FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR Y AMBIENTALES DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR, MICROBIOLOGA, MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PBLICA, FISIOLOGA

Y GENTICA

Determinacin de hibridacin natural entre Crassostrea angulata (Lamarck, 1819) y Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), en poblaciones naturales del Sudoeste de la Pennsula Ibrica

TIAGO FERNANDES FARIAS TESIS DE MSTER MSTER ACUICULTURA Y PESCA: RECURSOS MARINOS Y SOSTENIBILIDAD
Puerto Real a 24 de noviembre de 2008

LAUREANA

REBORDINOS

GONZLEZ,

DOCTORA

EN

CIENCIAS

BIOLGICAS E HICHAM CHAIRI, LICENCIADO EN CIENCIAS AMBIENTALES como directores de la Tesis de Mster titulada:

D eterm inacin de hibridacin

natural entre Crassostrea angulata (Lam arck, 1819) y Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), en poblaciones naturales del Sudoeste de la Pennsula Ibrica.
Realizada por: TIAGO FERNANDES FARIAS se ha realizado bajo nuestra direccin en las dependencias del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Microbiologa, Medicina Preventiva y Salud Pblica, Fisiologa y Gentica Y para que as conste firmamos el presente informe en Puerto Real 24 de noviembre de 2008

Firma del/los Director/es

Fdo.: Laureana Rebordinos Gonzlez

Fdo. Hicham Chairi

INDICE
Pgina LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABLAS ABSTRACT RESUMEN 1. INTRODUCCIN 2. MATERIAL Y MTODOS 2.1. Material Biolgico iii iv v vi 1 11 11 11 12 12 12 13 15 15 15 16 18 18 19 20

2.1.1. Localidades del Muestreo............................................ 2.1.2. Conservacin de las Muestras..................................... 2.2. Extraccin del ADN

2.2.1. Material Utilizado ......................................................... 2.2.2. Procedimiento para la Extraccin ................................ 2.3. Reaccin en Cadena de la Polimerasa

2.3.1. Amplificacin del Microsatlite CG44 .......................... 2.3.2. Procedimientos de la Amplificacin ............................. 2.3.3. Condiciones de Amplificacin ...................................... 2.4. Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin RFLP 2.4.1. La endonucleasa de Restriccin .................................. 2.4.2. Digestin por la Enzima de Restriccin ....................... 2.5. Gel de Agarosa

ii

2.6.

Deteccin de los Productos Amplificados

21 21 22

2.6.1. Electroforesis ............................................................... 2.6.2. Fotografiado del Gel ....................................................

3. RESULTADOS 3.1. 3.2. 3.3. Obtencin mediante PCR RFLP del Microsatlite CG44 ................................................................................. Anlisis de la Hibridacin ............................................... Determinacin de los Patrones en las Poblaciones Naturales .......................................................................... 3.3.1. Fuseta .......................................................................... 3.3.2. Punta del Moral ............................................................ 3.3.3. Juan Carlos .................................................................. 3.3.4. Sanlcar de Barrameda ............................................... 3.3.5. Calavera ....................................................................... 3.3.6. El Palmar ..................................................................... 3.4. Anlisis de las Poblaciones Naturales Muestreadas ...

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24 27 28 28 28 29 30 31 32 33 36 36 39 41 44 49

4. DISCUSIN 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. Problemas con la introduccin de Nuevas Especies ... Identificacin Gentica de las especies ........................ La Utilizacin de las Tcnicas Moleculares para la Diferenciacin Gentica entre C. angulata x C. gigas.. La Importancia en la Preservacin de los Recursos Genticos ......................................................................... 5. CONCLUSIONES

6. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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iii

LISTA DE FIGURAS Pgina Figura 01: Grfico de la produccin de ostras Crassostrea sp. en Europa ............................................................................... Figura 02: Morfologa interna de la ostra del gnero Crassostrea sp.. Figura 03: Localizacin de las regiones del muestreo ........................ Figura 04: Kit de reactivos utilizados para la extraccin del ADN genmico ........................................................................... Figura 05: Aparatos utilizados en la extraccin de ADN. (a) FastPrep FP120 de Therino y (b) Centrifuga 14.000xg ... Figura 06: Secuencia de los Primers (Forward y Reverse) utilizados en la amplificacin del microsatlite CG44 ........................ Figura 07: Termociclador Gene Amp PCR System 2700 Applied Biosysten ........................................................................... Figura 08: Esquema ilustrativo del 1 ciclo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa PCR ..................................................... Figura 09: Secuencia del ADN que ser reconocida (diana) y cortada por la enzima Bsp1407I ........................................ Figura 10: Eppendorf conteniendo la mezcla de la digestin, en bao de temperatura, Grant GD100 .................................. Figura 11: Molde utilizado para polimeralizar el gel de agarosa de 100ml ................................................................................. Figura 12: Gel cargado y conectado, listo para iniciar la electroforesis ...................................................................... Figura 13: Aparatos utilizados para la digitalizacin del producto en el gel .................................................................................. Figura 14: Secuencia del producto de amplificacin del microsatlite CG44 en C. gigas y C. angulata. ....................................... Figura 15: (a) PCR de individuos muestreado en el medio natural (b) Digestin de los productos amplificados anteriormente Figura 16: Individuos amplificados y cortados con la enzima ............. Figura 17: Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Fuseta (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN. .................................................................................. Figura 18: Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Punta del Moral (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN. ........................................................ 1 3 11 12 13 15 16 17 18 19 20 22 23 25 26 27

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iv

Figura 19: Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Juan Carlos (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN. ........................................................ Figura 20: Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Sanlcar (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN. ........................................................ Figura 21: Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Calavera (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN. ........................................................ Figura 22: Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Palmar (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN. ............................................................................. Figura 23: Grfico de la proporcin de hbridos encontrados por poblacin (%) ..................................................................... Figura 24: Produccin mundial de alimentos de origen animal (%)
Fuente: Estadstica de Pesca FAO, 2004 .........................................................

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33 34 36 37

Figura 25: Principales pases productores de Crassostrea gigas

Fuente: Estadstica de Pesca FAO, 2004 .........................................................

(a) PCR y Digestin de un individuo hbrido (b) PCR y Digestin de un individuo puro de C. angulata (c) PCR y Digestin de un individuo puro de C. gigas .. Figura 27: Localizacin geogrfica de la (5) Empresa acucola de C. gigas y, (6) regin muestreada de Calavera ......................

Figura 26:

42 45

LISTA DE TABLAS

Pgina Tabla 01: Tabla 02: Cantidad de agarosa en la formacin del gel, para cada proceso analizado .............................................................. Individuos por poblacin (%), de acuerdo con la caracterizacin obtenida por la PCR RFLP .................... 21 35

ABSTRACT:

The Portuguese oyster, Crassostrea angulata (Lamarck, 1819) and the Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) are widely known for their close genetic relationship and their full fecundation under controlled conditions. However, nowadays there are not many studies available regarding their fecundation in a natural environment. After the Portuguese oyster crisis during the 70s, several European countries have imported Pacific oyster samples, in order to save the mollusk industry. This activity has created a problem because they have put two similar species in contact with each other, and due to their reproduction strategy they run the risk of combining their genetic material and, consequently, producing hybrids. Furthermore, the taxonomic classification of these species is unclear. In this work, we have sampled 7 oyster populations from different zones on the southwestern coast of the Iberian Peninsula. The sequence of the CG44 microsatellite, which is the most detailed method for differentiating these cupped oyster groups, has been used (Huvet et al., 2004). The main objective was to characterize each species using the PCR-RFLP techniques in order to estimate genetic differences between both taxa and apply these differences to the study of natural populations of suspected C. angulata. The results showed the presence of hybrids in almost all the sampled populations. This fact is important because of the increasing probability of hybrids spreading due to aquaculture expansion. This jeopardizes the maintaining of the integrity of the species like C. angulata. It we take into consideration the hybrid fecundation and growth demonstrated in previous studies, the necessity of developing management and conservation programs emerges to preserve these resources in their natural environment before they disappear. Additionally the possible incorporation of the found hybrids within the aquaculture industry should be evaluated. This is because the wide distribution and elevated number of hybrids could result from the higher fitness of the hybrids compared with the two species, C. gigas and C. angulata.

vi

RESUMEN:

La ostra Portuguesa, Crassostrea angulata (Lamarck, 1819) y la ostra del Pacfico, Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) son ampliamente conocidas por su gran similitud gentica y por producir fecundacin cruzada en condiciones controladas, aunque hoy en da son pocas las referencias de fecundacin en ambiente natural. Debido a la crisis con la ostra Portuguesa en los aos 70, algunos pases europeos han trados ejemplares de la ostra del Pacfico, para salvar las industrias de moluscos. Sin embargo, esta importacin ha puesto en contacto dos especies muy semejantes, que debido a su estrategia reproductiva, presentan un alto riesgo de combinar los gametos y, por lo tanto, producir hbridos. Por otra parte, la clasificacin taxonmica de ellas todava es un tema no suficientemente aclarado. En nuestro trabajo, hemos muestreado 7 poblaciones naturales de ostras localizadas en la costa sudoeste de la Pennsula Ibrica. Para su estudio, utilizamos el microsatlite CG44 descrito como el ms resolutivo para diferenciar estas especies de ostras estrechamente relacionadas (Huvet et al., 2004). El principal objetivo fue caracterizar cada especie, mediante tcnicas de PCR RFLP, para encontrar y estimar la diferenciacin gentica entre los dos taxones. Los resultados revelaron la presencia de hbridos en casi todas las poblaciones muestreadas. Este dato es importante debido al aumento de la probabilidad de la produccin de hbridos por el auge de la acuicultura, lo que supone una amenaza para el mantenimiento de la integridad de especies como C. angulata. Teniendo en cuenta datos previos, que muestran la viabilidad y fertilidad de los hbridos, se necesitan programas de gestin y conservacin de estos recursos genticos para evitar que desaparezcan del medio natural. Adems, nuestros resultados apuntan a que la amplia distribucin y elevado nmero de hbridos encontrados podra deberse a una mayor eficacia biolgica, en comparacin con las dos especies C. gigas y C. angulata. La confirmacin de este dato tendra gran repercusin y podra suponer el inters econmico de la produccin de hbridos mediante acuicultura.

