TEMA 5.

3 REPLICACIN DEL DNA

1. CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 2. LAS DNA POLIMERASAS 2.1. DNA polimerasas de E.coli 2.1.1. La DNApol I 2.1.2. La DNApol II 2.1.3. La DNApol III 2.2. DNA polimerasas eucariotas 3.3. Otras DNA polimerasas 3. ELEMENTOS PARTICIPANTES EN LA REPLICACIN 3.1. Sitios especficos de origen de la replicacin 3.1. Actividad Primasa 3.2. Actividad DNA-ligasa 3.3. Actividad Helicasa, Topoisomerasa (girasa) y protenas fijadoras de monohebra (SSB) 4. EL COMPLEJO DE REPLICACIN: MODELOS DE REPLICACIN. 4.1. E.coli como modelo bsico de para replicacin del DNA: modelo de lazo 4.1.1. Inicio y progresin de la sntesis de DNA 4.1.2. Terminacin de la sntesis de DNA 4.2. Modelo de replicacin de crculo rodante 5. LA REPLICACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS 5.1. Papel de las DNApolimerasas eucarioticas 5.2. El origen de replicacin en eucariotas 5.3. Replicacin del DNA en el extremo de cromosomas lineales 5.3.1. Telomerasas eucariotas Anexo: RECOMBINACIN, MUTACIN Y SISTEMAS DE REPARACIN DEL DNA

El metabolismo del DNA comprende el proceso mediante el cual se hacen copias fieles de las molculas de DNA (REPLICACIN), junto a los procesos que afectan a la estructura inherentes a la informacin (reparacin y recombinacin) Cada una de las cadenas es complementaria de la otra. Cada cadena molde parental genera una cadena hija cuya secuencia es predecible y complementaria Necesidad de alto grado de precisin (los errores cometidos pueden tener funestas consecuencias: el cambio es hereditario) y velocidad (molculas de millones de bases) Desafo: Separacin de hebras en lugar determinado y soportar la tensin (superenrollamiento que provoca)
Determinados procesos requieren intercambio de material entre molculas parentales: recombinacin: generacin de diversidad en secuencias de anticuerpos, integracin de genoma virco en DNA hospedador,

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff. 2).- Carcter semiconservativo. 3).- Sntesis de replicacin 53. 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff. 2).- Carcter semiconservativo. 3).- Sntesis de replicacin 53. 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

TIPOS HIPOTTICOS TIPOS HIPOT TICOS DE DE REPLICACIN REPLICACIN

CONSERVATIVA

SEMICONSERVATIVA

DISPERSIVA

EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL: REPLICACIN SEMICONSERVATIVA

Cultivo cel en medio pesado (15N)

Transfieren las cel a medio ligero (14N)

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff. 2).- Carcter semiconservativo. 3).- Sntesis de replicacin 53. 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Sentido de Sntesis (Replicacin): 5 Cebador(primer) 3-OH 5-P 3-OH DNA molde Sentido de Lectura del molde: 3 5
- Sentido de la sntesis 53

5-P

El DNA es sintetizado por Enzimas DNA polimerasas Precursores 5-trifosfato de nucletido y slo pueden unirse al 3-OH de la desoxiribosa
H

- Necesidad de Cebadores o Primers (la DNApol los necesita para empezar a copiar)
Sintetizados por Enzimas primasas: son AN (RNA) de 7-10 nucletidos (complementarios del extr. 3 cadena DNA molde), comienzo de sntesis para DNApol

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).Complementariedad entre bases dellos DNA (DNA molde): Una vez iniciada la replicacin desde el origen, genes codificados Chargaff. se replican siempre en un orden determinado (uno tras otro), 2).- Carcter semiconservativo. NO al azar Procesividad : nreplicacin medio de nucletidos que son aadidos antes que 3).Sntesis de 5-3. la DNApol se disocie 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff. 2).- Carcter semiconservativo. 3).- Sntesis de replicacin 53. 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. Los lazos de replicacin siempre se originan en un punto nico 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.
denominado origen
Trozo DNA que se replica con un nico origen de replicacin: replicn

