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Received 30 June 2009; Accepted 12 November 2009

Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy 19(4): 931-936, Out./Dez. 2009

Yolanda Ramos Losqui,1 Felcio S.S. Rozete,1 Maycon B. Almeida,1 Alexandre H. C. Bittencourt,1 Simo Pedro F. Pereira*,1,2
Faculdade de Minas, Av. Cristiano Ferreira Varella, 655 Bairro Universitrio, Caixa Postal 36880-000 Muria-MG, Brazil 2 Hospital do Cncer Muria, Fundao Cristiano Varella, Av. Cristiano Ferreira Varella, 655 Bairro Universitrio, Caixa Postal 36880-000 Muria-MG, Brazil
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RESUMO: O uso indiscriminado de plantas medicinais vem da crena de que produtos naturais no causam mal sade, porm assim como medicamentos sintticos, as plantas possuem grupos de compostos farmacologicamente ativos que atuam nos organismos vivos, sendo necessrio o conhecimento destes para avaliao de suas potencialidades teraputicas e txicas. Estudos sobre propriedades qumicas de plantas medicinais, associando o extrato destas s atividades toxicofarmacolgicas, so pouco encontrados. O presente ensaio objetivou analisar a ao do leo essencial de B. trimera (Less.) DC., espcie pertencente famlia Asteraceae e popularmente conhecida como carqueja, sobre cultura de clulas do sistema nervoso central. Foram usadas clulas de retina de ratos neonatos tratadas pelo leo de carqueja nas concentraes 1:500 e 1:1000, por um perodo de incubao de 4, 24 e 48 horas. Nossos resultados demonstram que a carqueja possui ao inibitria na diferenciao de clulas neuronais in vitro quando tratadas cronicamente. Observamos tambm uma reduo na sobrevida de clulas neuronais e diminuio da proliferao de clulas gliais. Essa reduo da proliferao de clulas da glia poderia estar interferindo na sobrevivncia e diferenciao neuronal. Maiores estudos so necessrios para se compreender os mecanismos envolvidos nesse efeito. Unitermos: Carqueja, leo essencial, cultura de clulas, Baccharis trimera. ABSTRACT: Activity of Baccharis trimera (Less.) DC. Asteraceae on culture of retinal ganglion cells in vitro. The indiscriminate use of medicinal plants comes from the belief that natural products dont cause harm to health, but as well as synthetic drugs, plants have groups of pharmacologically active compounds that act in living organisms, with the necessary knowledge of these groups to evaluate the therapeutic and toxic potential. Studies of chemical properties of medicinal plants, involving the toxicfarmacologics activities of these extracts are hardly found. This study aimed to analyze the action of essential oil of B. trimera (Less.) DC., a species belonging to the Asteraceae family and popularly known as carqueja, on cultured cells of central nervous system. We used retinal cells from newborn rats treated by carquejas oil, with concentrations 1:1000 and 1:500, for an incubation period of 4, 24 and 48 hours. Our results showed that carqueja has inhibitory action on the differentiation of neuronal cells in vitro when treated chronically. We also observed a reduction in survival of neuronal cells and decreased proliferation of glial cells. This reduction of the proliferation of glial cells could be interfering with the survival and neuronal differentiation. Further studies are needed to understand the mechanisms involved in this effect. Keywords: Carqueja, essencial oil, cell culture, Baccharis trimera.

INTRODUO Plantas medicinais, assim como os medicamentos sintticos, possuem grupos de compostos farmacologicamente ativos que atuam nos organismos vivos. O emprego teraputico dessas plantas exige o conhecimento prvio de seus compostos para a avaliao
* E-mail: simaopedro@faminas.edu.br

das potencialidades teraputicas. Sua toxicidade tambm de grande importncia, para conseguir uma formulao apropriada e uma estratgia adequada para seu uso. As plantas, utilizadas popularmente devido a sua atividade medicinal, podem conter substncias que oferecem ao txica, mutagnica e at carcinognica quando utilizadas de maneira indiscriminada. Equivocadamente a cultura popular acredita que fazer uso exagerado de determinada
ISSN 0102-695X 931

