Aplicacin de CGH-array y rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados en pacientes con trastornos del neurodesarrollo

Sonia Mayo de Andrs Unidad de Gentica y Diagnstico Prenatal Grupo de Investigacin Traslacional en Gentica

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Conceptos bsicos:

- nucletido-ADN-ARN - gDNA-mRNA-cDNA

- PCR - electroforesis - cariotipo-array-FISH

- cromosoma-gen-alelo
- SNP-marcadores microsatlites

Nucletido-ADN-ARN
nucletido cido ribonucleico cido desoxirribonucleico

gDNA-mRNA-cDNA

Cromosoma-gen-alelo

SNP marcadores microsatlites

Polimorfismo de nucletido simple Marcador microsatlite

PCR Reaccin en cadena de la polimerasa

electroforesis agarosa acrilamida

Cariotipo-array-FISH

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Stephen Fodor

Michael Pirrung

Leightong Read

Lubert Stryer

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Affymetrix

Agilent

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Sonda: cDNA oligonucletidos

Aplicacin Arrays de expresin CGH array Array de SNPs

4X 44K

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ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG ATTAGCAGC TAATCGTCG

MUESTRA
ATTAGCAGC TAATCGTCG

REFERENCIA

ATTAGCAGC TAATCGTCG

ATTAGCAGC TAATCGTCG

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Indicaciones para el uso de array-CGH

Trastornos del neurodesarrollo

Rasgos dismrficos Anomalas congnitas

Antecedentes familiares

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Ejemplo 1

Cariotipo en lquido amnitico 46XXinv(9)/p11;q13)

- Desarrollo psicomotor alterado

Sosten ceflico 9 meses Deambulacin a los 20 meses A partir del 7 meses estancamiento Asiste a un colegio especial A los 2 aos sus primeras palabras Polidactilia (8 dedos en el pie izquierdo) Mala implantacin de pulgares en manos Trece pares de costillas Vertebras en mariposa Ano anterior Discreta hipertrofia del cltoris Orejas grandes y de implantacin baja Hipertelorismo Comisura bucal hacia abajo

- Retraso del lenguaje - Anomalas congnitas

- Rasgos dismrficos

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 1

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Ejemplo 1- alteracin 1
http://genome.ucsc.edu/

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Ejemplo 1- alteracin 1

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Ejemplo 1- alteracin 1
http://projects.tcag.ca/variation/

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 1- alteracin 1

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 1- alteracin 1

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 1- alteracin 1

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 1- alteracin 1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

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Ejemplo 1- alteracin 1

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Ejemplo 1- alteracin 1

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Ejemplo 1- alteracin 2

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Ejemplo 1- alteracin 2
http://decipher.sanger.ac.uk/

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Ejemplo 1- alteracin 2
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/map_search.cgi?taxid=9606&build=previous

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Ejemplo 1- alteracin 2

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Ejemplo 1- alteracin 2

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Ejemplo 1- alteracin 2

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Ejemplo 1- alteracin 2

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Ejemplo 1- alteracin 2

D21S1253 D21S269 D21S1442 D21S1916

1
1 1 3

2
1 2 1 2 1 2 1

3
2 3 2

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Ejemplo 1- alteracin 2

qPCR
1,4 1,2 1 APP RNF160

2^-DDCp

0,8 0,6 0,4 0,2 0 Paciente Padre Muestras Madre Control

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Ejemplo 1
ESTUDIO DE CGH-ARRAY:
Los resultados de este estudio ponen de manifiesto que la paciente presenta: 1. Una delecin de al menos 27.8Kb en el brazo largo del cromosoma 16 (16q22.1). Esta regin contiene el gen PDPR (pyruvate deshydrogenase phosphatase regulatory subunit). Por otro lado, se ha descrito en poblacin control varias variantes en nmero de copias (CNVs), tanto deleciones como duplicaciones, que contienen esta regin, incluyendo el gen PDPR. Teniendo esto en cuenta, consideramos esta alteracin como una variante polimrfica, no relacionada con la patologa de la paciente. 2. Una delecin de al menos 3.35Mb en el brazo largo del cromosoma 21 (21q21.3) que afecta a 16 genes. Algunos de estos genes estn relacionados con la regulacin de la expresin gnica o el desarrollo (APP, RNT160, USP16, CCT8 y ADAMTS1), con expresin variable en cerebro. En la bibliografa se ha descrito un caso con una delecin de novo de 8.8Mb que incluye esta regin (21q21.1-q21.3), en un varn sin aparentes rasgos dismrficos ni anomalas congnitas pero diagnosticado con trastorno generalizado del desarrollo (Chad et al., Am. J. Med. Genet. A. 152A(1):196-202).

