SUMRIO 1. Introduo....................................................................................................................02 2. Referencial Terico.......................................................................................................03 2.1 A eletroforese pode ser usada para separar molculas com carga............................03 2.

2 Fundamentos prticos................................................................................................04 2.2.1 Corrente eltrica.....................................................................................................04 2.2.2 A eletroforese realizada com portes....................................................................05 2.2.3 A velocidade de migrao das cargas influenciada por diversos fatores.............06 2.2.4 Porosidade de gis................................................................................................. 06 2.2.5 Mobilidade dos ons............................................................................................... 07 2.3 Tipos de Eletroforese................................................................................................ 07 3. Eletroforese em Gel..................................................................................................... 08 3.1 Subdivises da Eletroforese em Gel..........................................................................08 3.1.1 Eletroforese em Gel de Agarose ...........................................................................08 3.1.2 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida .................................................................. 09 4. Eletroforese Capilar ..............................................................................................09 4.1 Eletroforese Capilar em Zona ou Soluo Livre ..............................................10 4.2 Eletroforese Capilar em Gel ......................................................................................11 4.3 Eletroforeses de cidos Nuclicos ............................................................................ 11 5.Nativa Page ....................................................................................................12 6.SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis Laemmli, 1970)................................................................................................................................12 7. Focalizao Isoeltrica (IEF) ........................................................................................13 8. Mtodo Bidimensional................................................................................................14 9. Western blotting ........................................................................................................14 10. Realizao da Eletroforese........................................................................................15 11. Concluso..................................................................................................................16 12. Referncias Bibliogrficas .........................................................................................17

1 Introduo

Grande parte das pesquisas atuais em bioqumica estuda aspectos ligados s protenas e aos cidos nuclicos. Essas macromolculas tm uma caracterstica bastante importante: apresentam vrias regies (grupamentos) com cargas eltricas. As protenas apresentam tanto grupamentos com cargas positivas quanto grupamentos com cargas negativas, provenientes dos aminocidos que as constituem. As cargas so resultados da ligao ou perda de prtons. J os cidos nuclicos (DNA e RNA) apresentam uma situao mais simples do que as protenas porque s apresentam as cargas negativas dos grupos fosfato. Outra caracterstica interessante dos cidos nuclicos que surge de sua estrutura polimrica repetitiva que a razo entre o nmero de cargas negativas e o nmero de tomos que compem o cido nuclico praticamente constante, independentemente do tamanho ou da seqncia de nucleotdeos da molcula (LEHNINGHER,1995). Uma propriedade das cargas eltricas em soluo que quando uma diferena de potencial aplicada soluo - ou seja, quando os plos de uma bateria so conectados soluo as cargas positivas so atradas pelo plo negativo e as cargas negativas, pelo plo positivo, deslocando-se em direo a eles. Os cidos nuclicos, como so carregados negativamente, migram em direo ao plo positivo (KONAREV,1981). Essa migrao das cargas quando so submetidas a uma diferena de potencial chamada de eletroforese (LOPES,1984). O termo eletroforese foi criado por Michaelis, em 1909, para descrever a migrao de colides sob a influncia de um campo eltrico. Eletroforese representa, portanto, a migrao de ons submetidos corrente eltrica A evidenciao de protenas e cidos nuclicos pela eletroforese precisa e valiosa para estudos taxonmicos, filogenticos, fisiolgicos e genticos em plantas, animais, microorganismos e partculas virais. Focalizando definidas enzimas, protenas ou cidos nuclicos, seu emprego tem-se destacado, por exemplo, na identificao de certos grupos de fungos, bactrias e nematides, bem como fitovrus e virides. O conjunto de isoenzimas de definida enzima, denominado zimograma, pode ser empregado na cauterizao de fitopatgenos, no estudo de gentica e evoluo de fungos fitopatognicos e na identificao de clones, cultivares e linhagensm, assim como em estudos citognticos e bioqumicos de plantas. Zimogramas ainda assistem os fitopatologistas na cauterizao de cultivares resistentes a doenas e no estudo das relaes patgenos-hospedeiro. Enfim, a eletroforese pode ser usada para determinao do peso molecular e protenas e caracterizao de molculas de cidos nuclicos (DNA e RNA). Progressos na tecnologia da DNA recombinante, no mapeamento dos fragmentos de restrio e no seqenciamento dos nucleotdeos dos fragmentos de cidos nuclicos tm tornado esta tcnica um potencial analtico perspicaz.

