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NORMA TCNICA

L5.214
Ago/2007 30 PGINAS

Coliformes totais - determinao pela tcnica de membrana filtrante: mtodo de ensaio

Companhia Ambiental do Estado de So Paulo Avenida Professor Frederico Hermann Jr., 345 Alto de Pinheiros CEP 05459-900 So Paulo SP Tel.: (11) 3133 3000 Fax.: (11) 3133 3402 http: // w w w . c e t e s b . s p . g o v . b r

COLIFORMES TOTAIS DETERMINAO PELA TCNICA DE MEMBRANA FILTRANTE MTODO DE ENSAIO

L5.214 Ago/07

SUMRIO

Pgina

Introduo...................................................................................................................................... 1
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2 3 4 5 6 7 8 9

Objetivo...................................................................................................................................... 2 Documentos Complementares................................................................................................. 3 Definies................................................................................................................................... 3 Aparelhagem............................................................................................................................. 4 Meios de culturas e solues.................................................................................................. 10 Execuo de ensaio..................................................................................................................15 Resultados................................................................................................................................23 Testes complementares para confirmao de coliformes totais.........................................29 Referncias..............................................................................................................................30

Introduo A poluio das guas por material fecal de origem humana e animal torna esse elemento um veculo de transmisso de doenas infecciosas causadas por bactrias, vrus, protozorios e helmintos. Devido ao seu elevado potencial de disseminao, essas doenas representam um importante risco sade humana, e so responsveis por elevada morbidade e mortalidade, principalmente entre crianas dos pases em desenvolvimento (WORLD HEALTH ORGANIZATION 2004). A deteco de microganismos patognicos, embora necessria em algumas circunstncias, no aplicvel para fins de monitoramento ou verificao de rotina. Por esse motivo, uma das estratgias mais viveis para o controle da qualidade microbiolgica da gua a avaliao da presena dos chamados microrganismos indicadores de contaminao fecal. Esses microrganismos devem possuir uma srie de caractersticas, dentre elas, estar presente em grande quantidade em fezes humanas e de animais de sangue quente, no se multiplicar em guas naturais e ser detectvel por mtodos laboratoriais simples e rpidos. Alguns microrganismos atendem maior parte desses requisitos, destacando-se dentre eles as bactrias do grupo coliforme. Tratam-se de bactrias pertencentes famlia Enterobacteriaceae, e sua definio no se baseia unicamente em critrios taxonmicos, mas inclui igualmente vrias caractersticas observadas nos mtodos analticos utilizados para sua deteco. Assim, as

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bactrias do grupo coliforme so definidas como bacilos aerbicos e anaerbicos facultativos, Gram-negativos, no formadores de esporos, capazes de crescer na presena de concentraes relativamente elevadas de sais biliares e fermentar a lactose na temperatura de 35 - 37C, com formao de cido, gs e aldedo, em 24 a 48 horas. A Escherichia coli e os coliformes termotolerantes so um subgrupo dos coliformes totais que podem fermentar a lactose em temperaturas mais elevadas (WORLD HEALTH ORGANIZATION 2004, STANDING COMMITTEE OF ANALYSTS 2002). Mais recentemente, foram includos critrios adicionais para caracterizao de uma bactria como pertencente ao grupo coliforme, dentre eles a expresso da atividade da -D-galactosidase, uma das enzimas responsveis pela fermentao da lactose (LECLERC 2001). Alm da origem fecal, vrias bactrias do grupo dos coliformes totais so exclusivamente ambientais e podem multiplicar-se na gua e em biofilmes. Por esse motivo, elas no so atualmente utilizadas como indicadoras de contaminao fecal, mas sim para avaliao da eficincia do tratamento, da limpeza e integridade dos sistemas de distribuio e da presena potencial de biofilmes (WORLD HEALTH ORGANIZATION 2004, STANDING COMMITTEE OF ANALYSTS 2002). A Escherichia coli a nica bactria do grupo dos coliformes totais cujo habitat exclusivo o trato intestinal de humanos e de animais de sangue quente, sendo geralmente a bactria predominante do subgrupo dos coliformes termotolerantes. Por esse motivo, a E. coli considerada o indicador ideal de contaminao fecal, mas so igualmente aceitveis para esse fim os coliformes termotolerantes (LECLERC 2000, WORLD HEALTH ORGANIZATION 2004). Em concordncia com esses conceitos, a legislao brasileira sobre qualidade de guas destinadas ao consumo humano, guas minerais e guas naturais determina que sejam analisados os coliformes termotolerantes ou, preferencialmente, a E. coli, que devem estar ausentes nessas guas. Quanto aos coliformes totais, exigida ausncia na gua tratada, na sada do sistema, sendo aceitas determinadas porcentagens na rede de distribuio, enquanto que para guas minerais e guas naturais, estabelecido um limite mximo para essas bactrias. (BRASIL 2004, BRASIL 2005). A tcnica de membrana filtrante um dos mtodos que pode ser utilizado para a quantificao de coliformes em guas. uma tcnica muito reprodutvel, pode ser utilizada para grandes volumes de gua e, em geral, os resultados podem ser obtidos mais rapidamente em comparao com a tcnica de tubos mltiplos. bastante til no monitoramento da gua de consumo humano e outras guas naturais, mas apresenta algumas limitaes, quando a gua possui turbidez elevada ou altas concentraes de bactrias no pertencentes ao grupo dos coliformes (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, 2005). A presente norma apresenta a determinao de coliformes totais, coliformes termotolerantes e Escherichia coli, pela tcnica de membrana filtrante, segundo o mtodo descrito no "Standard Methods" (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, 2005). 1 Objetivo Esta Norma prescreve a tcnica da membrana filtrante para a determinao da densidade de bactrias do grupo coliforme, com aplicao na:
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Avaliao da qualidade de guas tratadas ou brutas destinadas ao consumo humano (com ou sem simples desinfeco); Avaliao e controle de qualidade de mananciais que abastecem estaes de tratamento de gua; Avaliao e controle das guas destinadas recreao de contato primrio; Avaliao da qualidade de guas minerais; Avaliao e controle de guas destinadas criao natural intensiva ou ambas (aquicultura) de espcies destinadas alimentao humana; Deteco de contaminao fecal.

2 Documentos Complementares Os documentos relacionados a seguir contm disposies que constituem fundamento para esta norma. As edies indicadas estavam em vigor no momento desta publicao. Como toda norma est sujeita reviso e alteraes, aqueles que realizam procedimentos com base nesta, devem verificar a existncia de legislao superveniente aplicvel ou de edies mais recentes das normas citadas. Na aplicao desta norma necessrio consultar: CETESB (So Paulo). Guia de Coleta e Preservao de Amostras de gua. So Paulo, 1988; L5.216 Controle de Qualidade de Meios de Cultura. M1.001 Lavagem, Preparo e Esterilizao de Materiais em Laboratrios de Microbiologia.