1.

INTRODUCCIN Hasta mediados de los aos 70, la ostra conocida como ostra

portuguesa, Crassostrea angulata (Lamarck, 1819) era la especie ms cultivada por las industrias de moluscos en el continente Europeo. La especie fue cultivada inicialmente a lo largo de la costa atlntica de Francia, especficamente en la Baha de Arcachon y Marennes-Olron. La ostra fue introducida desde Portugal hacia Francia en 1868, cuando algunos ejemplares fueron llevados por los barcos que transitaban por el estuario de Gironde (Boudry et al., 1998). Francia fue el primer pas en invertir en ese recurso como una fuente de alimento y renta. La especie se propag muy pronto debido a que el encuentro entre las necesidades biolgicas de las ostras con las condiciones encontradas en la costa atlntica de Francia fue una combinacin muy aceptable, de hecho en los aos 50 el pas lleg a producir valores superiores a las 100.000 toneladas. Sin embargo, entre 1967 y 1972 los cultivos de C. angulata en Francia empezaron a estar afectadas por una enfermedad caracterizada por atacar las branquias labiales de los animales. Estudios posteriores de Comps et al., (1976) comprobaron que el sndrome era causado por un iridovirus. La epidemia produjo una mortalidad muy grande, que ha sido la responsable de prcticamente la desaparicin de la ostra Portuguesa de la costa francesa en 1973. La alternativa encontrada por las industrias para detener la crisis y sustentar el mercado que ya estaba consolidado, fue introducir una nueva especie que fuese capaz de sustituir a C. angulata. (Figura 01).

Figura 01:

Grfico de la produccin de ostras Crassostrea sp. en Europa

1

Y fue as cmo la especie Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), tambin conocida como la ostra del Pacfico, lleg hasta Europa con la difcil tarea de salvar las industrias de moluscos en Francia, que se encontraban agotadas por la crisis de los aos 70. La especie ya haba sido introducida anteriormente en varias regiones del mundo entero, incluyendo Canad (1912), Australia (1958), Nueva Zelanda (1972) y posteriormente en Chile y Sudfrica (1986). Para los cultivos franceses, los ejemplares fueron trados desde Canad y Japn que se implantaron con xito haciendo que la industria local de ostras se recuperase rpidamente de las prdidas sufridas por la epidemia. Con el paso de los aos, C. gigas se convirti una especie muy apreciada en todo el mundo, y adems muy aceptada por las industrias por tener un rpido crecimiento y por su resistencia a los altos niveles de turbidez y temperatura (Grizel y Heral, 1991). Mientras tanto los cultivos de la ostra portuguesa entraron en decadencia hasta el punto de no ser ms viable para las industrias de ostras. Adems su incidencia ha sido cada vez ms rara, y se supone que las poblaciones de C. angulata que sobrevivieron se encuentran solamente a lo largo del Sur de Portugal y Espaa. (Michinina y Rebordinos, 1997; Rebordinos y Cross, 1999; Cross y Rebordinos, 2003; Cross et al., 2003) Los Bivalvos son un grupo extremadamente adaptado y muy diversificado. Son animales exclusivamente acuticos, aunque puedan sobrevivir mucho tiempo fuera de ella, y se encuentran en ambientes con diversas salinidades. La mayora de las especies son bentnicas y viven en al fondo, mientras que otras son organismos ssiles y se fijan al substrato a travs del biso donde quedarn fijadas durante toda su vida. Son animales de gran xito en las condiciones marinas, incluso algunos son capaces de nadar con el movimiento de apertura y cerramiento de las valvas, cmo el caso de las vieiras, que pertenecen a la familia de los pectnidos. Las ostras presentan el cuerpo completamente envuelto por dos conchas, que estn unidas por un ligamiento situado en la regin anterior del animal. En el lado interior de cada una de las valvas se encuentra un fuerte msculo aductor que es el responsable del cerramiento de la concha, que es la

nica proteccin de estos animales contra sus predadores (Dantas Neto, 2001). (Figura 02)

Figura 02:

Morfologa interna de la ostra del gnero Crassostrea sp.

Las ostras se alimentan por filtracin. Estos animales ingieren grandes cantidades de agua por da en busca de micropartculas que estn suspendidas en el agua. El flujo es realizado por un par de sifones (inhalante y exhalante), que es por donde el alimento entra y seguir directamente hacia las branquias. Las micropartculas quedarn retenidas en los cilios para luego ser llevadas hasta la boca donde se iniciar el proceso de digestin. Los Bivalvos aunque filtradores, son capaces de seleccionar lo que va a ingerir y poseen su dieta compuesta principalmente por fitoplancton. El exceso de partculas ingeridas ser eliminado por el animal en forma de pseudoheces. El sistema reproductor est constituido por las gnadas y por los gonoductos que es por donde el animal libera sus gametos. Las especies del gnero Crassostrea poseen sexos separados, sin embargo, entre cada periodo de desove el animal puede cambiar de sexo (hermafroditismo secuencial), as que en un ao puede desovar como macho y el ao siguiente como una hembra. La fecundacin es externa, y durante el periodo del desove los gametos masculinos y femeninos son liberados al agua La manera utilizada por estos animales para garantizar la fecundacin y proliferacin de los progenitores, es la realizacin de un enorme desove

sincronizado garantizando as que un nmero mayor de ovocitos sean fecundados. De hecho, eso depender de un conjunto de factores relacionados con las variaciones temporales y espaciales de cada regin que habita la especie (Fernandes, 2007). Teniendo en cuenta que, esos animales liberan sus gametos masivamente en el agua y que estn fijados en el mismo sitio desde su periodo larvario, la probabilidad de que esos gametos se encuentren y fecunden a los gametas de otras especies de moluscos es considerablemente alta. La probabilidad es todava ms grande cuando hablamos del gnero Crassostrea, con un gran nmero de individuos distribuidos a lo largo de todo el mundo. De hecho, la presencia de dos taxones tan semejantes (Crassostrea gigas y Crassostrea angulata) que se encuentran en lados opuestos del mundo, llev a varios investigadores a la bsqueda de este origen. Varias hiptesis fueron sugeridas para explicar la distribucin de C. gigas y C. angulata, pero hay tres teoras que son consideradas las ms aceptadas: 1 Ambos taxones podran haberse originado de un ancestro comn C. gryphoides y han permanecido inmutables durante ms 10 millones de aos (Stenzel, 1971); 2 Ejemplares de Crassostrea gigas fueran introducidos en Portugal (Buroker et al., 1979); 3 Individuos de Crassostrea angulata fueron introducidas en Japn. La hiptesis ms aceptable actualmente es la de introduccin de C. angulata de Asia (precisamente de Taiwn) en las costas Portuguesas por los barcos comerciantes que navegaban durante el siglo XVI. La presencia de la especie de C. gigas en el continente europeo, se explica porque, fue introducida en los aos 70, para sustituir las prdidas de C. angulata en las industrias francesas de moluscos, como se ha dicho anteriormente. Basndose en la distribucin geogrfica y en la biologa de estas dos especies, se supone que la introduccin de C. gigas para acuicultura pudo haber producido una zona de contacto entre estos dos taxones. Considerando las estrategias reproductivas citadas anteriormente, estas especies pueden haber estado mezclndose, transfiriendo su material gentico durante largos

