Cultivos puros: son aquellos que contienen un solo tipo de microorganismo.

El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola clula (son clones).

Historia
El problema de separar una especie microbiana de las otras, de tal manera que pueda crecer en cultivo puro, fue solucionado en el laboratorio del famoso microbilogo alemn Roberto Koch (1843-1910). Koch, tal como lo hicieron otros bilogos, descubri que debera emplearse un medio slido en lugar del lquido si se deseaban obtener cultivos microbianos puros. Como ocurre frecuentemente en la ciencia, los descubrimientos de Koch y su grupo estaban basados en las observaciones de algn otro investigador. En 1872, Johann Samuel Schroeter not que las bacterias crecan sobre la superficie de materiales diversos, incluyendo la superficie de una papa cortada. Aqu las bacterias daban lugar a la formacin de una masa relativamente grande a la que despus se le denomin colonia.Cuando estas colonias individuales fueron examinadas al microscopio, se encontr que cada una de ellas estaba formada por cantidades enormes de bacterias; pero el asunto ms importante era que todos los organismos de una misma colonia pertenecan a la misma especie. Aparentemente, las clulas individuales haban cado del aire, tocando la superficie de la papa en un cierto lugar, multiplicndose ah hasta producir millones de individuos, con lo que las colonias se hacan visibles a simple vista. Todas las bacterias de una sola colonia habran derivado de una sola clula, y, por lo tanto, cada colonia constitua un cultivo puro.

Caractersticas de los cultivos puros

Las colonias deben ser iguales en forma, tamao y color. Que no existan formas inhibidas. Al microscopio deben tener un aspecto comn. Tiene que tener iguales propiedades tintoriales Deben ser bioqumicamente y fisiolgicamente iguales.. Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

Tcnica de la siembra
La tcnica para el aislamiento comienza preparando un inculo de siembra, que es la deposicin de una pequea porcin de la muestra en el medio o en los medios de cultivo

adecuado, en funcin de las especies microbianas que se espera encontrar. Por eso existen distintos mtodos o tipos de siembra, en funcin de la muestra de partida, del medio en el que se siembra y de la finalidad del estudio. Describiremos la siembra para inoculacin y la siembra para aislamiento. Siembra para inoculacin: La inoculacin consiste en tomar una pequea porcin de la muestra y diluirla para dispersarla y que crezca con ms facilidad en el medio de cultivo. Se puede inocular en medio lquido o en medio slido. Siembra para aislamiento: La finalidad de este tipo de siembras es la de obtener cultivos puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios de cultivo slidos. Existen varios tipos de siembras para aislamiento:Siembra en estra o zig-zag, siembra por estra mltiple, siembra de los cuatro cuadrantes, siembra de los tres giros.

Mtodos para obtener los cultivos puros:

Mtodo de siembra para aislamiento por agotamiento o en estra

Materiales

Placa petri con medio de cultivo Muestra (slida o lquida) Asa de siembra de platino

Con el asa estril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensin anterior en otra direccin. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensin en otra direccin. Esterilizamos y repetimos la operacin. Incubamos a 37 durante 24 horas y, en la primera zona, habr un amasijo de clulas. En la segunda, parte de la primera zona estar mejor extendida, y en la tercera y en la 4 mejor an. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro. Estra nica: Depositamos la muestra lo ms alejado de nosotros y realizamos la siembra en forma de zig-zag. De esta forma vamos descargando la muestra del asa. Es importante no volver a repasar el trozo de medio de cultivo que ya hemos sembrado. Para conseguir que al final de la estra tengamos colonias aisladas es importante que al principio hagamos la estra ms junta y que la cantidad de muestra tomada en el asa sea la adecuada.

Estra mltiple: En esta tcnica de aislamiento por agotamiento se realizan varias estras. Esto se puede llevar a cabo flameando el asa de paso en paso, es decir, de estra en estra, o sin flamear el asa. Adems, dependiendo de la forma en la que hagamos las estras, existen varios tipos de estriados: Estriado sobre cuatro cuadrantes: Se utiliza cuando queremos conservar algn microorganismo que nos interesa. Consiste en sembrar uno a uno los cuadrantes, sin flamear el asa entre estra y estra, de tal forma que en el cuarto cuadrante, al ir agotando la muestra del asa, tendremos los microorganismos aislados. Esterilizando asa entre siembra y siembra: Consiste en realizar un primer estriado en uno de los extremos de la placa, esterilizar el asa, girar un poco la placa y realizar otro estriado introduciendo el asa en el primer estriado para ir arrastrando la muestra y volver a repetir esta operacin con un tercer estriado: Sin esterilizar el asa entre siembra y siembra: Se lleva a cabo igual que en el caso anterior salvo en que en esta tcnica no se flamea el asa entre la realizacin de los estriados y por lo tanto no es necesario arrastrar la muestra de las primeras siembras.

Mtodo de siembra para aislamiento por diluciones sucesivas

Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas clulas que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodologa: Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 C durante 24 horas. En la primera dilucin habr un amasijo de colonias. En la siguiente habr diez veces menos nmero de colonias, y as sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas. Este mtodo nos permite calcular el nmero de microorganismos viables que existen en la muestra que estamos analizando: N=C 1/D 1/i donde:

N es el nmero de microorganismos presentes en la muestra C es el nmero de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias) D es la dilucin I es el inculo Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una contaminacin) y, si hay ms, no estn aisladas.

Tcnica del cultivo por enriquecimiento

Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar. Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias fotoauttrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoauttrofas. Ejemplo: Queremos aislar bacterias quimiolittrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoauttrofos. Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37, mientras que para incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45.

Conservacin de cultivos puros

Almacenamiento a temperaturas bajas. Ponemos las bacterias con glicerol al 20 - 50% a -70 y podemos mantenerlas as durante aos, dcadas... Liofilizacin: Es un mtodo ms eficaz. En un vial de liofilizacin ponemos leche desnatada y las bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilizacin. La liofilizacin es una evaporacin por condensacin. Se basa en el punto triple del agua; podemos pasar de slido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante dcadas.

Colecciones de cultivo: En todos los pases hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos puros o tipo. En Espaa existe la C.E.C.T (Coleccin espaola de cultivos tipo), que est en Valencia. La ms grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).

Mantenimiento

1. Debemos transferir peridicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua. 2. Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer ms tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer. 3. Se disminuye la temperatura, congelamos las clulas. Para proteger las clulas y que no se formen cristales que las daen se usa el glicerol 4. La liofilizacin es la sublimacin a alto vaco de las muestras congeladas con rapidez.

Fuente

Sasson, Albert. Las biotecnologas: desafos y promesas Investigaciones Biolgicas. La Habana.1984