MICROBIO LOGA APLICADA

CRECIMIENTO DE HONGOS
1

Cuando una espora germina, emite un filamento o hifa que se alarga y ramifica rpidamente a medida que va creciendo, formando as un conjunto de hifas llamado micelio. El crecimiento de los hongos se lleva a cabo en los pices de las hifas por lo que se le conoce como crecimiento apical. Este crecimiento se puede ver al microscopio de luz con un hongo de crecimiento rpido como Neurospora crassa el cual crece a una velocidad de 40 m/min. a 25C. Tambin se ha visto un movimiento neto del citoplasma hacia el pice de la hifa, por lo tanto, para que el pice de la hifa crezca tiene que utilizar el material citoplsmico que viene de atrs. Por otro lado, se sabe que el pice hifal tambin est rodeado por la pared celular, aunque sta es ms delgada y ms plstica que la que se Presenta en el resto de la hifa. Por lo tanto, en el crecimiento de la hifa deben intervenir tanto una degradacin como una sntesis de pared celular de una manera balanceada. Hace tiempo se observaron en los pices hifales ciertas vesculas que aparecan cuando la hifa estaba creciendo y desaparecan cuando dejaba de crecer. Dichas vesculas no se han caracterizado completamente pero presentan varios precursores para la biosntesis de pared celular y algunas enzimas murolticas. En la Fig. 6 se observa una representacin hipottica de lo que sucede con las vesculas en la pared celular del pice hifal. No se sabe cual es el mecanismo del movimiento de estas vesculas hacia el pice, pero se ha sugerido que puede ser: a) por un gradiente electrognico a travs de la hifa, b) por un flujo electroosmtico de agua hacia el pice, o c) por un sistema de microtbulos o microfilamentos. Tambin se ha observado que cuando la espora germina existe una fase inicial de hinchazn donde aumenta de tamao debido a la entrada de agua y que, por lo tanto, dicha espora tiene que sintetizar pared celular nueva de una manera ms o menos uniforme. Posteriormente la hifa joven llamada tubo germinativo emerge de la espora y es en el pice de esta estructura donde la sntesis de pared celular empieza a ocurrir. (fig. 7) En otras palabras, la germinacin de la espora involucra una fase inicial donde la pared celular se sintetiza de forma no polar u homognea en la superficie de la espora seguida de una sntesis polar en el pice de tubo germinativo.

Cul es el mecanismo de ramificacin de las hifas una vez que la primera de ellas ha germinado y ha formado el tubo germinativo?

