02/10/2011

BACILOS GRAM-NEGATIVOS

Enterobactrias

Provas bioqumicas

ENTEROBACTRIAS IMPORTNCIA CLNICA A maioria das enterobactrias encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino animal, na gua, solo e vegetais. So considerados enteropatgenos por causarem infeces gastrointestinais (Salmonella typhi, Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Escherichia coli) e em outros locais. So responsveis por de cerca de 70% das infeces urinrias e 50% das septicemias. As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram negativos de importncia clnica isolados na rotina microbiolgica.

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ENTEROBACTRIAS a maior e mais heterognea famlia de bacilos Gram negativos de importncia mdica (27 gneros, 102 espcies e 8 grupos indefinidos). 25 espcies envolvidas em 95% das amostras, sendo possvel o isolamento de enterobactrias de qualquer amostra clnica. So bacilos Gram negativos, no esporulados, oxidase negativos, com motilidade varivel. So anaerbios facultativos, fermentam a glicose com ou sem produo de gs, so catalase positivos e reduzem nitrato a nitrito. Crescem em: Meios bsicos (caldo peptona); Meios ricos (gar sangue, gar chocolate e CLED); Meios seletivos (MacConkey, EMB).

INFECES HOSPITALARES E NA COMUNIDADE Baseado em dados de prevalncia e importncia clnica, os laboratrios de microbiologia utilizam metodologias que permita discriminar com 80% de acerto os gneros e espcies considerados abaixo: - Escherichia coli - Shigella spp. - Salmonella typhi - Salmonella spp. - Citrobacter freundii -Proteus mirabilis - Proteus vulgaris - Citrobacter koseri

- Klebsiella pneumoniae - Klebsiella oxytoca - Providencia spp. - Serratia spp. - Enterobacter aerogenes -Enterobacter cloacae -Enterobacter agglomerans -Yersinia enterocolitica - Morganella morganii

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INFECES HOSPITALARES E NA COMUNIDADE Nas infeces hospitalares: Principais gneros das enterobactrias (99% dos isolamentos): Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providencia spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp. As enterobactrias que atualmente predominam so: Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. As enterobactrias menos isoladas so: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp. Nas infeces da comunidade: Destacam-se: Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Shigella spp.

A diferenciao dos gneros da famlia Enterobacteriaceae feita atravs de provas bioqumicas. A diferenciao das espcies ou tipos feita sobretudo com base em caracteres sorolgicos (sorotipos). Tambm pode ser baseada na combinao de ambos.

Salmonella E. coli

Shigella

Yersinia

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IDENTIFICAO SOROLGICA As amostras relacionadas bioquimicamente so divididas em subgrupos ou tipos, por critrio sorolgico, de acordo com a presena dos antgenos: somtico (O), flagelar (H) e de envoltrio ou cpsula (K). A identificao sorolgica feita apenas com patgenos de importncia epidemiolgica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, utilizando-se esquemas simplificados, em laboratrios de referncia.

Escherichia coli
Provas complementares (sorolgicas, testes biolgicos) so utilizadas, para complementao de provas bioqumicas, principalmente na identificao de uma das seis categorias de E. coli enteropatognicas para o homem.

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Escherichia coli
E. coli um bacilo Gram negativo e pertence famlia das Enterobacteriaceae. So arobias e anaerbias facultativas. O seu habitat natural o lmen intestinal do homem e de animais de sangue quente. Possui mltiplos flagelos dispostos em volta da clula.

A Escherichia coli , portanto, um componente da flora normal do intestino humano e de animais saudveis, impedindo o crescimento de espcies bacterianas nocivas e sintetizando aprecivel quantidade de vitaminas (K e do complexo B).

Escherichia coli

Possuem fmbrias e adesinas que permitem a sua fixao, impedindo o arraste pela urina ou diarria. Muitas produzem exotoxinas. So suscetveis aos ambientes secos, aos quais no resistem. Possuem camada LPS e esta camada lipopolissacardica ativa o sistema imunitrio (que a reconhece como endotoxina ou lipdeo A) de forma agressiva. A vasodilatao excessiva provocada pelas citocinas (produzidas pelas clulas de defesa do organismo) pode levar ao choque sptico e morte em alguns casos.

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Baseado nos fatores de virulncia, manifestaes clnicas e epidemiologia, linhagens de E. coli so agrupadas em classes ou variantes: Atualmente, existem patognicas: 6 grupos reconhecidos de E. coli

Enteropatognicas ou EPEC Enterotoxignicas ou ETEC Enteroinvasivas ou EIEC Enterohemorrgicas ou EHEC Enteroagregativas ou EAEC Difuso-aderentes ou DAEC

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1) EPEC ("Enteropathogenic E.coli"; E.coli Enteropatognica): Causam diarrias no sanguinolentas. So epidmicas em crianas causando diarria aquosa em crianas pequenas com menos de 1 ano de idade (diarria do lactente). Causam febre, nuseas e vmitos.

