PASTEURELOSE PULMONAR: UMA ATUALIZAO

Sandra Maria Borowski 1

Centro de Pesquisa Veterinria Desidrio Finamor, Laboratrio de Patologia Suna, Caixa Postal 2076, CEP 90001970, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil

INTRODUO As patologias respiratrias esto entre os problemas de maior relevncia econmica na suinocultura moderna. A maioria tem causas infecciosas, de origem bacteriana ou viral. O diagnstico dessas enfermidades se baseia principalmente no exame clnico dos animais afetados, caractersticas epidemiolgicas do surto e nas leses presentes em animais mortos pela infeco ou sacrificados para diagnstico. A confirmao do diagnstico laboratorial depende quase que exclusivamente do isolamento do agente causal ou de sua demonstrao atravs de tcnicas imunolgicas. Existe uma dificuldade bsica no diagnstico bacteriolgico das infeces do trato respiratrio, que se relaciona com o fato de ser esse um ambiente contaminado por ampla variedade de microorganismos comensais. Por ser uma extenso do ambiente externo, as vias respiratrias so constantemente expostas ao contato e colonizao por microorganismos em suspenso no ar atmosfrico. Um agente importante e prevalente como causa de diferentes infeces respiratrias em sunos a Pasteurella (P.) multocida. As do tipo capsular D esto envolvidas na etiologia da rinite atrfica progressiva e as do tipo capsular A so consideradas agentes complicadores de processos pneumnicos, principalmente aqueles que resultam em pleurite (Pijoan, 1999; Zucker et al., 1996). Nos ltimos anos muitos autores tm reportado a presena de P. multocida em pulmes de sunos em diversos pases (Pijoan et al., 1984; Zhao et al., 1992), em vrios tipos de clima e condies de criao. A importncia da bactria como agente primrio de pneumonia em sunos tem sido bastante discutida. Segundo Pijoan e Fuentes (1987), o microorganismo incapaz de agir como patgeno primrio, necessitando da interao com outros agentes para produzir pneumonia (como adenovrus, vrus da Peste Suna Clssica, vrus da PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae e vrus da Doena de Aujeszky). Entretanto, de acordo com os mesmos autores, o isolamento de P. multocida a partir de leses pneumnicas de sunos abatidos em frigorfico comprova a importncia desse microorganismo em pneumonias nessa espcie animal e Zhao et al. (1992) referem-se pneumonia causada por esse agente como sendo aquela que causa maiores prejuzos econmicos indstria suna. Stepan (1995) acompanhou o abate de 5987 sunos em 4 frigorficos do Rio Grande do Sul no ano de 1993. A partir de 230 pulmes coletados, que apresentavam consolidao, pleurite e pneumonia, foram isoladas 100 amostras de P. multocida. No Brasil, cada vez maior o nmero de isolamentos de cepas dessa bactria a partir de pulmes de sunos com pneumonia e pleurite. Esse fato tem sido comprovado pelo crescente nmero de diagnsticos em nosso meio, como aqueles realizados no Laboratrio de Patologia Suna do Centro Pesquisa Veterinria Desidrio Finamor (CPVDF). A bactria cresce com facilidade nos meios usuais de laboratrio, mas a simples presena da mesma no tm significao diagnstica, pois o agente faz parte da microbiota anfibintica (flora normal) das narinas, mas no considerado parte da microbiota normal do pulmo (Pijoan, 1999). Para determinar a significao dos isolados do pulmo, necessria a determinao da patogenicidade, o que requer o uso de provas de difcil realizao. Em muitos casos, tm sido usados modelos biolgicos para conseguir essa diferenciao, o que limita a tcnica a apenas alguns laboratrios especializados e apresenta restries na rea do bem estar animal. A identificao e tipagem de diferentes gneros bacterianos tm sido feita principalmente utilizando mtodos fenotpicos. Tcnicas enquadradas nesse grupo (como sorotipagem, biotipagem, determinao da sensibilidade a antimicrobianos e fagotipagem) no foram suficientemente sensveis para diferenciar clones individuais de P. multocida envolvidos em surtos de infeco natural (Rbies et al., 1996). Os mtodos moleculares, como a restrio do DNA genmico bacteriano utilizando endonucleases de restrio e visualizao dos fragmentos gerados aps eletroforese surgiram como melhores alternativas aos mtodos de identificao usuais e esto sendo consideradas valiosas ferramentas no estudo epidemiolgico das enfermidades infecciosas. Segundo Valenzuela et al. (1995), esses mtodos permitem estabelecer uma relao clonal entre cepas isoladas em diferentes situaes epidemiolgicas e facilitam o estudo da histria natural das enfermidades. Sob o ponto de vista econmico, as doenas respiratrias representam um dos principais problemas nas granjas de sunos. Os prejuzos acarretados pelas mesmas so decorrentes no somente da mortalidade de animais, mas repercutem tambm no retardo no desenvolvimento dos animais, desuniformidade dos lotes, condenao de carcaas no frigorfico e gastos com medicamentos. Na indstria, as perdas se relacionam com condenaes ou utilizao condicional das carcaas. Segundo Piffer (1995) em 1992, no Estado de Santa Catarina, 6,07 % das carcaas foram condenadas ou tiveram aproveitamento condicional. Segundo Piffer e Brito (1993) estimada uma perda de 37,4 g/dia de ganho de peso para cada 10% de hepatizao pulmonar presente necropsia. No nosso meio, Stepan (1995), ao acompanhar 5987 animais abatidos em 4 frigorficos de diferentes regies criatrias de sunos do Estado do Rio Grande do Sul, observou a ocorrncia de leses de pleurite em 1,87% entre os pulmes examinados, fato esse que tem sido confirmado pelos resultados de exames de diagnstico rotineiros executados no Laboratrio de Patologia Suna do CPVDF, Eldorado do Sul, RS.