aos y posiblemente causando lo que en ciencia se denomina hibridacin natural. La hibridacin consiste en la reproduccin entre individuos de especies o poblaciones que son distintas por uno o ms caracteres hereditarios (Arnold, 1997). La coincidencia de ambas poblaciones y de sus gametos, principalmente durante el periodo de desove, permite que ocurra la hibridacin. Dependiendo del grado de hibridacin en la regin, puede resultar que se ha formado una zona de hbridos o hybrid zone. En el ambiente marino se puede encontrar la principal fuente para estudios de hibridacin natural, resultado de la gran variedad de especies que habitan en ese ecosistema y por las distintas estrategias reproductivas que existen ah. La evolucin de esos contactos podra dar lugar a (i) la extincin de uno de los dos taxones; (ii) la mezcla de los genomas; o (iii) el fortalecimiento del apareamiento y la especializacin de esas especies. Adems, solamente una pequea porcin de individuos van efectivamente a contribuir a la produccin de la prxima generacin, y eso puede conducir a la prdida de alelos no comunes y consecuentemente al descenso de la heterocigosidad (Huvet, et al., 2000b). La consecuencia de ello es la reduccin de la variabilidad gentica en las poblaciones. Segn los principios bsicos de la taxonoma, si dos taxones estn reproductivamente aislados habrn acumulado diferencias genticas suficientes para que sean genticamente distinguibles. Si los dos taxones son simptricos (aislamiento geogrfico), la diferenciacin gentica proporciona fuerte evidencia de la separacin de especies, sin embargo cuando las poblaciones son aloptricas (sin aislamiento geogrfico), no est tan claro porque pequeas diferencias genticas podran reflejar un limitado flujo de genes entre poblaciones. Algunas de estas especies son destacadas en estos estudios por presentar caractersticas reproductivas que los dejan ms propicios a estos cruzamientos entre especies, como por ejemplo los moluscos Bivalvos, que por dispersar sus materiales genticos en las corrientes martimas, sus gametos pueden seguir flotando durante das hasta que sean fecundados. Los gametos
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pueden alcanzar largas distancias hasta el periodo de pedivelliger, que es cuando el organismo todava en forma de larva, buscar un sitio apropiado para fijarse y desarrollarse. El concepto biolgico de esas especies, descrito por Mayr (1942), declara que los Bivalvos son uno de los grupos de animales efectivos o potencialmente aptos para cruzarse entre s mismos. Este concepto tambin admite que la produccin ocasional o constante de hbridos, no desintegrar la integridad gentica de las especies como un todo. En los Bivalvos marinos, varios casos de zona de hbridos ya fueron investigados y comprobados en Almejas (Mercenaria spp) (Bierne et al., 2002) y en Mejillones (Mytilus spp.) (Koehn, 1991). En ostras, la fertilizacin entre el cruzamiento de C. gigas y C. virginica demuestra ser normal, sin embargo la larva cesa su desarrollo cuando est en la fase del umbo. Experimentos con C. gigas con C. sikamea presentaron resultados satisfactorios y clara asimetra en la fertilizacin (Gaffey y Allen, 1993). Los huevos de C. sikamea son fcilmente fertilizados por el esperma de C. gigas, pero cuando se hace el cruzamiento recproco el resultado ya no es el mismo. En contraste, cuando se cruza C. gigas con C. iredalei y C. gigas con C. rivularis el xito de la fertilizacin se encuentra muy limitado (Menzel, 1987; Gaffey y Allen, 1993). Entre los taxones de C. gigas y C. rhizophorae, se encuentran altas tasas de fertilizacin pero casi ningn ejemplar consigue sobrevivir hasta la fase de la metamorfosis (Menzel, 1974). Sin embargo, existen varios casos descritos de xito en la produccin de hbridos entre C. angulata y C. gigas (Huvet et al., 2002). Se han demostrado hibridaciones entre taxones relacionados en condiciones controladas en laboratorio, pero hasta el momento no ha sido comprobada ninguna confirmacin gentica de hibridacin entre estos dos taxones en ambiente salvaje (Leito et al., 2007). Adems, la situacin taxonmica entre C. angulata y C. gigas ya hace mucho tiempo que est cuestionado por diversos autores, pues son especies muy parecidas y con caractersticas morfolgicas internas y externas prcticamente indistinguibles. Varios autores creen que sta confusin en la clasificacin puede ser debida a su aparente separacin geogrfica, ya que la

C. gigas fue descrita primeramente en Asia por Thunberg, mientras que C. angulata fue descrita en Europa por Lamarck. De cualquier modo, Ranson (1960) en estudios de comparaciones morfolgicas con las larvas de los dos taxones, fue el primero en publicar que C. angulata no puede ser distinguida de C. gigas y que deberan ser consideradas de la misma especie. Adems de las comparaciones morfolgicas, investigaciones con hibridacin experimental (Gaffney y Allen, 1993) y datos de aloenzimas (Mattiucci y Villani, 1983) confirmaron que ambas se trataban de la misma especie. Sin embargo, Menzel (1974) con estudios de diferenciacin entre las especies, propuso que deberan ser consideradas especies distintas y sugirieron que sean divididas como dos subespecies del gnero Crassostrea. Adems, algunas diferencias fenotpicas significativas entre los dos taxones son claramente observadas. Por ejemplo, la ostra del Pacfico tiene una produccin significantemente superior en ambiente natural en Francia, y su crecimiento es de hasta dos veces que el de la ostra Portuguesa (Soletchnick et al., 2002). Diferencias en trminos de caractersticas ecofisiolgicas tambin fueron reveladas entre las dos especies por Goulletquer et al., (1999). El avance de la gentica en los ltimos aos, ha posibilitado averiguar caracterizaciones ms precisas en los individuos y conocer sus diferencias, lo que resulta muy til cuando son aplicadas en estudios de poblaciones, principalmente cuando se trata de especies de difcil identificacin por parte de los taxnomos. Los anlisis en estos organismos marinos, estn aportando nuevos e interesantes datos gracias a la aplicacin de las nuevas tcnicas moleculares que apoyan y amplan los resultados obtenidos, mediante el uso de las tcnicas clsicas. Diversos autores buscan la diferenciacin gentica en varios niveles entre los dos taxones (Cross et al., 2006). Estudios de anlisis del cariotipo confirmaron la estrecha semejanza gentica entre los dos taxones en comparacin con las otras especies de ostras (Leito et al., 1999a). Adems diferencias entre C. angulata y C. gigas tambin fueron observadas notablemente en el cromosoma 7 (Leito et al., 1999b; Cross et al., 2005).
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Estudios de Boudry et al., (1998) con el gen mitocondrial para la subunidad I del citocromo oxidasa (COI) demostraron una clara diferenciacin gentica entre los dos taxones. De hecho, la estimacin en las divergencias nucleotdicas (5,26%) para el gen citocromo oxidasa permiti datar una diferencia entre C. angulata y C. gigas de 1 2 millones de aos revelando una pequea distancia gentica comparada con la estimacin entre otras especies del gnero Crassostrea (OFoighil et al., 1998). El objetivo del estudio de la gentica de poblaciones es comprender la composicin gentica y las fuerzas que determinan y cambian dicha composicin, relacionando los cambios hereditarios en poblaciones de organismos. La variacin gentica, o polimorfismo, podra ser la base del cambio evolutivo reflejado en uno o ms niveles del fenotipo, tanto entre poblaciones, como dentro de una poblacin o en ambos casos. Estos estudios se basaban inicialmente en el anlisis de las caractersticas morfolgicas, muy influenciables por el entorno. Avances en el campo de la gentica molecular permiten medir en la actualidad la variabilidad gentica con total exactitud. As, es importante tener herramientas necesarias para describir cuantitativamente esa variacin y proponer una teora del cambio evolutivo que pueda utilizar estas observaciones, para realizar las supuestas predicciones. La teora se basa en que, todos los organismos son susceptibles de sufrir mutaciones como consecuencias de su metabolismo celular normal. El aspecto ms importante de una poblacin, desde el punto de vista de la gentica, es su variabilidad gentica la cual surge como consecuencia del proceso de mutacin que proporciona el sustrato sobre el que actan los diferentes agentes evolutivos principalmente con la migracin, la deriva gentica y la seleccin que pueden producir cambios en la estructura gentica de las poblaciones. La seleccin natural acta sobre la variabilidad gentica promoviendo su adaptacin al ambiente (Tamarin, 1996). Tales mutaciones conducen a la aparicin del polimorfismo entre los individuos, especies y grupos taxonmicos de orden superior. El nmero y grado de variacin de cada

tipo de mutacin va a definir la variabilidad gentica que se pone de manifiesto mediante el anlisis de los marcadores moleculares. Recientemente, el uso de microsatlites para analizar los grupos de poblaciones de ostras C. gigas y C. angulata revelaron una pequea pero significativa diferenciacin gentica entre poblaciones de las diferentes especies (FST = 0,022; Huvet et al., 2000b). Esta diferencia puede ser hasta dos veces ms alta que la diferenciacin gentica estimada entre poblaciones de la misma especie que estn separadas geogrficamente. (FST= 0,010; Huvet et al., 2000b). Los microsatlites o SSR (Simple Sequence Repeats), son loci polimrficos presentes en el ADN nuclear que consisten en repeticiones de motivos de 1 a 6 nucletidos que se ubican uno tras otro. Generalmente se encuentran en zonas no codificantes del DNA, aunque tambin se pueden encontrar dentro de regiones internas codificantes y en secuencias no codificantes. Son neutros, co-dominantes y poseen una alta tasa de mutacin, lo que los hace muy polimrficos. A pesar de esto, la variabilidad que presentan es til para su uso como marcadores moleculares, en cuanto al nmero de repeticiones, no de la secuencia repetida. La mayora de los microsatlites son relativamente pequeos, variando desde unas pocas a cientos de repeticiones. Un marcador molecular es cualquier sustancia de tipo protico (protenas sanguneas, isoenzimas o anticuerpos) o cido nuclico (ADN y ARN) que permite etiquetar a cada uno de los individuos de una poblacin, de acuerdo a una parte o a un producto de su genoma. Un buen marcador gentico se caracteriza por ser co-dominante, altamente polimrfico y ser representativo de una parte del genoma. Los marcadores moleculares aparecen como la herramienta ms idnea para la identificacin de hibridacin en especies marinas en la actualidad. Las principales ventajas son que permiten evaluar los caracteres de las especies, que son transmitidos genticamente y que no se ven influenciados por variaciones de las condiciones ambientales. Para el estudio de poblaciones, el polimorfismo se presenta como el principal factor para caracterizar una diferenciacin molecular.
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Adems de los microsatlites, un marcador muy utilizado son los RFLP. En biologa molecular, las siglas RFLP o polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin (del ingls Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias especficas de nucletidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restriccin (tambin llamadas endonucleasas de restriccin) y que varan entre individuos. Las secuencias de restriccin presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposicin diferentes en el ADN de diferentes individuos de una poblacin, por lo que se dice que la poblacin es polimrfica para estos fragmentos de restriccin. Huvet et al., (2004) public resultados de la aplicacin de varios tipos de marcadores a la diferenciacin gentica de especies de Crassostrea. Adems comprob que el microsatlite CG44R se presentaba como el marcador molecular ideal para el estudio de caracterizacin y diferenciacin de estas especies. Este marcador nuclear ha permitido estudiar la presencia de hbridos naturales entre C. angulata y C. gigas a lo largo de la costa atlntica Europea. El objetivo de este trabajo es utilizar el microsatlite especfico sugerido por Huvet et al., (2004), para caracterizar poblaciones naturales de C. angulata del Sudoeste de la Pennsula Ibrica en cuanto a presencia de una o ms especies y de posibles hbridos entre ambas.