So os principais patgenos causadores de diarria em pases subdesenvolvidos. Alimentos vegetais so transmitindo a diarria. regados com guas contaminadas

EPECs tm um fator de adeso (EAF) aos entercitos e produzem enterotoxinas, resultando em destruio das microvilosidades do intestino delgado, com m absoro dos nutrientes e conseqente diarria osmtica.

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PENETRAO NAS CLULAS DO HOSPEDEIRO A clula eucaritica (do hospedeiro) possui um citoesqueleto composto de uma protena chamada actina.

E.coli quando em contato com a clula do hospedeiro causam uma mudana no ponto de contato pela produo de INVASINAS. As INVASINAS rearranjam os filamentos de actina que aninham a bactria e a ajuda a entrar para dentro da clula.

2) ETEC ("Enterotoxic E.coli ou E.coli Enterotoxinognica): Infectam principalmente o intestino delgado e os sintomas so: Dores abdominais, vmitos, nuseas e febre baixa. Produzem enterotoxinas semelhantes toxina da clera, causando aumento da secreo de eletrlitos como o sdio para o lmen intestinal, seguidos de gua por osmose. Produz dois tipos de toxinas: Toxina Termolbil (LT) inativada a 60 C por 30 min. Toxina Termoestvel (ST) suporta 100 C por 30 min. O resultado diarria profusa aquosa, tipo gua de arroz, sem sangue. A bactria tem fmbrias que lhe permite aderir fortemente ao epitlio e no ser completamente arrastada pela diarria volumosa.

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ETECs so as causadoras mais comum de diarria do turista (diarria do viajante), sendo ingeridas em grandes nmeros em comida mal cozida ou gua contaminada com detritos fecais.

3) EIEC ("Enteroinvasive E.coli; E.coli Enteroinvasiva): so invasivas e destrutivas da mucosa intestinal, causando lceras e inflamao. Causa diarria aquosa inicial seguida de disenteria (diarria com sangue e muco), semelhante da disenteria bacteriana (Shigella spp.). Produz invaso do entercito (endocitose), rompe as clulas e invade as clulas vizinhas, causando a morte celular das clulas do hospedeiro. Acomete crianas maiores do que o grupo acometido pelas EPECs e adultos, mas o isolamento em pacientes com diarria no freqente.

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4) DAEC (Difusamente aderente ou "Diffusely adherent E.coli) Aderem s clulas epiteliais num padro difuso e apresenta fmbrias de superfcie (F1845). A maioria dos pacientes apresenta diarria aquosa sem sangue nem leuccitos fecais.

5) E. coli enteroagregativa (EAEC ou EAggEC) Produz adeso na mucosa do clon (padro diferente da EHEC, EPEC ou EIEC). Produz toxinas LT e ST e fatores de colonizao das fmbrias (AAF = fmbrias de aderncia agregativa). Est associada diarria crnica, aquosa e mucide (sem sangue e nem leuccitos), com febre baixa, pouco ou nenhum vmito.

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6) EHEC ("Enterohemorragic E.coli" ; E.coli Enterohemorragica): Causam diarria aquosa inicial que pode progredir em colite hemorrgica e sndrome hemoltico-urmico (que ocorre em 5% das infeces por EHEC). Tm fmbrias aderentes e produzem uma toxina semelhante toxina de Shiga (entero-hemolisina) produzida pela Shigella. Causa diarria sanguinolenta sem leuccitos, sem febre, dor abdominal. Podem provocar anemia, trombocitopenia e insuficincia renal aguda potencialmente perigosa (SHU), levando colite hemorrgica (grave). O sorogrupo mais comumente envolvido o O157:H7 (doena do hambrguer).

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Woman paralyzed by E. coli-tainted hamburger Stephanie Smith: the 22 year old children's dance instructor was paralyzed from the waist down after eating E. coli-tainted hamburger traced back to the meat supplier. She was in a coma for nine weeks (that's her, hospitalized, in the photo), and can now no longer walk. "Ground beef is not a completely safe product," one food safety expert in the article is quoted.

TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS

Nenhum sistema oferece 100% de acerto para a caracterizao das espcies de enterobactrias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura.

80%

Acurcia da identificao - A maioria dos esquemas trabalha com um mximo de 80% de acerto.