2. Referencial terico 2.1 A eletroforese pode ser usada para separar molculas com carga Tendo em vista todos os fatores influentes sobre a migrao eletrofortica, consideremos uma soluo em que haja uma mistura de macromolculas com tamanhos e/ou cargas diferentes. Ao aplicarmos uma diferena de potencial a esta soluo, as molculas migraro com velocidades e/ou direes diferentes, dependendo de seus tamanhos e cargas. Ao final de um dado intervalo de tempo, ao desligarmos a fonte da diferena de potencial, cada tipo de molcula estar em um lugar diferente da soluo no espao entre o plo positivo e o plo negativo. Essa potencialidade da eletroforese usada para separar macromolculas contidas numa mistura complexa. Com efeito, a eletroforese encontra inmeras aplicaes tanto na pesquisa e no desenvolvimento biotecnolgico baseados na tecnologia do DNA recombinante quanto nos diagnsticos clnico e forense (CHELIAK,1984). Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromolculas, podemos separ-las mais com base na carga ou mais com base em seu tamanho. Na eletroforese em suporte de papel, a frico com o suporte que as macromolculas experimentam pequena, o que faz com que o tamanho da molcula no influencie profundamente a sua velocidade de migrao. Sendo assim, as molculas so preferencialmente separadas com base em suas cargas. Esse tipo de eletroforese encontra grande utilidade na separao de protenas que, devido variada composio de seus aminocidos, apresentam grandes diferenas na carga total. Sendo substncias anflitas, as protenas adquirem carga positiva ou negativa em funo do pH. , portanto, conveniente manter o pH do meio estvel durante a eletroforese, mediante o uso de solues-tampo. O sistema-tampo consiste de duas partes: o tampo do gel, usado no preparo do gel, e o tampo dos eletrodos (catodo/anodo), usado nos respectivos tanques. Em virtude do contado eltrico dos plos com as solues-tampo dos tanques haver participao dos componentes dos respectivos tanques na neutralizao da base formada no catodo e do cido formado no anodo. As solues-tampo estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo da corrente eltrica, mas geralmente elas so inertes no processo eletrofortico. Todavia, algumas solues-tampo, como as constitudas de borato ou fosfato, podem complexar-se com carboidratos ou protenas, respectivamente. O tampo deve, portanto, ter acentuada condutividade eltrica. costume serem aplicado, para este propsito, eletrlitos na concentrao de 0,05 a 0,5M. em geral, solues-tampo mais concentradas fornecem melhor resoluo, embora o tempo de separao seja maior. Uma partcula com carga eltrica migrar sob a ao da fora eltrica, acelerando-se at que sua frico com o meio torne a sua velocidade uniforme. Isso ocorre costumeiramente em espao de tempo curto, em geral, poucos segundos depois de ligada a corrente eltrica. Uma vez alcanada a velocidade uniforme, o on migrante encontra-se em equilbrio

dinmico, o steady state. Ento: fora eltrica = fora de frico. A eletroforese em papel no til na separao de cidos nuclicos, pois a quantidade de cargas por massa molar de cido nuclico praticamente constante, independentemente do tamanho ou da seqncia de nucleotdeos da molcula. Sendo assim, todas as molculas de cido nuclico em uma soluo sofreriam a mesma atrao eletrosttica pelo plo positivo. Mas, como o suporte de papel no apresenta grande capacidade de separar molculas com base no tamanho molecular, os diferentes fragmentos de cido nuclico no seriam separados nesse suporte. Esse problema resolvido nos suportes em gel. Nestes suportes, como a soluo est contida na trama do gel, a frico entre as macromolculas e o suporte grande. Ou seja, os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as molculas com base no tamanho molar, sendo praticamente o nico tipo de suporte para eletroforese utilizado para a separao de fragmentos de cidos nuclicos. 2.2 FUNDAMENTOS PRTICOS 2.2.1 Corrente eltrica A passagem da corrente eltrica atravs de uma soluo segue a Lei de Ohm, na qual: V = RI Em que V = voltagem, R = resistncia e I = amperagem. A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem (corrente) ou, ento, wattagem (potncia) constantes reguladas pela fonte eltrica. medida que as molculas migram no campo eltrico, a resistncia geralmente aumenta. Ento, a amperagem diminui sob voltagem constante, ou esta aumenta sob amperagem constante. As variaes na intensidade da corrente ou na voltagem podem ser detectadas na fonte de energia, anotando-se os respectivos valores no inicio e no final da corrida eletrofortica. A escolha da voltagem, amperagem ou wattagem feita empiricamente. A energia da corrente eltrica manifesta-se, em parte, pelo calor emanado, cuja intensidade pode ser expressa pela seguinte equao: c = W t / 4,18 Em que c = calorias, W = wattagem e t = tempo, em segundos: W=VI Em que V = voltagem e I = amperagem. A temperatura elevada tende a desnaturar as protenas, o que acarreta, no raro, alguma perda de atividade enzimtica. Quanto mais alta a voltagem ou a intensidade da corrente, mais ser tambm o calor emanado. Visando manter a temperatura baixa

durante a eletroforese, o gel resfriado com o auxlio de uma coluna de gua fria em dispositivo apropriado inserido na cuba ou efetuando-se a corrida em geladeira.

2.2.2 A eletroforese realizada com suportes Apesar de corresponder a uma migrao de cargas em soluo, a eletroforese no normalmente realizada em solues puras. Isso porque as solues esto sujeitas a uma srie de influncias fsicas do ambiente que lhes causam perturbaes. Dentre as inmeras fontes dessas perturbaes destacam-se as ondas mecnicas e at mesmo movimentos de conveco do lquido pelo aquecimento da soluo causado pela aplicao da diferena de potencial. As perturbaes fazem com que a eletroforese, nessas condies, seja um processo muito pouco reprodutvel, com as cargas de mesma natureza no migrando juntas, mas sim, dispersas. Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais perturbaes eletroforese so minimizadas. Esses sistemas utilizam matrizes rgidas - conhecidas como suportes - com as quais a soluo interage e que diminuem as perturbaes mecnicas e os movimentos de conveco no lquido. Existem dois tipos bsicos