Simões Karina

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
KARINA SIMES
CICLO REPRODUTIVO ANUAL E CARACTERSTICAS MORFOFISIOLGICAS TESTICULARES DO PATO DOMSTICO (Anas platyrhynchos)
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para a obteno do Ttulo de Doutor em Biologia Celular e Estrutural na rea de: Anatomia
Orientador: Prof. Dr. Antnio Marcos Orsi
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FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA UNICAMP
Simes, Karina Si51c Ciclo reprodutivo anual e caractersticas morfo-fisiolgicas testiculares do pato domstico (Anas platyrhynchos) / Karina Simes.-Campinas, SP: [s.n.], 2004. Orientador: Antnio Marcos Orsi Tese (Doutorado) Universidade Estadual de Campinas . Instituto de Biologia. 1. Ave. 2. Testculos. 3. Espermatozides. 4. Metabolismo energtico. I. Orsi, Antnio Marcos. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Ttulo.
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Campinas, 23 de julho de 2004.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Antonio Marcos Orsi (Orientador)
_________________________________
(Assinatura)
Profa. Dra. Valria Helena Alves Cagnon Quitete _________________________________

(Assinatura)
Prof. Dr. Francisco Eduardo Martinez
_________________________________
(Assinatura)
Profa. Dra. Sandra Maria Miraglia Valdeolivas
_________________________________
(Assinatura)
Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder
_________________________________
(Assinatura)
Prof. Dr. Humberto Santo Neto
_________________________________
(Assinatura)
Prof. Dr. Ruberval Armando Lopes
_________________________________
(Assinatura)
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Dedico esta Tese de Doutorado:
Aos meus pais Joaquim Simes Filho e Maria Celeste Moschin Simes, minha irm Adriane Simes Ramos e ao meu cunhado Marcus Vincius Ramos pelo amor, carinho, estrutura familiar e incondicional apoio em minha lida pelo ideal.
Ao meu amigo e namorado Claudinei da Cruz pelo seu amor, companheirismo, incentivo, apoio emocional e constante colaborao na execuo deste trabalho.
Coloca teu ideal entre as estrelas, embora saibas que jamais poder alcan-las (Tolstoi)
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Antnio Marcos Orsi, Departamento de Anatomia, UNESP/Botucatu, pela orientao, confiana, respeito, estmulo, amizade, disponibilidade constante durante a realizao deste trabalho. Professor Orsi, o verdadeiro Mestre, exemplo de competncia, humanismo, humildade, me ensinou as coisas mais importantes de vida, a lutar pelos meus ideais e a crescer como profissional e pessoa. Aos professores doutores Mrcia Rita Martinez Criscuolo Fernandes Baraldi Urbinati Machado Artoni e
(Anatomia/UNESP/Jaboticabal), (Anatomia/UNESP/Jaboticabal) e
Silvana Elizabeth
(Fisiologia
CAUNESP/UNESP/Jaboticabal) pela cordial colaborao, disponibilidade constante, amizade e incentivo durante a execuo do trabalho. Aos meus amigos Claudinei da Cruz (Setor de Tcnicas Morfolgicas e CAUNESP/UNESP/Jaboticabal), Flvio Dalio Gonalves (Laboratrio de Fisiologia e CAUNESP/UNESP/Jaboticabal), Damares Perecim Roviero (tcnica do Laboratrio de Fisiologia/UNESP/Jaboticabal), Nilton de Arajo e Iara Maria Messiano (tcnicos do Laboratrio de Anatomia/UNESP/Jaboticabal), graduandos e ps-graduandos da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP/Jaboticabal por me ajudarem nas trabalhosas coletas, no processamento do material histolgico e fisiolgico e pela amizade e companheirismo incentivador. minha amiga Ktia Aparecida da Silva Viegas (Anatomia/USP/So Paulo) por me ajudar na finalizao dos artigos e na formatao da tese; aos meus amigos ps-graduandos
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do Programa de Ps-graduao em Biologia Celular e Estrutural/UNICAMP/Campinas pela amizade, solidariedade, incentivo, apoio durante as disciplinas e adorvel convivncia, contribuindo muito para minha evoluo cientfica durante o curso de ps-graduao. Ao Centro de Microscopia Eletrnica (IB/UNESP/Botucatu) pelo processamento do material de pesquisa e ateno dispensada durante o desenvolver do nosso trabalho. Seo de Fotografias (UNESP/Botucatu), especialmente ao Slvio, Silvinho e Daniel pela amizade, cordialidade e auxlio fotogrfico prestado no decorrer deste trabalho. Aos amigos do Departamento de Anatomia (UNESP/Botucatu), Departamento de Biologia Celular (UNICAMP/Campinas), Departamento de Anatomia
(UNICAMP/Campinas) e Laboratrio de Anatomia (UNESP/Jaboticabal) pela convivncia, amizade e colaborao na execuo deste trabalho. Comisso Examinadora pelas inmeras e valiosas sugestes dispensadas ao nosso trabalho de tese de doutorado. Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pela concesso da bolsa de Doutorado durante o curso de ps-graduao e suporte financeiro para a realizao do projeto de pesquisa (Processo n 00/05079-4). A todos aqueles que participaram da minha formao e me incentivaram direta ou indiretamente, aqui omitidos, porm nunca esquecidos, meu MUITO OBRIGADO.
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SUMRIO
I.
Resumo
II.
Abstract
III. IV.
Introduo Geral Objetivos
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V.
Artigos
Artigo 1: Ciclo reprodutivo anual e variabilidade dos nveis plasmticos de testosterona no pato domstico (Anas platyrhynchos) 13
Artigo 2: Variabilidades morfomtricas testiculares e nveis de glicose, glicognio e lipdeo durante o ciclo reprodutivo anual do pato domstico 37
(Anas platyrhynchos)
Artigo 3: Caractersticas ultra-estruturais dos espermatozides do pato domstico (Anas platyrhynchos) 63
VI.
Concluses Gerais
85
VII.
Referncias Bibliogrficas Gerais
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RESUMO
Em aves, a reproduo um processo cclico definido, onde a cada ano os rgos reprodutores crescem e regridem sob a influncia de fatores ambientais. Durante o processo de maturao das gnadas e reproduo, o organismo do animal mobiliza energia intensamente. O processo reprodutivo bem elaborado, incluindo operaes especializadas como produo, maturao e liberao de gametas, bem como a sntese de hormnios esterides sexuais e comportamento sexual. O objetivo do estudo foi conhecer a morfologia testicular do pato domstico (Anas platyhrynchos) e estabelecer seu ciclo reprodutivo anual, relacionando-o ao nvel do hormnio testosterona e a alguns parmetros do metabolismo energtico interligados ao processo reprodutivo. Para isto foram utilizados 36 animais, sendo coletados testculos de 3 animais por ms, visando a descrio morfolgica e o estabelecimento do ciclo reprodutivo anual da espcie por meio de microscopia de luz e anlise morfomtrica. Os espermatozides foram analisados atravs de microscopia eletrnica de transmisso e de varredura. Os nveis de testosterona plasmtica total foram dosados mensalmente por meio do Kit Cout-A-Count (DPC) e os nveis de glicose sangnea pelo mtodo colorimtrico. Tambm foram dosados o glicognio heptico e muscular pelo mtodo Glicognio Trinder e lipdeos totais heptico e muscular pelo mtodo de extrao com solvente orgnico. O ciclo reprodutivo anual do pato domstico caracterizado por quatro fases distintas, se iniciando com a fase reprodutiva no comeo do inverno (Julho) e com pico da reproduo na primavera (Outubro), apresentando maiores peso e volume testiculares, e maiores dimetro dos tbulos seminferos e altura do epitlio
seminfero. A fase regressiva ocorre no final da primavera (Novembro) e incio do vero (Dezembro). A fase de quiescncia ou repouso testicular observada durante o vero (Janeiro, Fevereiro), sendo sucedida pela fase de recrudescncia que ocorre no outono (Maro a Junho), correspondendo fase mais longa do ciclo. O processo completo da espermatognese em termos de maturao dos espermatozides e a espermiao foram notados durante a fase reprodutiva, coincidindo com o pico de testosterona plasmtica. Os espermatozides so caracterizados pela presena de cabea, curta pea intermediria e uma longa pea principal. No conjunto os espermatozides so longos, filiformes e cilndricos. O espermatozide do pato domstico similar ao de outras aves nopasseriformes correspondendo a um tipo bsico de espermatozide. Concernente ao metabolismo energtico somente a glicose sangnea estava correlacionada ao ciclo reprodutivo anual da espcie, fornecendo energia para o processo reprodutivo.
ABSTRACT
In birds, reproduction is a defined cyclic process; in which each year the reproductive organs grow and regress under the influence of environmental factors. During the process of gonadal maturation and reproduction, the organism of the animal intensively mobilizes energy. The reproductive process is well elaborated, including specialized operations such as the production, maturation and release of gametes, as well as the synthesis of sex steroid hormones and sexual behavior. The aim of the present study was to determine the morphology of the testes of the domestic duck (Anas platyrhynchos) and to establish its annual reproductive cycle, correlating it with testosterone levels and some parameters of energy metabolism associated with the reproductive process. Using a total of 36 ducks, testes were collected from 3 animals per month, and the morphology and annual reproductive cycle of the species were determined by light microscopy and morphometric analysis. Spermatozoa were analyzed by transmission and scanning electron microscopy. Total plasma testosterone levels were measured monthly using the Cout-A-Count (DPC) kit and blood glucose levels were determined by a colorimetric method. Hepatic and muscle glycogen was measured by the Trinder glycogen method and total hepatic and muscle lipids using extraction with organic solvents. The annual spermatogenic cycle of the domestic duck is characterized by four distinct phases, starting with the reproductive phase at the beginning of winter (July) and peak reproduction in spring (October), with higher testicular weight and volume, a larger seminiferous tubular diameter and greater seminiferous epithelium height being observed during these periods. The regressive phase occurs at the
end of spring (November) and the beginning of summer (December). The phase of quiescence or testicular resting is observed during summer (January, February), followed by the phase of recrudescence that occurs in autumn (March to June), corresponding to the longest phase of the cycle. The complete process of spermatogenesis in terms of spermatozoon maturation and spermiation is noted during the reproductive phase, coinciding with peak plasma testosterone levels. The spermatozoa are long, filiform and cylindric and are characterized by the presence of a head, short middle piece and long principal piece. The spermatozoon of the domestic duck resembles that of other nonpasseriform birds, corresponding to the basic type of spermatozoon. Considering energy metabolism, only blood glucose was correlated with the annual reproductive cycle of the domestic duck, providing energy for the reproductive process.
INTRODUO GERAL
1 - Morfologia Testicular e dos Espermatozides
As aves da famlia Anatidae (Ordem Anseriforme) constituem importante reserva econmica para o pas, na medida em que representam alimento apreciado e fonte de renda resultante do comrcio ligado cinegtica (Sick, 1988). O pato domstico, Anas platyhrynchos, uma espcie introduzida no pas, que habita partes da Amrica do Norte e Eursia, e no inverno do hemisfrio norte, migra para o sul do Mxico, norte da frica e sudeste da sia (Harrison e Greensmith, 1995). Atualmente, maior nfase tem sido dada aos aspectos fisiolgicos e