10

2.

MATERIAL Y MTODOS 2.1. Material Biolgico

2.1.1.

Localidades del Muestreo

Para la realizacin de este trabajo, se recogieron un total de 58 ejemplares de ostras de diferentes poblaciones en su ambiente natural, fijados a las rocas o en estructures presentes en sus respectivas playas donde formaban grandes bancos de ostras. Los individuos de C. gigas, fueron comprados en una empresa situada en Chiclana (Amalthea S.L.). El muestreo de las poblaciones fue hecho en siete regiones distintas localizadas al Sur de Portugal y Espaa, que se muestran en la figura siguiente. (Figura 03)

Figura 03:

Localizacin de las regiones del muestreo

11

2.1.2.

Conservacin de las muestras

Los ejemplares eran transportados todava vivos al laboratorio para la retirada del animal de la concha. La hepatopncreas eran eliminados cuidadosamente y el resto se conservaba en etanol 95%, despus de tres lavados consecutivos de 30 minutos para eliminar el exceso del agua. Los tejidos fueron preservados en un eppendorf, y almacenados en cajas a una temperatura de -20 C.

2.2. Extraccin del ADN

2.2.1.

Material Utilizado

Para la extraccin del ADN genmico, se eligi preferencialmente el tejido de las branquias y del manto. La extraccin se hizo llevando a cabo el protocolo, del kit denominado FastDNA Kit MP Biomedicals LLC. (Figura 04)

Figura 04:

Kit de reactivos utilizados para la extraccin del ADN genmico

12

El proceso se inicia con la preparacin de la muestra con lavados en PBS 1x, que tiene la finalidad de eliminar el exceso de etanol del tejido proveniente de la conservacin. Luego, mediante los aparatos FastPrep y de una centrifuga, (Figura 05) seguimos el protocolo descrito por el fabricante, hasta concluir la extraccin.

Figura 05:

Aparatos utilizados en la extraccin de ADN. (a) FastPrep FP120 de Therino y (b) Centrifuga 14.000xg

2.2.2.

Procedimiento para la extraccin

La extraccin fue hecha respetando al siguiente protocolo: i) Coger un trozo del tejido de aproximadamente 150 200 mg, despus de limpiado con PBS 1x, e introducir en un Eppendorf con Bolas del Kit; ii) Aadir 1ml del tampn CLS-TC (Cell Lysing Solution); iii) Meter los tubos en la Fast-Prep a 5 m/s durante 40 segundos; iv) Centrifugarlos durante 5 minutos a 14.000xg; v) Recoger 600l del sobrenadante de la mezcla y pasarlo a un Eppendorf; vi) Aadir 600l de Binding Matrix ;

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vii) Agitarlos suavemente con las manos durante 5 segundos, y despus dejarlo reposar durante 5 minutos para que se precipite; viii) Centrifugar durante 5 segundos a 14.000xg; ix) Desechar el sobrenadante y aadir 500l de SEWS M y mezclarlo bien con el precipitado hasta que lo homogenice; x) Vaciar todo el contenido en un Spin Filter xi) Centrifugar a 14.000xg durante 1 minuto xii) Desechar el lquido y volver a repetir el proceso de la centrifugacin para secar la membrana xiii) Transferir el filtro a un nuevo Eppendorf; xiv) Aadir 50l de DES y esperar 2 3 minutos; xv) Centrifugar nuevamente durante 1 minuto; xvi) Retirar el filtro, y el lquido contendr el ADN extrado;

El ADN extrado debe ser analizado por electroforesis para conocer su concentracin antes de amplificarlo. Pequeas o demasiadas cantidades de ADN pueden perjudicar el paso siguiente, y consecuentemente causar fallos en los resultados esperados. En algunos casos fue necesario hacer una dilucin para garantizar que las etapas de la PCR se completasen correctamente. Para la dilucin de las extracciones ms concentradas, utilizamos agua Milli Q y adoptamos la proporcin de 1:1 (H2O: ADN) para las ms intensas y por tanto ms concentradas, y 1:3 para las muestras ms diluidas. Las mismas diluciones son comprobadas hasta que se encuentre en una concentracin buena para la amplificacin.

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2.3. Reaccin en Cadena de la Polimerasa PCR

2.3.1.

Amplificacin del Microsatlite CG44

Para realizar esa tcnica, es necesaria la utilizacin de una serie de reactivos: mezcla de una solucin tampn (Buffer) para mantener el pH constante, una mezcla de desoxinucletidos trifosfato (dNTPs) que permitir polimerizar un nuevo ADN, iones divalentes (Mg2+) que deben actuar como cofactores de la DNA polimerasa, una polimerasa termoestable (Taq) que es esencial para que el ADN soporte las altas temperaturas de desnaturalizacin y los cebadores (Primers) que son las secuencias que van a ser reconocidas por la polimerasa y que permitirn dar el inicio de la amplificacin. Las tcnicas de diseo de los cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de productos de PCR, y en evitar la formacin de productos falsos. Hemos amplificado el microsatlite basado en la secuencia de Primers diseada por Magoulas et al., (1998). (Figura 06)

Microsatlite

Secuencia de los cebadores (5

3)

Fw: GAAGAATGTCATAGATTGATGG CG44 Rv: CATGCCTGTTTACCAGTATTC

Figura 06:

Secuencia de los Primers (Forward y Reverse) utilizados en la amplificacin del microsatlite CG44

2.3.2.

Procedimiento de la Amplificacin

Para realizar la tcnica de amplificacin es necesario hacer una mezcla de todos los reactivos citados antes. La composicin de la mezcla de reaccin utilizada por nosotros, para obtener un volumen final de 50 l de la PCR fue: 1mM Buffer (5 l de 10x); 3 mM MgCl2 (3 l de 50mM); 0,2 mM dNTPs (1,5 l de 10mM); 0,1 M de cada Primers (1,5 l de 10M); y 2 U de Taq polimerasa
15

(0,6 l); entre 2 y 4 l de ADN (dependiendo de la concentracin de lo mismo); lo que resta completamos con agua Millli Q. Los reactivos fueron mezclados en un tubo de PCR (0,2ml), para luego ser amplificados en un termociclador de ADN. (Figura 07)

Figura 07:

Termociclador Gene Amp PCR System 2700 Applied Biosysten

2.3.3.

Condiciones de Amplificacin

Un factor muy importante para la amplificacin de los microsatlites son las condiciones utilizadas en los programas de amplificacin. El ciclo comn de la PCR se realiza con tres ciclos variados de temperatura, que harn que ocurra la desnaturalizacin, alineamiento y elongacin de la cadena en cada ciclo. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo van a depender de una gran variedad de parmetros. Las condiciones de amplificacin del microsatlite utilizadas por nosotros fue de, 35 cambios repetidos de temperatura (ciclos) de las etapas de
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desnaturalizacin (94 C, durante 1 minuto), hibridacin (59 C, durante 1 minuto) y extensin (72 C, durante 1 minuto). Al final de estos ciclos, se produca una extensin de 72 C durante 10 minutos para asegurar que cualquier ADN de cadena simple restante quedar totalmente amplificado. En la figura siguiente se presenta el esquema demostrativo de lo que ocurre por cada ciclo de la PCR, cuando son colocados en el termociclador. (Figura 08)

Figura 08:

Esquema ilustrativo del 1 ciclo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa - PCR

17

Los fragmentos producidos por la amplificacin del microsatlite CG44 son separados, a travs de la electroforesis en gel de agarosa, por diferencia en el tamao de pares de bases. La variacin en el nmero de repeticiones crear diferentes alelos los cuales se distinguen entre s por la longitud total del fragmento, de manera que, todos los fragmentos de un mismo tamao representaran un alelo.

2.4. Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin RFLP

2.4.1.

La Endonucleasa de Restriccin

Despus de comprobar el resultado de la PCR, mediante la electroforesis, se coge una pequea muestra del producto para ser tratada con las enzimas de restriccin especficas, que va a producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Las enzimas, o endonucleasas de restriccin, reconocen la secuencia caracterstica de nucletidos dentro de la molcula de ADN, y cortan la cadena en una regin especfica, que es llamada diana de restriccin (Figura 09). Una diana de restriccin es la secuencia de ADN reconocida por la enzima, que es capaz de hidrolizar dicho polmero. Los fragmentos de restriccin se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, que van a proporcionar un patrn de bandas que es nico para el ADN en particular.

TGTACA ENZIMA ACATGT

T GTACA ACATG T

Figura 09:

Secuencia del ADN que ser reconocida (diana) y cortada por la enzima Bsp1407I

18

El nombre de cada enzima de restriccin est asignado segn el origen bacteriano de la misma. La endonucleasa utilizada en este trabajo para la caracterizacin de Crassostrea sp. es la enzima Bsp1407I que es producida por la bacteria Geobacillus stearothermophilus RFL 1407.

2.4.2.

Digestin por la Enzima de Restriccin

El procedimiento de la digestin es similar al de la PCR, desde un punto de vista prctico, pues consiste tambin en preparar una mezcla de reaccin con los reactivos especficos. Los reactivos son colocados en un eppendorf, donde luego van a ser puestos en un bao de temperatura, que mantendr el agua con temperatura constante a 37C. Las muestras se incubarn a esa temperatura durante aproximadamente dos horas, tiempo necesario para que ocurra el proceso de digestin (Figura 10). El clculo de la cantidad de la mezcla de reaccin utilizada para obtener un producto final de 20 l de la digestin fue: Buffer 1x (2 l); Enzima 10 U (1 l); 3 l del producto de la PCR y completamos lo dems con agua Milli Q.