3 Definies Para os efeitos desta norma so adotadas as definies de 3.1 a 3.7. 3.1 Coliformes totais Grupo de bactrias constitudo por bacilos Gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de esporos, oxidase negativos, capazes de crescer na presena de sais de bile ou outros agentes de superfcie com propriedades seletivas similares e que possuem a enzima galactosidase. Fermentam a lactose a 35-37C com produo de cido, gs e aldedo em 24-48 horas. So capazes de utilizar substratos cromognicos contendo -galactosdeo na temperatura de 35-37C. 3.2 Coliformes termotolerantes So os coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produo de cido e gs temperatura de 44-45C em 24 horas. 3.3 Escherichia coli Principal bactria do subgrupo dos coliformes termotolerantes, sendo de origem exclusivamente fecal. Dentre os coliformes, E. coli a nica bactria que possui a enzima -D glucoronidase,

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requerida para a hidrlise do MUG. 3.4 MUG (4 metilumbeliferil -D glicurondeo) Substrato para a enzima -D glicuronidase, enzima presente em 95% das linhagens de E. coli. Esse substrato utilizado no meio EC-MUG para diferenciao de E.coli dos outros termotolerantes. 3.5 Bacilo Designao dada a bactrias que apresentam forma cilndrica. 3.6 Colorao de Gram Colorao diferencial, atravs da qual as bactrias so classificadas em Gram-positivas ou Gramnegativas, dependendo da reteno ou no do corante cristal-violeta. As bactrias, nas quais o cristal-violeta retido, apresentam colorao roxa (Gram-positivas), e aquelas nas quais o cristal-violeta removido pela ao do lcool-acetona, coram-se posteriormente pela safranina, apresentando colorao rosa (Gram-negativas). 3.7 Teste de oxidase Este teste tem por finalidade evidenciar a presena da citocromo-oxidase, uma enzima da cadeia respiratria de certas bactrias. Esta enzima necessria para a oxidao do citrocromo c, segundo a seguinte reao: 2 citocromo-c-reduzido + 2H+ + 1/2O2
citocromo-oxidase

2 citocromo-c-oxidado + H2O

No teste de oxidase, o citocromo-c-oxidado, sofre reduo, ocorrendo a oxidao da tetrametil-pfenilenodiamina, formando-se uma substncia de colorao azul. As bactrias do grupo coliforme, por no possurem a citocromo-c-oxidase, apresentam resultado negativo neste teste. 4 Aparelhagem 4.1 Equipamentos 4.1.1 Balana Com sensibilidade de, no mnimo, 0,1g ao serem pesados 150g. As balanas devem ser colocadas em local adequado, protegidas de vibraes, umidade e mudanas bruscas de temperatura. 4.1.2 Banho-maria Equipado com termostato e agitador de baixa velocidade, para promover a circulao da gua e manter a temperatura uniforme na faixa requerida (44,5 0,2C) em todos os pontos. O termmetro utilizado para controle do banho-maria deve ter a escala graduada em incrementos de 0,2C ou menos. A quantidade de gua no banho-maria deve ser suficiente para atingir a
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altura do nvel do meio de cultura nos tubos de ensaio imersos para incubao. 4.1.3 Destilador de gua ou aparelho para desionizao Deve produzir gua que obedea aos critrios de qualidade estabelecidos pela Agncia Ambiental Americana no Manual for the Certification of Laboratories Analyzing Drinking Water (UNITED STATES EPA, 2005). 4.1.4 Equipamentos para esterilizao 4.1.4.1 Autoclave Deve ter capacidade suficiente para permitir a circulao do vapor ao redor do material a ser esterilizado. Deve manter a temperatura de esterilizao de 121C durante o ciclo, o qual no deve exceder 45 minutos para um tempo de esterilizao de 15 minutos.1 4.1.4.2 Estufa para esterilizao Deve manter a temperatura de 170 a 180C durante o perodo de esterilizao (mnimo de duas horas). O termmetro utilizado para controle de temperatura deve ter a escala graduada em incrementos de 10C ou menos, com seu bulbo colocado em areia, durante o uso. 4.1.5 Equipamentos para filtrao 4.1.5.1 Bomba de vcuo ou outro dispositivo conveniente para produzir uma presso diferencial no porta-filtro de, no mnimo, 0,5atm. 4.1.5.2 Frasco Kitassato de paredes espessas, para filtrao, com capacidade adequada, ou suporte para os porta-filtros, individual ou mltiplo ("manifold"). 4.1.5.3 Frasco para proteo, com capacidade adequada , conectado ao frasco de filtrao (ou ao suporte) e fonte de vcuo atravs de tubo de polietileno ou de ltex de espessura adequada. 4.1.5.4 Porta-filtro de vidro, plstico autoclavvel ou ao inoxidvel, para membranas de 47mm de dimetro (Figura 1). 4.1.6 Incubadora bacteriolgica Deve manter a temperatura uniforme na faixa requerida (35 0,5C ou 44,5 0,2C). O termmetro utilizado para o controle da incubadora deve ter a escala graduada em incrementos de 0,5C ou menos, para a faixa de temperatura de 35 0,5C e de 0,2C ou menos , para a faixa de temperatura de 44,5 0,2C, e estar imerso em gua.2

As autoclaves mais modernas que possuem portas deslizantes, com abertura e fechamento automticos, ciclos programveis de esterilizao e monitoramento contnuo de temperatura e presso, tambm podem apresentar etapas de resfriamento e remoo do vapor como parte do ciclo; para esses equipamentos, no requerido o tempo estrito de 45 minutos para o ciclo, desde que os registros impressos indiquem a operao do ciclo normal e o resfriamento durante a exausto e remoo do vapor. Para atender ao rgido controle de temperatura requerido nas determinaes de coliformes termotolerantes deve-se utilizar um banho-maria ou incubadora que comprovadamente proporcione esse controle.

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4.1.7 Microscpio estereoscpio binocular Para ampliao de 10 a 15 dimetros. Para iluminao, usar lmpada de luz fluorescente branca (fria). 4.1.8 Potencimetro Deve fornecer exatido mnima de 0,1 unidade de pH. 4.1.9 Refrigerador Deve manter a temperatura na faixa de 2 a 8C, e ter capacidade para conter os meios de cultura e as solues a serem mantidas sob refrigerao. O termmetro utilizado para controle de temperatura deve ser graduado em incrementos de 1C ou menos. 4.2 Vidraria e materiais plsticos 4.2.1 Bales De borossilicato, vidro neutro ou plstico autoclavvel atxico, com capacidade adequada para conter a gua de diluio a ser usada no enxge dos porta-filtros, durante a filtrao das amostras. 4.2.2 Frasco para coleta de amostra De vidro neutro ou plstico autoclavvel atxico, com capacidade mnima de 125mL, com boca larga e tampa prova de vazamento. 4.2.3 Provetas3 Graduadas (100mL) com erro volumtrico inferior a 2,5%. 4.2.4 Tubos de ensaio De borossilicato ou vidro neutro de 15mm de dimetro x 150mm de comprimento (com tampa de rosca de material atxico), de 15 ou 16mm de dimetro x 150mm de comprimento (com tampas frouxas) e de 12mm de dimetro x 120mm de comprimento. 4.2.5 Tubos de Durhan De borossilicato ou vidro neutro, de 9mm de dimetro e 45mm de comprimento. 4.2.6 Frasco para gua de diluio De borossilicato ou vidro neutro, com tampa de rosca que permita boa vedao e seja livre de substncias txicas, com capacidade para conter 90 2mL de gua de diluio tamponada, deixando um espao suficiente para permitir uma boa homogeneizao quando se efetuar a agitao.
3 Em alternativa s provetas, podem ser utilizados porta-filtros graduados, com erro volumtrico inferior a 2,5%

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4.2.7 Pipetas Tipo Mohr, para 10mL, 5mL, 2mL e 1mL, com graduao de 1/10 e erro volumtrico inferior a 2,5%, com bocal para tampo de algodo. Podem ser utilizadas pipetas descartveis de plstico, estreis, ou de vidro borossilicato. 4.2.8 Placas de Petri Devem ser de borossilicato ou de vidro neutro de boa qualidade, com 100mm de dimetro e 15mm de altura ou de plstico no txico, de 90mm de dimetro e 15mm de altura. 4.3 Outros materiais 4.3.1 Alas de inoculao Fio de nquel-cromo, platina-irdio ou platina, com 0,5mm de dimetro e 7 a 8cm de comprimento, com um aro de 3mm de dimetro numa extremidade e a outra fixada a um cabo metlico (cabo de Kolle).4 4.3.2 Bandejas de plstico ou ao inoxidvel Devem ser forradas com material absorvente embebido em gua, para fornecer a umidade requerida durante a incubao das placas de Petri contendo as membranas aps a filtrao das amostras. 4.3.3 Bicos de Bunsen ou similar Devem ter funcionamento adequado, de modo a produzir combusto completa. 4.3.4 Caixas ou cestas de ao inoxidvel Para acondicionamento de materiais a serem esterilizados. 4.3.5 Estantes De ao inoxidvel ou galvanizado plastificado, de tamanho adequado para acomodao dos tubos de ensaio. 4.3.6 Estojo para pipetas Usar estojo de alumnio ou ao inoxidvel de tamanho adequado, para acondicionamento das pipetas a serem esterilizadas. Opcionalmente, as mesmas podem ser embrulhadas individualmente em papel apropriado para a esterilizao. 4.3.7 Membranas filtrantes De steres mistos de celulose, ou de steres de celulose e nitrato de celulose, com 47mm de dimetro e 0,45m de porosidade, brancas, quadriculadas e estreis.
4 Opcionalmente ao uso de alas de inoculao, podem ser empregadas hastes de madeira de aproximadamente 20cm de comprimento e 0,2cm de dimetro. Antes do uso, essas hastes so esterilizadas por calor seco (170-180C) durante 2 horas. Aps o uso, as mesmas so autoclavadas a 121C durante 30 minutos e descartadas.