endocrinolgicos da biologia reprodutiva aviria. A morfologia gonadal tem sido pouco estudada e seu conhecimento est limitado a um pequeno nmero de espcies quando comparada ao de outras classes de vertebrados (Breucker, 1982; Baraldi-Artoni et al., 1999). O sistema reprodutor masculino de aves constitudo pelos testculos e via espermtica extratesticular, que compreende os ductos eferentes, a regio epididimria e o ducto deferente, e pelo rgo copulador. Estas estruturas, exceto o rgo copulador, so intra-abdominais, pois as aves so animais endrquidos (King, 1975; Breucker, 1982; Mercadante et al., 1983).
O parnquima testicular composto pelos tbulos seminferos, rede testicular e dctulos eferentes, nas aves. Cada tbulo seminfero est formado pelo epitlio espermatogentico com dois tipos celulares funcionalmente diferentes, denominados de clulas germinativas e clulas de sustentao. As clulas germinativas so constitudas, da parede dos tbulos em direo luz, pelas espermatognias, espermatcitos primrios (I), espermatcitos secundrios (II), espermtides e espermatozides (Lake, 1981; BaraldiArtoni, 1993). As clulas de sustentao so denominadas clulas de Sertoli, sendo responsveis pela transferncia de nutrientes para as clulas germinativas e sustentao do epitlio germinativo (Sturkie, 1967; Lake, 1981). Usando rdioistopos, De Reviers (1974) demonstrou que a durao da espermatognese em aves mais curta quando comparada dos mamferos, onde a prfase meitica dura cerca de 5 a 6 dias, e a espermiognese cerca de 6 dias, durando ambas em mamferos de 15 dias em mdia. Entre os tbulos seminferos se localiza o tecido intersticial, cujo principal componente estrutural a clula de Leydig, responsvel pela produo de andrgenos (Lake, 1981). Estruturalmente os testculos das aves apresentam tnica albugnea delgada que se continua com o estroma intratesticular pouco desenvolvido, estando ausentes septos testiculares e um mediastino testicular definido (Sisson e Grossman, 1981). Os espermatozides de aves domsticas tm sido estudados desde o sculo passado, entretanto, a literatura sobre espermatozides de aves no extensa (Vernon e Woolley, 1999). Atualmente, h grande interesse em saber o significado evolucionrio da competio dos espermatozides em aves; para tanto, se torna necessrio o conhecimento da morfologia dos espermatozides, principalmente a estrutura do flagelo, com o intuito de se estabelecer um padro de motilidade para cada espcie (Vernon e Woolley, 1999).
Vernon e Woolley (1999) estudando os espermatozides de vrias espcies de aves, por meio de microscopia eletrnica de varredura, verificaram que os espermatozides do estorninho so tpicos de espcies de passeriformes, tendo acrossoma, ncleo e cadeia simples de mitocndrias fusionadas que contribuem para dar poro proximal da clula uma superfcie de encaixe helicoidal. J os espermatozides da codorna domstica possuem um flagelo muito mais longo (208m) em relao aos do galo domstico (82 m). Os espermatozides do pombo so tpicos de espcies no passeriformes, tendo cabea encurvada, flagelo longo (132 m) e mitocndrias dispostas em 4 ou 5 cadeias paralelas. Estudos ultra-estruturais comparativos dos espermatozides de peru, galo e galinha dangola foram realizados por Thurston e Hess (1987). A forma dos espermatozides destas espcies similar quando so observados ao nvel de microscopia eletrnica de varredura, quando aparecem longos, estreitos e com aparncia vermiforme, tendo acrossoma, ncleo, pea intermediria e flagelo facilmente distinguveis, diferindo, entre si, somente no comprimento flagelar.
2 - Ciclo Reprodutivo Anual e Ao Hormonal
Em aves, a reproduo um processo cclico definido. A cada ano, principalmente nas aves silvestres, os rgos reprodutores masculinos crescem e regridem sob a influncia de fatores ambientais como luz, temperatura, ndice pluviomtrico e disponibilidade de alimento (Kemp, 1973). Durante o processo de maturao das gnadas e reproduo, o organismo do animal mobiliza energia intensamente. O processo reprodutivo bem
elaborado, incluindo operaes especializadas como produo, maturao e liberao de gametas, bem como sntese de hormnios esterides sexuais e comportamento sexual. Parte da energia utilizada para sustentar estes processos fornecida pelos carboidratos, lipdeos e protenas ingeridos pela dieta ou estocados nos tecidos corpreos (Mommsen et al., 1980; Andriguetto et al., 1981; Lehninger, 1995). Estudos tm sido conduzidos sobre a influncia de diferentes fotoperodos no controle de funes reprodutivas de aves, fmeas e machos, de acordo com os seus interesses econmicos. Em uma avicultura conduzida com controle de luminosidade, a durao pr-estabelecida da luz ou a sua ausncia de fundamental importncia para cada fase do ciclo reprodutivo do animal (Baraldi-Artoni et al., 1997). Para se determinar o ciclo testicular anual de uma ave, alguns parmetros morfolgicos e morfomtricos tm sido utilizados tais como: dimetro dos tbulos seminferos, altura do epitlio seminfero, nmero de clulas intersticiais, nmero e cintica de clulas germinativas, espessura da tnica albugnea e dimetro nuclear das clulas germinativas (Fuenzalida et al., 1989; Baraldi-Artoni et al., 1997). Os ciclos testiculares anuais foram estudados em algumas espcies de pssaros (Bailey, 1953), no cisne europeu (Breucker, 1982), no pingim antrtico (Fuenzalida et al., 1989) e na codorna domstica (Baraldi-Artoni et al., 1997), utilizando-se principalmente os parmetros propostos por Fuenzalida et al. (1989), os quais esto associados ou no aos nveis hormonais testiculares. Estes ciclos apresentam geralmente quatro fases distintas denominadas de repouso, recrudescncia, proliferao e regresso. As fases sucedem-se ao longo do ano, nos diferentes meses, ou nas diferentes estaes, e apresentam aparentemente
como principal influncia exgena sobre as suas freqncia e durao, o comprimento do fotoperodo (Baraldi-Artoni, et al., 1997). Considerando os fatores endgenos e exgenos da cintica testicular de aves, a codorna domstica mostrou atividade espermatogentica mxima em setembro e mnima em outubro, no hemisfrio sul (Baraldi-Artoni, 1993). O peso testicular, forma dos tbulos seminferos e composio do epitlio germinativo da codorna revelaram grande variao ao longo do ano, quando o maior peso testicular detectado foi observado no final do outono e durante o inverno, perodos de dias curtos, tendo nveis mximos em setembro. Em contraste, o peso corpreo e a atividade espermatogentica foram marcadamente diminudos no final da primavera e durante o vero austral, sendo perodos de dias longos (Baraldi-Artoni et al., 1999). As variaes circanuais da atividade espermatogentica foram observadas no pato andino (Breucker et al., 1989). Segundo os autores, um ciclo testicular anual foi verificado, baseado na aparncia dos testculos, no peso testicular, volume testicular e dimetro dos tbulos seminferos. A melhor evidncia de fases cclicas da espermatognese, naquele estudo foi o aumento e diminuio do dimetro dos tbulos seminferos, correspondendo s diferentes etapas de atividade e de involuo testiculares. Uma diminuio pequena no dimetro dos tbulos seminferos foi observada no final do vero (outubro/dezembro) e no incio do inverno (julho/agosto). No pato andino, o perodo de atividade reprodutiva bastante prolongado, enquanto que as fases de regresso e quiescncia testiculares so reduzidas a um perodo mnimo. Dawson (1983) estudando o estorninho selvagem (Sturnus vulgaris) observou mudanas significativas na concentrao do hormnio testosterona durante o ciclo testicular
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anual, atingindo os valores mximos somente no ms de abril, diminuindo em maio e permanecendo baixo durante todo o vero. O autor concluiu que o ciclo testicular anual do estorninho est restrito estao reprodutiva, quando o peso testicular e as concentraes de testosterona permanecem reduzidos durante todo o ano, aumentando rapidamente para atingir o pico mximo em abril (primavera na Inglaterra), coincidindo tambm com os maiores valores sricos de LH e FSH (Dawson e Goldsmith, 1982). Esses autores tambm enfatizaram que nveis mximos de testosterona, em muitas espcies de aves, coincidem com o estabelecimento e defesa territorial e comportamento reprodutivo.
3 - Metabolismo Energtico
O estoque de energia de um organismo animal importante para o suporte de vrios processos fisiolgicos, incluindo o reprodutivo. Parte dessa energia fornecida pelos carboidratos, e parte pelos lipdeos e protenas (Lehninger, 1995). O metabolismo de carboidratos tem sido estudado extensivamente como fonte de energia para a manuteno das atividades dos espermatozides, no somente na atuao em funes naturais dos espermatozides, mas tambm para o desenvolvimento de tcnicas de manuteno de espermatozides in vitro, visando a inseminao artificial em aves (Freeman, 1984). Os possveis processos metablicos para sustentar os espermatozides durante as vrias fases de seu ciclo de vida, desde os testculos at atingirem o ocito na fase de fertilizao, tm sido estudados. Os espermatozides podem utilizar monossacardeos exgenos, onde poucos ou quase nenhum esto naturalmente presentes nos ductos
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deferentes (Freeman, 1984), os rgos de estoque de zides em aves. Alguns estudos tm sido realizados para investigar quais as substncias importantes como fontes de energia para o processo de ejaculao em aves. Uma das principais alternativas de substrato para o metabolismo energtico seria a utilizao de lipdeos ou compostos lipdicos, pois espermatozides e plasma seminal no fludo do ducto deferente contm lipdeos, compostos lipdicos ou outros compostos associados com o metabolismo lipdico (Lake, 1971; Howarth, 1983; Freeman, 1984). Experimentos tm sido realizados para se determinar o papel de compostos lipdicos, como o colesterol, na capacitao dos espermatozides (Cerolini et al., 1997; Cross, 1998; Wolfe et al., 1998). Variaes sazonais no contedo de protenas, lipdeos e carboidratos dos msculos corpreos e fgado correlacionadas com crescimento, maturao das gnadas e espermatognese tm sido analisadas tambm em animais pecilotrmicos, principalmente em peixes. conhecido que nestas espcies os estoques destes nutrientes no fgado e msculos corpreos so transferidos para as gnadas e utilizados como fontes de energia para o metabolismo, crescimento gonadal e maturao (Eliassen e Vahl, 1982 a, b). Tanto as protenas como o material lipdico so depositados no fgado e msculos corpreos, durante os perodos de repouso e de maturao gonadal. A fase de estoque de carboidratos no fgado e msculos corpreos ocorre somente na etapa de maturao gonadal, sendo os carboidratos utilizados como fonte de energia para a atividade espermatogentica (Ochiai e Tanaka, 1980).
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OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivos a investigao morfolgica da estrutura testicular, o estabelecimento do ciclo reprodutivo anual do pato domstico (Anas platyrhynchos), correlacionando-o aos nveis de testosterona plasmtica e metabolismo energtico, e a anlise ultra-estrutural dos espermatozides, visando contribuir para o entendimento da biologia reprodutiva e melhor desempenho na produo comercial desta espcie.
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Ciclo reprodutivo anual e variabilidade dos nveis plasmticos de testosterona no pato domstico (Anas platyrhynchos)
Annual reproductive cycle and variability in plasma testosterone levels in the domestic duck (Anas platyrhynchos)
K. Simes1, A. M. Orsi2, C. Cruz3, E. C. Urbinati4, F. D. Gonalvez3, K. A. S. Viegas5