Figura 10:

Eppendorf conteniendo la mezcla de la digestin, en bao de temperatura, Grant GD100

19

2.5. Gel de Agarosa

Para evaluar el funcionamiento de cada uno de los procesos descritos anteriormente, es necesario que se lleve a cabo la tcnica de electroforesis, que en este trabajo fue hecha en gel de agarosa. La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. El procedimiento es conocido como la fuerza electromotriz, que se emplea para desplazar las molculas a travs del gel. La preparacin del gel consiste en aadir una cierta cantidad del polvo de agarosa a un recipiente conteniendo tampn TBE 0,5X, que servir para mantener el pH adecuado. A continuacin hay que calentarlo para que se homogenice bien (sin cristales). Despus se deja enfriar un poco y se aade aproximadamente 1 l de Bromuro de Etidio (a partir de la concentracin inicial de 0,5mg/ml) por cada ml de gel, agitando suavemente y luego se vierte sobre el molde. El molde tendr una especie de peine que servir para formar los pocillos en el gel, donde se vertern los productos que sern analizados. (Figura 11)

Figura 11:

Molde utilizado para polimeralizar el gel de agarosa de 100ml

El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente usado comnmente como marcador de cidos nucleicos en laboratorios de biologa molecular, para
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procesos como la electroforesis en gel de agarosa. Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, que se intensifica hasta 20 veces despus de haberse unido a una cadena de ADN. Los fragmentos de ADN migrarn al polo positivo por tamao, los ms pequeos migrarn ms rpido que los ms grandes. La forma en que las bandas de ADN van a desplazarse por el gel, depender de la concentracin de agarosa utilizada para la formacin de los mismos. As que, hemos utilizado diferentes concentraciones para cada una de las pruebas, con la finalidad de obtener resultados ms precisos en la separacin de las bandas. Los valores utilizados por nosotros para polimeralizar el gel de agarosa, en cada proceso estn descritos en la Tabla 01.

Tabla 01:

Cantidad de agarosa en la formacin del gel, para cada proceso analizado

Tampn (ml)

ADN extrado (1%) 0,5 g 1g

Bromuro de PCR (1,5%) Digestin (2%) Etidio (0,5mg/ml) 0,75 g 1,5 g 1g 2g 45 l 90 l

50 100

2.6. Deteccin de los Productos Amplificados 2.6.1. Electroforesis

Para analizar las muestras, debemos cargarlas antes con un tampn que auxiliar en la lectura de las bandas. En cada pocillo del gel echbamos, 8 l de H2O Milli Q, 4 l de Tampn (Azul de Bromofenol 0,25%; Sacarosa 40%; EDTA - 50M) y 4 l de ADN o del producto amplificado. Para cargar el producto de la digestin que ya contena 20 l, solamente hemos aadido 4 l del Tampn de carga directamente al eppendorf.

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Las electroforesis eran conectadas a una fuente de corriente continua durante 90 minutos con una intensidad de 80V, (Figura 12) que permitir separar las molculas segn su movilidad en un campo elctrico. Estas muestras expuestas al campo, se movieron de modo que las bandas ms pequeas avanzaron ms y las ms grandes quedaron cerca del lugar de partida.

Figura 12:

Gel cargado y conectado, listo para iniciar la electroforesis

2.6.2.

Fotografiado del Gel

Finalizado tal proceso, el gel era retirado con precaucin y colocado en un transiluminador Biorad, que sirvi para tratar las imgenes mediante una fuente de luz UV. A travs de una cmara que est conectada al ordenador (Figura 13), utilizamos el programa especfico (Quality One Biorad) que tena la funcin de conservar digitalizadas las posiciones de las bandas en los geles.

22

Figura 13

Aparatos utilizados para la digitalizacin del producto en el gel

23

3.

RESULTADOS En este trabajo hemos utilizado las tcnicas de PCR RFLP para

amplificar el microsatlite CG44 (Magoulas et al., 1998) e identificar las diferencias genticas existentes entre C. angulata y C. gigas. Los resultados fueron obtenidos con xito, semejante a los sugeridos por Huvet et al., (2004), demostrando as la eficiencia y la gran importancia de la utilizacin de un marcador especfico cuando se estudia la genticas de las poblaciones como herramienta esencial para los estudios con especies de taxonoma dudosa. En la bsqueda de los hbridos tambin tuvimos resultados satisfactorios, encontrando individuos genticamente mezclados en casi todas las poblaciones, excepto los individuos que fueron comprados de la empresa acucola, que tenan la finalidad de servir como control para los puros C. gigas. Aunque la cantidad de individuos muestreados por poblacin (n=10) no sea suficiente para definir alguna de las regiones estudiadas como una zona de hbridos, esta frecuente incidencia de hbridos podra producir grandes problemas relacionados con la conservacin de los recursos genticos de C. angulata.

3.1. Obtencin mediante PCR RFLP del Microsatlite CG44 El ADN total fue extrado del tejido segn el protocolo descrito anteriormente. Su concentracin final fue comprobada en un gel de agarosa, para luego dar inicio al paso siguiente de la amplificacin. El microsatlite amplificado va a proporcionar secuencias repetidas conocidas en el ADN. Estas secuencias sern reconocidas por la endonucleasa de restriccin (Bsp1407I). La accin o no de esta enzima va a caracterizar si el individuo es C. angulata o C. gigas. Por eso la importancia del diseo de una secuencia Primers especfica para amplificar el microsatlite. De acuerdo con Huvet et al., (2004), el microsatlite CG44 fue el ms eficiente en el estudio entre esos taxones de ostras, debido a la diferencia entre el tamao medio de pares de bases (21pb). En su publicacin, que trataba de

24

evaluar los diferentes resultados de diversos marcadores, observ que en la amplificacin del CG44 haba un total de 46 alelos entre las especies de C. gigas y C. angulata. El alelo ms grande tena 266 pb y apareci en C. angulata, mientras que el ms pequeo mostraba 188 pb y apareci en C. gigas. La alineacin de ambas secuencias mostraba 11 sustituciones, 2 inserciones (de 21 y 43 pb) localizadas a ambos lados del la secuencia repetida del microsatlite, y una diferencia de 7 elementos repetidos (CA). Estos 2 inserciones y los 7 elementos repetidos adicionados estaban presentes en el alelo grande de 266 pb de C. angulata, y eran los responsables de los 78 pb diferentes entre los alelos secuenciados por Huvet et al.,(2004). La insercin de las 21 pb, nos permite estudiar las diferencias genticas, a travs del mtodo de PCR-RFLP (PCR para amplificacin con los Primers del microsatlite CG44 y de la digestin con la endonucleasa en la diana de restriccin). La secuencia obtenida en la amplificacin del microsatlite CG44 en ambas especies se muestra en la Figura 14.

Figura 14:

Secuencia del producto de amplificacin del microsatlite CG44 en C. gigas y C. angulata.

25

La secuencia de la parte superior pertenece a la especie caracterizada como C. gigas, y la de abajo a C. angulata, demostrando claramente la diferencia de tamao entre ellas, y donde se localiza exactamente en la cadena de ADN amplificada. En el rectngulo grande se marcan las repeticiones de dinucletidos (CA), y en el rectngulo rojo se muestra la adicin de 7 repeticiones en la secuencia de C. angulata. En la secuencia subrayada estn las 21 pb insertadas por el microsatlite, y en rojo se destaca justamente donde la enzima Bsp1407I cortar en la diana de restriccin. Los resultados obtenidos por nosotros mostraron que los individuos que posean la secuencia amplificada cortada por la enzima, formando dos bandas pequeas, una de aproximadamente 111 pb y la otra de 155 pb, seran caracterizadas como C. angulata. Las secuencias en las cuales la enzima no reconoca la diana, no eran cortadas, consecuentemente tendr una banda mayor formada por 188 pb, y son identificadas como de C. gigas. En la Figura 15, se muestra una foto en un gel grande (100ml) con 18 individuos de diferentes poblaciones, mostrando los productos de la amplificacin y la clara diferencia que se puede obtener en la cadena cuando son tratadas con la endonucleasa de restriccin.
Marcadores Peso Molecular

300pb

Figura 15:

(a) PCR de individuos muestreado en el medio natural (b) Digestin de los productos amplificados anteriormente
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3.2. Anlisis de la Hibridacin De acuerdo con los mtodos de PCR RFLP para la caracterizacin de estas ostras, las especies que presentaron la secuencia cortada fueron designadas como C. angulata, as como las que no son cortadas van ser denominadas como C. gigas. Siguiendo este raciocinio, las especies que presentaron caractersticas en las bandas que son tpicos de C. angulata y al mismo tiempo una de la C. gigas, van ser consideradas como individuos hbridos, ya que presentan en su ADN caractersticas genticas de los dos taxones. En la Figura 16, se puede observar claramente la diferencia entre los taxones y cmo se comportaron las bandas en el gel despus de la amplificacin y digestin. En el lado izquierdo est los productos de la PCR y en el lado derecho la digestin de los mismos.
Marcadores Peso Molecular

300pb

Figura 16:

Individuos amplificados y cortados con la enzima

El individuo 6 fue el nico de la foto que tuvo un patrn de bandas caracterstico de la especie C. angulata. En los individuos 8 y 9, no se observa ninguna seal de corte de la enzima, resultado obtenido solamente con los individuos que son caracterizados como C. gigas. Todos los dems individuos (1, 2, 3, 4, 5 y 7) presentaron el patrn propio de individuos hbridos, con bandas especficas de ambos taxones.

27

3.3. Determinacin de los Patrones en las Poblaciones Naturales Para averiguar la incidencia de hbridos, hemos recogido 10 individuos de cada poblacin, de las 6 regiones analizadas, para ser tratados por las tcnicas de PCR RFLP. Los patrones obtenido por nosotros por cada poblacin muestreada en este estudio estn descritos a continuacin, desde la poblacin ms occidental hacia la ms oriental. 3.3.1. Fuseta

Est situada en la regin ms occidental, entre las regiones muestreadas. La cantidad de hbridos encontrados en esta poblacin fue de 7 individuos, lo que representa un alto ndice de acuerdo con nuestros datos. En la Figura 17, se observa el patrn de bandas obtenido en los procesos de comprobacin del ADN, PCR y Digestin.