O aprimoramento de tcnicas de diagnstico das enfermidades respiratrias dos sunos fundamental para a adoo de medidas profilticas e de controle, visando a diminuir as perdas, aumentando a produtividade e com isso conferir um alto status de sade aos animais em diferentes sistemas de produo. No caso da P. multocida, um estudo mais aprofundado sobre diferenas fenotpicas e genotpicas em certas amostras ou sorotipos e avaliao da virulncia usando um modelo experimental poderia contribuir para aprimorar mtodos de preveno, como a determinao de antgenos para serem multiplicados na forma de vacinas, ou para avaliaes epidemiolgicas. Borowski (2001) ao estudar amostras de P. multocida isoladas de animais com leses pneum nicas, visando a desenvolver uma metodologia de caracterizao fenotpica e genotpica e tambm uma avaliao da virulncia, observou grande polimorfismo com as tcnicas utilizadas e diferenas de virulncia para camundongo entre os isolados . Dentre os testes fenotpicos utilizados, o comportamento bioqumico avaliando a utilizao do manitol, sorbitol, arabinose, maltose, dulcitol, xilose e trealose pde ser usado como triagem para estabelecer diferenas clonais (subtipagem) entre amostras de P. multocida. Em relao s tcnicas moleculares, o teste PCR/RFLP a partir de um amplicon do gene que codifica a protena da membrana externa (ompH ) da P. multocida pde ser usado para identificar polimorfismo nessa regio do genoma bacteriano, sendo o teste que melhor discriminou os isolados, conforme pode ser observado na Tabela 1, na qual so apresentadas as caractersticas das amostras de P. multocida relacionando-as com os perfis encontrados nos diferentes testes utilizados para a sua tipificao. Tabela 1: Caractersticas de 24 amostras de P. multocida isoladas de sunos com pneumonia e/ ou pleurite.
Amostra Biotipo Perfil de Resistncia 10 18 2 2 12 11 -a 6 1 9 16 17 4 14 5 1 3 1 -a 15 4 13 8 7 Perfil da DL50 Perfil de Hidrofobicidade 1 3 4 2 5 4 2 5 2 3 2 1 1 1 1 2 2 4 2 3 1 2 3 3 Padro de restrio com Hinf I 1 1 5 6 4 4 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 -b -b Padro de restrio com Rsa I 1 1 6 7 5 5 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 2 2 -b -b Origem