1
Departament of Anatomy, Institute of Biology, State University of Campinas, UNICAMP,
Campinas, So Paulo, Brazil, 13083-970

2
Departament of Anatomy, Institute of Biosciences, So Paulo State University, UNESP,
Botucatu, So Paulo, Brazil, 18618-000

3
Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil, 148700-000 Departament of Physiology and Animal Morphology, So Paulo State University, UNESP,
Jaboticabal, and Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil, 148700-000

5
Departament of Surgery, So Paulo University, USP, So Paulo, Brazil, 05508-000
Running headline: Testicular cycle and testosterone levels in the domestic duck
Corresponding Author: Karina Simes, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biocincias, Departamento de Anatomia, Distrito de Rubio Jnior, S/N, Botucatu, So Paulo, Brasil, CEP 18618-000. Artigo formatado segundo as normas da revista Experimental Journal of Zoology, USA.
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Resumo
O ciclo reprodutivo anual do pato domstico caracterizado por quatro fases distintas, se iniciando com a fase reprodutiva no comeo do inverno (Julho) e com pico da reproduo na primavera (Outubro), seguida pela fase regressiva no final da primavera (Novembro) e incio do vero (Dezembro). A fase de quiescncia ou repouso testicular observada durante o vero (Janeiro, Fevereiro), sendo sucedida pela fase de recrudescncia que ocorre no outono (Maro a Junho), correspondendo a fase mais longa do ciclo. Uma completa espermatognese em termos de maturao dos espermatozides e espermiao notada durante a fase reprodutiva, coincidindo com o pico de testosterona plasmtica. Na fase regressiva uma descamao do epitlio seminfero observada, acompanhada aparentemente pelo aumento na quantidade de fibras colgenas. Um aumento no dimetro dos tbulos seminferos ocorre durante a fase de quiescncia testicular, com predominncia de espermatognias e clulas de Sertoli e um segundo pico de testosterona plasmtica foi tambm constatado durante esta fase (Janeiro), provavelmente representando a preparao para um retorno gradual do processo espermatogentico durante a fase de recrudescncia. Esta ltima fase caracterizada pela retomada da recuperao do epitlio seminfero, sendo acompanhada pelo aumento de espermatognias, incio de diviso meitica e presena de espermatcitos primrios e espermtides em maturao. Palavras-chave: ciclo reprodutivo, testosterona, testculo, aves, pato domstico.
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Introduo
A reproduo em vertebrados est sob regulao endgena e geralmente dependente tambm de fatores ambientais ou parcrinos. Logo, os modelos reprodutivos se desenvolvem alternando perodos de atividade e quiescncia gonadal. Nas aves, os ciclos reprodutivos sazonais so constantes, influenciados por fatores parcrinos, onde os rgos reprodutores crescem e regridem com a luz, temperatura, ndice pluviomtrico e disponibilidade de alimento (Kemp, 1973), estando sujeitos tambm a constantes variaes em virtude da latitude e altitude geogrfica (Breucker et al., 1989). Os ciclos reprodutivos de vertebrados silvestres se sincronizam com as variaes ambientais, visando a sobrevivncia das espcies, apresentando uma caracterstica sazonalidade. Muitas aves tropicais tm conservado esta sazonalidade apesar de habitarem regies de condies ambientais relativamente constantes ao longo do ano (Fuenzalida et al., 1989). Em aves de reproduo sazonal, a disponibilidade de gametas maduros est restrita a uma determinada poca do ano, sendo varivel entre as espcies. As alteraes morfofuncionais das gnadas apresentam um ciclo anual onde, nos testculos, pode-se distinguir 4 fases denominadas de quiescncia (repouso), recrudescncia, proliferao (reproduo) e regresso, baseadas em modificaes histolgicas do epitlio seminfero (Fuenzalida et al., 1989; Breucker et al., 1989; Baraldi-Artoni et al., 1997). Estas fases distintas se sucedem ao longo do ano, nos diferentes meses, ou nas diferentes estaes e apresentam aparentemente como principal influncia exgena sobre a sua freqncia e durao, o comprimento do fotoperodo (Baraldi-Artoni, et al., 1997).
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O comprimento do fotoperodo responsvel pelo desenvolvimento das gnadas e pela sincronizao da reproduo, atuando na hipfise e no hipotlamo, estimulando as gonadotrofinas gonadais. As gonadotrofinas FSH e LH atuam no desenvolvimento das clulas germinativas e na formao e liberao dos hormnios esterides gonadais. O FSH estimula a espermatognese, enquanto que o LH estimula as clulas de Leydig a produzirem testosterona, um esteride necessrio para a maturao dos espermatozides (Bentley, 1998). Nas aves, o hormnio testosterona responsvel pela estimulao da agressividade territorial, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundrios, produo de espermatozides e pelo comportamento sexual em machos (Hau et al., 2000). Em geral, os nveis plasmticos de testosterona circulante aumentam prximos primavera e mantm-se elevados durante o perodo reprodutivo (Follett, 1984; Wingfield e Farner, 1993; Hau et al., 2000). J em algumas espcies de aves tropicais terrestres, as mudanas nos nveis de testosterona durante o ciclo reprodutivo so pequenas ou at ausentes (Wingfield et al., 1990; Lorme et al., 2000). O objetivo do estudo foi determinar o ciclo reprodutivo anual do pato domstico, de acordo com as caractersticas histolgicas do epitlio seminfero e estabelecer os nveis plasmticos de testosterona durante as fases deste ciclo reprodutivo, relacionando-os s diferentes estaes do ano.
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Material e Mtodos
No estudo do ciclo reprodutivo anual e dos nveis plasmticos de testosterona foram utilizados 36 patos domsticos adultos da espcie Anas platyrhynchos, com peso corpreo de 2,5 a 4,0 Kg, provenientes de criao comercial extensiva. Os animais foram eutanasiados ao longo de 1 ano, mediante saturao anestsica com uma mistura de cloridrato de quetamina (20mg/Kg) e cloridrato de xilazina (1,5 mg/Kg) aplicada intramuscularmente. Os rgos reprodutores foram abordados por meio de laparotomia abdominal, rebatimento do plastro esternal e eviscerao do trato gastrointestinal. Para a determinao do ciclo reprodutivo anual, 3 animais foram sacrificados por ms e os testculos retirados, seccionados longitudinalmente e imersos em soluo de Bouin ou McDowell (McDowell e Trump, 1976) por 24 horas e includos em Histosec (Merck, USA) ou Historesin (Leica, Germany). Seces histolgicas de 5 a 3 m de espessura foram coradas com Hematoxilina-Eosina, Heidenhain Scheleicher (Behmer et al., 1976) e Hematoxilina-Floxina, Azul de Toluidina 1%-Fucsina Bsica 0,5%. Na dosagem de testosterona plasmtica total coletou-se mensalmente amostras de sangue dos animais nos perodo da manh, por puno no ventrculo cardaco esquerdo, com a utilizao de seringa heparinizada. Aps a centrifugao refrigerada, o plasma obtido foi congelado a -20C para posterior anlise dos nveis de concentrao do andrgeno. A dosagem de testosterona total plasmtica foi efetuada por radioimunoensaio com o uso de Kit comercial Coat-A-Count (DPC, USA), usado em duplicata para eventual contraprova das anlises. Para a dosagem utilizou-se 50 l de plasma e 1.0 ml de Iodo125
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para cada tubo, com incubao de 3 horas a 37C e decantao por 1 hora. A leitura procedeu-se por 1 minuto/amostra no Contador Gama (DPC, USA). O coeficiente de variabilidade inter-ensaio foi de 9,6%. Os dados foram estatisticamente analisados, sendo submetidos anlise de varincia (ANOVA) e ao Teste de Tukey 5 %, utilizando-se o software SAS (Statistical Analyses System, USA).
Resultados
O ciclo reprodutivo anual de Anas platyrhynchos pode ser dividido em quatro fases cclicas e sucessivas ao longo do ano, baseadas nas modificaes morfolgicas do epitlio seminfero, sendo caracterizadas como fases de reproduo (proliferao), regresso, quiescncia (repouso) e recrudescncia gonadal. A fase de reproduo se iniciou no inverno (Julho) e atingiu seu pico reprodutivo no incio da primavera (Outubro). Esta se caracterizou pela presena de um processo completo de espermatognese, tbulos seminferos amplos com espermatognias, espermatcitos primrios em diferentes estgios da prfase I meitica, difereniaco da espermtides e espermatozides no lmen tubular (Figs. 1, 2, 3). Ainda durante a fase reprodutiva, a tnica albugnea era delgada e o interstcio pouco desenvolvido, aparentemente com reduo na quantidade de clulas de Leydig e vasos sangneos (Figs. 1, 2). A fase de regresso ocorreu no final da primavera (Novembro) e incio de vero (Dezembro), com a involuo do epitlio seminfero, meiose e espermatognese
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incompleta. A principal caracterstica desta fase regressiva foi a descamao do epitlio seminfero, que recobria o lmen tubular (Figs. 4, 5). A tnica albugnea e a membrana basal dos tbulos seminferos apresentaram-se, aparentemente, mais espessas (Fig. 5) e ocorreu no interstcio um predomnio fibrilar de colgeno e presena de vrios vasos sangneos (Fig. 4). Na estao de vero (Janeiro, Fevereiro) iniciou-se a fase de quiescncia testicular, somente com a presena de espermatognias, de clulas de Sertoli e dimetro dos tbulos seminferos reduzidos (Figs. 6, 7). A tnica albugnea, a membrana basal e o tecido peritubular dos tbulos seminferos eram espessos e o interstcio desenvolvido, com vrios fibroblastos e clulas de Leydig (Fig. 7). A fase de recrudescncia ocorreu durante todo o outono (meses de Maro a Junho), sendo esta a mais longa do ciclo reprodutivo. Caracterizou-se pela recuperao do epitlio seminfero, com presena marcante de espermatognias e incio da meiose, com espermatcitos primrios em diferentes estgios da prfase I meitica e espermtides em maturao (Figs. 8, 9). A tnica albugnea, a membrana basal e o tecido peritubular dos tbulos seminferos eram delgados e o interstcio escasso, com algumas clulas de Leydig (Fig. 8). A concentrao do hormnio testosterona no plasma sangneo do pato domstico variou sazonalmente. Os maiores valores mdios ocorreram durante o pico da reproduo (76,91 0,20 ng/dL) em outubro e, tambm, durante o incio da quiescncia (70,84 5,71 ng/dL) em janeiro, sem diferena significativa entre essas duas fases (Grfico 1), porm diferindo significativamente das demais fases do ciclo reprodutivo.
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Os nveis intermedirios de testosterona foram observados durante todo o perodo de recrudescncia, sem diferena significativa entre os meses desta fase. Entretanto, os valores mdios mais baixos de testosterona foram notados entre as fases de quiescncia, reproduo e regresso, sem diferena significativa entre estas fases (Grfico 1).
Grfico 1. Valores mdios dos nveis de testosterona plasmtica total (ng/dL) durante o ciclo reprodutivo anual do pato domstico
(ng/dL)
100 a 75 50 25 0
a Fe ry br ua ry M ar ch M ay ne ril Ap Ja nu Ju Ju l y
mean b d d cd bc d d d d d
Month of the year
*Valores seguidos pelas mesmas letras no diferem entre si (teste de Tukey 5%). **Fases do Ciclo: Janeiro e Fevereiro (fase de quiescncia); Maro a Junho (fase de recrudescncia); Julho a Outubro (fase de reproduo); Novembro e dezembro (fase de regresso).
g S e ust pt em be r O ct ob er N ov em be D r ec em be r
Au
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Figs. 1, 2, 3 Fotomicrografia na fase de pico da reproduo, mostrando amplos tbulos seminferos (estrelas), espermatognias (G), espermatcitos primrios (cabeas de seta), espermtides redondas (asteriscos pequenos) e alongadas (setas). Note os espermatozides (Z) no lmen tubular na Fig. 1, o interstcio (asteriscos grandes) nas Figs. 1 e 2, clulas de Leydig (L) nas Figs. 1 e 2. Bar = 10 m na Fig. 1; Bar = 2,5 m nas Figs. 2 e 3.
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Fig. 4 Fase de regresso, evidenciando a descamao celular do epitlio seminfero no lmen tubular (rosceas), interstcio (asteriscos) com predomnio fibrilar de colgeno e vaso sangneo (V). Bar = 10,0 m.
Fig. 5 Epitlio seminfero na fase de regresso, mostrando clulas de Sertoli (setas largas pequenas), espermatognias (G), espermatcitos primrios (cabeas de seta), membrana basal e tecido peritubular desenvolvidos (seta larga grande) e descamao celular do epitlio seminfero (roscea). Bar = 2,5 m.
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Fig. 6 Fase de quiescncia testicular, mostrando pequenos tbulos seminferos (estrelas). Bar = 5 m.
Fig. 7 Fase de quiescncia, com epitlio apresentando somente espermatognias (G) e clulas de Sertoli (setas largas). Nota-se um interstcio desenvolvido (asterisco), com vrios fibroblastos (F). Bar = 2,5 m.
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Fig. 8 Fase de recrudescncia, epitlio seminfero com espermatognias (G), espermatcitos primrios (cabeas de seta), espermtides redondas (asteriscos pequenos), clulas de Sertoli (setas largas pequenas), interstcio (asterisco grande), membrana basal e tecido peritubular (seta larga preta). Bar = 2,5 m.
Fig. 9 Fase de recrudescncia testicular, com epitlio mostrando espermatognias (G), espermatcitos primrios (cabeas de seta), espermtides redondas (asteriscos pequenos) e clulas de Sertoli (setas largas). Bar = 2,5 m.
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Discusso
O ciclo reprodutivo anual de codorna domstica foi estudado por Baraldi-Artoni et al. (1997), que definiram quatro fases distintas, sucessivas e seqentes, denominadas de quiescncia (final da primavera), recrudescncia (outono), fase de atividade (final de inverno, comeo da primavera) e de regresso (final da primavera e vero). As quatro fases na codorna domstica foram similares s previamente descritas para alguns passeriformes (Riley, 1936;1937) e para uma espcie de pingim antrtico (Fuenzalida et al., 1989), sendo tambm similares as fases e suas respectivas duraes observadas no ciclo reprodutivo anual do pato domstico. As variaes circanuais da atividade espermatogentica tm sido tambm reportadas no pato andino (Breucker et al., 1989). A melhor evidncia do estgio da espermatognese naquele estudo foi o aumento e/ou diminuio do dimetro dos tbulos seminferos, correspondendo s diferentes fases da atividade testicular e/ou a involuo desta. Uma pequena diminuio no dimetro dos tbulos seminferos foi observada durante o vero (outubro a dezembro) e no inverno (julho a agosto). De acordo com Breucker et al. (1989) e baseado nas presentes observaes, o perodo de atividade reprodutiva bastante prolongado no pato domstico, enquanto que as fases de regresso e quiescncia testicular so reduzidas a um perodo mnimo, caracterizando um padro de atividade testicular anual cclica, como fora afirmado pelos ltimos autores para o pato andino. Assim, no pato domstico, as fases reprodutiva e de recrudescncia testicular apresentaram-se relativamente longas quando comparadas aos perodos de regresso e quiescncia gonadal. A fase de reproduo, conforme as observaes feitas, iniciou-se no
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inverno (julho) e se estendeu at agosto, tambm inverno, atingindo o seu pico mximo na primavera (outubro), sendo esta fase caracterizada pela atividade espermatogentica completa. A fase de regresso se iniciou em novembro, no final da estao da primavera, com a descamao do epitlio seminfero e a fase de quiescncia ocorreu nos meses de janeiro e fevereiro, estao de vero, quando foi caracterizada por apresentar somente espermatognias e clulas de Sertoli no epitlio seminfero. J a fase de recrudescncia se estendeu por todo o outono, nos meses de maro a junho, quando houve recuperao do epitlio seminfero, caracterizando-se pela espermatognese incompleta, porm com preparao para a fase subseqente de reproduo. Estes dados so aparentemente inditos e espcie-especficos. Ademais, estudos realizados com o cisne europeu (Breucker, 1982) e a codorna domstica (Baraldi-Artoni et al., 1997) demonstraram uma fase de maior atividade reprodutiva ocorrendo na primavera, apesar do cisne apresentar espermatozides apenas durante umas poucas semanas nesta estao. J os testculos da codorna exibiram espermtides em maturao e espermatozides, com pequenas variaes, durante todo o ano. Segundo Baraldi-Artoni et al. (1997) esta diferena na produo de espermatozides devido, provavelmente, ao fato de que as condies climticas serem diferentes nos hemisfrios Sul e Norte. A produo de espermatozides no pato domstico ocorre durante todo o inverno e tambm durante a primavera, quando atinge o seu pico mximo de produo (outubro), conforme os resultados obtidos. O papel do fotoperodo, na regulao do desenvolvimento gonadal tem sido documentado em um grande nmero de vertebrados (Farner, 1985). Entretanto, poucos estudos em aves revelaram que o comprimento do dia atuaria como um start para o
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desenvolvimento testicular (Farner e Follett, 1979; Farner e Gwinner, 1980; Follett, 1984; Wingfield, 1993). No caso do pato domstico, observou-se que a diminuio do comprimento do dia, na passagem das estaes de outono para inverno, talvez possa desencadear o desenvolvimento gonadal, iniciando o perodo reprodutivo desta espcie, similarmente ao observado no pardal e codorna domstica (Wingfield, 1993), onde a mudana do fotoperodo influenciava na atividade testicular. Mas, efetivamente, no perodo da primavera (outubro), quando o comprimento do dia comea a se alongar, que o pico da reproduo ocorre. Esta seria talvez, a maior contribuio deste estudo, consoante aspectos de cronobiologia e dinmica dos ritmos biolgicos na reproduo, com uma bvia interdependncia entre fatores parcrinos e endcrinos, no processo reprodutivo de aves. Algumas espcies de aves exibem um ciclo reprodutivo anual e variaes cclicas em hormnios reprodutivos, associados s mudanas estruturais dos testculos e das clulas espermatogenticas. Os andrgenos desempenham importante papel na reproduo aviria, quando os seus nveis plasmticos se modificam em paralelo com a atividade espermatognica dos testculos (Kim e Yang, 2001). Hau et al. (2000), estudando os nveis de testosterona plasmtica, o comportamento reprodutivo, o ciclo reprodutivo da espcie Hylophylax naevioides (Passeriformes), observaram que os nveis da testosterona aumentavam no incio da primavera e permaneciam elevados durante o perodo reprodutivo, situaes no observadas no pato domstico. Para os autores, o nvel de testosterona desta espcie territorial, alm de desencadear um comportamento agressivo, durante a corte e o acasalamento, importante para a expresso dos caracteres sexuais secundrios, produo de espermatozides e comportamento sexual tpico dos machos.
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A atividade gonadal de vrias espcies de aves selvagens, que habitam as regies temperadas, mostra uma variao sazonal em conseqncia da interao de fatores ambientais parcrinos e de fatores hormonais (Tsutsui et al., 1994). Nestas espcies, o LH e os esterides sexuais se elevam na primavera; permanecem relativamente altos durante a fase reprodutiva e declinam, para nveis basais, no final da reproduo (Ball e Wingfield, 1987). O pato domstico mostrou uma sazonalidade nos nveis de testosterona plasmtica, com picos elevados durante o pice da fase reprodutiva, e no incio da fase de quiescncia. Similarmente este modelo hormonal foi encontrado na espcie de pssaro subtropical Ploceus philippinus (Tsutsui et al., 1994) e tambm no canrio Serinus canarius (Nottebohm et al., 1987). O ciclo reprodutivo da espcie Ploceus philippinus demonstrou ser sazonal, estando dividido nas fases de reproduo, regresso, quiescncia e progresso. Altos nveis de testosterona plasmtica circulante na espcie foram observados, no somente na fase de reproduo, mas tambm na fase de repouso testicular (Tsutsui et al., 1994), de modo similar ao encontrado, neste trabalho, no pato domstico. De acordo com Tsutsui et al. (1994), este perfil talvez mostre um aumento no nmero de receptores de gonadotrofinas, pois fora observado neste estudo nveis mximos de gonadotrofinas nas fases de reproduo e de quiescncia durante o ciclo reprodutivo. No pato domstico, de forma indita, o pico de testosterona na fase de quiescncia (janeiro) poderia estar relacionado com o aumento no nmero de espermatognias, que caracteriza esta fase, e tambm um aumento no nmero de clulas de Sertoli. Aps esta fase, a concentrao de testosterona diminuiu at a fase de reproduo em agosto, posto que
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a testosterona estaria envolvida nos processos de espermatognese e proliferao celular. J a ocorrncia de um pico nos nveis de testosterona plasmtica na fase da reproduo, poderia estar relacionada ao comportamento de corte fmea e de agressividade na defesa territorial, caracterstico durante o perodo reprodutivo. Estas afirmaes concordam com as descries prvias elaboradas por Hau et al. (2000), Wikelski et al. (2000) e Hau (2001). Estudos recentes sobre o controle endcrino do comportamento reprodutivo sazonal em aves tropicais, revelaram que a testosterona regularia o comportamento agressivo do macho em aves territoriais (Hau et al., 2000; Wikelski et al., 2000; Hau, 2001). Segundo os autores, a testosterona produzida, muitas vezes, durante a fase no reprodutiva, em que as gnadas talvez segreguem testosterona, mesmo no estgio em que os testculos mostraramse regredidos, como notado no pato domstico. Alternativamente, precursores de testosterona poderiam surgir de fontes no gonadais (Wikelski et al., 1999; Soma et al., 2000) e seriam convertidos em testosterona nos stios alvos cerebrais (Schlinger e Arnold, 1992; Soma e Wingfield, 1999; Hau et al., 2000; Soma et al., 2000).
Agradecimentos Agradecemos a Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro deste projeto (Processo 00/05079-4) e a Sra. Damares Perecim Roviero pelo auxlio tcnico.
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Variabilidades morfomtricas testiculares e nveis de glicose, glicognio e lipdeo durante o ciclo reprodutivo anual do pato domstico (Anas platyrhynchos)
K. Simes1, A. M. Orsi2, E. C. Urbinati3, F. D. Gonalvez4, C. Cruz4
Campinas, So Paulo, Brazil