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4.3.8 Pinas De ao inoxidvel, com as extremidades arredondadas. 4.3.9 Placas de Petri para membrana filtrante De plstico no txico, estreis, bem vedadas, de 49mm de dimetro x 13mm de altura. 4.3.10 Termmetros Os termmetros de mercrio devem ter escala adequada ao uso e a coluna no deve apresentar interrupes. Tambm podem ser utilizados termmetros eletrnicos digitais, desde que apresentem faixa, sensibilidade e exatido adequadas. 4.3.11 Lmpada ultravioleta Lmpada de luz ultravioleta de comprimento de onda de 365nm e 6 watts de potncia.

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FIGURA 1 - Vista geral dos diversos componentes da unidade de filtrao

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5 Meios de culturas e solues 5.1 m-Endo gar LES 5.1.1 Frmula Extrato de levedura----------------------------------------------------------------------------------- 1,2 g Casitona ou tripticase--------------------------------------------------------------------------------- 3,7 g Tiopeptona ou tiotona-------------------------------------------------------------------------------- 3,7 g Triptose------------------------------------------------------------------------------------------------- 7,5 g Lactose--------------------------------------------------------------------------------------------------9,4 g Dihidrogeno fosfato de potssio (KH2 PO4).------------------------------------------------------ 1,0 g Monohidrogeno fosfato de potssio (K2HPO4) .------------------------------------------------- 3,3 g Cloreto de sdio (NaCl).----------------------------------------------------------------------------- 3,7 g Desoxicolato de sdio-------------------------------------------------------------------------------- 0,1 g Lauril sulfato de sdio------------------------------------------------------------------------------ 0,05 g Sulfito de sdio (Na2SO3).--------------------------------------------------------------------------- 1,6 g Fucsina bsica----------------------------------------------------------------------------------------- 0,8 g gar--------------------------------------------------------------------------------------------------- 15,0 g gua destilada (contendo 20mL de lcool etlico a 95%)----------------------------------- 1000mL pH final aps esterilizao: 7,2 0,2 5.1.2 Preparo

Pesar 51g do meio desidratado m-Endo gar LES e acrescentar 1000mL de gua destilada, contendo 20mL de lcool etlico a 95%. Deixar em repouso durante, aproximadamente, 15 minutos. Aquecer em banho-maria, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. No autoclavar. Estabilizar a temperatura do meio a 45-50C em banho-maria. A seguir, distribuir, assepticamente, volumes de 4 4,5mL em placas de Petri de 49mm x 13mm, estreis. No expor as placas luz solar durante a distribuio.
Observaes: a) evitar exposio excessiva ao calor durante a dissoluo, pois isto pode determinar a perda ou reduo da especificidade do meio. Para isto, aconselhvel preparar volumes de meio inferiores a 1L (cerca de 300mL); b) o lcool etlico, utilizado na concentrao de 2% (v/v), deve ser de grau analtico (p.a.). lcool etlico desnaturado no deve ser empregado, pois os desnaturantes utilizados so o metanol e o propanol, ambos txicos para os coliformes. A finalidade da adio de lcool etlico no m-Endo gar LES a formao de steres, essenciais ao desenvolvimento das colnias de coliformes com brilho mximo e a inibio do crescimento de um nmero significativo de organismo no coliformes, evitando o crescimento confluente.

5.1.3

Armazenamento

O meio preparado dever ser estocado sob refrigerao, ao abrigo da luz, durante, no mximo, duas semanas. 5.2 Caldo Lauril Triptose com prpura de bromocresol 5.2.1 Frmula Triptose----------------------------------------------------------------------------------------------- 20,0 g Lactose--------------------------------------------------------------------------------------------------5,0 g
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Dihidrogeno fosfato de potssio (KH2 PO4)------------------------------------------------------ 2,75 g Monohidrogeno fosfato de potssio (K2HPO4)-------------------------------------------------- 2,75 g Cloreto de sdio (NaCl)------------------------------------------------------------------------------ 5,0 g Lauril sulfato de sdio-------------------------------------------------------------------------------- 0,1 g Prpura de bromocresol-----------------------------------------------------------------------------0,01 g gua destilada------------------------------------------------------------------------------------- 1000mL pH final aps esterilizao: 6,8 0,2 5.2.2 Preparo Pesar 35,6 g do meio desidratado Caldo lauril triptose e acrescentar 1000mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Em tubos de ensaio de 16mm x 150mm, contendo em seu interior tubos de Durham invertidos, distribuir volumes adequados para que o volume final, aps esterilizao, seja de 10mL. Tamponar e esterilizar em auctoclave a 121C, durante 15 minutos.5 5.2.3 Armazenamento O meio reparado poder ser estocado ao abrigo da luz e temperatura ambiente, durante, no mximo, duas semanas (tubos com tampas frouxas) ou durante trs meses (tubos com tampa de rosca). 5.3 Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% - C.L.V.B.B. 5.3.1 Frmula Peptona------------------------------------------------------------------------------------------------ 10,0 g Lactose------------------------------------------------------------------------------------------------ 10,0 g Bile de boi desidratada------------------------------------------------------------------------------ 20,0 g Verde brilhante------------------------------------------------------------------------------------ 0,0133 g gua destilada------------------------------------------------------------------------------------- 1000mL pH final aps esterilizao: 7,2 0,2 5.3.2 Preparo Pesar 40g do meio desidratado Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% e acrescentar 1000mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Em tubos de ensaio de 16mm x 150mm, contendo em seu interior tubos de Durham ou no invertidos, distribuir volumes adequados para que o volume final, aps esterilizao, seja de 10mL. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos.6 5.3.3 Armazenamento O meio preparado poder ser estocado ao abrigo da luz e temperatura ambiente, durante, no mximo, duas semanas, (tubos com tampas frouxas) ou durante trs meses (tubos com tampa de rosca).

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No preparo desse meio, evitar aquecimento excessivo durante a dissoluo e a esterilizao. O tempo transcorrido entre seu preparo e esterilizao no deve exceder duas horas. Ver nota de rodap n5.