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff. 2).- Carcter semiconservativo. 3).- Sntesis de replicacin 53. 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Replicacin bidireccional: horquillas replicativas

El DNA bicatenario de las 2 hebras debe desenrollarse y separarse antes de ser replicado: requiere la intervencin de enzimas Helicasas y Topoisomerasas Replicacin evoluciona a ambos lados originando las burbujas u horquillas de replicacin Los dos extremos tienen replicacin activa: bidireccional

Replicacin de un cromosoma circular: exp de timidina marcada con tritio (3H) E.coli

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 1).- Complementariedad entre bases del DNA (DNA molde): Chargaff. 2).- Carcter semiconservativo. 3).- Sntesis de replicacin 53. 4).- Necesidad de Cebador o Primer: primasas. 5).- Carcter secuencial de la replicacin a partir del origen: procesividad de la DNApolimerasa. 6).- Origen fijo de replicacin: replicones. 7).- Replicacin bidireccional: horquillas replicativas. 8).- Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki.

Replicacin semidiscontinua: fragmentos de Okazaki

Las 2 cadenas DNA son antiparalelas y las 2 son sintetizadas en la direccin 53 cmo simultneamente?!
Hebra Conductora o lder

Direccin del movimiento de la orquilla de replicacin

Hebra rezagada

Okazaki (1968) (experimentos de Pulso y Caza) Cadena continua o conductora (leading strand) sntesis transcurre en la misma direccin que el movimiento de la horquilla (y continua). La otra cadena se sintetiza en fragmentos cortos de Okazaki (cadena discontinua o rezagada lagging strand) Fragmentos de Okazaki: -En E.coli de 1000 a 2000 nucletidos -En eucariotas de 150-200 nucletidos

Necesidad de Ligasas y Primasas

DNA-POLIMERASAS
La DNA polimerasa es una enzima que cataliza la sntesis de DNA a partir de desoxirribonucletidos y de una molcula de DNA molde

Kornberg (1958): primera actividad DNApol de E.coli: DNApol I Existen ms enzimas DNA pol en E. coli DNApol II, DNApol III, (al menos 5 DNApol)

Reaccin fundamental: (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi

DNA polimerasa: requerimientos

-Molcula de DNA molde (segn reglas de apareamiento) -Cebador: segmento de cadena (RNA complementario del molde) con extremo 3-OH libre: extremo cebador o "Primer trminus" Los 4 dNTPs Cebador como sustrato 3-OH 5-P 3-OH 5-P DNA molde

La replicacin es muy precisa

E. Coli un error cada 109-1010 nucletidos (cromosoma de 4,6106 pb) un error cada 1000-10000 replicaciones

Los puentes de hidrgeno especifican el apareamiento y la geometra comn entre bases complementarias. El centro activo de la DNApol acomoda solamente pares de bases con esa geometra
Medida in vitro indican error cada 104-105 nucletidos

La tasa de error disminuye gracias a mecanismos enzimticos adicionales

Reparacin mediada por actividad Exonucleasas de la DNApol I:

-Exonucleasa 3 5: Comprobacin de Lectura Correccin de pruebas (proof reading)
Segunda comprobacin, quita aquellos nucletidos que por fallo de la propia actividad polimerasa se hallan mal apareados: corrige y la polimerasa vuelve a empezar.
Mejora la precisin en factor 102-103 En DNApol I actividades polimerizacin y correccin de pruebas en centros activos diferentes

-Exonucleasa 5 3: Traslado de mella (Nick translation)

Reparacin de apareamientos incorrectos: quita aquellos nucletidos que se hallan apareados por delante de la actividad polimerasa (RNA o DNA) Si existe una mella nick en la cadena (enlace P cortado), lo desplaza en la direccin de avance de la polimerasa: simultneamente degrada 5- 3 y reemplaza por actividad polimerasa
Precisin adicional en factor 102-103

