Mutazione, riparazione e ricombinazione

Mutazioni
z Cosa

sono? z Come radiazioni e sostanze chimiche provocano mutazioni? z Mutazioni spontanee e mutazioni indotte z Le cellule le riparano?

Esiste una variet di sistemi di riparazione, la maggior parte basata sulla complemenrariet tra le basi: si usa un filamento di DNA come stampo per correggere il DNA danneggiato

Mutazioni puntiformi
z Sono

modificazioni di una singola coppia di basi o di poche coppie adiacenti z Possono essere indotte o spontanee z Se sono indotte, maggiore la dose di mutageno, maggiore il numero di mutazioni indotte

Relazione lineare tra la dose di raggi X e la mutazione

Sostituzioni di singole basi possono avere esiti diversi

Effetti di mutazioni comuni su RNA e proteine

Si annulla il legame della RNA polimerasi

Meccanismi di induzione delle mutazioni puntiformi

Appaiamenti normali tra le forme chetoniche delle basi

Appaiamenti errati: rare forme tautomeriche delle basi danno luogo ad appaiamenti errati, si formano spontaneamente o quando le basi si ionizzano

Il mutageno 5-bromouracile un analogo della timina che al posto del CH3 legato al carbonio
5 (come in timina) ha il bromo La sua azione mutagenica basata sulla ionizzazione

Altro agente mutageno: 2-amminopurina o 2-AP, si appaia con la timina ma nella forma protonata di appaia con la citosina anzich con la timina

Alterazione delle basi

Alcuni agenti mutageni non sono incorporati nel DNA ma alterano una base provocando errori di appaiamento. z Agenti alchilanti come EMS (etilmetanosulfonato) aggiungono gruppi alchilici, gruppo etilico nel caso di EMS
z

Appaiamento specifico errato indotto per alchilazione

Transizione GC-AT nel successivo ciclo di replicazione

Agenti intercalanti: altra classe di modificatori del DNA: possono causare inserzioni o delezioni di singole coppie di basi

Danneggiamento delle basi

SOS: E.coli , polimerasi che tollerano gli errori, anche negli eucarioti z Prendono parte a un meccanismo di risposta al danneggiamento chiamato sintesi translesione di DNA che assomiglia al sistema SOS di E.coli
z Sistema

Sintesi translesione di DNA: induzione SOS lultima risorsa per la cellula, una forma di tolleranza del danno che consente alla cellula di continuare a vivere al prezzo di un certo livello di mutagenesi

La luce ultravioletta pu provocare alterazioni dette fotoprodotti: vengono unite pirimidine adiacenti in due modi. I fotoprodotti UV perturbano profondamente la locale struttura della doppia elica

Altro danneggiamento di basi: aflatossina, potente cancerogeno originariamente isolato in arachidi infettate da un fungo

Si attacca alla guanina in posizione N-7, provocando la rottura del ponte tra la base azotata e lo zucchero, con liberazione della base e formazione di un sito apurinico

Il sistema SOS bypassa i siti apurinici mediante inserzione di un residuo adeninico di fronte al sito apurinico

Le mutazioni spontanee
Test della fluttuazione di Luria e Delbruck 1943. Studio su mutanti di E.coli resistenti allattacco del fago T1. Non si sapeva se i mutanti si producevano spontaneamente ma in modo casuale oppure se la presenza del fago induceva un cambiamento fisiologico che provocava resistenza al fago stesso

Ipotesi del test della fluttuazione alberi genealogici cellulari e risultati attesi in base alle due ipotesi alternative sullorigine delle cellule resistenti

Si pu dimostrare che in una popolazione esistono mutanti gi prima della selezione?