Artigo

Atividade de Baccharis trimera (Less.) DC., (Asteraceae) sobre cultura de clulas in vitro

Yolanda Ramos Losqui, Felcio S.S. Rozete, Maycon B. Almeida, Alexandre H. C. Bittencourt, Simo Pedro F. Pereira

planta no causa mal algum, pelo simples fato desta ser de origem natural. Estudos de toxicidade com plantas medicinais so pouco realizados, principalmente, avaliando sua ao em nvel celular (Peron et al., 2008). Baccharis trimera (Less.) DC., Asteraceae, conhecida como carqueja amplamente utilizada na medicina popular, seu uso um hbito herdado dos indgenas e h sculos utilizada para o tratamento de vrias doenas. de 1931 o primeiro registro escrito do uso da carqueja no Brasil, empregada na forma de infuso de folhas e ramos para o tratamento da esterilidade feminina e da impotncia masculina, atribuindo-lhe ainda propriedades tnicas, febrfugas e estomquicas. A partir da, o uso medicinal aumentou, principalmente para a soluo de problemas hepticos, disfunes estomacais e intestinais, para diabetes, obesidade e reumatismo (Auler, 2004; Carreira, 2007). A carqueja usada tambm como anti-helmntico, contra anorexia, gripe, resfriado, assim como em feridas e ulceraes, entre outros (Dresch et al., 2006). Considerando o potencial teraputico descrito para a infuso da carqueja e a falta de estudos que avaliem sua ao txica, foi desenvolvido um trabalho que teve como objetivo a investigao, por meio de anlise citogentica, dos efeitos txicos em nvel celular desta planta. Aps os tratamentos com as duas concentraes da infuso de B. trimera, foi verificado que atravs dos testes utilizados no houve ao citotxica, aps 24 h de tratamento, nas clulas de medula ssea de ratos Wistar tratados via gavagem, indicando, assim, uma segurana maior de uso desta planta pelo homem (Peron et al., 2008). Segundo Verdi et al. (2005), B. trimera possui atividade antimutagnica e hepatoprotetora. A literatura corrente descreve a realizao de estudos sobre o uso da carqueja, tendo sido observado a reduo do ciclo mittico, em concentraes elevadas, bem como o surgimento de anormalidades cromossmicas; a planta possui baixa toxicidade por via oral, porm possui moderada toxicidade por via intraperitoneal; a administrao do extrato de carqueja em ratas exerce ao abortiva, sendo contra indicada durante a gestao e a lactao (Peron et al., 2008). Alguns modelos de culturas de clulas so utilizados para avaliao da atividade de determinadas substncias qumicas. Clulas da retina cultivadas in vitro so um excelente modelo experimental para SNC, devido a sua fcil acessibilidade e obteno de material sem risco de contaminao com outros tecidos. Alm disso, possibilita estudos farmacolgicos, principalmente por possurem variados tipos celulares comparvel a outros tecidos neuronais (Cadilhe, 2006). A retina de ratos neonatos apresenta apenas seis classes de tipos neuronais e, em geral, apenas um tipo de clula glial: a clula de Mller (Ferraz, 2007). Foi na dcada de setenta que a primeira cultura de clulas de retina de mamfero foi obtida, tendo assim iniciado os estudos acerca da sobrevida das clulas ganglionares in vitro (Souza, 2006). Assim como outras
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reas do sistema nervoso central, a retina (que organizada como uma rede neuronal laminar) utiliza uma grande variedade de substncias neuroativas, sendo demonstrado por anlises bioqumicas que essencialmente grande maioria dos neurotransmissores encontrados no crebro se fazem tambm presentes na retina (Ferraz, 2007). A proliferao, a migrao e a diferenciao de clulas nervosas e gliais, so etapas relacionadas ao desenvolvimento do sistema nervoso. O controle do nmero de clulas neuronais e gliais no sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso perifrico (SNP), parece ser tambm controlado pela morte celular natural, que um evento fisiolgico bastante conservado filogeneticamente. Vrios trabalhos apontam um papel importante da apoptose (morte celular programada) nas doenas neurodegenerativas e em processo de envelhecimento. Em se tratando de morfologia, a apoptose tem como caractersticas a perda de volume celular, a condensao da cromatina, a fragmentao organizada do DNA em oligonucleossomas provocada pela ativao das endonucleases, a manuteno da estrutura de outras organelas e da membrana plasmtica at o seu rompimento e por fim a fagocitose dos corpsculos apoptticos por macrfagos e por clulas vizinhas; sendo a ausncia de resposta inflamatria no tecido uma caracterstica muito importante da apoptose (Cunha, 2006). O processo de morte celular pode ser induzido em diferentes tipos celulares em resposta a uma grande variedade de estmulos incluindo danos do DNA, nveis elevados de clcio no citoplasma, entre outros. Este dado permite dizer que a morte celular natural e a apoptose so fenmenos tambm mediados por vias bioqumicas intracelulares que mantm certa similaridade (Pereira & Arajo, 1997). Aps um dano citotxico ocorre a parada do ciclo celular em G1 (uma das fazes do ciclo de replicao celular). Sendo este mecanismo importante para que possa haver o reparo do DNA antes que ocorra a diviso. Quando a extenso do dano ao DNA grande, ocorre a induo do processo de apoptose (Medina, 2008). Novos fatores envolvidos com o incio do fenmeno apopttico so a cada dia descritos, medida que os estudos avanam. Sabe-se que a manuteno da sobrevida mediada por fatores do ambiente extracelular que geram mudanas gnicas que constitutivamente ativam mecanismos intracelulares de manuteno da sobrevida (Eastman, 1995). O presente trabalho objetivou determinar a ao do leo essencial de Baccharis trimera sobre clulas, do sistema nervoso central, em cultura de clulas in vitro. MATERIAIS E MTODOS Material vegetal As amostras de Baccharis trimera (Less.) DC., Asteraceae, foram coletadas na zona rural do municpio de Eugenpolis-MG, Brasil, situado em latitude de 21 05 56 Sul e longitude de 42 11 13 Oeste, com clima