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Botucatu, So Paulo, Brazil

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Departament of Physiology and Animal Morphology, So Paulo State University, UNESP,
Jaboticabal, and Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil

4
Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil
Corresponding Author: Karina Simes, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biocincias, Departamento de Anatomia, Distrito de Rubio Jnior, S/N, Botucatu, So Paulo, Brasil, CEP 18618-000.
Artigo formatado segundo as normas da revista British Poultry Science, Inglaterra
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Resumo
Estudos quantitativos foram realizados para determinar o ciclo reprodutivo anual do pato domstico (Anas platyrhynchos) e correlacion-lo aos parmetros bioqumicos de glicose sangnea, glicognio e lipdeos hepticos e musculares, substratos metablicos bsicos ligados ao processo reprodutivo. Para o estabelecimento das fases do ciclo reprodutivo anual do pato domstico foram utilizados parmetros morfomtricos de pesos testiculares, volume testicular, dimetro de tbulos seminferos e altura do epitlio seminfero ao longo do ano. Foram avaliados os nveis de glicose sangnea, glicognio e lipdeos hepticos e musculares, nas diferentes fases do ciclo reprodutivo. O ciclo reprodutivo anual do pato domstico pode ser dividido em quatro fases sucessivas ao longo do ano, denominadas de reproduo, regresso, quiescncia e recrudescncia gonadal. A fase reprodutiva se iniciou na estao de inverno (julho), atingindo seu pico mximo em outubro, apresentando maiores pesos e volume testiculares, dimetro dos tbulos seminferos e altura epitelial. A fase de regresso ocorreu no final da primavera (novembro) e incio de vero (dezembro), com reduzidos valores de pesos e volumes testiculares. A fase de quiescncia gonadal representou o final do ciclo reprodutivo, ocorrendo no vero (meses de janeiro e fevereiro), quando os parmetros morfomtricos mostraram os menores valores no ciclo reprodutivo. A fase de recrudescncia se iniciou no outono (maro) e se estendeu at o comeo do inverno (junho), com valores reduzidos dos parmetros analisados. Em relao ao metabolismo energtico somente a glicose sangnea estava correlacionada ao ciclo reprodutivo anual da espcie, fornecendo energia para o processo reprodutivo. Palavras-chave: glicose, glicognio, lipdeo, ciclo reprodutivo, ave.
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Introduo
A reproduo nos animais est sob regulao endgena e geralmente dependente de fatores ambientais, desenvolvendo modelos reprodutivos que alternam perodos de atividade e quiescncia gonadal. Nas aves, os ciclos reprodutivos sazonais so constantes, e influenciados por fatores parcrinos, quando os rgos reprodutores crescem e regridem com a luz, temperatura, ndice pluviomtrico e disponibilidade de alimento (Kemp, 1973; Silverin, 1975), estando sujeitos tambm a constantes variaes em virtude da latitude e altitude geogrfica (Breucker et al., 1989). Os ciclos reprodutivos de vertebrados silvestres se sincronizam com as variaes ambientais, visando a sobrevivncia das espcies, apresentando uma caracterstica sazonalidade. Muitas aves tropicais tm conservado esta estacionalidade apesar de habitarem regies de condies ambientais relativamente constantes ao longo do ano (Fuenzalida et al., 1989). Em aves de reproduo estacional (sazonal), a disponibilidade de gametas maduros est restrita a uma determinada poca do ano, sendo varivel entre as espcies. As alteraes morfofuncionais das gnadas constituem um ciclo anual, de modo que, nos testculos, pde-se distinguir quatro fases denominadas de quiescncia, recrudescncia, atividade e regresso, observadas histologicamente e por alteraes de peso e volume testicular (Fuenzalida et al., 1989). Estudos tm sido conduzidos sobre a influncia de diferentes fotoperodos no controle de funes reprodutivas de aves, fmeas e machos, de acordo com os seus interesses econmicos. Em uma avicultura conduzida com controle de luminosidade, a durao pr-estabelecida da luz ou a sua ausncia de fundamental importncia para cada
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fase do ciclo reprodutivo do animal (Baraldi-Artoni et al., 1997). Para se determinar o ciclo testicular anual de uma ave, alguns parmetros morfolgicos e morfomtricos tm sido utilizados tais como: dimetro dos tbulos seminferos, altura do epitlio seminfero, nmero de clulas intersticiais, nmero e cintica de clulas germinativas, espessura da tnica albugnea e dimetro nuclear das clulas germinativas (Fuenzalida et al., 1989; Baraldi-Artoni et al., 1997). O organismo animal necessita de grande estoque energtico para o suporte de vrios processos fisiolgicos, inclusive o reprodutivo. Parte dessa energia fornecida pelos carboidratos e, parte pelos lipdeos e protenas (Lehninger, 1995). Os carboidratos so uma fonte de energia importante para o metabolismo animal. Estes elementos participam do metabolismo intermedirio em vias como gliclise, glicognese, glicogenlise e gliconeognese, nas quais h participao central da glicose. A glicose sangnea e o glicognio heptico so substratos metablicos bsicos e podem ser importantes parmetros no estudo do metabolismo animal. O glicognio heptico um carboidrato importante como fonte de energia e fornecedor de glicose para a manuteno da homeostase glicmica (Lehninger, 1995). Os carboidratos, assim como protenas e lipdeos, tm influncia no processo reprodutivo, atuando em perodos de emergncia para a produo de energia no msculo (Mommsen et al., 1980), colaborando como fonte de energia para a reproduo (Zaiden, 2000). A atividade dos espermatozides depende de carboidratos como fonte de energia utilizada no metabolismo das funes intrnsecas dos espermatozides, mas tambm na elaborao de tcnicas de manuteno de espermatozides in vitro, visando a inseminao artificial nas aves (Freeman, 1984).
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De acordo com o exposto, o objetivo deste trabalho foi determinar o ciclo reprodutivo anual do pato domstico (Anas platyrhynchos) atravs de anlises morfomtricas e correlacion-lo a parmetros bioqumicos de glicose, glicognio e lipdeo total heptico e muscular utilizados como fonte energtica para o processo reprodutivo em aves.
Material e Mtodos Para o estabelecimento do ciclo reprodutivo anual foram utilizados 36 patos domsticos adultos da espcie Anas platyhrynchos sp, com peso corpreo de 2,5 a 4,0 Kg, provenientes de criao comercial extensiva, sendo sacrificados 3 animais por ms ao longo do ano. Todas as aves foram pesadas e sacrificadas mediante saturao anestsica com uma mistura de cloridrato de quetamina (20mg/Kg) e cloridrato de xilazina (1,5 mg/Kg) aplicada intramuscularmente. A seguir, abordaram-se os rgos reprodutores por meio de laparotomia abdominal, rebatimento do plastro esternal e eviscerao do trato gastrointestinal.
Anlises morfomtricas
Os testculos foram retirados, pesados em balana semi-analtica (Acculab, USA), e o comprimento dos eixos maior (longitudinal) e menor (transversal) foi medido utilizandose paqumetro de preciso digital (Mitutoyo, Japo). Para o clculo morfomtrico do
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volume total de cada testculo, aplicou-se a frmula de elipside: V = 4/3. . a. b2 , onde a o semi-eixo maior e b o semi-eixo menor (Miraglia e Hayashi, 1993). Os testculos foram ento seccionados longitudinalmente, imersos em soluo de Bouin por 24 horas e includos em Histosec (Leica, Germany). Seces histolgicas de 5 m de espessura foram coradas com Hematolina-Eosina. Para a anlise morfomtrica de dimetro dos tbulos seminferos e altura do epitlio seminfero nas diferentes fases do ciclo reprodutivo utilizaram-se 3 animais por ms e 6 seces histolgicas aleatrias dos testculos por animal, onde foi mensurado o dimetro de 30 tbulos seminferos e obtidas 150 medidas da altura do epitlio seminfero, por animal, atravs do Programa Computacional de Anlise de Imagens Image Pro-Plus (Media Cybernetics, USA).
Anlises bioqumicas de glicose sangnea, glicognio e lipdeo hepticos e musculares
Durante as coletas dos testculos, tambm se coletou sangue e amostras de tecidos heptico e muscular (m. peitoral superficial e m. gastrocnmio) de 3 animais mensais para a avaliao da glicose sangnea, glicognio e lipdeo heptico e muscular. Na dosagem de glicose sangnea foi obtido sangue do ventrculo cardaco esquerdo dos animais, sendo esta determinada pelo mtodo colorimtrico (King e Garner, 1947), com leitura realizada em espectrofotmetro a 540 nm. Para a anlise de glicognio heptico e muscular, fragmentos de fgado e de msculo branco (msculo peitoral superficial) e de msculo vermelho (msculo
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gastrocnmio) foram coletados e congelados sobre gelo seco e estocados em placas a -70C at a realizao das anlises. O glicognio foi dosado pelo mtodo Glicognio Trinder, Placa de Elisa (Moon et al., 1989) com leitura em espectrofotmetro a 490- 505 nm. A determinao do lipdeo total tecidual foi realizada com fragmentos de fgado, msculo branco (msculo peitoral superficial) e de msculo vermelho (msculo gastrocnmio), segundo Bligh e Dyer (1959). Para isso utilizamos 500 mg de tecido homogeneizado em 5,0 ml da mistura de extrao com solvente orgnico
(clorofrmio/metanol 2:1). Aps a filtragem do homogenado foram obtidas camadas distintas, uma delas contendo frao lipdica (clorofrmio) e outra frao no lipdica (metanol). Aps separao da camada que continha lipdeos, esta foi colocada em placas de Petri previamente pesadas e levadas a estufa a 100C, por 1 hora, para evaporao. A diferena entre os pesos inicial e final das placas permitiu os clculos para obteno da porcentagem de lipdeos de cada amostra. Os resultados obtidos dos parmetros morfomtricos e bioqumicos foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) e testados pelo Teste de Tukey 5%, utilizando-se o software SAS (Statistical Analyses System, USA).
Resultados
Ciclo reprodutivo anual O ciclo reprodutivo anual do pato domstico pde ser dividido em 4 fases sucessivas ao longo do ano, denominadas de reproduo, regresso, quiescncia e recrudescncia, de acordo com os parmetros morfomtricos utilizados.
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A fase reprodutiva se iniciou na estao de inverno (julho), atingindo seu pico mximo no incio de outubro, estao de primavera. Durante toda esta fase, os pesos testiculares (Grfico 1) e o volume dos testculos direito e esquerdo (Grfico 2) aumentaram significativamente, com valores mximos no pico reprodutivo (outubro). Nesta fase reprodutiva os tbulos seminferos eram amplos, com maiores dimetros no pico da reproduo em outubro (Grfico 3). A variao da altura do epitlio seminfero, durante esta fase, acompanhou, em geral, a modificao anual do dimetro tubular (Grfico 4). Os maiores valores ocorreram no pico reprodutivo (outubro) e no incio da reproduo (julho). Nos demais meses do perodo reprodutivo (agosto, setembro) foram observados valores intermedirios de altura do epitlio seminfero (Grfico 4), no pato domstico. A fase de regresso ocorreu no final da primavera e incio de vero, nos meses de novembro e dezembro. Nesta fase, os pesos dos testculos (Grfico 1) e o volume testicular (Grfico 2) eram reduzidos. No trmino da fase regressiva observou-se um aumento significativo no dimetro (Grfico 3) e na altura do epitlio seminfero (Grfico 4). A fase de quiescncia gonadal representou o final do ciclo testicular. No pato domstico esta ocorreu no vero, nos meses de janeiro e fevereiro. Tanto os pesos testiculares (Grfico 1), como o volume dos testculos (Grfico 2) apresentaram os menores valores mdios e tambm os menores dimetros (Grfico 3) e menor altura epitelial (Grfico 4) dos tbulos seminferos de todo o ciclo reprodutivo. A fase de recrudescncia se iniciou no outono (maro) e se estendeu at o comeo do inverno (junho), sendo o perodo mais longo do ciclo reprodutivo. Nesta fase os pesos testiculares (Grfico 1) e o volume dos testculos (Grfico 2) eram reduzidos e o dimetro dos tbulos seminferos (Grfico 3) e a altura do epitlio seminfero (Grfico 4)
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apresentaram valores reduzidos em relao s demais fases do ciclo. No incio da recrudescncia (maro), a altura epitelial dos tbulos seminferos mostrou valores intermedirios em comparao aos outros meses desta fase (Grfico 4).
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Grfico 1. Pesos testiculares direito e esquerdo (mdias desvio padro) durante o ciclo reprodutivo anual do pato domstico.
Pesos T e s tic u la re s (g ) 20
15
10
0
ja ne iro fe ve re iro m a r o a b ril m a io junho julho a g o sto s e te m b ro o utub ro no ve m b ro d e ze m b ro
M eses do ano
P es o tes tc u lo d ireito (g ) P es o tes tc u lo es q u erd o (g )
Grfico 2. Volume testicular (mdias desvio padro) durante o ciclo reprodutivo anual do pato domstico.
1400
1200
Volume Testicular (mm3)
1000
800
600
400
200
0
janeiro fevereiro maro abril maio junho julho agosto setembro outubro novembro dezembro
M eses do ano
V olum e testicular esquerdo (m m 3) V olum e testicular direito (m m 3)
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Grfico 3. Mdias ( desvio padro) do dimetro (m) dos tbulos seminferos durante o ciclo reprodutivo anual.
400
a
350
b
300
c
250 Dimetro (um)
d m d ia e
200
150
gh
100
fg
gh
fg h
i
50
0
ja n e iro fe v e re iro m ar o a b r il m a io ju n h o ju lh o a g o s to s e te m b r o o u tu b ro n o v e m b ro d ez em bro
M eses d o an o
*Letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey (5%) Grfico 4. Mdias ( desvio padro) da altura epitelial (m) dos tbulos seminferos durante o ciclo reprodutivo anual.
120 a a b bc 80 c
100 Altura do epitlio (um)
60 d 40 e 20 e e e e e
m d ia
0
j anei r o f ev er ei r o mar o abr i l mai o j unho j ul ho agos t o s et embr o out ubr o nov embr o dez embr o
M e s e s d o an o
*Letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey (5%).
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Metabolismo energtico
A determinao das concentraes de glicose circulante no sangue do pato domstico demonstrou variaes ao longo do ano (Grfico 5). A glicemia apresentou-se mais elevada durante toda a fase de recrudescncia (maro a junho), fase de regresso (novembro, dezembro) e fase de quiescncia testicular (janeiro, fevereiro), onde no diferiram entre si. Os menores valores encontrados de glicemia foram durante a fase reprodutiva (julho a outubro), diferindo das demais fases do ciclo reprodutivo anual. As concentraes de glicognio heptico e muscular variaram ao longo do ano (Grfico 6). O glicognio heptico mostrou maiores valores durante a fase de recrudescncia (meses de maro a junho), fase reprodutiva (julho, outubro) e fase de quiescncia (fevereiro), no diferindo entre si. Entretanto, o menor valor encontrado de glicognio heptico foi no ms de agosto, na fase de reproduo. Os nveis de glicognio do msculo vermelho (Grfico 6) apresentaram seu maior pico no ms de outubro, na fase reprodutiva, onde este no diferiu significativamente dos valores encontrados nos demais meses da fase de reproduo (julho, agosto, setembro) e tambm nas fases de quiescncia (fevereiro) e recrudescncia (maio, junho). Nos outros meses do ano foram encontrados os menores valores de glicognio para o msculo vermelho. As concentraes de glicognio de msculo branco variaram no decorrer do ano (Grfico 6), com o maior pico observado na fase de recrudescncia (abril), no diferindo significativamente das fases de reproduo (julho, outubro), regresso (novembro), quiescncia (janeiro) e recrudescncia (abril, maio, junho).
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As concentraes de lipdeo total heptico e lipdeo total muscular se diferenciaram no decorrer do ano (Grfico 7). O lipdeo total heptico apresentou maiores valores nas fases de reproduo (agosto), regresso (novembro, dezembro) e quiescncia (janeiro), no diferindo entre si. Nos demais meses do ano foram encontrados valores intermedirios, sendo o menor valor verificado no incio da fase de recrudescncia (maro). A concentrao de lipdeo total de msculo vermelho mostrou maiores picos durante toda a fase reprodutiva (julho a outubro), diferindo das demais fases do ciclo. O menor valor encontrado foi na fase de recrudescncia (abril), no se diferenciando significativamente das outras fases do ciclo reprodutivo. Para o msculo branco, os maiores valores de lipdeo total foram vistos durante as fases de reproduo (julho a outubro), regresso (novembro, dezembro), quiescncia (janeiro) e de recrudescncia (abril, maio, junho), diferindo dos demais meses do ano, com menor valor em fevereiro, fase de repouso testicular.
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Grfico 5 - Valores mdios ( desvio padro) de glicose sangnea (mg/100mL) durante o ciclo reprodutivo anual.
300,0 a a a a a Glicose (mg/100mL) 200,0 ab ab ab
250,0
150,0
bc c c c
Mdia
100,0
50,0
0,0
Meses do ano
*letras diferentes indicam diferena significativa entre as mdias pelo Teste de Tukey 5%. Grfico 6 Mdias ( desvio padro) de glicognio heptico e de glicognio muscular (msculos vermelho e branco) durante o ciclo reprodutivo anual.
* letras diferentes indicam diferena significativa entre as mdias pelo Teste de Tukey
1 0 ,0 0
a a a ab ab Glicognio (g/100g) ab abc
hep t ic o
ab
8 ,0 0
6 ,0 0
bc d
ms c ulo v er melho ms c ulo b r anc o
4 ,0 0
cd
2 ,0 0
cd b ab ab bc
f ev er eir o
b bc
m ar o
ab ab
ab ab
d ab ab ab
a c ab bc abc
out ubr o
b abc
b bc
0 ,0 0
janeir o abr il m aio junho julho a g o st o se t e m b r o nov em br o dez em br o
M e s e s d o an o
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Grfico 7 Anlise da porcentagem (mdias desvio padro) de lipdeo heptico e lipdeo muscular (msculos vermelho e branco) relacionados ao ciclo reprodutivo anual.
3,00
2,50
ab ab cde de e bcd bcde bcde abc a bcde a a cde ab