S, dalla tecnica sviluppata da Lederberg nel 1952 detta piastratura delle repliche

Premendo il tampone su piastre con mezzo selettivo (es.fagi T1), le cellule che aderiscono al tessuto vengono inoculate sulle piastre di replica nella stessa posizione delle colonie sulla piastra master. La distribuzione delle colonie resistenti uguale tra le varie piastre di replica

Meccanismi di insorgenza delle mutazioni spontanee. Depurinazione, deaminazione

Lanalisi delle sequenze di DNA degli hot spot (punti caldi) per le transizioni GC AT nel gene lacI ha mostrato che in corrispondenza di ogni hot spot presente un residuo di 5metilcitosina (asterisco)

III tipo di lesione spontanea: danni da ossidazione da radicali superossido, perossido di idrogeno e radicali ossidrilici OH

Residuo timidinico danneggiato

Residuo guanosinico danneggiato

Errori nella replicazione del DNA

Modello delle mutazioni ins del: le mutazioni indel si verificano quando, nel corso della replicazione del DNA, anse nelle regioni a filamento singolo sono stabilizzate per effetto di appaiamenti errati da slittamento di sequenze ripetute

Mutazioni spontanee nel gene lacI. Il principale punto caldo una sequenza di 4 paia di basi CTGG ripetute 3 volte in tandem nel tipo selvatico. La maggior parte delle mutazioni dovuta a inserzione di un gruppo aggiuntivo di 4 basi CTGG, una minor parte risulta dalla perdita di un gruppo di 4 basi, CTGG

Analisi delle delezioni in regioni contenenti sequenze ripetute nel gene lacI

Le mutazioni spontanee possono derivare da processi differenti

Le lesioni spontanee e gli errori nella replicazione danno origine a gran parte delle sostituzioni di basi e delle mutazioni indel

Mutazioni spontanee nelluomo: malattie da ripetizioni trinucleotidiche. Il gene FMR-1, coinvolto nella sindrome dellX-fragile

Meccanismi biologici di riparazione

Il basso tasso di mutazione spontanea indice dellefficacia dei sistemi di riparazione

3 tipi di riparazione del DNA contenente una base danneggiata

Portare la base alla sua forma corretta

Riparazione mediante reversione diretta, fotoriparazione

Riparazione dei siti AP (apurinici e apirimidinici)

Riparazione per escissione di nucleotidi in E.coli

Riparazione per escissione di nucleotidi negli eucarioti. Un dimero pirimidinico (triangolo) causa un rigonfiamento che riconosciuto dal riparosoma, il pezzo danneggiato escisso e risintetizzato

Riparazione postreplicativa Nota: il DNA batterico metilato, la metilazione avviene dopo la replicazione Il DNA viene metilato in corrispondenza dei residui A nella sequenza GATC. La replicazione del DNA produce un duplex emimetilato che persiste finch la metilasi non modifica il filamento neosintetizzato. Il sistema di riparazione degli appaiamenti errati compie tutte le correzioni necessarie basandosi sulla sequenza che trova sul filamento metilato

Modello per la riparazione degli appaiamenti errati nelluomo

La riparazione caratterizzata da due fasi: a)rimozione del DNA danneggiato e di quello adiacente b) uso dellaltro filamento come stampo per la sintesi di DNA a colmare il vuoto. Ma se tutti e due i filamenti sono danneggiati? Se non viene riparata, la rottura di entrambi i filamenti pu portare a morte cellulare o a uno stadio precanceroso

Meccanismo di unione delle estremit non omologhe nel caso di rottura del doppio filamento: meccanismo incline agli errori

Riparazione della rottura del doppio filamento mediante ricombinazione omologa Una rottura del doppio filamento induce un enzima a erodere le estremit 5, lasciando le 3 sporgenti, rivestite da proteine.Un segmento del cromatide fratello (blu) usato come stampo per riparare la rottura

Rotture doppio filamento

Nelle cellule che non si dividono: Le estremit del doppio filamento rotto si uniscono in modo efficace mediante un pocesso non privo di errori detto unione di estremit non omologhe
z

Nelle cellule che si dividono: Si utilizza il processo di ricombinazione omologa, in cui le estremit libere invadono la regione omologa del cromatide fratello per iniziare la sintesi di DNA, realizzando cos una riparazione priva di errori
z

Modello di crossing over per rottura del doppio filamento