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5.4 Meio EC 5.4.1 Frmula Triptose------------------------------------------------------------------------------------------------ 20,0g Lactose--------------------------------------------------------------------------------------------------5,0 g Mistura de sais biliares ou sais biliares n 3------------------------------------------------------- 1,5 g Dihidrogeno fosfato de potssio (KH2 PO4).------------------------------------------------------- 1,5 g Monohidrogeno fosfato de potssio (K2HPO4)..-------------------------------------------------- 4,0 g Cloreto de sdio (NaCl).----------------------------------------------------------------------------- 5,0 g gua destilada------------------------------------------------------------------------------------- 1000mL pH final aps esterilizao: 6,9 0,2 5.4.2 Preparo Pesar 37g do meio desidratado EC e acrescentar 1000mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Em tubos de ensaio de 16mm x 150mm contendo em seu interior tubos de Durham invertidos, distribuir volumes adequados para que o volume final, aps esterilizao, seja de 10mL. Tamponar e esterilizar em auctoclave a 121C, durante 15 minutos. 5.4.3 Armazenamento O meio preparado poder ser estocado ao abrigo da luz e temperatura ambiente, durante, no mximo, duas semanas, (tubos com tampas frouxas) ou durante trs meses (tubos com tampa de rosca). 5.5 Meio EC-MUG 5.5.1 Frmula Triptose----------------------------------------------------------------------------------------------- 20,0 g Lactose-------------------------------------------------------------------------------------------------5,0 g Mistura de sais biliares ou sais biliares n 3------------------------------------------------------ 1,5 g Dihidrogeno fosfato de potssio (KH2 PO4).------------------------------------------------------1,5 g Monohidrogeno fosfato de potssio (K2HPO4)..------------------------------------------------- 4,0 g Cloreto de sdio (NaCl).---------------------------------------------------------------------------- 5,0 g 4-metil-umbeliferil--D-glicurondeo (MUG)--------------------------------------------------- 0,05g gua destilada------------------------------------------------------------------------------------- 1000mL pH final aps esterilizao: 6,9 0,2 5.5.2 Preparo Pesar 37,1g do meio desidratado EC-MUG e acrescentar 1000mL de gua destilada fria. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Em tubos de ensaio de 15mm x 150mm com tampa de rosca e que no apresentam fluorescncia sob luz ultravioleta (comprimento de onda de 365nm), distribuir volumes adequados para que o volume final, aps esterilizao, seja de 10mL. Esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos.

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5.5.3 Armazenamento O meio preparado poder ser estocado ao abrigo da luz e temperatura ambiente, durante, no mximo, duas semanas, (tubos com tampas frouxas) ou durante trs meses (tubos com tampa de rosca). 5.6 gar eosina-azul de metileno (segundo Levine) 5.6.1 Frmula Peptona.................................................................................................................................10,0g Lactose................................................................................................................................. 10,0g Monohidrogeno fosfato de potssio (K2HPO4)...................................................................... 2,0g Eosina.....................................................................................................................................0,4g Azul de metileno................................................................................................................ 0,065g gar......................................................................................................................................15,0g gua destilada................................................................................................................. 1000mL pH final aps esterilizao: 7,1 0,1 a 25C 5.6.2 Preparo Pesar 37,5g do meio desidratado gar eosina-azul de metileno e acrescentar 1000mL de gua destilada fria, deixando em repouso durante, aproximadamente, 15 minutos. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio. Estererilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos. Distribuir volumes de aproximadamente 12mL em placas de Petri de 15mm x 90mm.
Observaes: a) durante a esterilizao, poder ocorrer descolorao do meio, o qual voltar colorao normal aps o resfriamento. b) aps a autoclavao, pode ocorrer a formao de um precipitado, o qual deve ser ressuspenso, atravs de homogeneizao lenta do meio no frasco, antes de sua distribuio em placas de Petri.

5.6.3 Armazenamento O meio preparado dever ser estocado sob refrigerao, durante, no mximo, duas semanas. 5.7 gar nutriente 5.7.1 Frmula Peptona...................................................................................................................................5,0g Extrato de carne..................................................................................................................... 3,0g gar......................................................................................................................................15,0g gua destilada................................................................................................................. 1000mL pH final aps esterilizao: 6,8 0,1 a 25C 5.7.2 Preparo Pesar 23g do meio desidratado gar nutriente e acrescentar 1000mL de gua destilada fria, deixando em repouso durante, aproximadamente, 15 minutos. Aquecer, agitando freqentemente, at a completa dissoluo do meio, tomando cuidado para que no seja atingida
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a temperatura de ebulio. Distribuir volumes de 6 a 7mL em tubos de ensaio de 12mm x 120mm. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos. Aps a autoclavao e enquanto o meio estiver quente, colocar os tubos em posio inclinada at que o meio se solidifique. 5.7.3 Armazenamento O meio preparado dever ser estocado sob refrigerao, durante, no mximo, duas semanas. 5.8 gua de diluio 5.8.1 Frmula Soluo-estoque A--------------------------------------------------------------------------------- 1,25mL Soluo-estoque B--------------------------------------------------------------------------------- 5,00mL gua destilada------------------------------------------------------------------------------------- 1000mL pH final aps esterilizao: 7,2 0,2 5.8.2 Preparo

a) preparar a soluo-estoque A com a seguinte composio: Dihidrogeno fosfato de potssio (KH2PO4).------------------------------------------------------34,0 g gua destilada .----------------------------------------------------------------------------------- 1000mL Preparo: Dissolver dihidrogeno fosfato de potssio em 500mL de gua destilada, ajustar o pH para 7,2 0,5 com soluo de hidrxido de sdio 1N e completar o volume para 1 litro com gua destilada. Distribuir volumes adequados necessidade de uso do laboratrio em frascos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos. Armazenar em geladeira, durante no mximo 2 meses.7 b) preparar a soluo-estoque B com a seguinte composio: Cloreto de magnsio hexaidratado (MgCl2.6H2O)---------------------------------------------- 81,1g gua destilada q.s.p.------------------------------------------------------------------------------ 1000mL Preparo: Dissolver o cloreto de magnsio em 500mL de gua destilada e completar o volume para 1000mL com gua destilada. Distribuir volumes adequados necessidade do laboratrio em frasco com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos. Armazenar em geladeira, durante no mximo 2 meses. c) adicionar 1,25mL da soluo-estoque A e 5mL da soluo-estoque B em um litro de gua destilada; d) distribuir, em frascos de diluio, quantidades adequadas para que o volume final, aps esterilizao, seja de 90 2mL;8 e) tamponar e esterilizar em autoclave a 121C, durante 15 minutos.

7 8

Antes da utilizao da soluo-estoque A deve-se verificar se no h quaisquer evidncias de contaminao microbiana (turbidez,presena de material em suspenso). Em caso afirmativo, essa soluo deve ser descartada. A gua de diluio a ser utilizada no enxge de porta-filtro, aps a filtrao de cada amostra, pode ser distribuda em bales, erlenmeyers, ou frascos de polipropileno, em volumes adequados s necessidades de uso do laboratrio, devendo ser observado o tempo requerido para a esterilizao por autoclavao, de acordo com o volume de gua por balo e a carga da autoclave (exemplo: 30 minutos para volumes de 500 e 1000mL).