heptico msculo vermelho msculo branco
2,00 Lipdeo (%)
1,50 abc bc c 0,50 abc c bc abc bc ab
a bc abc bc abc
abc bc abc bcabc
1,00
bc
0,00
Meses do ano
* letras diferentes indicam diferena significativa entre as mdias pelo Teste de Tukey 5%.
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Discusso
Parmetros morfomtricos como o dimetro dos tbulos seminferos, variao da altura do epitlio seminfero, quantidade de figuras meiticas neste epitlio, quantificao de espermtides maduras e de espermatozides presentes na luz dos tbulos seminferos, alm de caracterizao dos pesos testiculares foram utilizados para estabelecer o ciclo testicular anual da codorna domstica (Baraldi-Artoni et al., 1997). De acordo com estes parmetros, o ciclo testicular anual da codorna apresentou 4 fases distintas, sucessivas e seqentes, denominadas fases de: repouso ou quiescncia (final da primavera), recrudescncia (outono), atividade (final de inverno, comeo da primavera) e regresso (final da primavera e vero). No presente estudo, os parmetros quantitativos investigados no pato domstico nos permitiram definir um ciclo reprodutivo anual com quatro fases distintas e sucessivas, similares s fases e suas respectivas duraes encontradas na codorna domstica (Baraldi-Artoni et al., 1997), em alguns passeriformes (Riley, 1936/37) e no pingim antrtico (Fuenzalida et al., 1989). O ciclo reprodutivo anual do cisne europeu (Cygnus olor) foi observado por Breucker (1982) que considerou o aumento e a diminuio do dimetro dos tbulos seminferos como parmetro para a avaliao da atividade espermatognica. O dimetro dos tbulos seminferos do cisne europeu apresentou um aumento progressivo no inverno e maior valor na primavera, perodo da reproduo, com um subseqente decrscimo no vero e outono, perodos de regresso e quiescncia gonadal. No pato domstico, os maiores dimetros dos tbulos seminferos foram observados durante toda a fase reprodutiva, nas estaes de inverno e primavera, com pico em outubro, e tambm na fase
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regressiva, estao de vero, similar ao encontrado para a codorna domstica (BaraldiArtoni et al., 1997). Em relao altura epitelial observou-se variao semelhante ao dimetro tubular, com exceo do comeo da fase de recrudescncia (maro) que apresentou valores intermedirios, indicando o incio da recuperao do epitlio seminfero atravs dos processos de diviso meitica dos espermatcitos e diferenciao das espermtides. Logo, no pato domstico, as fases reprodutiva e de recrudescncia testiculares apresentaram-se relativamente longas quando comparadas s de regresso e quiescncia gonadal. A fase de reproduo, conforme as observaes feitas, iniciou-se no inverno (julho), se estendeu at setembro (primavera) e atingiu o seu pico mximo em outubro, ainda na estao de primavera. A fase de regresso se iniciou em novembro, no final da estao da primavera, e a fase de quiescncia se deu nos meses de janeiro e fevereiro, na estao de vero. J a fase de recrudescncia se estendeu por todo o outono, nos meses de maro a junho, quando os parmetros morfomtricos indicaram a recuperao da cintica da espermatognese para a fase subseqente de reproduo. O ciclo anual do ganso Plectropterus gambensis fora descrito por Halse (1985), no continente africano, tendo nove estgios espermatognicos reconhecidos; baseados em parmetros de variao testicular. O peso testicular mostrou mudanas pronunciadas durante o ciclo anual. Assim sendo, o seu aumento foi acompanhado por alargamento dos tbulos seminferos, devido elevao na atividade espermatognica. O interstcio intertubular tambm se modificou durante o ano, mas em direo oposta ao peso testicular e ao dimetro dos tbulos. No pato domstico, os maiores valores de peso e volume
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testiculares foram encontrados durante toda a fase reprodutiva, com pico em outubro, similar ao encontrado para a codorna domstica (Baraldi-Artoni et al., 1999). Bhat e Marti (2000) analisando o ciclo reprodutivo sazonal do pardal de garganta amarela (Petronia xanthocollis, Burton), uma ave selvagem subtropical, descreveram quatro fases no ciclo reprodutivo anual desta espcie. Notaram as fases de recrudescncia indo de janeiro a maro, de reproduo em abril, de regresso em maio a junho e de quiescncia estendendo-se de julho a dezembro. Observaram, portanto, uma fase reprodutiva limitada apenas a um curto perodo do ano. A produo de espermatozides no pato domstico ocorre durante todo o inverno (julho, agosto) e tambm durante a primavera (setembro, outubro) quando atinge seu pico mximo de produo, conforme os resultados aqui obtidos. Experimentos feitos com a codorna japonesa (Coturnix japonica), estorninho europeu (S. vulgaris), P. guttata e P. undulatus (Psitacidae) demonstraram que o desenvolvimento gonadal pode ocorrer em dias curtos (Sharp e Sterling, 1985). Nas espcies de passeriformes Q. quelea, E. amandava e M. malacca, os dias curtos promoveram a regresso testicular (Thapliyal e Saxena, 1964), sugerindo uma regulao endgena diferente e espcie-especfica do ciclo reprodutivo (Wingfield, 1983). Os carboidratos, como a glicose e o glicognio, oferecem certas vantagens como fontes imediatas de energia metablica (Lenninger, 1995). A glicose o principal combustvel da maioria dos organismos e ocupa uma posio central no metabolismo energtico. Atravs do armazenamento da glicose como um polmero de alto peso molecular, a clula pode acumular grande quantidade de unidades de hexose. Quando as demandas energticas da clula aumentam subitamente, a glicose pode ser liberada
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rapidamente destes polmeros de armazenamento intracelulares. Em certos tecidos e tipos celulares, como por exemplo os espermatozides, a glicose por meio da gliclise, a principal, ou mesmo a nica, fonte de energia metablica (Lenninger, 1995). No msculo, a finalidade da gliclise a produo de ATP. J o fgado tem um papel importante no metabolismo global do organismo, e o metabolismo da glicose diferenciado. Este serve para manter um nvel constante de glicose no sangue, produzindo e exportando glicose para os tecidos quando necessrio, e importando e armazenando a glicose quando est em excesso. Uma fonte de glicose o glicognio heptico e a outra a gliconeognese (Lenninger, 1995). No pato domstico a concentrao de glicose variou ao longo do ano, com maiores valores nas fases de quiescncia, regresso e durante toda a fase de recrudescncia, perodo que antecede a fase reprodutiva. Observou-se queda significativa dos nveis de glicose na fase de reproduo, devido, talvez, elevada demanda energtica deste processo, podendo ento, estar correlacionada ao perfil reprodutivo da espcie, similarmente ao encontrado na codorna por Peebles et al. (1996). Variaes sazonais no contedo de protenas, lipdeos e carboidratos dos msculos corpreos e do fgado correlacionadas ao crescimento; maturao das gnadas e espermatognese tm sido analisadas tambm em animais pecilotrmicos, principalmente em peixes. conhecido que nestas espcies os estoques destes nutrientes no fgado e nos msculos corpreos so transferidos para as gnadas, e utilizados como fontes de energia para o metabolismo, crescimento gonadal e maturao (Eliassen e Vahl, 1982 a, b). Tanto as protenas como o material lipdico so depositados no fgado e msculos corpreos, durante o perodo de quiescncia gonadal e na fase de maturao. A fase de estoque de
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carboidratos no fgado e msculos estriados ocorre somente na fase de maturao gonadal, sendo os acares utilizados como energia para a atividade espermatogentica (Ochiai e Tanaka, 1980). O glicognio o principal polissacardeo de armazenamento das clulas animais, sendo abundante no fgado, e estando tambm presente nos msculos esquelticos. O glicognio heptico, um carboidrato importante como fonte de energia e fornecedor de glicose para a manuteno da homeostase glicmica (Lenninger, 1995), mostrou no pato domstico, variaes nas concentraes, que no acompanharam todas as modificaes do desenvolvimento gonadal. Apesar de apresentar valores maiores nas fases de quiescncia e de recrudescncia, o que indicaria um estoque para ser utilizado na reproduo, estes no caram significativamente, mantendo-se constantes durante toda a fase reprodutiva, com exceo no ms de agosto, em que apresentou menor valor, talvez sendo requisitado como fonte energtica imediata nesta fase. O mesmo perfil aconteceu com os nveis de glicognio do msculo vermelho e do msculo branco no pato domstico. Logo, parece no haver demanda expressiva de energia por parte das gnadas, ficando o glicognio acumulado nos respectivos rgos. As funes biolgicas dos diferentes lipdeos so diversas. Em muitos organismos, leos e gorduras so as formas principais de armazenar energia, enquanto que os fosfolipdeos e os esterides representam aproximadamente a metade da massa formativa das membranas biolgicas (Lenninger, 1995). Peebles et al. (1996) estudando o metabolismo energtico da codorna Colinus virginianus concluram que o peso gonadal, a concentrao de lipdeos sricos e a concentrao de glicose sangnea esto interelacionados durante as diferentes fases
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reprodutivas. As relaes entre peso testicular e nveis de colesterol plasmtico tm sido tambm investigadas em diferentes linhagens de codorna domstica (Marks e Washburn, 1991). No pato domstico, os nveis de glicose sangnea mostraram correlao com o ciclo reprodutivo, funcionando como fonte energtica para o processo reprodutivo. Estudos conduzidos in vitro tm indicado que a liplise dos adipcitos, em aves, muito regulada (Leclerq, 1984), e as mudanas nas concentraes de glicose sangnea esto associadas com o metabolismo de lipdeos (Hazelwood, 1986; Furuse et al., 1991). Alm disso, outros estudos, em espcies de mamferos, tm mostrado que o processo reprodutivo est associado com concentraes circulantes de vrios lipdeos sricos, incluindo os triglicerdeos e o colesterol (Yanagibori et al, 1993). Estudos tm sido realizados para investigar quais as substncias importantes como fontes de energia para o processo de ejaculao em aves. Uma das principais alternativas de substrato para o metabolismo energtico seria a utilizao de lipdeos ou compostos lipdicos, pois espermatozides e plasma seminal no fludo do ducto deferente contm lipdeos, compostos lipdicos ou outros compostos associados ao metabolismo lipdico (Lake, 1971; Howarth, 1978, 1981; Freeman, 1984). Recentemente, trabalhos tm sido realizados para se determinar o papel de compostos lipdicos, como o colesterol, na capacitao dos espermatozides (Cerolini et al., 1997; Cross, 1998; Wolfe et al., 1998). O lipdeo total heptico variou ao longo do ano no pato domstico, mas no est diretamente correlacionado ao ciclo reprodutivo, pois apresentou menores valores na fase de recrudescncia que antecedia a reproduo. O estoque de lipdeo total no msculo vermelho foi elevado durante os meses da fase reprodutiva, sugerindo que este estoque tenha outra finalidade que no a reproduo, pois segundo Srivastav et al. (1986), a fase de
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estoque de carboidratos, protenas e lipdeos no fgado e nos msculos somticos ocorre somente na fase que antecede reproduo, sendo, portanto, os acares utilizados como fonte energtica primria para a atividade espermatogentica. A concentrao de lipdeo total de msculo branco apresentou-se elevada durante a fase reprodutiva, no mostrando diferenas significativas entre as outras fases do ciclo reprodutivo, similarmente ao observado na espcie Camaroptera brevicaudata (Fogden e Fogden, 1979). Nesta no houve mudanas sazonais na concentrao de lipdeos musculares em relao ao ciclo reprodutivo anual desta espcie.
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Caractersticas
ultra-estruturais
dos
espermatozides
do
pato
domstico
(Anas platyrhynchos)
Ultrastructural features of the spermatozoon of the domestic duck (Anas platyrhynchos)
K. Simes1, A. M. Orsi2, C. Cruz3, K. A. S. Viegas4