Exonucleasa 35: Comprobacin de Lectura Correccin de pruebas centros activos

diferentes

Comprobacin 1 a 1

Una base mal apareada impide la translocacin de la DNApol I al sitio siguiente. Deslizndose hacia atrs el enzima corrige el error con su actividad exonucleasa 35 y, a continuacin, reemprende su actividad polimerasa en la direccin 53

Exonucleasa 35: Comprobacin de Lectura Correccin de pruebas

(proof reading)

5-P 3-OH
5-P 3-OH
5-P 3-OH

3-OH 5-P
Pol 5- 3 5-P
Pol 5- 3 5-P

5-P 3-OH 5-P 3-OH

Pol 5- 3 5-P Pol 5- 3 (error) ERROR 5-P

Exonucleasa 35: Comprobacin de Lectura Correccin de pruebas

(proof reading)

5-P 3-OH

Pol 5- 3 (error) ERROR 5-P

5-P 3-OH

Exo 3-5 5-P

5-P 3-OH 5-P 3-OH

Pol 5- 3 5-P Pol 5- 3 5-P

Exonucleasa 53: Traslado de mella (Nick translation)

Importantes en la reparacin del DNA y eliminacin de cebadores de RNA durante la replicacin La sntesis de DNA comienza en una mella
(fosfodiester con 3-OH, y fosfato en 5 libre)

El AN a eliminar en verde

La DNApol I extiende la hebra que no hace de molde y desplaza la mella a lo largo del DNA hasta el sitio de disociacin, donde quedar una mella que sellar otro enzima

3-OH

Me lla

Exonucleasa 53: Traslado de mella (Nick translation)

5-P 3-OH

5-P

Me lla 5-P 3-OH Pol 5- 3 Exo 5 -3 5-P

Me lla 5-P 3-OH Pol 5- 3 Exo 5 -3

Me lla Pol 5- 3 Exo 5 -3

5-P

5-P 3-OH

5-P Me lla

Traslada la MELLA
5-P 3-OH

Pol 5- 3 Exo 5 -3 5-P Me lla Pol 5- 3 Exo 5 -3 5-P

5-P 3-OH

Dominios estructurales de la DNApol I de E.coli

Mediante tratamiento proteoltico suave se pueden separar dos fragmentos: Pol. *de Klenow ( 2 centros activos independientes) 5 3 *exonucleasa 53 o N-terminal (no presente en otras DNApol)
C-terminal KLENOW Exonucleasa 3 5 N-terminal Exonucleasa 5 3

Los dominios de los dedos (fingers) y pulgar (trumb) se enrollan alrededor del DNA y lo mantienen sujeto al centro activo (residuos de la palma) Fragmento de Klenow incluye el centro activo exonucleasa 35

Fragmento Klenow

La reaccin polimerasa depende de dos iones metlicos (Mg2+)

DNApol I de E.coli no es la replicasa del DNA

DNApol I NO puede ser la encargada de replicar todo el DNA -FUNCIN y CINETICA DE LA DNApol I * Es LENTA (Velocidad=600-1000 nucleotidos/min). * PROCESIVIDAD muy BAJA (20 nucleotidos).
Nucletidos aadidos antes de la disociacin de la polimerasa

* NUMERO DE COPIAS (400 molculas/clula).

Existe Cepa bacteriana con el gen de la DNApol I alterado (enzima inactivo) es VIABLE
(anormalmente sensible a los agentes que daan el DNA)

DNApol I NO ES LA REPLICASA DE E.coli SU FUNCIN ES REPARADORA de fragmentos cortos de DNA Incluidos fragmentos de Okazaki En la replicacin intervienen muchos genes, y por tanto muchas protenas

DNA polimerasa II
Funcin REPARADORA.