Figura 17:

Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Fuseta (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN.

3.3.2.

Punta del Moral

La cantidad de hbridos encontrada en esta regin fue considerada baja, fueron observados solamente 1 individuos con los patrones caractersticos de esta mezcla entre gametos. Adems, hemos analizado

28

solamente 8 individuos de esta poblacin pues tuvimos algunos atrasos en la reparticin de la enzima. En la Figura 18, vemos como se comportaron los individuos de esta poblacin mediante los 3 procesos.

Figura 18:

Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Punta del Moral (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN.

3.3.3.

Juan Carlos

La proporcin de individuos cortados por la enzima en esta poblacin tambin fue considerada con alto ndice. Hemos encontrado un total de 7 individuos de los 10 muestreados. En la Figura 19, observamos el comportamiento de las bandas en los 3 procesos utilizados en ese estudio de caracterizacin gentica.

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Figura 19:

Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Juan Carlos (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN.

3.3.4.

Sanlcar de Barrameda

De los 10 individuos analizados en esta poblacin, hemos encontrado 4 supuestos hbridos. El resultado de esta regin, aunque sea equivalente a menos de la mitad del total muestreado, entre las poblaciones que observamos las menores cantidad de hbridos, ella fue aquella que obtuve el mayor ndice. En la Figura 20, vemos el comportamiento de las bandas en los 3 procesos utilizados para alcanzar nuestros resultados.

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Figura 20:

Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Sanlcar (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN.

3.3.5.

Calavera

Esta poblacin est localizada en la desembocadura del rio Iro, situado en Chiclana. En la regin ms continental de este rio, se encuentra empresas acucolas dedicados a la produccin de C. gigas. En concreto se encuentran las instalaciones de la Empresa Amalthea S.L. que nos suministr los ejemplares de C. gigas utilizadas en este trabajo. De hecho, eso debera tornar esta regin como la ms propicia para esa mezcla, entre las poblaciones muestreadas. Sin embargo, en esta poblacin que hemos encontrado los menores ndices de hbridos, con solamente 2 individuo identificado de acuerdo con el patrn utilizado por nosotros. El comportamiento de las bandas encontradas por esa poblacin esta asignada en la Figura 21.

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Figura 21:

Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Calavera (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN.

3.3.6.

El Palmar

En esa poblacin se observa datos interesantes, cuando relacionamos al patrn en la distribucin de los hbridos encontrado por nosotros. Est situada al lado ms oriental de las regiones muestreadas, y mismo as tuve valores semejantes a las poblaciones que tuvieron mayores ndices. Fueron encontrados un total de 6 individuos considerados hbridos, en la Figura 22 se observa en patrn de las bandas en los 3 procesos aplicados.

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Figura 22:

Geles obtenidos en la caracterizacin de 2 individuos de Palmar (a y b) para el ADN total, el producto amplificado y de la digestin. A la izquierda de las calles demuestra el patrn de peso molecular y a la derecha cada uno de los ADN.

3.4. Anlisis de las Poblaciones Naturales Muestreadas De los 60 individuos que fueron recogidos en el ambiente natural, hemos analizados con xito 58 deles y encontramos un total de 27 hbridos, que equivalen a 46,55% del total. De acuerdo con la cantidad de hbridos distribuidos por las regiones de muestreo en nuestro trabajo, no se observ ningn patrn. Las poblaciones denominadas Fuseta (7), J. Carlos I (7) y El Palmar (6) fueron aqullas donde se encontr la mayor cantidad de hbridos. Por otro lado las poblaciones donde encontramos las menores incidencias de hibridacin fueron Sanlcar (4), Calavera (2) y Punta de Moral (1). (Figura 23)

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Figura 23:

Grfico de la proporcin de hbridos encontrados por poblacin (%)

Lo interesante en estos valores que obtuvimos es que, en las poblaciones que parecen ms hbridos por individuos muestreados (Fuseta, J. Carlos y El Palmar), se encuentran separadas unas de otras. Mientras que las poblaciones en que hemos encontrado menos hbridos se encuentran justo entre ellas. La cantidad total de hbridos encontrados por cada poblacin est descrita en la Tabla 2. Los individuos estn divididos de acuerdo con la accin de la enzima, as que, para aquellos que presentaron solamente un par de bandas cortadas (Cc) sern individuos puros de C. angulata y aquellas que no denotan ningn corte sern los puros de C. gigas (Sc). Consecuentemente, los individuos que presentan bandas sin cortes y con cortes en la misma secuencia sern denominados como hbridos (Sc/Cc). En la Tabla 02, se puede ver la proporcin de individuos por cada poblacin, caracterizadas genticamente por la accin de la enzima.

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Tabla 02:

Individuos por poblacin (%), de acuerdo con la caracterizacin obtenida por la PCR - RFLP

Poblacin (1) Fuseta (2) Punta de Moral (3) Juan Carlos I (4) Sanlcar (5) C. gigas (6) Calavera (7) El Palmar

N 10 8 10 10 7 10 10

Sc % 100 -

Cc % 30 87,5 30 70 80 40

Sc/Cc % 70 12,5 70 30 20 60

35

4.

DISCUSIN 4.1. Problemas con la Introduccin de Nuevas Especies

Con casi 70% de las especies convencionales de la pesca encontrndose sobreexplotadas, o cerca de la extincin (FAO, 2004), la acuicultura se presenta con un enorme potencial para sustituir la actividad pesquera convencional. Los cultivos de organismos acuticos disminuirn considerablemente la presin que la pesca ejerce sobre los recursos marinos, es el nico recurso, en la actualidad, capaz de mantener la demanda del mercado mundial sobre los productos originarios del medio acutico, adems pueden proporcionar una gran oferta de nuevos empleos. Es por eso que, en los ltimos aos la acuicultura obtuvo mayor crecimiento que cualquier otro sector de produccin de alimentos de origen animal. (Figura 24)

Figura 24:

Produccin mundial de alimentos de origen animal (%)

Fuente: Estadstica de Pesca FAO, 2004

No obstante, este rpido crecimiento ha provocado varios problemas que se vienen agravando cada da ms. En las ltimas dcadas, se estn realizando grandes esfuerzos por parte de los rganos competentes en todo el mundo, para evitar o causar el mnimo dao cuando se implanta un proyecto de acuicultura. Eso incluye desde las cosas ms sencillas, como la contaminacin

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visual, hasta problemas ms complejos como la posibilidad de extinguir especies autctonas. La gran mayora de los problemas relacionados con la contaminacin proveniente de la acuicultura, no influyen cuando se trata de cultivos de moluscos, porque son animales filtradores y las estructuras de los cultivos generalmente quedan por debajo de la columna del agua. Sin embargo, estn entre los principales responsables de uno de los problemas ms graves relacionados con la acuicultura, que es el control en la introduccin de animales exticos. La reciente expansin de los stocks de ostras cultivados en numerosas partes del mundo, podra conducir a una gran extensin de estos problemas. Como consecuencia del transporte extensivo de semillas de una regin a otra (Figura 25), es de esperar una alta homogeneidad en las poblaciones de C. gigas, que es con mucho la ostra ms importante comercializada en el mundo.

Figura 25:

Principales pases productores de Crassostrea gigas

Fuente: Estadstica de Pesca FAO, 2004

Adems de los pases que aparecen marcados en el mapa, la especie ha sido introducida tambin en otros como: Ecuador, Belice, Costa Rica, Puerto Rico, las Islas Virgen, Brasil, Israel, Filipinas, Malasia, Rumania, Ucrania,
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Seychelles, Fiji, la Polinesia Francesa, Guam, Palau, Samoa y Vanuatu. (FAO, 2004) Es necesario mencionar que la introduccin de la ostra japonesa en Francia despus de la crisis no ha causado daos graves en las poblaciones cercanas, y tampoco la extincin de alguna. Adems, con el desarrollo de las tecnologas acucolas y la produccin de individuos infrtiles triplides (3n) y tetraploides (4n) ya se han controlado los problemas relacionados con la mezcla de gametos entre poblaciones salvajes con las de cultivos y sobre todo las fecundaciones indeseadas. Sin embargo, la produccin de individuos infrtiles de C. gigas es una tcnica que fue desarrollada en las ltimas dcadas. As que las ostras que fueron tradas anteriormente a esto, estuvieron mezclndose durante aos. Considerando nuestros resultados, no hemos observado un patrn en la distribucin de los hbridos, puesto que las poblaciones en las cuales hemos encontrado ms hbridos, estn separadas unas de las otras. Aunque los datos no son suficientes para extraer conclusiones definitivas podemos sugerir que es de suma importancia conocer el origen de los gametos de C. gigas que estn fecundando los de C. angulata. Adems, esa importacin descontrolada podra haber extendido un nuevo virus que puede afectar gravemente la situacin de la C. angulata en Europa, en caso de que la enfermedad se propague por el Sur de Portugal y Espaa, ya que las informaciones sobre distribucin actual del virus en Europa son escasas. En una reintroduccin experimental en 1982, ejemplares de C. angulata llevados de Portugal a Francia, tuvieron una mortalidad del 100% entre 1983-1984. El resultado de los anlisis con microscopio electrnico revel nuevamente la presencia del iridovirus. Tambin fueron observados los mismos sntomas de la infeccin en ostras identificadas como C. gigas procedentes de Japn, Corea y Columbia Britnica (Bougrier, et al., 1986).