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tropical, estando o local da coleta aproximadamente 800 m de altitude. Extrao do leo essencial A extrao de leo essencial foi feita com a planta fresca, por arraste vapor (hidrodestilao), utilizando um extrator do tipo Clevenger. Para a avaliao da ao do leo essencial de B. trimera sobre cultura de clulas ganglionares utilizou-se diferentes diluies (1:1000, 1:500). As diluies continham o leo, o solvente propilenoglicol e o veculo (mesmo meio de cultura utilizado para a cultura de clulas): Meio 199 (GIBCO). Tendo sido previamente estabelecido o uso de propilenoglicol para dez vezes o volume do leo a ser diludo e o volume do meio 199 em quantidade suficiente para 1 mL de soluo para cada placa. Uma observao importante a ser feita que cada placa continha um volume final (incluindo o meio, os diluentes, as clulas, o leo etc) de 4 mL. As culturas de clulas ganglionares da retina de ratos Lister Hooded (sobre as quais foram colocadas as diluies do leo essencial de B. trimera) foram feitas de acordo com o protocolo experimental descrito por Pereira & Arajo (2001). As clulas foram semeadas numa concentrao de 6,5x105 clulas/mL diludas em meio 199, sobre lamnulas pr-tratadas com poli-L-ornitina, estas foram dispostas no fundo de uma placa de Petri de 35 mm. Deixou-se transcorrer 4 h, acrescentou-se 1 mL de meio de cultura nas placas controle, e 1 mL da soluo contendo leo essencial nas placas testes, tendo ambas sido mantidas 24 e 48 h, e fixadas aps este tempo para que fossem posteriormente analisadas. importante lembrar que todas as placas de amostras e controles foram feitas em triplicata. RESULTADOS E DISCUSSO A anlise foi elaborada atravs de microfotografia em campo claro, com o aumento de 400x, as quais foram feitas utilizando-se uma Cmera fotogrfica SONY, modelo DSC-S650 com comprimento focal 13 mm. Para a avaliao dos resultados comparou-se as placas que continham o leo essencial nas suas diluies com as placas controles (4, 24 e 48 h in vitro). As culturas controle 4 h, foram fixadas, tratadas apenas com meio de cultura (199, GIBCO), acrescido de 5% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 g/mL, na ausncia do leo essencial. Observam-se (Figura 1a) clulas neuronais ou gliais diferenciadas formando grumos, onde os neurnios se sobrepem s clulas gliais. Na Figura 1b observa-se a presena de neurnio em processo de diferenciao com aparecimento dos primeiros ramos dendrtico/axonais. As culturas controle 24 h foram cultivadas in vitro na presena de meio 199 suplementado e na ausncia do leo experimental. Observa-se sua exuberncia iniciando