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5.8.3

Armazenamento

A soluo preparada poder ser estocada ao abrigo da luz e temperatura ambiente, durante, no mximo, duas semanas. 5.9 Soluo de hidrxido de sdio 1N 5.9.1 Frmula Hidrxido de sdio (NaOH) ------------------------------------------------------------------------ 40,0g gua destilada q.s.p.------------------------------------------------------------------------------ 1000mL 5.9.2 Preparo Pesar 40,0g de hidrxido de sdio, colocar em um balo volumtrico e completar o volume para 1000mL com gua destilada. Homogeneizar bem at a completa dissoluo do hidrxido de sdio. 5.9.3 Armazenamento Em frasco com tampa de rosca. Manter em temperatura ambiente, durante no mximo 6 meses. 5.10 Reagentes para o teste de oxidase 5.10.1 Frmula Cloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina.------------------------------------------------------- 0,1 g gua destilada.-------------------------------------------------------------------------------------- .10mL 5.10.2 Preparo Pesar o cloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina e acrescentar 10mL de gua destilada. Homogeneizar bem at a sua completa dissoluo. 5.10.3 Armazenamento Em frasco mbar, sob refrigerao, durante, no mximo, uma semana. 6 Execuo do ensaio 6.1 Princpio do mtodo A tcnica de membrana filtrante para quantificao de coliformes baseia-se na filtrao de volumes adequados de gua, mediante presso negativa (vcuo), atravs de membrana filtrante com porosidade de 0,45m. As bactrias, apresentando dimenses maiores que o poro da membrana, ficaro retidas em sua superfcie, a qual ser ento transferida para uma placa de Petri, contendo o meio de cultura seletivo e diferencial m-Endo gar LES. Por capilaridade, o meio se difundir para a membrana, entrando em contato com as bactrias e, aps um perodo de 22-24 h de incubao a 35 0,5C se desenvolvero colnias de coliformes. Para a confirmao das colnias, faz-se a transferncia das mesmas para caldo lauril triptose, com posterior confirmao em caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%. Paralelamente verificao das colnias, pode-se obter a diferenciao para coliformes termotolerantes ou E. coli. Essa
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diferenciao pode ser feita qualitativamente (item 6.6.1) ou quantitativamente (item 6.6.2), transferindo-se todo o crescimento da superfcie da membrana ou cada colnia para o meio diferencial EC ou EC-MUG. 6.2 Amostragem Deve ser efetuada segundo as especificaes apresentadas no Guia de Coleta e Preservao de Amostras de gua (CETESB, 1988). 6.3 Procedimento 6.3.1 Identificar a amostra a ser analisada e definir os volumes a serem filtrados em funo de sua procedncia, segundo especificaes a seguir: a) para guas destinadas ao consumo humano, requerida a anlise de um volume mnimo de 100mL da amostra, o qual filtrado diretamente, no caso de guas de boa qualidade, ou subdividido em volumes menores, dependendo do grau de contaminao fecal que pode estar presente. b) para outros tipos de gua, incluindo guas superficiais marinhas ou doces, pode ser requerida a filtrao de volumes menores (diluies decimais da amostra), dependendo do grau de contaminao fecal presente. 6.3.2 Antes de iniciar o exame, desinfetar a bancada de trabalho, usando como desinfetante lcool etlico 70%. 6.3.3 Dispor sobre a mesma os seguintes materiais: a) porta-filtro(s) previamente esterilizado(s), adaptado(s) ao suporte de filtrao (Manifold), o qual conectado a um frasco kitassato, que por sua vez conectado a um frasco kitassato de proteo, e este fonte de vcuo; b) placas de Petri, de 49 x13mm, contendo o meio m-Endo gar LES, identificadas com o nmero da amostra e o volume a ser filtrado; c) pinas com as extremidades mergulhadas em lcool etlico contido em um bquer; d) bicos de Bunsen, para manter o ambiente assptico e efetuar a flambagem das pinas utilizadas; e) provetas graduadas estreis, com a abertura recoberta com papel alumnio, identificadas com o nmero da amostra. Podem ser utilizados porta-filtros graduados com marcao externa, desde que os mesmos apresentem erro volumtrico inferior a 2,5%; f) gua de diluio estril, contida em bales, erlenmeyers ou frascos de polipropileno de 1000mL; e
g)

membranas filtrantes de steres mistos de celulose, ou de ster de celulose e nitrato de celulose, com 47mm de dimetro e 0,45m de porosidade, brancas, quadriculadas e estreis.

6.3.4 Preparao do porta-filtro a) retirar a parte superior do porta-filtro e, com as extremidades de uma pina, previamente flambadas e resfriadas, colocar uma membrana filtrante estril, com a face quadriculada
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voltada para cima, centralizando-a sobre a parte inferior do porta-filtro;


b)

acoplar a parte superior do porta-filtro parte inferior, tomando cuidado para no danificar a membrana;

c) para o controle de contaminao de cada porta-filtro usado, efetuar a filtrao de um volume de 100mL de gua de diluio tamponada estril no incio de cada srie de filtrao e aps a filtrao de 10 amostras. 6.3.5 Preparao da amostra para a filtrao 6.3.5.1 Para volumes superiores a 10mL:
a) b)

homogeneizar a amostra no mnimo 25 vezes, inclinando o frasco, de modo a formar um ngulo de aproximadamente 45 entre o brao e o antebrao distribuir os volumes requeridos da amostra em provetas graduadas estreis, previamente identificadas e proceder filtrao conforme o item 6.3.6 .

6.3.5.2 Para volumes iguais ou inferiores a 10mL:


a)

homogeneizar a amostra conforme descrito em 6.3.5.1.a e, com o auxlio de uma pipeta estril, retirar o volume desejado e adicionar a um frasco contendo 90mL de gua de diluio estril (este volume servir apenas de suporte para que as possveis bactrias existentes na amostra se distribuam uniformemente na superfcie da membrana, ao ser efetuada a filtrao); homogeneizar e proceder filtrao conforme o item 6.3.6 .

b)

6.3.5.3 Para volumes decimais (diluies da amostra): a) efetuar as diluies decimais da amostra da seguinte forma: -

proceder a marcao de cada frasco de gua de diluio estril, anotando o nmero da amostra e a diluio que dever conter; homogeneizar a amostra (conforme o item 6.3.5.1.a) e, com uma pipeta estril de 10mL e obedecendo aos cuidados de assepsia, transferir 10mL da amostra para um frasco previamente identificado, contendo 90 2mL de gua de diluio estril. Estar preparada assim a primeira diluio decimal (101), sendo que 1mL da mesma corresponde ao volume de 0,1mL da amostra; repetir a operao segundo o item anterior, com o frasco contendo a diluio feita anteriormente (10 1) e desta, com uma nova pipeta estril de 10mL, transferir 10mL para um novo frasco, previamente identificado, contendo 90 2mL de gua de diluio estril. Prepara-se assim a segunda diluio decimal (10-2), sendo que 1mL da mesma corresponde ao volume de 0,01mL da amostra; proceder dessa maneira na seqncia das diluies desejadas (10-3, 10-4, ...10-8,...); aps o preparo das diluies e homogeneizao da diluio selecionada para a filtrao (conforme o item 6.3.5.1.a), retirar 1mL de cada diluio com uma pipeta estril e adicionar a frascos contendo 90mL de gua de diluio estril (este volume servir apenas de suporte para que as possveis bactrias existentes na amostra se distribuam uniformemente na superfcie da membrana, ao ser efetuada a filtrao). Homogeneizar e proceder a filtrao conforme o item 6.3.6.
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b)

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6.3.6 Filtrao da amostra e incubao 6.3.6.1 Verter cuidadosamente o volume da amostra a ser examinado no porta filtro, evitando que a gua respingue sobre as bordas superiores do mesmo. 6.3.6.2 Ligar o sistema ou a bomba de vcuo e proceder a filtrao. 6.3.6.3 Aps a filtrao, enxaguar o porta-filtro trs vezes com pores de 20-30mL de gua de diluio tamponada estril, para evitar a reteno de alguma bactria nas paredes internas do mesmo. 6.3.6.4 Desligar a vlvula de controle de vcuo do porta-filtro, ao finalizar a operao. Evitar a secagem excessiva da membrana filtrante, desligando o vcuo imediatamente aps o trmino do processo de filtrao. 6.3.6.5 Separar a parte superior do porta-filtro e, com uma pina, cujas extremidades foram flambadas e resfriadas, retirar com cuidado a membrana. Acoplar novamente a parte superior do porta-filtro inferior. 6.3.6.6 Obedecendo aos cuidados de assepsia, colocar cuidadosamente a membrana, com a superfcie quadriculada voltada para cima, na superfcie do meio de cultura contido na placa de Petri, devidamente identificada com o nmero da amostra e o volume filtrado.
Observao: Ao transferir a membrana para a superfcie do meio de cultura, observar que toda a rea da membrana deve ficar completamente aderida ao meio. Para isso, segurando a membrana pelas bordas (fora da rea de filtrao) com as extremidades da pina, previamente flambadas e resfriadas, coloc-la sobre o meio de cultura e efetuar um movimento giratrio da mesma, para permitir uma boa adeso. Se persistir a formao de bolhas entre a membrana e o meio de cultura, sempre com a extremidade da pina, levantar a borda da membrana mais prxima bolha para elimin-la, pois as bolhas impedem o contato das bactrias com o meio de cultura, dificultando, ou mesmo impedindo seu crescimento (Figura 2).