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4.2. Identificacin Gentica de las Especies

Hace mucho tiempo que se han realizados diversas investigaciones a varios niveles para responder a las preguntas relacionadas con la correcta clasificacin de estas dos especies del gnero Crassostrea. Las diferencias que existen entre C. angulata y C. gigas son suficientes para que sean clasificadas como dos especies distintas, o deberan ser tratadas como individuos del mismo taxn? Las metodologas aplicadas en los estudios de estos recursos, son suficientes para la clasificacin definitiva, o no estn englobando los temas necesarios para llegar a una adecuada conclusin sobre esa clasificacin? Lo que aparentemente parece ser algo sencillo, ha demostrado ser un rompecabezas muy complejo. Boudry, et al., (1998), mediante estudios de diferenciacin entre las poblaciones utilizando datos de aloenzimas, no demostraron diferencias heterocigticas o polimrficas significativas entre los dos taxones. El anlisis de estos factores, en las grandes reas ocupadas por las poblaciones de ostras, considerando la alta fecundidad y la dispersin de las larvas en largas distancias, explicara la observacin de pequeos niveles de diferenciacin gentica entre las poblaciones. Huvet et al., (2000a) encontraron fuertes diferencias entre las poblaciones de C. gigas y C. angulata, y ninguna fue genticamente significativa entre las poblaciones del mismo taxn. Ese fue el primer dato del estudio gentico de poblaciones de grupos de ostras, en el ambiente natural, utilizando microsatlites para discutir esas cuestiones filogenticas. Sin embargo, diversos estudios previos indicaran que ese tema est prximo a su conclusin (Aranishi et al., 2004; Boudry et al., 2003; Haure et al., 2003; Hubert et al., 2004; Kimberly et al., 2008; Li y Yu, 2007; Taris et al., 2005). Teniendo en cuenta los datos morfolgicos y fisiolgicos de las especies, la homogeneidad en las frecuencias allicas de aloenzimas entre poblaciones de ambos taxones y, la demostracin de la hibridacin entre ellas, ha conducido a que diversos autores afirmaran que ambas deberan ser reagrupadas como la misma especie.
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En estudios sobre la fertilizacin de hbridos, Huvet et al., (2002), consideraron estos resultados como una prueba ms de que ambas son la misma especie. Sin embargo, los resultados obtenidos por ellos, tampoco fueron suficientes para definir la clasificacin taxonmica entre C. gigas x C. angulata, pero cabe sealar que, esas diferencias existentes entre las poblaciones siguen reproducindose y en su mayora sobre condiciones aloptricas. Con eso nos dejan claro que para tomar una decisin definitiva sobre este tema, se necesitan estudios para localizar las zonas geogrficas donde ambos taxones estn en contacto, y documentar el nivel de la hibridacin natural en esas zonas (hybrid zone). El nmero de individuos muestreados por poblacin en nuestro trabajo (n=10), no permite determinar si aquella zona sera de hbridos, o si fueron solamente un mezcla casual de los gametos. Pero hay que considerar que, en las poblaciones que presentaron las mayores proporciones de hbridos tuvieron ndices considerablemente altos (70%). Las barreras reproductivas entre los dos taxones pueden actuar a dos niveles diferentes, el pre y post zigtico. La identificacin de los mecanismos que envuelven los mecanismos precigtica y sus caractersticas son tambin puntos claves para esos estudios de biologa evolucionara. En organismos marinos con fertilizacin externa, se han descrita solo unos pocos casos de aislamiento pre-zigotico (McCartney et al., 2000). Es el caso de los mejillones Mytilys edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus que son reconocidos como tres especies diferentes, por caractersticas genticas y morfolgicas diferentes, y persisten los tres en el medio silvestre a pesar del elevado flujo migratorio, lo que puede ser explicado por algn tipo de barrera reproductiva (Koehn, 1991). Para el estudio detallado de las barreras reproductivas, es fundamental conocer el origen e historia de la especie. De acuerdo a los estudios presentados sobre ese tema, ya se puede decir con certeza que la C. angulata presente en Europa tiene origen asitica, ms precisamente de Tailandia. (Gardner, 1997; OFoighil et al., 1998; Boudry et al., 1999; Mousseau et al., 1998; Normand et al., 2008)

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4.3. La utilizacin de las tcnicas moleculares para la diferenciacin gentica entre C. angulata x C. gigas

Entre las ostras, se han probado varios casos de identificacin equivocada, debido a su alta plasticidad morfolgica, a su amplia distribucin geogrfico y a las diversas introducciones en regiones que posiblemente ni siquiera fueron documentadas. Sin embargo, recientemente se han aplicado tcnicas moleculares para la discriminacin entre las ostras y para cuantificar la divergencia gentica dentro y entre las especies. Los marcadores moleculares de ADN, se han convertido en las herramientas esenciales para la identificacin de las especies marinas en la actualidad (Rebordinos y Cross, 2005). La mayora de los estudios genticos en poblaciones de Bivalvos marinos se han hecho usando como marcadores de las aloenzimas. Ms recientemente la utilizacin de los microsatlites como marcadores ha puesto en evidencia que son fundamentales para examinar la diferenciacin gentica entre C. angulata y C. gigas, porque detectan bajos niveles de variacin (Huvet et al., 2000a). La aplicacin de microsatlites, como marcador para los estudios genticos de las poblaciones de ostras, ha permitido evaluar con precisin la diferenciacin gentica entre la ostra Portuguesa y la ostra del Pacfico. Huvet et al., (2000b), describieron una diferenciacin significativa entre C. angulata y C. gigas utilizando microsatlites. De acuerdo con estudios recientes de Leito et al., (2007), hasta ahora no hay confirmacin citogentica de la hibridacin natural entre estos dos taxones. Adems hay una carencia de marcadores nucleares especficos para el diagnstico, ya que solamente existen los marcadores mitocondriales utilizados por Boudry et al., (1998), y el marcador nuclear utilizado por Huvet et al., (2004) para diferenciar ambos taxones.

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En

nuestro

trabajo

obtuvimos

resultados

satisfactorios

en

la

caracterizacin especfica de las especies, y principalmente sobre sus hbridos, mediante la amplificacin del microsatlite CG44 y el tratamiento con la endonucleasa de restriccin especfica. Se observaron diferencias en el tamao de los alelos entre Crassostrea angulata y Crassostrea gigas. (Figura 26)

Figura 26:

(d) PCR y Digestin de un individuo hbrido (e) PCR y Digestin de un individuo puro de C. angulata (f) PCR y Digestin de un individuo puro de C. gigas

El microsatlite CG44, mostr la insercin de las 21pb en los individuos denominados como C. angulata y estuvo ausente en las especies descrito como C. gigas. Muchos estudios han descrito los intentos de hibridacin interespecfica en ostras, particularmente en el gnero Crassostrea (Soletchnik et al., 2002; Haure et al., 2003; Leito et al., 2007). Gaffney y Allen (1993) ha indicado las dificultades que se pueden encontrar en este tipo de trabajo. Las ambigedades en la clasificacin de las ostras, la necesidad de evaluar la capacidad de los gametos y la necesidad de confirmacin de las condiciones hbridas de la descendencia son posibles utilizando marcadores genticos.
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Un factor muy importante para conocer los procesos de hibridacin, las zonas de hbridos y el nivel en que se encuentran, es entender detalladamente como ocurre el fenmeno, es decir, evaluar la hibridacin desde los rendimientos hacia las preferencias larvarias por la fecundacin. Para eso, es necesario el anlisis nuclear precoz por la competicin de los espermas, solamente as se puede evitar el efecto de la mortalidad diferencial en el perodo larval. Huvet et al., (2001) en experimentos analizando microsatlites con embriones de 6-horas-edad, examinaron la reproduccin aislada y los primeros pasos larvarios, buscando alguna confirmacin en la preferencia sobre la fertilizacin entre C. angulata y C. gigas. En sus resultados no fue demostrada ninguna evidencia en la preferencia por la fertilizacin entre los gametos del mismo taxn. Pero observaron una gran contribucin de los gametos masculinos de C. gigas con los femeninos de C. angulata, mientras que no hubo diferencias significativas entre el rendimiento obtenido con el cruzamiento con los gametos femeninos de C. gigas. Adems, los valores de hbridos obtenidos del cruzamiento con ovocitos de C. angulata fue incluso mayor de los valores esperados. Lo que puede sugerir una heterosis precoz o diferentes interacciones entre los gametos, que son concebibles por el desove libre de organismos marinos o ausencia de barrera reproductiva en esta etapa. En estudios de evaluacin del crecimiento, supervivencia y

reproduccin de C. gigas, C. angulata y sus hbridos a travs de cruzamientos entre ellos, se averigu que los patrones fueron muy similares para los progenitores de C.angulata y los hbridos producidos con los gametos maternos de C.angulata. Lo mismo pas con los resultados con los progenitores de C. gigas y de los hbridos generados con ovocitos de C. gigas. Lo que nos lleva a concluir que hay algn efecto maternal sobre las caractersticas que participan en la reproduccin, debido a la ausencia de barrera reproductiva entre los taxones (Soletchnik et al., 2002).