a formao de monocamada de clulas gliais, as quais atingem a confluncia em aproximadamente quinze dias aps plaqueamento. Nota-se as clulas da glia sendo recobertas por neurnios j bem desenvolvidos formando as primeiras conexes neurais. Pode-se notar o crescimento de arborizao e comunicao entre clulas atravs de rede de dendritos e axnios (Figura 2a). Na Figura 2b observa-se os primeiros debris de clulas mortas e presena de clulas j diferenciadas, como a glia indicada pela seta. Tambm pode-se perceber a conexo de clulas gliais e neuronais. Essas conexes so essenciais para a manuteno da sobrevivncia das clulas cultivadas. As culturas experimentais foram fixadas aps 24 h in vitro na presena de meio 199 suplementado e adicionado leo de Baccharis trimera (Less.) DC., Asteraceae na concentrao de 1:1000 (Figuras 3a e 3b). Nas culturas tratadas com essa diluio pode-se observar a presena de clulas menos diferenciadas com menor quantidade de contatos entre clulas como se ocorresse uma inibio no crescimento da rede dendrtica e axonal. Notase claramente que o corpo celular no apresenta ncleo apopttico indicando assim uma reduo e desacelerao no processo de diferenciao. Isso pode ser notado pela reduo no crescimento de processos de arborizao e rede dendrtica tambm observado (Figuras 3a e b). A sobrevida celular foi analisada atravs da manuteno das culturas por 48 h in vitro sem troca de meio, que faz-se necessria para manuteno da sobrevivncia celular por maior tempo. As clulas foram ento fixadas aps 48 h in vitro na presena de meio 199 suplementado e na ausncia do leo experimental. Observa-se o incio de degenerao neuronal devido pobreza de nutrientes encontrados no meio de cultura. Nota-se que a cultura j no apresenta exuberncia com muitas clulas morrendo possivelmente por apoptose, as quais apresentam as caractersticas morfolgicas descritas por Cunha (2006). As clulas restantes demonstram morfologia caracterstica de clulas gliais que normalmente so mais resistentes (Figuras 4a e b). As culturas experimentais foram fixadas aps 48 h em in vitro na presena de meio suplementado 199 e adicionado leo de B. trimera em duas diferentes diluies. Observa-se nas figuras 5a e 5b as clulas sem prolongamento quando tratadas com diluio de 1:500, assim como nas Figuras 6 (a e b), nas quais as culturas foram tratadas com a diluio de 1:1000. Nota-se que a cultura com a diluio de 1:500 apresenta maior concentrao celular, enquanto que na diluio de 1:1000, a presena de clulas est bem reduzida. O processo de toxicidade mais evidente foi observado na diluio de 1:1000 pois a cultura aparenta um estgio degenerativo mais avanado. Estes resultados apontam um outro possvel efeito no txico e sim um efeito trfico inibido pela ao do leo de carqueja. Pode-se notar que a cultura com menor concentrao da carqueja entre as culturas apresentou uma aparncia mais devastadora com menor volume celular e quase
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nenhum processo axodendrtico visvel. O uso da carqueja popularmente est relacionado ao hepatoprotetora, antireumtica, antihemntica, uso em feridas e lceras. Recentes estudos sobre propriedades qumicas de plantas medicinais, associando o extrato da carqueja demonstram que as atividades toxicofarmacolgicas, so pouco encontradas em clulas de medula ssea de ratos Wistar (Peron et al., 2008). Entre os poucos estudos, encontrase o de Luize et al. (2005), o qual sugere que apesar da ao hemoltica encontrada para extrato de B. trimera, a eficcia biolgica nas concentraes testadas no revelam citotoxicidade in vitro. Porm outros dados da literatura demonstram que os ensaios utilizando a carqueja apontam para uma ao abortiva em ratas Wistar e uma reduo do ciclo mittico celular alm do surgimento de anormalidades cromossmicas (Verdi et al., 2005). Apesar de ser amplo o uso de culturas de clulas utilizando retina, o que possibilita grande quantidade de informaes sobre este tecido, e permite comparar e correlacionar os resultados experimentais novos com os dados presentes na literatura (Medina, 2008). Os resultados obtidos apontam para uma reduo no processo proliferativo celular com visvel reduo na proliferao glial de culturas tratadas com extrato de carqueja. As interaes neurnio/glia tem sido responsveis por diversos processos ligados a construo da arquitetura neuronal (Gomes et al., 2001).