6.3.6.7 Tampar a placa de Petri. 6.3.6.8 Lavar novamente o porta-filtro com gua de diluio estril, e proceder a filtrao da prxima amostra.9 6.3.6.9 Aps as filtraes, colocar as placas contendo o meio de cultura e a membrana, em posio invertida em bandejas, em cujo fundo foram colocadas folhas de papel toalha (ou outro material absorvente) embebidas em gua e incubar as placas a 35 0,5C, durante 22-24 horas.

Os porta-filtros devem estar estreis no incio de cada srie de filtrao e, se houver um intervalo de 30 minutos entre uma filtrao e outra, os mesmos devem ser esterilizados novamente ou substitudos por outros estreis, para evitar uma contaminao acidental .

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FIGURA 2 - Colocao da membrana filtrante na superfcie do meio de cultura

6.3.7 Aps o perodo de incubao e com auxlio de um microscpio estereoscpio (com iluminao fluorescente branca, colocada em direo a mais prxima possvel da perpendicular em relao ao plano da membrana), efetuar a contagem das colnias tpicas e atpicas de coliformes.10 6.4 Leitura 6.4.1 Os limites aceitveis para a contagem de colnias de coliformes totais em m-Endo gar LES situam-se entre 20 a 80, sendo que a contagem total de todos os tipos de colnias deve ser inferior a 200. Para essa contagem, observar as figuras 3 e 4.

10 A colnia tpica de coliforme apresenta colorao rosa a vermelho-escura, com brilho metlico, que pode recobrir parcial ou totalmente sua superfcie. Colnias atpicas de coliformes podem ser vermelho-escuras, mucides ou nucleadas, sem brilho. Em geral, colnias cor-de-rosa, azuis ou incolores, sem brilho metlico so no-coliformes.

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FIGURA 3 - Modelo para contagem das colnias (o crculo interior indica a rea de filtrao e as linhas pontilhadas indicam a seqncia a ser seguida na contagem)

FIGURA 4 - Poro da membrana filtrante quadriculada, em aumento (as colnias so contadas nos quadrados indicados pela setas)

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6.4.2 No caso de terem sido filtrados vrios volumes, selecionar para leitura apenas aquele(s) que tiver(em) fornecido contagem de colnias dentro dos limites aceitveis. 6.4.3 Se a contagem em todos os volumes filtrados for inferior a 20 colnias de coliformes , no considerar o limite mnimo e efetuar a leitura em todas as placas correspondentes aos volumes filtrados da amostra. 6.4.4 Quando todos os volumes filtrados no apresentarem crescimento bacteriano, isto , contagens iguais a zero, expressar o resultado segundo o item 7.2.1.1. 6.4.5 Quando a estimativa visual do total de colnias for superior a 200, ou quando houver crescimento em toda rea de filtrao da membrana, sem colnias bem definidas (crescimento confluente), a contagem no efetuada. Nestes casos deve ser avaliada a necessidade de recoleta da amostra para seleo de volume mais adequados para filtrao de forma que sejam obtidas contagens de colnias dentro dos limites aceitveis. 6.5 Procedimento de confirmao de Coliformes Totais 6.5.1 Selecionar um nmero de 10 colnias tpicas e atpicas bem isoladas, para serem submetidas ao procedimento de confirmao (se o nmero total de colnias tpicas e atpicas, for menor que 10, confirmar todas as colnias). 6.5.2 Identificar tubos de caldo lauril triptose, em concentrao simples, de tal modo que a cada colnia corresponda um tubo de meio. 6.5.3 Com auxlio de uma agulha de inoculao, devidamente flambada e resfriada, ou com o auxlio de uma haste de madeira estril, transferir um inculo de cada colnia para o tubo de caldo lauril triptose correspondente. 6.5.4 Aps a transferncia, incubar todos os tubos de caldo lauril triptose a 35 0,5C durante 24 2 horas. 6.5.5 Aps o perodo determinado de incubao, efetuar a primeira leitura, considerando resultado positivo para os tubos que apresentarem gs no tubo de Durham invertido. Registrar os resultados. Os tubos com resultados negativos nessa leitura so reincubados e reexaminados aps 24 1 hora. 6.5.6 Efetuar a segunda leitura (48 3 horas), separando os tubos com resultado positivo e desprezando agora os tubos com resultado negativo. 6.5.7 Todos os tubos que apresentarem resultados positivos no caldo lauril triptose devero ser submetidos confirmao em caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% (C.L.V.B.B.) imediatamente aps as respectivas leituras. 6.5.8 Para essa confirmao, identificar inicialmente tubos de C.L.V.B.B. em correspondncia a cada tubo de caldo lauril triptose, com resultado positivo. 6.5.9 Homogeneizar bem as culturas positivas em caldo lauril triptose e, com uma ala de inoculao devidamente flambada e resfriada ou haste de madeira estril, retirar um inculo dessa cultura e transferi-lo para o tubo de C.L.V.B.B. correspondente, evitando a pelcula
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superficial que pode se formar no caldo lauril triptose. 6.5.10 Incubar todos os tubos de C.L.V.B.B. inoculados, durante 24 2 horas a 35 0,5C. 6.5.11 Efetuar a primeira leitura aps 24 2 horas, considerando teste confirmativo positivo para coliformes totais todos os tubos que apresentarem formao de gs no tubo de Durham invertido. Registrar os resultados. Os tubos que apresentarem resultados negativos nessa leitura so reincubados e reexaminados aps 24 1 hora. 6.5.12 Efetuar a segunda leitura (48 3 horas), separando os tubos com resultado positivo e desprezando agora os tubos com resultado negativo. 6.5.13 A partir do nmero de colnias confirmadas como coliformes totais, calcular a densidade destas bactrias conforme o item 7.1.1.
Observao: a) aceitvel a inoculao simultnea das colnias submetidas confirmao, para caldo lauril triptose e caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% (C.L.V.B.B.). A incubao e a leitura de ambos os meios de cultura devem ser efetuados segundo especificado em 6.5.4 a 6.5.13. b) nos casos em que ocorrerem colnias em grande nmero (superior a 200) ou o crescimento for confluente, remover todo o crescimento na superfcie da membrana, com auxlio de uma ala de inoculao (devidamente flambada e resfriada) ou uma haste de madeira estril, e transferir para um tubo de caldo lauril triptose. O prosseguimento do teste de confirmao efetuado conforme j descrito nos itens 6.5.4 a 6.5.13. Para a expresso dos resultados, observar o exposto no item 7.2.1.

6.6 Diferenciao para coliformes termotolerantes ou E. coli 6.6.1 O teste de diferenciao para coliformes termotolerantes ou E. coli pode ser feito de forma qualitativa, sendo requerida a ausncia destas bactrias em 100mL da amostra, segundo legislao vigente em nosso pas para avaliao da qualidade de guas de consumo humano. efetuado paralelamente confirmao para coliformes totais, aps ter sido efetuada a transferncia para caldo lauril triptose das colnias selecionadas para confirmao. Para sua realizao, observar a seqncia descrita a seguir: 6.6.1.1 Identificar, com o nmero da amostra, um tubo contendo meio EC ou EC-MUG, previamente mantido a 44,5 0,2C durante 30 minutos; 6.6.1.2 Com auxlio de uma ala de inoculao devidamente flambada e resfriada (ou haste de madeira estril) e aps ter sido efetuada a transferncia para caldo lauril triptose das colnias a serem confirmadas como coliformes totais (item 6.5.3), remover todo o crescimento bacteriano restante na superfcie da membrana filtrante e transfer-lo para o tubo de meio EC ou EC-MUG; 6.6.1.3 Incubar o tubo de EC ou EC-MUG, no mximo at 30 minutos aps a transferncia do crescimento bacteriano, em banho-maria ou incubadora, a 44,5 0,2C, durante 24 2 horas; 6.6.1.4 Aps esse perodo, proceder leitura e registro, considerando como resultado positivo, como segue: Coliformes termotolerantes: formao de gs, o qual fica retido no tubo de Durham invertido; E.coli: presena de fluorescncia azul no tubo aps leitura sob lmpada ultravioleta de comprimento de onda de 365nm (6 watts de potncia), em ambiente escuro.
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Observao: ao se efetuar a leitura do EC-MUG, utilizar um controle positivo (E. coli) e um controle negativo (meio no inoculado), a fim de se evitar um resultado falso-positivo devido a fraca autofluorescncia do meio EC MUG.