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TESTES UTILIZADOS PARA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS Podem ser utilizados testes preparados no laboratrio (controle de qualidade). Adquiridos no comrcio em testes isolados ou em kits. Mtodos automatizados (ampliam o nmero de testes) Mtodos rpidos em substratos cromognicos (deteco de enzimas bacterianas) que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao.

Cerca de 80-90% das enterobactrias podem ser identificadas atravs desses esquemas, com resultado concludo entre 48 a 72 horas.

Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica

1. Fermentao da glicose 2. Fermentao da lactose 3. Motilidade 4. Utilizao de citrato 5. Descarboxilao da lisina 6. Produo de sulfeto de hidrognio (H2S) 7. Produo de gs (CO2) 8. Oxidase 9. Produo de indol 10. Produo de urease 11. Produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase 12. Produo de gelatinase ou opo DNAse Provas complementares de Identificao Fermentao de outros carboidratos: sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. Utilizao de aminocidos: arginina e ornitina Hidrlise da esculina, etc.

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ETAPAS DA IDENTIFICAO DE ENTEROBACTRIAS

ANLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOS

A identificao de uma enterobactria comea com a anlise do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secrees: gar sangue, gar EMB (Eosin Methylene Blue) MacConkey. e

Lquidos nobres e bipsias: gar Chocolate, EMB e MacConkey. Fezes: MacConkey, EMB e Salmonella-Shigella (S-S) Urina: CLED (Cistina-Lactose-Eletrolito-Deficiente) sangue e MacConkey, etc. ou gar

MacConkey gar Sangue

EMB

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CLED

Salmonella-Shigella agar

1. Cultura em placa contendo meio slido MacConkey Observar a morfologia e fermentao da lactose: Negativa: Colorao transparente Positiva: Rosa ou vermelha

Salmonella Shigella Proteus Yersinia

E. coli Enterobacter Citrobacter Klebisiella

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ANLISE DO CRESCIMENTO NOS MEIOS RICOS E SELETIVOS Devemos considerar que: A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (gar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: gar MacConkey, EMB e Salmonella-Shigella. Os Gram positivos como regra no crescem em gar MacConkey e Salmonella-Shigella, exceto os enterococos e tambm bactrias no fermentadoras e Candida spp. Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela est presente em todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros (bacilos no fermentadores, enterococos e Candida spp.).

Aps a semeadura no meios, recomenda-se realizar: Colorao de Gram da colnia isolada Para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram positivos de Gram negativos e leveduras). Prova da oxidase indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas,Vibrio que tambm so fermentadores. Prova do metabolismo fermentador triagem utilizando os meios de OF glicose (quando suspeitar de no fermentador), TSI (Trplice Acar Ferro) ou EPM (Rugai sem sacarose), para enterobactrias. Srie bioqumica complementar sempre necessria para caracterizar gnero e espcie.

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As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como:

Crescem bem no meio de McConkey ou EMB (Eosin Methylene Blue); Bacilos Gram negativos; Fermentadores da glicose; Produzem ou no gs; Oxidase negativas; Reduzem nitrato a nitrito.

PROVA DO CITOCROMO-OXIDASE

Sistema enzimtico relacionado com os citocromos da cadeia respiratria de alguns microrganismos. As enterobactrias so oxidase negativas (diferente de outros bacilos Gram negativos). Teste: Papel de filtro contendo um reagente incolor (tetrametil pfenileno de amina), protegido da luz. Utilizando uma ala de platina as colnias do microrganismo so espalhadas sobre a rea do papel. Prova positiva = desenvolve-se a cor prpura em at 1 minuto.

E. coli

Pseudomonas

Na reao negativa no h desenvolvimento de cor prpura (cor da colnia a rsea).

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PROVA DA PRODUO DE UREASE

A urease uma enzima que degrada a uria em duas molculas de amnia e uma de anidrido carbnico. Colnias so transferidas com uma ala para o meio contendo uria, pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. Aps o crescimento: Prova positiva quando a urease ataca a uria alcalinizando o meio = rosa choque. Na prova negativa no h alterao da cor do meio.
Proteus

Os organismos do gnero Proteus so diferentemente da maioria das enterobactrias.

urease

positivos

PROVA DA FERMENTAO DE CARBOIDRATOS Esta prova pode ser realizada de vrias maneiras. A mais usual envolve a utilizao de um meio com glicose ou outro acar e/ou lcool com pH neutro e um indicador de pH. Alm disso utiliza-se um tubo de Durhan, invertido, imerso no meio. O meio inoculado com a cultura teste e incubado. Enterobactrias produzem cido devido a fermentao da glicose = meio se torna amarelo Exceo: Shigella produz cido e no produz gs.