Processos como neurogenese (Lim & Alvarez, 1995), formao sinptica (Pfrieger & Barres, 1997), proliferao (Gomes et al., 2001) e diferenciao (Garcia-Abreu et al., 1995) esto diretamente ligados a formao e manuteno do sistema nervoso central in vitro e in vivo. Fatores solveis secretados tanto por glias e neurnios como neurotransmissores (Pereira & Arajo, 2001), hormnios e fatores de crescimento tem sido implicados na formao arquitetnica do crebro (Gomes et al., 2001). Observamos tambm uma diminuio do crescimento de rede axodendrtica que poderia ter acelerado o processo degenerativo em nossas culturas experimentais. Os resultados de Verdi compactuam aos nossos indicando uma modificao na diferenciao e proliferao celular em nossas culturas quando tratadas com extrato de carqueja na menor concentrao 1:100. Devido falta de estudos sobre atividade toxicofarmacolgicas de plantas medicinais sobre culturas de clulas neuronais, o resultado encontrado no presente trabalho no pde ser comparado, sendo apenas descrito e determinado que o leo essencial de B. trimera possui ao inibitria sobre as clulas de retina em cultura in vitro, tendo sido observada a inibio da arborizao axodendrtica e reduo na proliferao e diferenciao de clulas gliais quando na presena do mesmo.

Figura 1. Cultura controle (4 h) sem a presena de leo essencial; (a) formao de grumos por clulas neuronais ou gliais indiferenciadas, com sobreposio dos neurnios sobre as clulas gliais; (b) presena de neurnio diferenciando-se com aparecimento dos primeiros ramos dendrtico/axonais.

Figura 2. Cultura controle (24 h); (a) incio da formao da monocamada de clulas neuronais; crescimento de arborizao e comunicao entre clulas atravs de rede de dendritos e axnios; (b) presena de debris de clulas mortas e de clulas j diferenciadas, como a glia indicada pela seta. 934
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Figura 3. Cultura de 24 h com presena do leo essencial de B. trimera na diluio 1:1000; (a) e (b) presena de clulas menos diferenciadas e com menor quantidade de contatos intercelular; possvel ocorrncia de inibio da rede dendrtica e axonial.

Figura 4. Cultura controle (48 h); (a) incio de degenerao neuronal; a cultura j no apresenta exuberncia com muitas clulas morrendo possivelmente por apoptose; (b) as clulas restantes demonstram morfologia caracterstica de clulas gliais que normalmente so mais resistentes.

Figura 5. Cultura (48 h) com presena do leo essencial de B. trimera em diluio 1:500; clulas sem prolongamento.

Figura 6. Cultura (48 h) com presena do leo essencial de B. trimera em diluio 1:1000; clulas sem prolongamento.
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AGRADECIMENTOS Agradecemos FAMINAS pelo apoio e incentivo pesquisa e a Profa. Elizabeth Giestal Arajo (Laboratrio Hertha Mayer - UFF) pela colaborao e fomento para realizao deste trabalho. REFERNCIAS
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