6.6.1.5 Expressar os resultados relativos a coliformes termotolerantes ou E. coli segundo o item 7.2.2.1. 6.6.1.6 Nos casos especificados na observao b do item 6.5.13 (nmero de colnias acima de 200 ou crescimento confluente), a diferenciao para coliformes termotolerantes ou E. coli efetuada a partir de tubo do caldo lauril triptose para o qual foi transferido todo o crescimento bacteriano da superfcie da membrana. 6.6.2 Para diferenciao quantitativa dos coliformes termotolerantes ou E. coli, deve ser realizada a seqncia descrita a seguir: 6.6.2.1 Identificar com o nmero da amostra o nmero de tubos de EC ou EC-MUG necessrios, previamente mantidos a 44,50,5 durante 30 minutos. Devem ser submetidas ao teste de diferenciao pelo menos 10 colnias tpicas. Se o nmero total de colnias for inferior a 10, todas devem ser submetidas ao teste. 6.6.2.2 Com o auxlio de uma ala de inoculao devidamente flambada e resfriada (ou haste de madeira estril), e aps ter sido efetuada a transferncia para caldo lauril triptose, transferir cada colnia para um tubo de EC ou EC MUG. 6.6.2.3 Incubar os tubos de EC ou EC-MUG, no mximo at 30 minutos aps a transferncia das colnias, em banho-maria ou incubadora, a 44,5 0,5 durante 24 2 horas. 6.6.2.4 Aps esse perodo proceder leitura e registro, considerando como resultado positivo: Coliformes termotolerantes: formao de gs, o qual fica retido no tubo de Durham invertido; E. coli: presena de fluorescncia azul no tubo sob lmpada ultravioleta de comprimento de onda de 365nm (6 watts de potncia), em ambiente escuro.

Observao: ao se efetuar a leitura do EC-MUG, utilizar um controle positivo (E. coli) e um controle negativo (meio no inoculado), a fim de se evitar um resultado falso-positivo devido a fraca autofluorescncia do meio EC -MUG.

6.6.2.5 Expressar os resultados de coliformes termotolerantes ou E. coli, conforme descrito no item 7.2.2.2. 7 Resultados

7.1 Clculo dos resultados 7.1.1 Coliformes totais

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7.1.1.1 Para contagens de colnias tpicas iguais ou inferiores a 10 calcular a densidade de coliformes totais em 100mL atravs da aplicao da seguinte frmula: Coliformes totais/100mL = N total de colnias confirmadas x 100 Volume filtrado da amostra (mL) Exemplo: Volume filtrado: 100mL Total de colnias no m-Endo gar LES : 9 Total de colnias submetidas confirmao em C.L.V.B.B.: 9 N de colnias com resultados positivos em C.L.V.B.B.: 7 Coliformes totais/100mL = 7 x 100 = 7 100 7.1.1.2 Para contagens de colnias tpicas superiores a 10, considerar as duas possibilidades seguintes: a) Quando todas as 10 colnias testadas apresentarem confirmao positiva (confirmao de 100%), considerar o seguinte: N total de colnias confirmadas = N total de colnias tpicas Calcular a densidade de coliformes totais por meio da aplicao da frmula descrita no item 7.1.1. b) Quando nem todas as 10 colnias testadas apresentarem confirmao positiva, h necessidade de se calcular inicialmente o nmero total de colnias confirmadas atravs de extrapolao aplicando a seguinte frmula:
N total de colnias tpicas x N total de colnias confirmadas N total de colnias confirmadas = N de colnias submetidas confirmao

A seguir, calcular a densidade de coliformes totais, aplicando a frmula descrita no item 7.1.1. Exemplo: Volume filtrado: 20mL Nmero total de colnias tpicas no m-Endo gar LES: 40 Nmero de colnias submetidas confirmao em C.L.V.B.B.: 10 Nmero total de colnias confirmadas (com resultados positivo) em C.L.V.B.B.: 8 N total de colnias confirmadas = 40 x 8 = 32 10 Coliformes totais/100 mL = 32 x 100 = 160 20 7.1.1.3 Se as contagens forem efetuadas em placas correspondentes a mais de um volume filtrado, conforme item 6.4.3, calcular a densidade em 100mL atravs da seguinte frmula:
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Soma das colnias confirmadas Coliformes totais/100mL = Soma dos volumes correspondentes (mL) Exemplos: a) Volumes filtrados: 4 de 25mL N total de colnias confirmadas: 16, 21, 17 e 14 Clculo da densidade de coliformes totais por 100mL: (16 + 21 + 17 + 14) x 100 = 68 (25 + 25 + 25 + 25) b) Volumes filtrados:70, 25 e 5mL N total de colnias confirmadas: crescimento confluente, 70 e 20 Clculo da densidade de coliformes totais por 100mL: (70 + 20) (25 + 5) x 100 = 300 x 100

7.1.1.4 Nos casos em que todos os volumes filtrados fornecerem contagens iguais a zero, se esses volumes no totalizarem 100mL, considerar como sendo 1 a contagem no maior volume filtrado e utilizar a frmula geral apresentada no item 7.1.1 para o clculo da densidade de coliformes totais em 100mL e item 7.2.1.1.b para a expresso dos resultados. 7.1.2 Coliformes termotolerantes ou E. coli 7.1.2.1 Para contagens de colnias tpicas iguais ou inferiores a 10, calcular a densidade de coliformes termotolerantes ou E. coli em 100mL por meio da seguinte frmula: Coliformes termotolerantes/100mL = N total de colnias diferenciadas Volume filtrado de amostra (mL) Exemplo: Volume filtrado: 100mL Total de colnias no m-Endo gar LES: 8 Total de colnias submetidas diferenciao: 8 N de colnias com resultados positivos em EC ou EC-MUG: 7 Coliformes termotolerantes ou E. coli/100mL = 7x100 = 7 100 7.1.2.2 Para contagens de colnias tpicas superiores a 10, submeter 10 colnias tpicas diferenciao e considerar as duas possibilidades seguintes: a) quando as 10 colnias testadas apresentarem resultado positivo para coliformes termotolerantes ou E. coli (diferenciao de 100%) : x 100