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PROVA DA FERMENTAO DE CARBOIDRATOS

A prova positiva indicada pela viragem da cor do meio (amarelo) devido a produo de cidos, com abaixamento do pH do meio.

A prova negativa revelada pela ausncia de mudana de cor (laranja ou vermelho).

Alm disso, o cido frmico transformado em CO2 e Hidrognio, os quais so coletados pelo tubo de Durhan.

PROVA DA PRODUO DE GS SULFDRICO OU SULFETO DE HIDROGNIO

Existem duas hidrognio.

vias

fermentativas

que

produzem

sulfeto

de

Primeira via: O gs sulfdrico produzido por reduo do enxofre orgnico presente no aminocido cistena (nas peptonas do meio), atravs da ao da enzima cistena desulfurase. Em meio de cultura contendo o aa sulfurado, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente. Coloca-se sobre a cultura uma tira de papel de filtro impregnada com soluo saturada de acetato de chumbo. Na prova positiva = papel de filtro negro Na prova negativa a fita permanece branca.

O H2S produzido voltil e incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo, que enegrece o papel de filtro.

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PROVA DA PRODUO DE GS SULFDRICO OU SULFETO DE HIDROGNIO

Pela segunda via: o H2S pode ser produzido pela reduo de compostos inorgnicos de enxofre, pela ao da enzima redutase do tiossulfato (convertem o tiossulfato em sulfito com liberao de sulfeto de hidrognio). Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (trplice sugar and iron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). O meio semi-slido para permitir a respirao anaerbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em aerobiose por 24h a 35oC. Nas duas vias, o H2S produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que apresentam colorao negra.
Salmonella spp. = H2S + Shigella spp. = H2S +

PROVA DA PRODUO DE INDOL

O indol resultante da degradao do aa triptofano pela enzima triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio contendo triptofano. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovacs atravs da parede interna do tubo. A prova positiva: Ocorre a complexao do indol com o aldedo, em meio cido, formando o composto colorido. Desenvolve-se um anel de cor rsea em 5 minutos. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom).
triptofanase Triptofano Indol + piruvato e amnia

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PROVA DA MOTILIDADE A prova da motilidade indica indiretamente a presena de flagelos e (no uma prova bioqumica e sim fisiolgica). A prova efetuada inoculando-se em linha reta, atravs da tcnica da punctura (com agulha), 2/3 de um meio semi-slido. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de inoculao, turvando o meio. A prova negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculao sem, contudo, turvar o meio.

PROVAS DO MEIO DE TSI Meio de TSI (Triple Sugar Iron) permite avaliar: Fermentao da glicose, Produo de gs, Fermentao de lactose e/ou sacarose Produo de H2S. O TSI ou trplice acar e ferro um meio slido distribudo de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinao. Cor = vermelho cereja Deve ser inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC. constitudo de: glicose (0,1%); lactose (1,0%); sacarose (1,0%); peptonas; aminocidos, incluindo sulfurados; tiossulfato de sdio; citrato frrico amoniacal (indicador da produo de H2S), com pH neutro e um indicador de pH (vermelho de fenol).

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PROVAS DO MEIO DE TSI Aps o crescimento da bactria pode-se observar os resultados: K=alcalina (vermelho) e A= cida (amarelo) Resultado: expresso como A/A (inclinao e base cidas = amarelo). Resultado expresso como K/A (inclinao alcalina e base cida);
A K

Presena de gases: Levantam ou fragmentam o meio. O resultado representado como A/A com gs. H2S na presena de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolvel.

PROVAS DO MEIO DE TSI Desse modo, pode-se observar num nico meio os processos fermentativos, respirao aerbia e anaerbia. A utilizao dos acares e aminocidos na inclinao se d apenas por respirao aerbia.

Na base os processos so realizados por fermentao (incluindo tambm putrefao), com utilizao dos aminocidos bsicos, sulfurados, triptofano, com produo de gs sulfdrico, mercaptanas, aminas, dentre outras. J a utilizao do tiossulfato indica que ocorre respirao anaerbia, gerando tambm gs sulfdrico.