-LENTA (50 nucleotidos/min) -PROCESIVIDAD BAJA -Con EXONUCLEASA 3-5 (Sin EXONUCLEASA 5-3) -VELOCIDAD ALTA (9000 nucletidos/min) -PROCESIVIDAD ALTA. -CON EXO 3-5 (sin EXONUCLEASA 5-3)

Actividad DNA polimerasa III:

DNA pol III forma parte de un complejo con multimrico denominado

HOLOENZIMA pol III: verdadera REPLICASA de E.coli

Subunidad cataltica
Actividad Exonucleasa 3-5

-Ncleo o Core: subunidades (polimerasa), (correccin pruebas) y (estructural). -Resto: subunidades ,,,,.. aumentan la procesividad y velocidad del core (15000 nucleotidos/min)

DNA polimerasa IV y V (1999) estn implicadas en un tipo de reparacin poco habitual

DNA polimerasas Eucariticas

DNA pol : replicasa nuclear, Exo 3-5, procesividad media. Actividad fundamental PRIMASA de Eucariotas. DNA pol : verdadera REPLICASA nuclear, comparable a la DNApol III. Sin Exo 3-5y sin actividad Primasa. Muy procesiva en presencia de la protena del antgeno nuclear (PCNA )
Papel ~subunidades procesivas de DNApol III

DNA pol : nuclear, comparable a DNApol I, Sin Exo 35, Poco procesiva. No Primasa. Actividad REPARACIN. DNA pol : replicasa nuclear, Exo 35, muy procesiva. Sin actividad primasa. Funcin REPARACIN Lesiones U.V. DNA pol : replicasa mitocondrial, poco conocida.

Otras DNA polimerasas

-DNA polimerasas de bacterias termfilas: Taq polimerasa PCR -DNA polimerasas de fagos: diversas estrategias M13 y x174: DNApolIII de E.coli modificada por factores propios. T4: DNApolimerasa monomrica con exonucleasa 35 muy fuerte Biologa molecular T7 secuenasa DNA polimerasa monomerica con un nivel de fidelidad de copia muy alto Secuenciacin -DNA polimerasas RNA dependiente Transcriptasa reversa: Copia un molde de RNA para dar una copia de DNA

La replicacin de DNA requiere muchos enzimas y factores proteicos

o Topoisomerasa II

ELEMENTOS PARTICIPANTES EN LA REPLICACIN

Sitios especficos de origen de la replicacin (E. coli)

En eucariotas varios orgenes fijos de replicacin En E. coli uno nico para todo el genoma: oriC (un solo replicn) 9-mer

13-mer Secuencia de 13 p.b. oriC: 245 pb, con 3 secuencias casi idnticas en tandem (13-mer) y cuatro lugares de unin (9-mer) para la dnaA (protena de iniciacin cuya unin inicia secuencia sucesos)

Protenas que intervienen en la horquilla de replicacin

o Topoisomerasa

La replicacin necesita un cebador

ACTIVIDAD PRIMASA (RNA polimerasa especializada):

sntesis de PRIMERS o cebadores.
-Primasa de Eucariotas: es una de las replicasas la DNA pol . -Primasa de E. Coli: es un enzima especial exclusivo para sintetizar PRIMERS. Es POCO PROCESIVA (20 nucleotidos max) y puede usar dNTPs y NTPs (usa ms los segundos slo por su abundancia)RNA No acta aislado sino como SUBUNIDAD DE UN COMPLEJO llamado PRIMOSOMA (Primasa + 7 subunidades ms, incluyendo helicasa) Necesidad PRIMASAS: Para asegurar fidelidad DNApol comprueba la validez del par de bases precedentes antes de formar un nuevo enlace fosfodiester. Las RNApol NO son tan restrictivas y pueden comenzar la sntesis de novo sin comprobaciones mayor tasa de error, pero NO problema porque es provisional (RNA cebador se elimina por exonucleasa 53) Otros modelos: -Primasa de fago M13: emplea la RNA polimerasa de E.coli Como PRIMASA en el paso de la forma infectiva del fago (ss), a la forma replicativa (Rf). -Primasa de x174: aunque es tambin fago de E.coli, sintetiza un enzima multimrico propio especial para la actividad PRIMASA.