ESTUDIO DE SEGREGACIN DE MARCADORES POLIMRFICOS

Se han caracterizado los marcadores D21S269, D21S1442, D21S1253 y D21S1916 en el ADN de la paciente y sus progenitores, para identificar si se trata de una alteracin de novo o heredada. El resultado obtenido no ha sido concluyente, ya que la madre slo muestra una variante allica en los cuatro marcadores, compatible bien con una regin en homocigosis (dos copias iguales) o bien con una delecin (perdida de una copia) en el cromosoma 21, como la que presenta la paciente.

ESTUDIO DE PCR CUANTITTIVA

Se ha realizado un estudio mediante la tcnica qPCR en el ADN de la paciente y sus progenitores para cuantificar el nmero de copias de los genes APP y RNF160, y por ende de la regin. Los resultados confirman la delecin detectada mediante CGH-array en la paciente, mientas que en la muestra materna los resultados obtenidos podran ser compatibles con una delecin, completa o en mosaico.

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I:1 I:2 I:3 I:4

Ejemplo 2
II:6 II:7 II:8 II:9

II:1

II:2

II:3
?

II:4

II:5

III:1

III:2

III:3

III:4

III:5

III:6

III:7

III:8

III:9

III:10

Gestacin normal Talla al nacer 50cm (percentil 50) Peso al nacer 3055g (percentil 50) Cariotipo en lquido amnitico 46XX Edad: 7 aos Talla 125.2cm (percentil >75) Peso 26.7Kg (percentil >75)

- Retraso mental severo

- Desarrollo psicomotor alterado Sedestacin tarda Deambulacin a los 2 aos Desarrollo normal en los primeros meses A partir del 7 meses estancamiento Asiste a un colegio especial A los 3 aos sus primeras palabras Apenas habla Orejas y ojos grandes Labios gruesos Puente nasal hundido Incisivos superiores separados Esterotipias manuales (lavado de manos) Se come su propio pelo A veces no controla esfnteres

- Retraso del lenguaje

- Rasgos dismrficos

- Comportamiento anmalo

- Crisis epilpticas en miembros inferiores tratado con antiepilepticos - No anomalas congnitas - No microcefalia - No hipotona - Pruebas complementarias TAC normal EEG alterado

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Ejemplo 2
FAM3 A 153.40Mb G6PD IKBKG CTAG1 A CTAG1B IKBKGP CLIC2

153.45Mb

153.50Mb

154.15 Mb TKTL1

154.20Mb

IRAK1

MECP2

TEX28P2 TEX28P1 TEX28 OPN1LW OPN1MW OPN1MW2

FLNA

152.90Mb

152.95Mb

153.00Mb

153.05Mb

153.10Mb

153.15Mb

153.20Mb

153.25Mb

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Ejemplo 2
Sndrome de RETT
Mutacin MECP2

Sndrome de duplicacin de MECP2

Duplicacin MECP2

Mujeres - Desarrollo normal hasta los 6-18 meses - Regresin en las habilidades aprendidas - Perdida del habla - Trastorno del neurodesarrollo - Retraso mental - Estereotipia lavado de manos - Microcefalia - Convulsiones Varones - encefalopata - muerte temprana

Varones - Retraso mental moderado a grave - Hipotona - Deambulacin 2 aos - Habla ausente o escasa - Espasticidad progresiva - Infecciones recurrentes - Convulsiones - Problemas digestivos - Anomalas digitales - Microcefalia - Braquicefalia - Orejas grandes - Hundimiento maxilar superior - Raz nasal ancha
Lugtenberg et al., 2009

100% 70% >40%

>30%

La severidad del fenotipo no se correlaciona con el tamao de la duplicacin Triplicacin Fenotipo ms severo

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Ejemplo 2

- Retraso mental severo - Desarrollo psicomotor alterado Sedestacin tarda Deambulacin a los 2 aos Desarrollo normal en los primeros meses A partir del 7 meses estancamiento Asiste a un colegio especial A los 3 aos sus primeras palabras Apenas habla Orejas y ojos grandes Labios gruesos Puente nasal hundido Incisivos superiores separados Esterotipias manuales (lavado de manos) Se come su propio pelo A veces no controla esfnteres

- Retraso del lenguaje

- Rasgos dismrficos

- Comportamiento anmalo

- Crisis epilpticas en miembros inferiores tratado con antiepilepticos - No anomalas congnitas - No microcefalia - No hipotona - Pruebas complementarias TAC normal EEG alterado