1.- Se sabe que los hongos muestran un crecimiento con dominancia apical aunque no se conoce el control de dicha dominancia. Las ramificaciones hifales van apareciendo slo un poco atrs de los pices. 2.- Las ramificaciones divergen unas de otras, es decir, crecen hacia direcciones opuestas, quiz respondiendo al gradiente de nutrientes del medio de cultivo o a la presencia de inhibidores producidos por la hifa ya existente (fig. 8). 3.- La densidad de una colonia fngica o el nmero de ramificaciones que forma est directamente relacionada con la cantidad de nutrientes en el medio. 4.- Se han observado los diferentes estadios de desarrollo de las colonias fngicas jvenes y se encontr que la unidad de crecimiento hifal G se puede expresar de la forma siguiente: G= Longitud total del micelio Nmero de pices hifales Despus de fluctuaciones que se presentan al comienzo del crecimiento, el valor de G se mantiene constante conforme la colonia se desarrolla, siendo dicho valor caracterstico para cada hongo, por ejemplo, para Geotrichum es de 160 m y para Neurospora es de 120 m. Al mismo tiempo, se puede calcular la velocidad especfica de crecimiento se relaciona con la velocidad de crecimiento radial y el dimetro de la colonia W, como sigue: Velocidad de crecimiento radial = W El crecimiento de los hongos filamentos se puede poner de manifiesto por varios mtodos, como son la determinacin del crecimiento radial, del crecimiento longitudinal, del peso seco y del peso hmedo. REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO. Tubos de ensaye de 16 x 150 c0n 4.5 ml de agua destilada estril Cajas de Petri con gelosa nutritiva Pipetas estriles de 1 y 10 ml Tubos de Ryan con gelosa Sabouraud Cajas de Petri con gelosa Sabouraud Matraces nefelomtricos con 25 ml de medio E +0.25% de glucosa Tubos para fotocolormetro Klett-Summerson Probeta de 200 ml limpia Matraces Erlenmeyer de 125 y 500 ml. Cepas: Escherichia coli, Penicillium sp., Aspergillis sp., Rhizopus sp., Fusarium sp. METODOLOGA. I.- Cuenta de bacterias por el mtodo nefelomtrico. 1.- Inocular un matraz nefelomtrico que contenga 25 ml de un cultivo de 12 horas de E. Coli. 2.- Homogeneizar el inculo en el medio y medir la turbidez del cultivo en fotocolormetro Klett-Summerson (tiempo cero). Incubar el matraz en un bao de 37C. El cero del fotocolormetro se ajusta con medio E sin inocular. 3.- Realizar lecturas como en el punto 2 cada 0.5 horas durante 7 horas, manteniendo el cultivo a 37C. II.- Cuenta viable del inculo bacteriano original. 1.- Marcar del 1 al 10 dos series de 10 tubos que contienen 4.5 ml de agua

destilada estril. 2.- Agregar al primer tubo 0.5 ml del cultivo joven (12h) de E. Coli. 3.- Efectuar diluciones decimales hasta 10-10. 4.- Colocar o.1 ml de las diluciones 10-6 a 10.10 en la superficie de 5 placas de gelosa nutritiva marcadas previamente con la dilucin correspondiente (hacer lo anterior por duplicado). 5.- Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada. 6.- Incubar a 37C durante 24-48 horas. III.- Determinacin de la relacin de la turbidez como unidades KlettSummerson (U.K.) y la concentracin bacteriana. Esta determinacin no es necesario realizarla en condiciones de esterilidad, ni con material estril. 1.- Colocar 4.5 ml del cultivo original de E. Coli en un tubo para fotocolormetro Klett-Summerson y medir su turbidez. 2.- Realizar el siguiente esquema de diluciones al cultivo anterior, utilizando medio E como diluyente. Determinar la turbidez en el fotocolormetro a cada una de las diluciones. Diluir (ml) 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 10.5 13.5 18.5 25.5 38.5 63.5 medio E (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 3.0 5.0 7.0 13.0 25.0 150.0 Medir U.K. * *

IV.- Crecimiento longitudinal de hongos. 1.- Sembrar en un extremo del tubo de Ryan con gelosa Sabouraud una porcin del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28C. 2.- Medir la longitud del crecimiento en mm a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubacin. V. Crecimiento radial de hongos. 1.- Sembrar por punto el centro de una caja de Petri con gelosa Sabouraud con una porcin del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28C. 2.- Medir el dimetro en mm de la colonia a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubacin. PRECAUCION: Mover lo menos posible los tubos de Ryan y las cajas de Petri una vez inoculadas para evitar la dispersin de las esporas. INFORME. 1.- Tabular los resultados de la curva de crecimiento por el mtodo nefelmetrico, como se indica en la siguiente tabla. Tiempo (horas) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Unidades Klett

2.- Escribir en la tabla siguiente, el nmero de colonias encontradas en cada una de las diluciones que efectu del cultivo original de E. Coli. Dilucin UFC/0.1 ml UFC/ml

