administrados significativa, mientras que las respuestas en el grupo pComb id fueron detectables pero significativamente menor. En el contexto de la infeccin por el virus de la gripe H5N1, una mayor proteccin fue proporcionada por la respuesta inmunitaria provocada por ID la vacunacin. Esto puede haber sido debido a la mayor nivel de respuestas de anticuerpos observadas en este grupo o a la induccin de una respuesta inmune celular cualitativamente diferente no detectable por los ensayos de ELISPOT. Una mejor proteccin contra desafo, como se muestra por las cargas virales disminuidas, se obtuvo mediante el uso de Id inmunizacin. Este hallazgo apoya la superioridad de las respuestas de anticuerpos a travs de la inmunidad mediada por clulas en la mediacin de la proteccin contra la infeccin por H5N1 en los monos.