1
Campinas, So Paulo, Brazil

2
Botucatu, So Paulo, Brazil

3
Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil Departament of Surgery, So Paulo University, USP, So Paulo, Brazil.
Running title: Ultrastructure of the spermatozoa of duck
Corresponding Author: Karina Simes, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biocincias, Departamento de Anatomia, Distrito de Rubio Jnior, S/N, Botucatu, So Paulo, Brasil, CEP 18618-000.
Artigo formatado segundo as normas da Revista European Journal of Morphology, Holanda.
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Resumo
A ultra-estrutura dos espermatozides do pato domstico (Anas platyrhynchos) foi analisada pelas microscopias eletrnicas de transmisso e varredura e comparada aos resultados obtidos em estudos preliminares com outras aves no-passeriformes. As anlises ultra-estruturais dos espermatozides do pato domstico revelaram que estas clulas longas e cilndricas possuam uma cabea curta, pea intermediria reduzida e pea principal longa, similar estrutura geral dos espermatozides de outras aves no-passeriformes. Entretanto, o espermatozide do pato apresentou morfologia semelhante a dos espermatozides de aves no-passeriformes, mas com caractersticas diferenciadas que so espcie-especficas. Entre estas caractersticas foram notadas um reduzido nmero e diferentes formas das mitocndrias na pea intermediria, presena de um perforatorium disposto anteriormente ao ncleo e ocorrncia de um centrolo distal longo que se extendia por todo o comprimento da pea intermediria. Palavras-chave: espermatozide, ultra-estrutura, ave, pato domstico.
Introduo
Estudos ultra-estruturais da espermiognese e de espermatozides tm sido realizados em insetos e mamferos. Poucas informaes sobre o desenvolvimento de espermatozides foram vistas em outros grupos animais (Phillips & Asa, 1989; Ferreira & Dolder, 2003), principalmente em aves, representando estas uma pequena porcentagem de quase 9.000 espcies de aves existentes (Asa & Phillips, 1987). Entre as poucas espcies de
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aves estudadas, as investigaes eram centralizadas na espermiognese (Phillips & Asa, 1989) com notvel exceo aos estudos realizados no galo domstico (McIntosh & Porter, 1967; Nicander & Hellstrom, 1967; Tingari, 1973; Nagano, 1962) por razes de importncia econmica. Aspectos do desenvolvimento da cabea do espermatozide do pombo como alteraes na orientao da manchette de microtbulos durante a espermiognese foram reportados por Fawcett et al. (1971). Estudos foram realizados sobre a ultra-estrutura dos espermatozides de algumas espcies de aves como peru, galo, galinha d Angola (Thurston & Hess, 1987); ema (Phillips & Asa, 1989); avestruz (Bacetti et al., 1991; Soley, 1993, 1994, 1997); galo domstico, pombo, estorninho europeu (Vernon & Wooley, 1999); e codorna japonesa (Korn et al., 2000), principalmente em relao ao desenvolvimento da cabea, pea intermediria e pea principal dos espermatozides. Os espermatozides de aves domsticas tm sido estudados desde o sculo passado, entretanto, a literatura sobre espermatozides de aves no extensa (Vernon e Woolley, 1999). Atualmente, h grande interesse em saber o significado evolucionrio da competio dos espermatozides em aves; para tanto, se torna necessrio o conhecimento da morfologia dos espermatozides, principalmente a estrutura do flagelo, com o intuito de se estabelecer um padro de motilidade para cada espcie (Vernon e Woolley, 1999). Os espermatozides de ordens de aves primitivas como a Struthioniformes e Tinamiformes foram ignorados at alguns anos atrs quando Phillips et al. (1987) utilizando a microscopia eletrnica de transmisso estudaram o Crested Tinamou (Eudromia elegans) e a American Rhea (Rhea americana). Caractersticas morfolgicas peculiares foram encontradas nos espermatozides destas duas espcies, sendo semelhantes
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aos dos mamferos e de alguns rpteis, enquanto que outras espcies de aves, j estudadas, no apresentaram estes aspectos ultra-estruturais. Estas caractersticas encontradas sustentavam a hiptese de alta afinidade entre os Struthioniformes e Tinamiformes, fornecendo importantes contribuies para a resoluo de problemas filogenticos e de evoluo (Baccetti et al., 1991). O objetivo do trabalho foi analisar as caractersticas ultra-estruturais dos espermatozides do pato domstico (Anas platyrhynchos), as quais poderiam gerar informaes para anlises filogenticas e contribuir para a perpetuao da espcie.
Material e Mtodos
Nos estudos ultra-estruturais foram utilizados 8 patos domsticos adultos (Anas platyrhynchos), com peso corpreo entre 2,5 a 4,0 Kg, provenientes de criao extensiva. Todas as aves foram pesadas e sacrificadas mediante saturao anestsica com uma mistura de cloridrato de quetamina (20mg/Kg) e cloridrato de xilazina (1,5 mg/Kg) aplicada intramuscularmente.
Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) Para os estudos ultra-estruturais de transmisso foram utilizados 4 patos domsticos adultos na fase reprodutiva. O smen foi coletado atravs de massagem cloacal, em ependorfs, imerso em soluo fisiolgica e centrifugado para obteno de pellets. Os pellets foram fixados em soluo de Karnovsky (1965) em tampo fosfato (0,1 M, pH 7.3) durante 24 horas e ps-fixados em tetrxido de smio a 1%, no mesmo tampo, por 2 horas. Aps a
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dupla fixao, os pellets foram desidratados em solues de acetona, e infiltrados com mistura de Araldite e acetona pura (1:1) durante 24 horas. A emblocagem foi feita em Araldite (Polysciences, USA), seces de 60 a 80 nm (cortes finos) foram contrastadas com acetato de uranila (Watson, 1958) e citrato de chumbo (Reynolds, 1963) e observadas pela MET (Phillips EM 301).
Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) Para a anlise dos espermatozides, o smen de 4 patos domsticos foi coletado pelo mesmo procedimento anterior, imerso em soluo fisiolgica e centrifugado para obteno de pellets. Os pellets foram fixados em glutaraldedo 2,5% em tampo fosfato (0,1M, pH 7.3) por trs horas e ps-fixados em tetrxido de smio 1% em tampo fosfato (0,1M, pH 7.3), por duas horas. Ento os pellets foram desidratados em srie crescente de lcool (70 a 100%) e secados em Ponto Crtico Balzers Union, com fixao em lmina com poliL-lisina (Polysciences, USA), sendo observados pela MEV (Phillips SEM-515).
Resultados
Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) Ultra-estruturalmente, os espermatozides maduros apresentaram cabea curta e afilada, curta pea intermediria, longa pea principal (Fig. 1) e curta pea terminal, as duas ltimas formando o flagelo. A cabea mostrou-se composta por reduzido acrossoma, anterior ao ncleo (Figs 3, 9, 10). A cromatina estava compactada nos espermatozides maduros, mas no totalmente condensada nos imaturos, conservando nestes um aspecto
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granular (Fig. 2). Nas espermtides e espermatozides jovens foi observado um reduzido perforatorium em forma de haste, localizado numa depresso da membrana nuclear (Fig. 3). A pea intermediria localizava-se posteriormente ao ncleo. Nesta havia material eltron-denso associado ao centrolo proximal e membrana nuclear (Fig. 2). Entre a base do ncleo e o centrolo observou-se fossa de implantao (Fig. 2). O centrolo proximal era curto e o distal longo, sendo este observado em todas as seces transversais da pea intermediria, se estendendo por quase toda sua extenso e mostrando-se embebido em material eltron-denso (Fig. 4). O centrolo distal apresentou-se muito mais denso em seco transversal e mostrou-se circundado por 4 mitocndrias (Fig. 4). Este centrolo, em seco longitudinal, apareceu envolto ao longo de seu comprimento por 11 a 12 mitocndrias elpticas (Fig. 1), com matriz densa e numerosas cristas longitudinais (Fig. 5). Posteriormente s mitocndrias era visvel o nulo denso, em forma de um anel circular, marcando a regio final da pea intermediria (Figs. 1, 5). Posteriormente regio do nulo, a parte principal do axonema se formou, estando este rodeado por uma bainha de fibras densas externas (Fig. 6), bem definida em seco transversal (Fig. 7). O axonema organizou-se em seu comprimento de acordo com o modelo bsico 9+2, ou seja, um par central de microtbulos circundado por nove pares perifricos de microtbulos, circundados pela bainha de fibras densas externas (Fig. 7). Este conjunto estava rodeado ainda por uma fina camada citoplasmtica que continha material granular (Fig. 7). A poro terminal do flagelo do espermatozide era curta, estreita, constituda pelo axonema e recoberto por membrana plasmtica (Fig. 8).
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Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) Os espermatozides do pato domstico eram longos, filiformes, cilndricos e possuam acrossoma facilmente distinguvel, ncleo na regio da cabea, pea intermediria e pea principal contendo um flagelo longo (Fig. 9). O acrossoma era constitudo por curto e afilado capuz ceflico, com aparncia homognea (Fig. 9), que se localiza anteriormente ao ncleo. O segmento mais longo da cabea do espermatozide estava composto pelo ncleo e a superfcie deste era ondulada e rugosa; contudo unidades globulares aderidas a sua superfcie eram freqentemente visualisadas (Figs. 9, 10). A curta pea intermediria mostrou-se posterior ao ncleo e a superfcie da pea intermediria era lisa, com poucas unidades globulares aderidas a ela e as mitocndrias no puderam ser observadas atravs da membrana plasmtica (Figs. 9, 10). A margem entre a pea intermediria e a pea principal era freqentemente identificada por um anel que correspondia ao nulo observado na MET (Figs. 1, 9, 10). A pea principal formava um segmento longo, constituindo o flagelo do espermatozide, com superfcie lisa e menor dimetro comparado pea intermediria (Fig. 9).
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Fig. 1 Eletromicrografia de transmisso, mostrando espermatozide maduro com cabea curta (H), curta pea intermediria (M) e longa pea principal (T), formando o flagelo; nulo (seta). Bar = 0,5 m.
Fig. 2 Cabea do espermatozide com acrossoma (seta preta), ncleo (N), incio da pea intermediria com centrolo proximal ( C), material eltron-denso (estrela) e mitocndrias (M) ao redor dos centrolos. Entre a base do ncleo e o centrolo proximal observa-se a fossa de implantao (seta branca). Bar = 0,5 m.
Fig. 3 Espermtide com ncleo (N), cromatina granular (estrela), acrossoma (seta preta) e perforatorium (seta branca). Bar = 0,5 m.
Fig. 4 Seco transversal da pea intermediria do espermatozide de pato, mostrando o centrolo distal (seta branca) rodeado por mitocndrias (M), ambos embebidos por material eltron-denso (estrela). Bar = 0,5 m.
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Fig. 5 Regio de transio entre o centrolo distal (seta) e axonema (seta larga) na pea intermediria, com mitocndrias elpticas (M), contendo matriz densa e numerosas cristas longitudinais e nulo (seta preta). Bar = 0,5 m.
Fig. 6 Regio da pea principal de espermatozide de pato, mostrando o axonema (seta fina) rodeado por uma bainha de fibras densas (seta larga). Bar = 0,5 m.
Fig. 7 Seco transversal da pea principal do espermatozide, destacando a organizao do axonema, com um par central de microtbulos (seta fina) e nove pares perifricos (seta larga) circundados por bainha fibrosa (estrelas) e por uma fina camada citoplasmtica (asterisco). Bar = 0,5 m.
Fig. 8 Regio terminal do flagelo de espermatozide de pato, constituda pelo axonema (seta fina) e membrana plasmtica (seta larga). Bar = 0,5 m.
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Fig. 9 Eletromicrografia de varredura de espermatozide mostrando acrossoma (seta fina), regio da cabea com ncleo (N), pea intermediria (M), regio do nulo (seta larga), pea principal (T) e unidades globulares (setas pequenas) aderidas superfcie. Bar =10 m.