1628 1621 1265 1/95 PI7 PI5 1133 FII14 Ta 710 PI21 903 805 1363 Fr 76 PII8 CII2 PIII19 PIII47 FII9 PIII43 PI23 Ca

4 4 4 4 3 3 1 1 1 1 2 5 2 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4

2 2 2 1 3 3 3 4 2 1 2 -b 1 2 2 2 3 1 1 3 2 2 1 1

CC CC CC CC FR FR CC FR CC CC FR CC CC CC CC CC FR FR FR FR FR FR FR CC

- a sensibilidade a todos os antimicrobianos testados - b no determinado FR isolados de frigorfico CC isolados de casos clnicos

INFECO EM SUNOS Em sunos, a P. multocida um habitante normal da cavidade nasal e um dos agentes etiolgicos de uma forma de infeco do trato respiratrio superior conhecida como rinite atrfica progressiva (de Jong et al., 1980). Nessa enfermidade somente cepas toxignicas de P. multocida, sozinhas ou em associao com outros fatores, como infeco prvia por Bordetella bronchiseptica, so capazes de causar o problema (Pijoan, 1999). A pneumonia por P. multocida em sunos frequentemente ocorre como estgio final de pneumonia enzotica, sendo essa sndrome uma das mais comuns e daquelas que maiores prejuzos causam em criaes de sunos mantidos em confinamento (Pijoan, 1999). A epidemiologia da infeco por P. multocida ainda no est completamente esclarecida, porm sabido que o agente est presente em quase todas as granjas de sunos e pode ser isolado da cavidade nasal de animais sadios. Ainda que a transmisso por aerossol possa ocasionalmente ocorrer dentro de uma granja, provavelmente a transmisso por contato seja a forma mais comum. Pijoan (1999) citou diferentes fontes da bactria como camundongos, outros roedores e galinhas. Eles frequentemente esto infectados com P. multocida, dificultando ou mesmo impossibilitando manter-se uma granja livre do agente.

A infeco experimental com P. multocida difcil de ser estabelecida. Segundo Pijoan (1999), sunos sadios toleraram doses altas da bactria pela via intranasal ou intratraqueal. A eliminao pelo pulmo foi muito eficiente e, 30 minutos aps a inoculao, a bactria no pde mais ser isolada. A reproduo experimental s tem sido possvel com o uso concomitante de agentes imunossupressivos ou por massiva instilao de fludos infectados no pulmo (Pijoan, 1999). Os sinais clnicos variam em severidade, dependendo da amostra de P. multocida e do grau de imunidade do animal. Pijoan (1999) descreveu trs formas clnicas: aguda, subaguda e crnica. A forma aguda de pneumonia causada pela P. multocida frequentemente est associada a amostras do sorotipo B, sendo que a mortalidade pode ser alta (5 a 40%). Este tipo de infeco rara em sunos. A forma subaguda est associada com amostras que produzem pleurite. Nesse caso, tosse e respirao abdominal podem ser observadas em animais na fase de crescimento e terminao. Clinicamente, a doena pode ser confundida com a pleuropneumonia causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, porm geralmente no ocorre morte sbita. A forma crnica a mais comum e se caracteriza por tosse ocasional, comumente entre 10 a 16 semanas de idade. Os sinais so indistinguveis daqueles causados pela infeco simples pelo Mycoplasma hyopneumoniae, sendo que a P. multocida representa uma continuao e exacerbao da micoplasmose primria. As leses ocorrem na cavidade torcica, com consolidao do pulmo. A poro afetada apresenta colorao de vermelho a cinza (Figura 1). Em casos severos pode ser observada pleurite e a presena de abscessos, com aderncia da pleura parede torcica (Pijoan, 1999).