3 5

Mecanismo del PRIMOSOMA de E.coli sobre la hebra rezagada (sntesis de fragmentos de Okazaki)
PRIMER

PRIMOSOMA 3 5
PRIMER

5 3

3 5

PRIMER

PRIMOSOMA 3 5
3 5
PRIMER PRIMER

Primosoma sintetiza el primer sobre la cadena 35 y luego avanza en sentido contrario sobre la hebra parental retrasada (5 3) hasta encontrar nuevos sitios de inicio de fragmento donde se produce otro primer 5
3

PRIMER

PRIMOSOMA 3 5
PRIMER PRIMER PRIMER

5 3

ACTIVIDAD DNA-LIGASA: une los fragmentos de Okasaki

unin extremos de dos cadenas de DNA

3-OH + 5-P 3-P-5 + H2O

Reaccin energticamente desfavorable Requiere un Donador de energa -Donador ATP: Ligasa de fago T4 y Ligasa de Eucariotas -Donador NAD: Ligasa de E.coli
LIGASA

Etapas de la actividad DNA-ligasa:

1) Activacin de la DNA-ligasa 2) Reaccin nucleoflica 3) Liberacin de AMP

La actividad ligasa puede ser REVERSIBLE

Reducir enrollamiento introduciendo un nick

Comparacin entre

Ligasa de T4 (Biologa Molecular)

RNA
Ligasa de E.coli

RNA DNA DNA RNA DNA DNA DNA DNA

Ligacin Normal

DNA DNA RNA RNA DNA DNA DNA

DNA DNA

DNA DNA

OTRAS ACTIVIDADES: Helicasa y SSB(P)

Helicasa: va al frente de la horquilla replicativa, separando las 2 hebras mediante ruptura puentes hidrgeno: requiere ATP
En E. coli se han descrito varias: helicasa II, dnaB, protena Rep
ATP ADP

Helicasa SSB

SSB: protenas de alta afinidad por el DNA monohebra. Una vez separadas las hebras por helicasa estas son inestables (tienden a aparearse): se estabilizan que permanezcan separadas por unin SSB

OTRAS ACTIVIDADES: Topoisomerasa

Unin topoisomerasa a duplex DNA

Cambio conformacional

Etapas generales y comunes: 1) escisin hebras 2) paso del segundo segmento DNA a travs del hueco 3) reparacin corte

En E. coli

Topoisomerasa II (girasa): introduce superenrollamiento (-) para relajar el superenrollamiento (+), generado por la helicasa ATP dependiente
Topoisomerasa I: relaja estructuras superenrolladas por otros mecanismos (escisin 1 sola hebra) NO es dependiente de ATP

Topoisomerasa II o DNA girasa blanco de varios antibiticos: *NOVOBIOCINA impide unin de ATP a la girasa *cido Nalidxico y CIPROFLOXACINA dificultan rotura y empalme de cadenas de DNA
Tratamiento de infecciones de las vas urinarias al inhibir la replicacin bacteriana

EL COMPLEJO DE REPLICACIN (En procariotas)

HORQUILLA REPLICATIVA de E.coli 5 3

Topoisomerasa

Helicasa SSB (protenas fijadoras de monohebra) P 3

P DNApol III Holoenzima (replicasa) DNApol I (reparacin)

PRIMOSOMA (sntesis de primer) "Primer" SSB

Pero Cmo se replican simultneamente las 2 hebras?

SSB P

3 5 Hebra Lider

DNA-ligasa (cerrar Nicks)

5 3 Hebra Retardada

Horquilla de replicacin procariotica replisoma de E.coli

Holoenzima pol III actua como un dmero: replica las 2 hebras simultneamente

Formando un bucle

(abrazadera de deslizamiento)

(Cerrar Nicks)

Coordinacin en la sntesis de la hebra gua y la hebra retardada del DNA

Hebra retardada se sintetiza en fragmentos Crecimiento 35 y Polimerizacin 53

Bucle del molde lo sita en posicin para que tenga lugar la

polimerizacin en sentido 53
(orientado de manera favorable al avance de la horquilla de replicacin)