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4.4. La importancia en la preservacin de los recursos genticos

Teniendo en cuenta las diversas publicaciones sobre la hibridacin e incidencia en el ambiente salvaje, principalmente en el sudoeste europeo, hace que este tema sea todava ms importante y alarmante. El hecho es que, sin duda, la reciente importacin de C. gigas para la acuicultura en Europa ha creado esta zona de contacto. La evolucin de este contacto podra dar lugar a (i) la extincin de uno de los dos taxones, (ii) la mezcla de los dos genomas, o (iii) el fortalecimiento del pre apareamiento aislado y/o su especializacin. Segn datos de la FAO (2004), Portugal es el nico pas responsable para la produccin de la ostra C. angulata. Sin embargo, ya fue detectada la presencia de C. gigas en ambiente natural de 3 sitios a lo largo de la costa portuguesa, en Tavira, Rio Formosa y Barrinha (Faro) (Fabioux et al., 2002). Aunque la zona de hbridos puede proporcionar oportunidades nicas en los estudios de procesos evolutivos, principalmente sobre el aislamiento reproductivo entre las especies, esa produccin constante de hbridos podra poner en peligro las pocas poblaciones de C. angulata que todava estn presentes en el sudoeste europeo. Adicionalmente, el tema se torna ms alarmante cuando se tiene comprobada la produccin de hbridos viables (Leito et al., 2007). Cuando analizamos la localizacin de las regiones muestreadas, vemos que, las poblaciones con mayores ndices de hbridos estn muy separadas una de las otras. As que, s la introduccin de C. gigas en el sudoeste europeo fuera la responsable de poner ambos taxones en contacto, sera de esperarse que las regiones cercanas a las empresas, consecuentemente tendran los mayores ndices de hibridacin natural. Si seguimos con la misma lgica, entonces en la poblacin de Calavera deberamos haber encontrado las mayores cantidades de hbridos, puesto que se encuentra en la desembocadura del rio Iro Chiclana, que es justo donde actualmente estn las empresas acucolas (Amalthea S.L.) de la ostra del Pacfico (Figura 27), que fue incluso donde hemos comprado nuestras C. gigas para ser utilizados como control.
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Figura 27:

Localizacin geogrfica de la (5) Empresa acucola de C. gigas y, (6) regin muestreada de Calavera

Cuando nos acercamos a las poblaciones ms occidentales (Figura 03), vemos que la regin de Fuseta s tuvo una gran incidencia de hbridos (70%). Sin embargo, la regin adyacente a ella obtuvo solamente 20% de hbridos (P. Moral). Aunque la cantidad muestreada sea muy pequea para una conclusin definitiva, se podra sugerir la importancia de conocer los responsables de tal contacto y aadir a estos estudios una evaluacin de las corrientes martimas que actan en dicha regin. Solamente as ser posible identificar el origen y evitar los problemas generados por el contacto entre dos taxones. (Beaumount et al., 1993; Inou et al., 1997) Los estudios sobre hibridacin son complejos y problemticos, especialmente para las especies raras que entran en contacto con otras especies que son ms abundantes. Huvet et al., (2002) pusieron de manifiesto que en la naturaleza, la produccin de hbridos es menor, a pesar de que se observ una aparicin simptrica entre ambos taxones que la produccin de hbridos en laboratorio. Estudios realizados por Li y Hedgecock (1998), apoyan la hiptesis de una larga diferencia en el xito reproductivo de las ostras.
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Afirman que solamente una pequea parte de los adultos contribuyen a la reproduccin cuando son comparados con el tamao total de una poblacin. Adems de todos esos problemas relacionados con ese contacto, y teniendo en cuenta que, solamente una pequea porcin de los individuos van efectivamente a contribuir a la formacin de la prxima generacin, eso va a conducir a la prdida de los alelos no comunes y consecuentemente al decrecimiento de la heterocigosidad. Levantando as la cuestin sobre la necesidad emergente de preservar la especie considerada pura de C. angulata en Europa, ya que solamente se mantiene una pequea parte de su poblacin presente en el continente. La consecuencia mnima que eso pueda provocar es, la reduccin de la variabilidad en las poblaciones de C. angulata en Europa cuando se comparan con las poblaciones de origen, que en este caso provienen de Tailandia. Este fenmeno ya est ocurriendo con las poblaciones C. gigas cultivadas en Japn, que estn siendo afectadas por factores indeseados. (Leito et al., 2001; Li y Kijima, 2005;) En el estudio comparativo entre las poblaciones asiticas y europeas se sugiere que puede haber diferencias genticas basadas en las tasas de crecimiento entre estas regiones, lo que conduce a creer que los cultivos intensivos de ostras en Japn han dado lugar a numerosos intercambios de las poblaciones y que podra ser el responsable de la gran homogeneidad gentica observada en las poblaciones de C. gigas a lo largo de las costas japonesas. (Okimoto et al., 2008) La hibridacin en las poblaciones estudiadas por nosotros podra haber comenzado solo recientemente y probablemente, est limitada geogrficamente a la recin creada zona de hbridos. Pero si no se toman medidas de conservacin, esta situacin podra ser problemtica sobre todo porque C. angulata se est convirtiendo en una especie rara, y cada vez es ms difcil encontrar individuos puros de esa especie en el sudoeste europeo. Es de suma importancia la identificacin de los hbridos, no solo para el desarrollo de la acuicultura sostenible que tiende a guiar los esfuerzos hacia la

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domesticacin y determinacin de cruzamientos viables, sino tambin para una mejor comprensin de las cuestiones de diversidad biolgica. Si considerarnos los resultados comparativos entre los puros de C. gigas y C. angulata y sus hbridos obtenidos por Soletchnik et al., (2002), vemos que el resultado global de la produccin indic los mejores rendimientos con los individuos de C. gigas francs, despus de los hbridos obtenidos del cruzamiento con gametos femeninos de C. gigas con los masculinos de C. angulata. Paralelamente a eso, en publicaciones sobre fertilizacin de hbridos, se comprob que todos los intentos para producir individuos de la primera generacin (G1) de hbridos entre las dos especies tuvieron xito, lo que se atribuy a la estrecha similitud gentica entre ellas (Huvet et al., 2002). No obstante, con el avance de la tecnologa acucola, la hibridacin puede tornarse una herramienta habitual para la mejora de las capacidades productivas de las especies cultivadas en la acuicultura. A travs de cruces intra o interespecficos, se pueden buscar caracteres hereditarios, que de alguna forma podran resultar en un crecimiento en el rendimiento final del cultivo. Las posibles ventajas que se pueden obtener en la produccin de hbridos para fines acucolas son: aumentar la tasa de crecimiento, incrementar la transferencia de caractersticas de inters entre especies, combinar caractersticas de dos especies en un mismo grupo, reducir la reproduccin indeseada a travs de individuos infrtiles, y obtener una descendencia entera de un mismo sexo o aumentar las resistencias a las variaciones del medio. En estudios de comparacin de crecimiento, supervivencia y

reproduccin de C. gigas, C. angulata y sus hbridos fue posible conocer las adaptaciones de las especies nativas (Japn y Tailandia) y las introducidas (Francia y Espaa), y qued comprobado que el origen geogrfico paternal de los progenitores ha tenido influencia significativa en el crecimiento. Los progenitores tailandeses de C. angulata crecieron ms lento que los espaoles, del mismo modo que los progenitores de C. gigas de origen japonesas crecieron ms lentamente que las de origen francesa. Lo que sugiere la existencia de bases genticas diferentes entre las poblaciones, dentro de cada taxn (Rebordinos et al., 1999; Soletchnik et al., 2002;).

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As que sera de gran importancia, el desarrollo de ms estudios sobre la viabilidad y los rendimientos que se puede obtener con los hbridos de las especies estudiadas en este trabajo. Adems es necesario y urgente la necesidad de la elaboracin de programas de conservacin de estos recursos genticos y consecuentemente los programas de reproduccin. Aunque nuestros datos sean preliminares, pero se debe tener en cuenta que las mezclas continuarn con cada ciclo de la especie, y que puede llegar un punto en que se torne muy difcil, o casi imposible, revertir la situacin, ya que en nuestro estudio se demostr lo raro que es encontrar individuos puros de C. angulata, en ambiente natural.

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5.

CONCLUSIONES

1) La tcnica de PCR-RFLP mostr resultados satisfactorios para examinar diferencias genticas entre poblaciones de ostras portuguesas. Nuestros resultados apoyan la utilidad del microsatlite CG44 sugerido por Huvet et al., (2004) como la herramienta esencial descritas hasta el momento para diferenciacin gentica entre C. angulata x C. gigas. 2) De las 6 poblaciones muestreadas en este estudio, hemos analizado con xito 58 individuos, en los cuales encontramos 27 hbridos entre las especies C. gigas y C. angulata. La distribucin de hbridos no fue homognea entre las poblaciones, as haba poblaciones con gran cantidad de hbridos (20 hbridos en las poblaciones de Fuseta, Juan Carlos y El Palmar) y otra con bajos ndices (7 individuos entre los de Sanlcar, Calavera y Punta del Moral) 3) Aunque la cantidad de individuos muestreado sea estadsticamente insuficiente para representar una poblacin, los resultados del estudio muestran que se produce hibridacin natural en esas zonas geogrficas. No se observ ningn tipo de patrn aparente en la distribucin de los hbridos en las regiones analizadas, porque las poblaciones de mayores ndices se encontraban distantes geogrficamente una de las otras y mezcladas con poblaciones en los que los hbridos eran pocos frecuentes. 4) En vista de los resultados, y teniendo en cuenta la actual expansin de la acuicultura de C. gigas en Europa, se plantea la necesidad de preservacin de las poblaciones naturales de C. angulata, endmicas de esta regin. La situacin en la composicin gentica de estas poblaciones muestran que, probablemente, las actividades acucolas han creado zonas de contacto entre los dos taxones/especies. 5) Los resultados demuestran, una vez ms, que a pesar de la importancia de la acuicultura de ostras, los recursos genticos naturales de los que depende, son todava poco conocidos y que los conocimientos fundamentales sobre la taxonoma y sistemtica de las especies de inters

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deben ser establecidas para poder aplicar estrategias de gestin y/o conservacin de los mismos. 6) La alta frecuencia y amplia distribucin de los hbridos podra deberse a un aumento de su eficacia biolgica en comparacin con la de las dos especies parentales, C. angulata y C. gigas. Este resultado sera de gran inters para la industria ostrcola.

50

6.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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