3.- Con base en los datos de la tabla anterior, cul es el nmero de bacterias

/ml del cultivo original de E. Coli. 4.- De acuerdo con el punto III de la seccin de Mtodos, tabule las unidades Klett que corresponden a cada una de las diluciones efectuadas y calcule la Concentracin de bacterias en cada dilucin de la muestra original de E. Coli. Dilucin Unidades Klett Bacterias/ml a) 1:1.22 b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) 5.- Hacer una grfica con los resultados de la tabla anterior. Interpolar en la grfica anterior cada uno de los valores de U.K. obtenidos en el punto 1 de esta seccin y tabularlos de la siguiente forma: Tiempo (horas) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Unidades Klett-Summerson Bacterias/ml

7.- Hacer la grfica en papel milimtrico o en computadora con los resultados de la tabla anterior, colocando en el eje de las abscisas el tiempo de incubacin y en el de las ordenadas el nmero de bacterias/ml. 8.- Efectuar con los datos obtenidos en esta prctica, una regresin lineal por el mtodo de los mnimos cuadrados. 9.- Con base en todos los datos obtenidos en esta prctica, diga usted cul fue la densidad mxima de poblacin que se alcanz (K) y calcule cul fue la velocidad especfica de crecimiento () para E. Coli y cul su tiempo de
6

generacin. 10.- Tabular los resultados del crecimiento lineal y radial de los hongos, como se indica en la siguiente tabla. Tiempo (das) Radial Lineal 0 1 2 3 4 Cepa 11.- Hacer una grfica con los resultados de la tabla anterior, colocando el tiempo de incubacin en el eje de las abscisas y el crecimiento en centmetros en el de las ordenadas. CUESTIONARIO. 1.- De acuerdo con el modelo de crecimiento exponencial, resuelva el siguiente problema: usted inocul 106 clulas de E. Coli en 25 ml de medio de cultivo adicionado de glucosa, incub su matraz durante 4 horas. Sabiendo que el tiempo de generacin es de 20 min. Calcule el nmero de bacterias, toma 0.1 ml del matraz y lo inocula en medio de cultivo con manitol; incuba durante 4 horas, obteniendo al cabo de este tiempo 2.4 X 107 bacterias/ml. En este medio se present una fase lag de 20 min. Calcule usted el tiempo de generacin para este microorganismo en el medio con manitol. 2.- Si tenemos un cultivo que contiene 100 clulas de E. Coli, el cual presenta un tiempo de generacin de 30 min. a 35C, dibuje la curva de crecimiento de dicha bacteria cuando: a) las clulas se incuban a 35C durante 5 horas. b) despus de 5 horas, la temperatura se cambia a 20C durante 2 horas. c) despus de 5 horas a 35C la temperatura se cambia a 5C durante 2 horas, al trmino de las cuales se regresa a 35C durante 5 horas ms. REFERENCIAS. Campbell, R.C. 1974. Statistics for biologists. 2nd Ed. Cambridge University Press, London. P 385. Deacon, J.W. 1984. Introduction to modern mycology. 2nd. Ed. Blackwell Scientific Pub. Pp 42-56 Donachie, W:D: 1993. The cell cycle of Escherichia coli. Ann. Rev. Microbiol. 47: 199-230 Hutchinson, G.E. 1978. An introduction to population ecology. Yale University Pree. P 260 p. Kolter, R., D. A. Siegele y A: Tormo. 1993. The stationary phase of the bacterial life cycle. Ann. Rev. Microbiol. 47:855-874. Krebs, C.J. 1978. Ecology: the experimental analysis of distribution and
7

Abundance. 2nd. Ed. Harper and Row, Pub. P 678. Martnez Jernimo, F:F: 1983. Crecimiento poblacional. En: Comparacin De curvas de crecimiento poblacional de Ankistrodesmus falcatus (Chlorellales, Chlorolleceae) obtenidas al utilizar diferentes medios de cultivo. Aspectos ecolgicos y de nutricin mineral en el cultivos de algas microscpicas. Tesis profesional. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN. Mxico, D.F. Poole, R.W. 1974. An introduction to quantitative ecology. Mc. Graw Hill