Al avanzar va tirando del lazo, hacindolo ms grande. DNApol III abandona el molde y se forma nuevo bucle.
~1000 nucletidos en E. coli
5 3 5 3

5 3

5 3

ESTADO 1

ESTADO 2

ESTADO 3

ESTADO 0

3 5

3 5

Huecos entre fragmentos se rellena por DNApol I, que tambin elimina el RNA cebador (actividad exonucleasa 5-3) DNA ligasa empalma los fragmentos

5 3

INICIACIN de replicacin en E.coli

9-mer Cajas dnaA

13-mer secuencia rica en A-T

iC r O

1. El complejo con la dnaA se une a la secuencia 9-mer (caja dnaA) dando una conformacin plegada especial en OriC (colabora protena Hu) 2. La conformacin plegada en OriC promueve desapareamiento y apertura de las zonas repetidas de 13 pb (13-mer) ricas en A-T 3. Un complejo formado por las protenas de actividad helicasa dnaB y dnaC comienza a abrir las 2 hebras en colaboracin con la topoisomerasa II

3 (continuacin). Se libera el dnaA (gasto ATP) Las cadenas desapareadas se estabilizan con protenas SSB Se forma la BURBUJA INICIAL (cientos p.b.)

4. Se forma el complejo Precebador con colaboracin de otras protenas, y finalmente la protena dnaG de actividad primasa Formacin del PRIMOSOMA

5. El Primosoma se une a las 2 hebras de DNA molde e inicia la sntesis de primers de RNA (en cada hebra, bidireccional) 6. Unin de DNApol III y de la prot rep (Helicasa) convierte el primosoma en un REPLISOMA

Resumen: Protenas requeridas para iniciar la REPLICACIN en E. coli

Terminacin:
Las dos horquillas de replicacin del cromosoma circular de E. coli se encuentran en una regin terminal que contiene mltiples copias de una secuencia de 20 pb (Ter)
Trampa de donde no puede escapar la horquilla de replicacin

Secuencia Ter sitios de unin de protena Tus (contrahelicasa). Complejo Ter-Tus puede detener la horquilla de replicacin en una nica direccin
pocos centenares de bases que quedan entre grandes complejos proteicos se replican por mecanismo desconocido

Resultado final dos cromosomas circulares ligados (catenados)

se separan mediado por topoisomerasa IV (del tipo II) Est regulado, por un mecanismo no del todo conocido, que slo haya una replicacin en cada ciclo celular

REPLICACIN EN EUCARIOTAS

Proceso parecido pero MS COMPLEJO que en Procariotas *tamao GENOMA *n cromosomas Eucariot (hum) 6000106 pb 23 parejas lineales Procar (E coli) 4,8106 pb 1 circular

Papel de las DNA polimerasas Eucariticas

DNA pol : PRIMASA de los eucariotas. Primers de cadena Lider y de los fragmentos de la cadena rezagada.
Algn autor la considera la Replicasa de los Fragmentos de Okazaki (en discusin)

DNA pol : verdadera REPLICASA de la cadena Lider

segn autores tambin de la rezagada en colaboracin con la DNApol (en discusin)

DNA pol : comparable a DNApol I, Sin Exo 3-5, DNA pol : funcin REPARACIN de lesiones U.V. y rellenado de huecos dejados por los Primers en los fragmentos de Okazaki.
Segn autores colaborara con la DNApol , en replicar la hebra rezagada (en discusin)

Tabla comparativa tipos DNApol procariotas y eucariotas

Origen de replicacin en Eucariticas

SON MLTIPLES y en organismos superiores poco conocidos
En humanos ~30.000 orgenes, cada cromosoma cientos

En Levaduras se denominan Secuencias de replicacin autnoma (ARS), 100-120 pb: 1-Las ARS constan de una regin central de 11pb rica en A-T (anloga a secuencias de 13pb rica en A-T de procariotas), denominada Secuencia consenso ARS 2-Complejo de 6 protenas reconocen las zonas flanqueantes de la regin central de rica en A-T y se unen a ellas formando el complejo de Orgen de replicacin (ORC), que promueve la apertura de la zona rica en A-T.
helicasa extiende la burbuja inicial

3-Tambin se unen unas protenas de unin a monohebra (equivalentes a las SSB procariot), denominadas Protenas de replicacin A (RPA), estabilizando la zona abierta monohebra y permitiendo entrada de DNApol (primasa) 4-Tras aadir el cebador y ~20 desoxinucletidos ms, el Factor de replicacin C (RFC) desplaza a la DNApol y atrae al Antgeno nuclear de clulas proliferantes (PCNA) que se une a la DNApol (cambio de polimerasa).