- Sndromes de microdelecin - Regin Xq28

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,2

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

2,2

SLC6A8
L1CAM
P015C

P245 P015C

P245

Ejemplo 2

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Gene

Gene

IDH3 G

present case

Carrier Xq28 duplication f emale Af f ected Xq28 duplication male

Xq SL 2 1 C M 6 E A CP 8 2 Ex 4 Xq 1 Xp 2 M P E AR CP 2 Ex 4 M Xp E 21 CP 2 Ex 4 M 1 E 1 CP q 2 Ex 1 Xq 22 12 p1 L1 2 C A Xp M M 21 E CP .2 2 Ex 18 4 M E q2 CP 1 2 Ex 3 X M p E 21 CP 2 Ex ID 2 M H E 3 CP G 2 Ex 1 Xp 21 Xq 2 IR 5 AK Xp 1 PA R 17 p1 3 Xp 22 SY BL 1

TN FR PA G S A F FA TA 4 H 3 M 1B E 1 C N P U SD 2 BE 1 G 3 A C BR A R D EB G BP M NB SE E C 1 M P2 C A7 L A M DN E 5 G CP P1 2 B NB PA DN M X6 PA L A P FAET T H M1 SN 1B R 1 P N F A NF LR NC 1 R L C C 48 SNRR R 9 P D N LL MD G L TG E 1 L F C BN YP R 1A 1 N1 H M F s. A 1 53 P 86 T D 04 LG SN E 1 L R AP N AB 2 L 9 LI 2B M T K TGRP 1 FB S1 D R1 EI LG F3 1 S W TER3 H T S N C1 SD R 1 C AI R 1 H R 1

Aumento de dosis MECP2 Xq28 Aumento de dosis MECP2 y IRAK2 Dosis normal de L1CAM

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MLPA

Ejemplo 2
Dosis normal 2 2 Dosis alterada 3 4 Ratio Terico 3:2 4:2 MLPA P245 1.42 1.82 MLPA P015C 1.39 1.89

Duplicacin Triplicacin

Duplicacin

Dosis normal 1

Dosis alterada 2

Ratio Terico 2:1

MLPA P245 1.98

MLPA P015C 1.78

CGH- Array

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 2
qPCR (MECP2)
3,5 3 2,5
2^-DDCp

2 1,5 1 0,5 0 Male Female Carrier Xq28 duplication female Samples Present case

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 2

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Ejemplo 2

CGH-array: Aplicacin en pacientes con trastorno del neurodesarrollo

Limitaciones array CGH:

- no se podrn diagnosticar aquellas alteraciones que no supongan una prdida o una ganancia de material genmico: mutaciones puntuales translocaciones equilibradas inversiones equilibradas
-no se detectarn duplicaciones o deleciones inferiores al rango de resolucin de la plataforma empleada - las alteraciones presentes en mosaico (en menos del 40% de la poblacin celular), que podran ser los causantes de la patologa del paciente, tampoco se podrn detectar con esta tcnica.

Aplicacin de CGH-array y rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados en pacientes con trastornos del neurodesarrollo

Sonia Mayo de Andrs Unidad de Gentica y Diagnstico Prenatal Grupo de Investigacin Traslacional en Gentica

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Impronta Metilacin Epigentica

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Alteraciones de la impronta en estudio

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Alelo paterno metilado Metilacin Punto corte HpaII Primer Primer marcado Alelo materno metilado

Dosis

Metilacin

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Gestacin normal (semana 36) Talla al nacer 51cm (percentil >90) Peso al nacer 2940g (percentil 75-50)

MLPA Normal

P036B P064 P096

CGH Array Normal

Edad: 12 aos Talla 160cm (percentil >97)

- Retraso mental moderado - Desarrollo psicomotor alterado

escuela especial Deambulacin a los 16 meses 12 aos mala coordinacin A los 3 aos Macrocefalia Dolicocefalia Frente Olmpica Comisura bucal hacia abajo

- Retraso del lenguaje - Rasgos dismrficos

- Tic ocular

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Patient methylation

Methylation test
1,6 1,4 1,2

Control methylation Patient gene dosage Control gene dosage

Relative value

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 KCNQ1OT1 (11p15.5) MEG3 (14q32.2) Im printin region H19 (11p15.5) SNRPN (15q11.2)

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Metilacin MS030
Muestra control

Paciente

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

MLPA MS30

MLPA (MS030)
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 06266L05772 08743L08763 08744L08764 08745L08765 11080L11762 Probe 06276L05782 07171L06780 07172L06781 H19DMR KvDMR

Methylation Gene dosage

relative value

07173L06782

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Marcadores

D11S1984 D11S2362 D11S1999

2 2 1

2 2 2

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Rastreo de alteraciones de la metilacin en loci improntados

Otros ejemplos
Metilacin
2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
CGM-897-Met CGM-991-Met EX-712-Met CGM-962-Met

LIT1 GTL2 H19 SNRPN

CR-218-Met

DT
2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
CGM-897-DT CGM-991-DT EX-712-DT CGM-962-DT

LIT1 GTL2 H19 SNRPN

CR-218-DT

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