Figura 1- Leses concentradas nos lobos anteriores do pulmo (apicais, cardacos e intermedirio), tpicas da infeco com M. hyopneumoniae complicada com P. multocida. DIAGNSTICO O diagnstico baseado no isolamento do agente ou na realizao de testes para demonstrao da sua presena ou seus antgenos, como sorologia ou provas moleculares (Pijoan, 1999). O isolamento normalmente feito em meios enriquecidos, principalmente naqueles suplementados com soro ou sangue. A utilizao de meios seletivos tem sido indicada por vrios autores (Pijoan, 1999), para aumentar a probabilidade do isolamento da P. multocida a partir de secrees nasais e de pulmes, devido sua freqente associao com outros microorganismos. A inoculao de material suspeito em camundongo tambm utilizada com esse objetivo, uma vez que essa espcie animal muito suscetvel infeco pela bactria e atua como uma forma de filtro biolgico. Stepan et al. (1993) compararam alguns meios seletivos e no seletivos e a inoculao em camundongo visando ao isolamento de P. multocida a partir de pulmes de sunos coletados em frigorfico. Os melhores resultados foram obtidos com a inoculao em camundongo, a qual permitiu o isolamento de 100% das amostras. O uso isolado de gar sangue ou do meio seletivo de Rutter reduziu esse ndice para 37 a 40%. Com base nos antgenos capsulares, a P. multocida tem sido classificada em 5 grupos sorolgicos (A, B, D, E e F), sendo que os sorotipos A e D esto relacionados respectivamente com pneumonia e rinite atrfica em sunos (Pijoan, 1999). A ocorrncia do sorotipo B, causando septicemia em sunos, foi atpica e confinada a regies do sudeste da sia e China (Pijoan, 1999). Alm da classificao baseada no componente capsular, a P. multocida pode ser classificada tendo como base os antgenos somticos. At o momento 16 sorotipos j foram identificados. Segundo Pijoan (1999), os sorotipos 3 e 5 foram aqueles detectados com maior freqncia em sunos. A maioria dos isolados de P. multocida obtidos de pulmes com pneumonia e pleurite pertence ao tipo capsular A (Pijoan, 1999). Acredita-se que a razo pela qual as cepas do tipo A so encontradas com maior freqncia no pulmo estaria relacionada com a presena de cpsula de cido hialurnico, que dificultaria a fagocitose pelos macrfagos alveolares. Deve ser feito o diagnstico diferencial com outros agentes envolvidos em pneumonias como Actinobacillus pleuropneumoniae, vrus da influenza, Mycoplasma hyopneumoniae e outros agentes como o Streptococcus spp. (conforme Quadro 1).

Quadro1- Diagnstico diferencial entre os principais agentes envolvidos em pneumonias em sunos.

DOENA AGENTES MAIS IMPORTANTES SINTOMAS LESES MACROSCPICAS MAIS IMPORTANTES DIAGNSTICO MATERIAL A SER ENVIADO AO LABORAT. Imunofluorescncia Amostras ou imunoperoxidase de soro, Cultivo do agente. pulmes, Leses leito necropsia. Sorologia afetado. (ELISA). O mesmo acima, Os acrescido de exame mesmos bacteriolgico para acima. identificar o agente secundrio envolvido. Suabe nasal, leitto afetado.

Pneumonia enzotica

Mycoplasma hyopneumoniae

Tosse de exerccio. Pode ocorrer leve depresso no apetite e no crescimento. Comum em todas as idades, a partir dos 30 dias.

Pneumonia catarral. Consolidao dos lobos apicais, cardacos e parte anterior dos lobos diafragmticos. Pneumonia catarral a purulenta, presena de pus, abscessos e pleurite em alguns casos.

Pneumonia enzotica complicada

Gripe Suna (Influenza Suna)

Mycoplasma hyopneumoniae associado a outras infeces bacterianas (principalmente P. multocida) Vrus da Influenza suna (os subtipos virais mais comuns so H1N1 e H3N2)

Tosse de exerccio produtiva. Depresso no apetite, crescimento retardado, respirao abdominal. Morte de alguns animais pelo agravamento da doena.