Fig. 10. Detalhe da eletromicrografia anterior evidenciando o acrossoma (seta fina), regio da cabea com ncleo (N), pea intermediria (M), regio do nulo (seta larga) e unidades globulares (setas pequenas) aderidas superfcie. Bar =10 m.
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Discusso
Os espermatozides de aves apresentam similaridades estruturais com os de mamferos monotremos (Jones & Lin, 1993). Entretanto, existem algumas diferenas significativas na estrutura dos espermatozides entre aves e mamferos eutrios. Espermatozides de aves possuem um longo ncleo cilndrico, enquanto que nos espermatozides de mamferos eutrios o ncleo curto e achatado. Alm disso, os espermatozides de aves tem um longo perforatorium, sem bainha ps-acrossomal ligada a membrana plasmtica, nem colunas estriadas formando a regio do colo, e no possuem tambm bainhas de fibras densas externamente que se estendem pelo comprimento da pea principal dos espermatozides (Jones & Lin, 1993). Segundo Breucker (1982) existem diferenas nos espermatozides de aves passeriformes e no passeriformes. Os espermatozides dos passeriformes possuem acrossoma curvado ou com forma espiral, sem perforatorium, somente um centrolo proximal e um tipo de membrana ondulada que sugere similaridades com espermatozides de anfbios, mas sua estrutura no homloga. Os espermatozides de no passeriformes como os das aves galinceas, anseriformes e columbiformes correspondem ao tipo bsico de espermatozide, similar ao dos rpteis sauropsdeos. Estes espermatozides sauropsdeos so caracterizados por possurem pequeno acrossoma, perforatorium, pea intermediria bem definida contendo dois centrolos e flagelo longo e mvel (Yasuzumi & Sugioka, 1971; Humphreys, 1972; Baccetti et al., 1980), caractersticas estas tambm visualizadas no espermatozide do pato domstico.
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As caractersticas ultra-estruturais da cabea dos espermatozides do pato domstico so similares s encontradas para a ema (Phillips & Asa, 1989), apresentando uma curta cabea e um reduzido acrossoma, com material moderadamente eltron-denso, cromatina compacta, mas s vezes no totalmente condensada, como foi observado em espermatozides de insetos e mamferos (Phillips & Asa, 1989). Ademais, uma estrutura anloga haste acrossomal, ou perforatorium, tem sido observada em espermatozides de muitas aves no passeriformes (Phillips & Asa, 1989; Soley, 1993). O perforatorium uma estrutura slida bem definida, a qual se encaixa no interior de uma depresso nuclear posterior estando recoberto pelo acrossoma anteriormente, sendo observado desta forma no pato domstico e tambm no avestruz (Soley, 1993), em contraste ao da ema e tinamdeos, onde estava completamente rodeado pelo ncleo (Soley, 1993). A funo do perforatorium em aves ainda no foi definida, podendo ser apenas uma estrutura residual (Soley, 1993). Na pea intermediria dos espermatozides de ema foram descritos 2 centrolos, um proximal e outro distal, ambos embebidos em material eltron-denso, sendo o proximal curto e o distal longo (Philipps & Asa, 1989), semelhantes aos observados no pato domstico. Uma caracterstica comum dos espermatozides de ema, avestruz, tinamdeos e do pato a presena de um longo centrolo distal que se estende parcilamente ou por todo o comprimento da pea intermediria, finalizando a regio do nulo (Soley, 1993). Outras espcies de aves no passeriformes como o galo (Tingari, 1973), peru (Thurston & Hess, 1987) possuem um centrolo distal que ocupa somente a poro anterior da pea intermediria. A galinha dangola aparentemente a nica espcie que possui somente um centrolo distal localizado anteriormente a pea intermediria (Thurston et al., 1982; Thurston & Hess, 1987).
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As mitocndrias da pea intermediria de aves no passeriformes mostraram uma variedade de formas (Soley, 1993). No avestruz, estas organelas so retangulares ou poligonais, com cristas atpicas, similares s do galo (Bakst & Howarth, 1975), peru (Thurston & Hess, 1987) e galinha dangola (Thurston & Hess, 1987). No pato domstico, as mitocndrias eram elpticas, com matriz densa e cristas longitudinais, diferindo das espcies antes citadas. O nmero de mitocndrias na pea intermediria do espermatozide difere entre as espcies de aves. No avestruz, foram observadas cerca de 20 mitocndrias ao redor do centrolo distal e do axonema (Soley, 1993), enquanto que no galo, peru, periquito e ema cerca de 25 a 30 mitocndrias esto presentes (Soley, 1993); j no pato observou-se a presena de 11 a 12 mitocndrias. As similaridades e diferenas morfolgicas das mitocndrias, entre diversas espcies de aves, so indicativas de importantes diferenas metablicas, tais como: oxidao aerbica nos espermatozides de peru (Thurston & Hess, 1987) e gliclise anaerbica em espernatozides de galo (Wishart, 1982). Segundo Lake e Wishart (1984) quanto maior a proporo entre o tamanho da pea intermediria e do nmero de mitocndrias, em relao aos componentes da cabea do espermatozide, maior ser a capacidade de metabolismo oxidativo do espermatozide. A pea intermediria dos espermatozides de vertebrados geralmente alongada, em comparao aos espermatozides de animais com fertilizao externa, nos quais as mitocndrias esto dispostas em forma de anel ou em agrupamentos de 4 mitocndrias esfricas ao redor da base do flagelo (Fawcett, 1970). Adaptaes observadas em espermatozides de mamferos, como a adio de bainhas fibrosas externas e um aumento no nmero de mitocndrias, aparentemente ocorreram devido necessidade de um maior
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requerimento energtico para a locomoo dos espermatozides, no ambiente mais viscoso do trato reprodutivo das fmeas (Fawcett, 1970). O grande nmero de mitocndrias encontradas na pea intermediria dos espermatozides da codorna domstica (Saita et al., 1980) e codorna japonesa (Korn et al, 2000) sugerem a necessidade de elevadas quantidades de energia para a locomoo dos gametas destas espcies, pois estes so mais longos do que o dos galiniformes (Korn et al., 2000). J a pea intermediria dos espermatozides do pato domstico possui somente de 11 a 12 mitocndrias, alm destes serem relativamente menores quando comparados aos de outras espcies de aves (Korn et al., 2000). A pea principal dos espermatozides no avestruz e ema, nos tinamdeos e no pato corresponde ao mesmo segmento do corpo do espermatozide de mamferos (Soley, 1993). Como em mamferos, o limite entre a pea intermediria e a pea principal dos espermatozides das espcies citadas demarcado por um nulo distinto (Soley, 1993). Esta estrutura est tambm presente nos espermatozides de ema (Phillips & Asa, 1989) e do pato domstico e parece ser tpica de muitos espermatozides de aves no passeriformes. Nos espermatozides de avestruz (Soley, 1993) e tambm naqueles do pato a pea principal estava revestida por uma bainha fibrosa que rodeava o axonema, parecida com a mesma estrutura encontrada em espermatozides de mamferos (Fawcett, 1965). Esta estrutura consistia de colunas longitudinais pareadas e orientadas ao longo do comprimento da pea principal e interconectadas por pontes de material denso. A organizao dos microtbulos do axonema do pato domstico seguia o modelo bsico de distribuio, com um par central de microtbulos circundados por 9 pares perifricos dispostos longitudinalmente, similarmente ao encontrado em outras espcies de aves (Soley, 1993).
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A poro terminal do flagelo dos espermatozides do pato apresentou estrutura semelhante do avestruz (Soley, 1993), sendo curta e consistindo somente de axonema recoberto por membrana plasmtica, no havendo mais a presena da bainha fibrosa. Em concluso, os espermatozides do pato domstico esto estruturados de maneira similar aos espermatozides de outras espcies de aves no passeriformes, mas com algumas diferenas morfolgicas e peculiares espcie-especficas. Ademais os espermatozides do pato domstico so do tipo simples, caractersticos de aves no passeriformes. Em geral, a morfologia dos espermatozides do pato similar dos espermatozides do avestruz, galo domstico, peru, galinha dangola e periquito (Soley & Roberts, 1994). O acrossoma dos espermatozides do pato mostra-se reduzido, afilado e de aparncia homognea, semelhantes aos do avestruz (Soley & Roberts, 1994). Muitos espermatozides de mamferos possuem acrossomas com diferenciao regional e ntima associao com outras estruturas (Fawcett, 1970; 1971). Em contraste, acrossomas de espermatozides de aves no-passeriformes, como o do pato domstico, so homogneos em sua aparncia e no apresentam associaes especiais com outras organelas do espermatozide (Thurston & Hess, 1987). O ncleo do espermatozide do pato tem aspecto ondulado, com superfcie rugosa, similarmente ao descrito para o espermatozide do peru, galo e galinha dangola por Thurston e Hess (1987), os quais tambm possuam unidades globulares aderidas a sua superfcie, que, provavelmente, so constituintes do plasma seminal (Soley & Roberts, 1994). A pea intermediria do espermatozide do pato domstico mostra-se curta, de superfcie lisa, com poucas unidades globulares aderidas sua superfcie e com
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mitocndrias pouco visualizadas, similarmente ao descrito em espermatozides de avestruz (Soley & Roberts, 1994). Segundo Thurston e Hess (1987), a observao de mitocndrias da pea intermediria, em nvel de microscopia eletrnica de varredura, possvel somente quando a membrana plasmtica est danificada. A pea principal forma o segmento mais longo dos espermatozides de aves (Soley & Roberts, 1994). De acordo com Thurston e Hess (1987), a juno entre as peas principal e terminal no facilmente distinguida pela MEV em espermatozides de galo, peru, galinha dangola e no pato domstico aqui estudado.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP, Processo 00/05079-4). Os autores agradecem ao Sr. Nivalde Antnio Basso and Sra. Maria Helena Moreno pela assistncia tcnica.
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85
CONCLUSES GERAIS
1 O ciclo reprodutivo anual do pato domstico pode ser dividido em quatro fases sucessivas e sazonais, compreendendo: reproduo, regresso, quiescncia e
recrudescncia, sendo similar ao encontrado em outras aves tropicais. A fase reprodutiva ocorre entre os meses de julho a outubro, estaes de inverno e primavera, com seu pico de reproduo observado no ms de outubro, caracterstico do pato domstico.
2 A concentrao do hormnio testosterona no plasma sanguneo do pato domstico varia sazonalmente, tendo picos na fase reprodutiva (outubro) e na quiescncia gonadal (janeiro) durante o ciclo reprodutivo anual, similarmente ao observado para as espcies subtropicais Ploceus philippinus e Serinus canarius.
3 Os parmetros avaliados de peso testicular e volume testicular, dimetro tubular e altura do epitlio seminfero apresentam os maiores valores mdios durante a fase reprodutiva do ciclo, principalmente no ms de outubro, havendo uma tendncia de aumento generalizado destes parmetros em idntica fase do ciclo em vrias espcies de aves estudadas.
4 Os nveis de glicose sangnea mostraram correlao com o ciclo reprodutivo anual, funcionando como fonte energtica para o processo reprodutivo, sendo esta caracterstica metablica similar encontrada na codorna domstica.
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5 A ultra-estrutura do espermatozide do pato domstico similar de outras aves nopasseriformes, com algumas caractersticas espcie-especficas, correspondendo a um tipo bsico de espermatozide.
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS GERAIS
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Orientador: Prof. Dr. Antnio Marcos Orsi