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PROVAS DO MEIO DE TSI

Interpretao mais provvel

Sem crescimento = bactria exigente Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+)

pice ou inclinao
Vermelho Vermelho

Base
Vermelho Vermelho Vermelho Amarelo Amarelo Amarelo

H2S
neg neg neg neg neg +

Gs
neg neg neg varivel varivel varivel

Crescimento na superfcie = Gram (+) Amarelo Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Enterobactria Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter Vermelho Amarelo Amarelo

Srie Bioqumica (EPM, MILI, CITRATO )

O objetivo das provas bioqumicas a identificao de um dos agentes conhecidos: Shigella Salmonella Escherichia coli Yersinia Alm de outras enterobactrias, que devero ser classificadas utilizando tabelas de identificao. Leitura das sries Bioqumicas e identificao dos microrganismos, conforme tabela de reaes.

Obs: Todas as enterobactrias fermentam a glicose

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INTERPRETAO DO MEIO EPM Superfcie Desaminao do Triptofano (enzima L-triptofano desaminase) Reao positiva verde escuro ou acastanhado Reao negativa superfcie inalterada Base Produo de gs = Formao de bolhas ou rachaduras no meio Produo de H2S = Presena de pigmento negro de qualquer intensidade Hidrlise da Uria = Colorao azul esverdeada (fraca) indica prova positiva (presena de urease) Glicose - Fermentao desse acar, com produo de gs. Prova positiva: meio amarelo, com ou sem presena de bolhas de ar.

Enterobactrias Provas Bioqumicas EPM

Inocular picando at o fundo - semear na superfcie -incubar com a tampa frouxa 24hs/35C
Glicose
formiase

EPM
Urease
Tiossulfat o-redutase

L-triptofanodesaminase

Bactria Fermenta glicose produo de cido vira indicador para amarelo

Bactria Fermenta glicose produo de cido frmico enzima formiase desdobra c. Frmico em CO2 e H2 bolhas

Tubo EPM - Fermentao da glicose, produo de gs, H2S, uria, fenilalanina.

Bactria produz tiossulfato redutase age no tiossulfato de Na produz H2S. H2S reage com Fe do Citrato de Fe amoniacal sulfeto de Fe (precipitado negro)

Bactria produz urease - age sobre a uria formando CO2 e NH3. NH3 dissolve-se sob forma de carbonato de amnia alcaliniza o meio - azul

Bactria produz LTD que provoca desaminao de a.a., convertendoos em -cetocidos. No caso do L-triptofano, formase cido indol pirvico reage com sais de Fe origina composto cclico de cor verde escura

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Enterobactrias Provas Bioqumicas - Mili

Tubo MILI - fazer picada central apenas - incubar 24hs/35C

MILi

Motilidade

Lisina descarboxila se

Triptofanas e

Motilidade amostras mveis se difundem partir do inculo inicial turvando o meio. Amostras imveis somente crescem no local onde foram semeadas

Descarboxilao promovem remoo da de CO2 dos a.a. lisina: lisina positiva produz amina o meio torna-se alcalinizando o meio cor prpura roxo, na prova Se a.a. no o utilizado, negativa meio atravs da permanece fermentao da glicose, acidifica-se o amarelado nos 2/3 meio amarelo nos inferiores. 2/3 inferiores

Descarboxilases

Indol anel de indol faz parte da molcula de triptofano. Triptofanase age no a.a. libera anel pirrlico. Coloca-se reativo de Kovacs reage com indol anel vermelho

gar CITRATO DE SIMMONS Citrato a nica fonte de carbono. Alguns microrganismos como a E. coli no possuem a permease do citrato (transporte do citrato para o interior da clula) e no crescem no meio contendo como nica fonte de carbono o citrato. A prova feita semeando-se a bactria no meio slido inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A inoculao deve ser feita com ala em agulha e em linha reta. A prova positiva (alcalinizao do meio) = azul Prova negativa: colorao inalterada (verde original do meio) Observao: No utilizao do citrato (prova negativa) sem crescimento bacteriano.
+ -

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Enterobactrias Provas Bioqumicas Citrato de Simmons

Citrato - inocular a superfcie - incubar 24hs/35C A prova positiva evidenciada pelo aparecimento de colorao azul na superfcie.

Citrato de Simmons
Amostras que utilizam citrato como nica fonte de C tambm utilizam sal de amnia como nica fonte de Ni libera o Na. Na junta-se com H2O e forma NaOH alcaliniza o meio, que vira indicador azul de bromotimol para azul

TABELA PARA IDENTIFICAO BIOQUMICA DAS ENTEROBACTRIAS EPM MILI CITRATO Bactrias Lactose Glicose com produo de gs H2S Urease L-TD Motili Indol Lisina Citrato Descar -dade bo-xilase

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Arizona Shigella sp Edwardsiella tarda Salmonella sp Serratia marcescens Proteus mirabilis Providencia rettgeri Yersinia enterocolitica

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