Pleuropneumonia: forma superaguda Pleuropneumonia: forma aguda Pleuropneumonia: forma crnica

Actinobacillus pleuropneumoniae

Anorexia, prostrao, tosse e dispnia em graus variveis e febre. Afeta animais de todas as idades, com alta morbidade e mortalidade. Recuperao comea em 5 a 7 dias. So comuns as infeces secundrias, com agravamento do quadro. Dispnia acentuada, depresso, febre e alta mortalidade em rebanhos no imunes. Os mesmos anteriores, com menor gravidade.

Pneumonia com Isolamento do vrus distribuio lobular. Enfisema lobular.

Actinobacillus pleuropneumoniae

Pneumonia fibrinonecrtica, presena de fluido avermelhado na cavidade torcica. Os mesmos acima, com presena de leses de pleurite mais acentuadas.

Isolamento da bactria. Histopatologia. Os mesmos acima.

Pulmo. Leito afetado. Pulmo. Leito afetado. Pulmo. Leito afetado.

Actinobacillus pleuropneumoniae: cepas pouco patognicas ou na presena de imunidadeno rebanho.

Depresso moderada, tosse e graus variados de atraso no crescimento. Desuniformidade de lotes.

Pneumonia fibrinosa e Os mesmos acima. necrtica crnica. Presena de leses encapsuladas.

Pneumonia purulenta

Bactrias Em geral sem sintomas respiratrios. piognicas, comum em refugos e animais com mau como desenvolvimento. Streptococcus spp, Arcanobacterium spp

Presena de Isolamento dos abscessos distribudos diferentes agentes em diferentes reas do etiolgicos. parnquima pulmonar.

Pulmo. Leito afetado.

IMUNIDADE E VACINAO Existem referncias na literatura sobre vrios tipos de preparaes da bactria, com o objetivo de uso como imungeno para animais. Segundo Chanter e Rutter (1989), pouco conhecido sobre a imunidade das infeces respiratrias por P. multocida e uma grande proporo de sunos em quase todas as granjas est infectada pelo microorganismo no trato respiratrio superior ainda que, provavelmente, por um pequeno nmero de bactrias. Resultados de infeces experimentais tm sugerido que a colonizao do trato respiratrio de longa durao (Chanter e Rutter, 1989). Provavelmente a imunidade natural se restrinja a controlar ou limitar a infeco. Nas infeces por amostras toxignicas de P. multocida na cavidade nasal, Rutter e Rojas (1982) no detectaram anticorpos antitxicos em sunos naturalmente infectados e, em animais gnotobiticos experimentalmente infectados, no mais do que a meta de produziu pequenos ttulos de antitoxinas. Isso, segundo os autores, sugeriu uma deficincia do mecanismo de imunidade da cavidade nasal. A rinite atrfica progressiva uma enfermidade associada a amostras toxignicas de P. multocida. Essa toxina purificada imunognica e anticorpos produzidos contra ela protegem contra a doena. As vacinas atualmente usadas contra rinite atrfica progressiva constituem-se de toxides em vez de bacterinas, o que tem melhorado a sua eficincia no controle da doena.