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA UNICAMP

Campinas, 23 de julho de 2004.

Prof. Dr. Antonio Marcos Orsi (Orientador)

Profa. Dra. Valria Helena Alves Cagnon Quitete _________________________________

Prof. Dr. Francisco Eduardo Martinez

Profa. Dra. Sandra Maria Miraglia Valdeolivas

Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder

Prof. Dr. Humberto Santo Neto

Prof. Dr. Ruberval Armando Lopes

Dedico esta Tese de Doutorado:

Introduo Geral Objetivos

Artigo 3: Caractersticas ultra-estruturais dos espermatozides do pato domstico (Anas platyrhynchos) 63

Referncias Bibliogrficas Gerais

1 - Morfologia Testicular e dos Espermatozides

2 - Ciclo Reprodutivo Anual e Ao Hormonal

K. Simes1, A. M. Orsi2, C. Cruz3, E. C. Urbinati4, F. D. Gonalvez3, K. A. S. Viegas5

Departament of Anatomy, Institute of Biology, State University of Campinas, UNICAMP,

Campinas, So Paulo, Brazil, 13083-970

Departament of Anatomy, Institute of Biosciences, So Paulo State University, UNESP,

Botucatu, So Paulo, Brazil, 18618-000

Jaboticabal, and Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil, 148700-000

Departament of Surgery, So Paulo University, USP, So Paulo, Brazil, 05508-000

Month of the year

K. Simes1, A. M. Orsi2, E. C. Urbinati3, F. D. Gonalvez4, C. Cruz4

Departament of Anatomy, Institute of Biology, State University of Campinas, UNICAMP,

Campinas, So Paulo, Brazil

Departament of Anatomy, Institute of Biosciences, So Paulo State University, UNESP,

Botucatu, So Paulo, Brazil

Departament of Physiology and Animal Morphology, So Paulo State University, UNESP,

Jaboticabal, and Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil

Aquiculture Center of UNESP, Jaboticabal, So Paulo, Brazil

Artigo formatado segundo as normas da revista British Poultry Science, Inglaterra

Anlises bioqumicas de glicose sangnea, glicognio e lipdeo hepticos e musculares

P es o tes tc u lo d ireito (g ) P es o tes tc u lo es q u erd o (g )

Volume Testicular (mm3)

V olum e testicular esquerdo (m m 3) V olum e testicular direito (m m 3)

100 Altura do epitlio (um)

*Letras iguais no diferem entre si pelo teste de Tukey (5%).

300,0 a a a a a Glicose (mg/100mL) 200,0 ab ab ab

ms c ulo v er melho ms c ulo b r anc o

ab ab cde de e bcd bcde bcde abc a bcde a a cde ab

2,00 Lipdeo (%)

1,50 abc bc c 0,50 abc c bc abc bc ab

abc bc abc bcabc

Ultrastructural features of the spermatozoon of the domestic duck (Anas platyrhynchos)

K. Simes1, A. M. Orsi2, C. Cruz3, K. A. S. Viegas4

Departament of Anatomy, Institute of Biology, State University of Campinas, UNICAMP,

Campinas, So Paulo, Brazil

Departament of Anatomy, Institute of Biosciences, So Paulo State University, UNESP,

Botucatu, So Paulo, Brazil

Running title: Ultrastructure of the spermatozoa of duck

Artigo formatado segundo as normas da Revista European Journal of Morphology, Holanda.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS GERAIS

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