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N total de colnias confirmadas = N total de colnias tpicas Calcular a densidade de coliformes termotolerantes ou E. coli, por meio da frmula descrita no item 7.1.1.1. b) quando nem todas as 10 colnias testadas apresentarem resultado positivo para coliformes termotolerantes ou E. coli, necessrio calcular inicialmente o nmero total de colnias diferenciadas por extrapolao aplicando a seguinte frmula: Ntotal de colnias diferenciadas = N total colnias tpicas x N total colnias diferenciadas N colnias submetidas diferenciao Exemplo: Volume filtrado: 25mL Nmero total de colnias tpicas no m-Endo gar LES: 40 Nmero de colnias submetidas confirmao em EC ou EC-MUG: 10 Nmero total de colnias diferenciadas (com resultados positivos em EC ou EC-MUG): 5 N total de colnias confirmadas= 40 x 5 = 20 10 Coliformes termotolerantes ou E. coli/100mL = 20 x 100 = 80 25 7.2 Expresso dos resultados 7.2.1 Coliformes totais Unidades formadoras de colnias de coliformes totais por 100mL ou UFC de coliformes totais/100mL 7.2.1.1 Quando o(s) volume(s) filtrado(s) fornecer(em) contagem(s) igual(is) a zero, h dois casos a serem considerados: a) quando o(s) volume(s) filtrado(s) totalizar(em) 100mL: neste caso, expressar o resultado como: Unidade formadora de colnias de coliformes totais em 100mL = < 1 (Ausente) b) quando o(s) volume(s) filtrado(s) no totalizar(em) 100mL:neste caso, observar o exposto no item 7.1.1.4 para o clculo do resultado, expressando o valor obtido precedido do sinal < (menor que) Unidade formadora de colnias de coliformes totais em 100mL = < valor obtido 7.2.1.2 Quando a contagem no for efetuada, devido ao grande nmero de colnias tpicas e/ou atpicas que se desenvolveram na membrana (>200) ou ocorrncia de crescimento confluente, o
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resultado expresso em funo do resultado do teste de confirmao para coliformes totais: 7.2.1.3 Quando o teste de confirmao para coliformes totais for positivo, relatar o resultado como: Presena de coliformes totais - contagem prejudicada devido a crescimento confluente 7.2.1.4 Quando o teste fornecer resultado negativo, relatar o resultado final conforme item 7.2.1.1 a. 7.2.2 Coliformes termotolerantes ou E. coli 7.2.2.1 Teste qualitativo, expressar o resultado como: Coliformes termotolerantes ou E. coli: Presente ou Ausente em 100mL (de acordo com o resultado obtido no teste de diferenciao) 7.2.2.2 Teste quantitativo Unidades formadoras de colnias de coliformes termotolerantes/100mL ou E. coli/100mL ou UFC de coliformes termotolerantes ou E. coli/100mL

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Amostra

Filtrao

M-Endo agar LES 35C - 24h

Colnias tpicas e atpicas

Ausncia de colnia ou colonias de no coliformes Teste negativo para coliformes

Caldo lauril triptose 24-48h - 35C

Produo de gs

Ausncia de gs Teste negativo para coliformes totais

Caldo lactosado verde brilhante bile 24-48h - 35C

Meio EC / EC - MUG 24 h 45,5C

Produo de gs Teste positivo para coliformes totais

Ausncia de gs Teste negativo para coliformes totais

Produo de gs/ fluorescncia Teste positivo para coliformes termotolerantes / E.coli

Ausncia de gs/ fluorescncia Teste negativo para coliformes termotolerantes / E.coli

FIGURA 5 - Esquema de procedimentos para determinao de coliformes totais, coliformes termotolerantes ou E. coli pela tcnica de membrana filtrante

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8 Testes complementares para confirmao de coliformes totais 8.1 Teste para pesquisa de oxidase Este teste recomendado como um procedimento adicional de controle de qualidade analtica, devendo ser aplicado a, no mnimo, 10% das colnias tpicas que apresentarem resultados positivos no teste confirmativo para coliformes. O objetivo desse teste eliminar a possibilidade de resultados falsos-positivos, que podem ocorrer quando estiver presente na amostra a bactria Aeromonas hydrophila, que tem a capacidade de fermentar a lactose. Para a execuo deste teste, observar a seqncia descrita a seguir: a) para cada tubo positivo de C.L.V.B.B., correspondente confirmao de colnias tpicas em m-Endo gar LES, identificar placas de gar eosina-azul de metileno (EAM); b) homogeneizar bem a cultura positiva em C.L.V.B.B. e, inclinando o tubo, mergulhar a extremidade de uma ala de inoculao (devidamente flambada e resfriada), a uma profundidade de, aproximadamente, 1cm, para colher um inculo dessa cultura; c) depositar o inculo em um ponto nas bordas da placa de EAM, gir-la e iniciar seu espalhamento por estrias, at completar a semeadura em toda a sua superfcie; d) fechar a placa e incubar, em posio invertida, durante 24 2 horas a 35 0,5C; e) aps esse perodo de incubao, efetuar a leitura, considerando como tpicas de coliformes as colnias nucleadas, com ou sem brilho metlico; considerar como colnias atpicas de coliformes as colnias rseas, mucides, opacas, sem ncleo e, como colnias negativas, todos os outros tipos; f) selecionar uma colnia tpica bem isolada e, com auxlio de uma ala de inoculao devidamente flambada e resfriada, transferir um inculo da mesma para um tubo de gar nutriente, semeando-o por estrias na superfcie inclinada desse meio: g) incubar o gar nutriente durante 18-24 horas a 35 0,5C; h) a partir do crescimento em gar nutriente, efetuar o teste para pesquisa de oxidase; i) com auxlio de uma ala de inoculao de platina, devidamente flambada e resfriada, retirar uma pequena quantidade do crescimento em gar nutriente e tocar uma folha de papel de filtro, previamente colocada no fundo de uma placa de Petri estril e embebida em soluo de cloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina. A reao evidenciada pelo desenvolvimento de colorao azul intensa em aproximadamente 30 segundos, no local em que foi depositada a cultura. Se nenhuma ou discreta reao se desenvolver no perodo de dois minutos de observao, considera-se o resultado negativo. Os coliformes no possuem a enzima citocromo-oxidase, sendo esperada, portanto, resposta negativa neste teste. Para a realizao do teste, usar sempre, como controle positivo, uma cultura oxidase-positiva (Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila) e uma cultura oxidase-negativa (Escherichia coli).

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9 Referncias APHA; AWWA; WEF. Membrane filter technique for members of the coliform group. In: ______Standard methods for the examination of water and wastewater. 21th ed. . Washington, DC: APHA, 2005. Part 9222B. BORDNER, R.H. ; WINTER, J. A. (Ed.). Microbiological methods for monitoring the enviroment : water and wastes. Washington, DC: EPA, 1978. 338 p. (EPA/600/8-78-017; PB 290329/2BE). BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Portaria 518 de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade e d outras providncias. Dirio Oficial da Unio - Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 26 mar. 2004. Seo 1. Disponvel em:<http://www.anvisa.gov.br/e-legis>. Acesso em: mar. 2007. BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo RDC n 275 de 22 de setembro de 2005. Aprova o regulamento tcnico de caractersticas microbiolgicas para gua mineral natural e gua natural. Dirio Oficial da Unio - Repblica Federativa do Brasil, Poder Executivo, Braslia, DF, 23 set. 2005. Seo 1. Disponvel em <http://www.anvisa.gov.br/e-legis>. Acesso em: mar. 2007. CETESB (So Paulo).L4.214: Coliformes Totais: Determinao pela Tcnica de Membrana Filtrante. So Paulo, 1992 . 47 p. LECLERC, H.; MOSSEL, D.A.A.; EDBERG, S.C. Advances in the bacteriology of the coliform group: their suitability as markers of microbial water safety. Annual Reviews Microbiology . v.55, p. 301-234, 2001. UNITED KINGDOM. Environment Agency. Standing Committee of Analysts. The microbiology of drinking water: water quality and public health. Part 1. Nottingham, 2002. 50 p. (Methods for the Examination of Waters and Associated Materials, blue book 176). Disponvel em: <http://www.environment-agency.gov.uk/commondata/acrobat/mdwpart1.pdf>. Acesso em: mar. 2007. UNITED STATES. EPA. Microbiology. In _______. Manual for the certification of laboratories analyzing drinking water. 5th ed. Cincinnati, 2005. Chap. V-1 V-77. WHO. Guidelines for drinking water quality. 3rd ed. Genebra, 2004. v. 1: recommendations. Disponvel em: <http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/gdwq3rev/en/index.html> Acesso em: mar. 2007.

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