Pouco conhecido em relao imunidade induzida pelas amostras de P. multocida que causam pneumonia em sunos. Heddleston e Rebers (1975) verificaram que a endotoxina livre tanto de amostras de P. multocida virulentas encapsuladas quanto de mutantes avirulentas no encapsuladas foram capazes de induzir imunidade ativa, mas a frao lipopolissacardica da endotoxina no. Esses autores sugeriram, baseados nesses resultados, que a protena da P. multocida estaria envolvida na estimulao da imunidade ativa. Nos seus experimentos, um toxide no teve efeito quando os sunos foram agredidos com P. multocida toxignica. Erler e Schimmel (1992), comentaram que aplicaes intratraqueais de diferentes preparaes da toxina podiam induzir leses pulmonares no somente com amostras toxignicas, mas tambm s com a toxina purificada. Baseados nos resultados de outros autores, concluram que a toxina desempenhou um papel importante na rinite atrfica e pneumonia em sunos, bovinos e coelhos. Bechmann et al. (1992) salienta ram que alguns autores quando imunizaram animais com toxide protegeram os sunos contra a pneumonia induzida por toxina. Eles tambm estudaram o efeito da vacinao contra a pneumonia por P. multocida em sunos e verificaram que a imunizao de leites com antgeno preparado com o agente inteiro ou extrato capsular a partir de amostra toxignica de P. multocida tipo capsular D reduziu efetivamente o desenvolvimento de leses pulmonares quando o animal foi agredido com um sorotipo homlogo. Entretanto, a im unizao com toxide ou protena da membrana externa no resultou numa reduo significativa das leses pulmonares. O efeito protetor da vacina foi avaliado atravs do escore de leso pulmonar aps agresso. Tentaram correlacionar o ttulo de anticorpos com a severidade das leses. O resultado da deteco de anticorpos no mostrou correlao entre ttulos e leses pulmonares aps agresso. importante salientar que leses de pneumonia tambm podem ser produzidas por P. multocida no toxignicas. H suposio que outros fatores de virulncia poderiam ser importantes na patogenia da pneumonia e outros antgenos para a imunizao. Rangel e Aguade (1992), estudando amostras de P. multocida fimbriadas produtoras de pleurite e pneumonia em sunos, comentaram que a fmbria poderia ser responsvel pelo tropismo das amostras a diferentes estruturas pulmonares. Em parte, poderiam contribuir para o xito ou fracasso das vacinas usadas na preveno de pneumonias por Pasteurella, uma vez que essas bacterinas tm includo somente antgenos capsulares, sem considerar os somticos e os de aderncia. Borowski (2001) no encontrou estrutura semelhante fmbria ao analisar 24 isolados de P. multocida microscopia eletrnica, entretanto somente cultivos obtidos a partir de gar sangue foram testados. Tm sido mostrados efeitos benficos com a utilizao de bacterinas adicionadas de hidrxido de alumnio como adjuvante (Chanter e Rutter, 1989). Dados obtidos no laboratrio de patologia suna de CPVDF nos ltimos quatro anos comprovam a eficcia do uso desse tipo de produto na reduo de mortalidade e melhora do ganho de peso dos sunos em vrias granjas do Estado do Rio Grande do Sul (Borowski, dados no publicados). Entretanto, o uso desse tipo de vacina somente induz imunidade ao sorotipo somtico homlogo e j foram identificados pelo menos 16 sorotipos somticos diferentes. Sendo assim, a vacina para ser efetiva deve conter os sorotipos prevalentes na propriedade. A identificao de marcadores de virulncia e tambm a diversidade ou no dos mesmos poderia ser de utilidade na produo de vacinas que os expressassem. Atualmente o controle pela vacinao tem sido feito com o uso de bacterinas autgenas, o que necessita do isolamento de amostras de cada granja. Como j foi mencionada, a possibilidade da existncia de mais de um tipo bacteriano num mesmo surto pode ocasionar falhas vacinais por deficiente expresso antignica. Com a identificao de antgenos especficos, poderiam ser desenhadas vacinas eficientes em todas as situaes, conferindo imunidade cruzada aos diversos sorotipos e amostras prevalentes nos casos clnicos a campo. Borowski (2001) utilizou o gene que codifica a protena da membrana externa ( ompH ) e, atravs do PCR/RFLP, verificou diferenas entre isolados de P. multocida obtidos de animais com pneumonia e/ou pleurite, discriminando essas amostras em diferentes grupos. O gene ompH , descrito por Luo et al. (1999 e 1997), alm de apresentar polimorfismo entre diferentes sorotipos somticos, est envolvido nas d iferenas antignicas entre cepas que tm sido estudadas para o desenvolvimento de vacinas mais eficientes.
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CONCLUSES A P. multocida um agente importante e prevalente causando pneumonia e/ou pleurite em sunos, sendo que o tipo capsular A aquele isolado de quase 100% dos pulmes com leses; Resultados de anlises utilizando diferentes testes fenotpicos e genotpicos tm mostrado grande diversidade entre os isolados de P. multocida a partir de pulmes de sunos; A identificao de marcadores de virulncia fundamental visando a realizao de estudos epidemiolgicos e em estratgias de controle pela vacinao. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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