Cromatina en Eucariticas: empaquetamiento

El DNA eucaritico se enrolla alrededor de protenas Histonas, formando los Nucleosomas

-Modelo hipottico de Replicacin de los nucleosomas:

Las histonas no llegaran a separarse fsicamente del DNA durante la replicacin, los nucleosomas viejos permaneceran en la hebra conductora. Tras la replicacin, se incorporaran nuevas histonas dando lugar a nucleosomas hijos.

-Mecanismos de replicacin en cromosomas lineales:

Problema de terminacin replicacin en cromosomas lineales: resulta difcil replicar por completo los extremos porque las polimerasas actan nicamente en direccin 35
de lectura

Le hebra retardada presentara un extremo 5 incompleto tras la eliminacin del DNA cebador. Cada ronda de replicacin acortara an ms el cromosoma.
ESTO NO es un problema gracias a los TELMEROS (DNA no codificante de los extremos de los cromosomas que mantienen la integridad del cromosoma). El DNA de los telmeros contiene cientos de repeticiones en tandem secuencia 6 nucletidos (en humanos hasta 2000 copias de 3 AGGGTT 5). Una de las hebras enriquecida en G extremo 3 y ligeramente ms larga. Forma bucle, con la hebra sencilla creando un duplex de DNA con forma de lazo con otra de las zonas de secuencia repetida

Protegen y enmascaran el extremo del cromosoma

Mecanismo Telomerasas Eucariota

Los telmeros se replican mediante la telomerasa, polimerasa especializada que lleva su propio molde de RNA (ribonucleoprotena)

Cuando un cebador que termina en GGTT se aade al enzima telomerasa (en humanos) se generan secuencias ms largas: GGTTAGGGTT y GGTTAGGGTTAGGGTT y ms largas La telomerasa contiene una molcula de RNA que acta como molde para la elongacin de la hebra enriquecida en G el propio enzima tiene le secuencia para generar las secuencias del telmero Componente proteico de las telomerasas relacionado con las transcriptasas inversas de los retrovirus

Telomerasa es un transcriptasa inversa especializada que lleva su propio molde

TERMINACIN CON TELOMERASA 5-P 3-OH

hebra lider TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG AACCCC 5-P Telomerasa

3-OH

hebra rezagada

5-P 3-OH

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG 3-OH ACCCCAAC AACCCC 5-P TELOMERASA

5-P 3-OH

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG AACCCC 5-P DNA pol Telomerasa

3-OH
ACCCCAAC

5-P 3-OH

3-OH TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG AACCCC CCCCAACCCCAACCCC AACCCCAAC 5-P

Primer DNA pol

Finalmente DNApol con su actividad primasa introduce un primer en el extremo recin alargado y replica el fragmento

RECOMBINACIN
Reordenamiento de la informacin gentica dentro y entre molculas de DNA

En Eucariotas -Meiosis: intercambio limitado entre cromosomas emparejados genera diversidad gentica en la poblacin (entrecruzamiento) -Transposicin del DNA: tipo diferente recombinacin, en que un segmento corto de DNA presenta una notable capacidad de trasladarse de un lugar a otro del cromosoma -Generacin de diversidad molecular en anticuerpos (y algunas otras molculas inmunitarias) -Algunos virus para integrar su material gentico en el DNA cel huesped
En el laboratorio herramienta para manipular genes, por ej. Ratones knockout

Flujo de informacin en los retrovirus: del RNA al DNA