Revista de Cincias Farmacuticas Bsica e Aplicada

Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciences

Rev Cinc Farm Bsica Apl.,2009;30(1):35-46 ISSN 1808-4532

Emulses O/A contendo Cetoconazol 2,0%: avaliao da estabilidade acelerada e estudos de liberao in vitro
Mendona, C.C.1; Silva, I.C.L.1; Rodrigues, K.A.1; Campos, M.A.L.1; Medeiros, M.C.M.1; Casteli, V.C.1; Ferrari, M.1, Musis, C.R.1; Machado, S.R.P1*
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Laboratrio de Desenvolvimento e Avaliao de Formas Farmacuticas e Cosmticas, Faculdade de Farmcia, Universidade de Cuiab, UNIC, Cuiab, MT, Brasil. Recebido 16/09/2008 / Aceito 18/05/2009

RESUMO Os objetivos do estudo foram desenvolver e avaliar a estabilidade fsico-qumica de emulses O/A contendo cetoconazol a 2,0% e determinar seu perfil de liberao in vitro. As formulaes foram preparadas com bases auto-emulsionveis com diferentes caractersticas qumicas. A estabilidade do sistema foi avaliada de acordo com o Guia para Realizao de Testes de Estabilidade em Produtos Farmacuticos, utilizando diferentes temperaturas (4C, 37C e 45C) por um perodo de tempo de trs meses. Os parmetros avaliados durante o ensaio foram: as caractersticas organolpticas,o pH, o comportamento reolgico e a concentrao do ativo. A emulso considerada estvel foi submetida ao ensaio de liberao in vitro utilizando clula de difuso de Franz. A quantificao do cetoconazol na formulao e na soluo receptora foi realizada por mtodo espectrofotomtrico no ultravioleta a 244 nm. Dentre as formulaes testadas, somente aquela preparada com lcool cetoestearlico e estearato de polietilenoglicol (PEG20) manteve suas caractersticas fsico-qumicas estveis durante o teste. O estudo de liberao in vitro demonstrou que o frmaco foi liberado do sistema gradualmente no decorrer do tempo, apresentando uma cintica pseudo zero ordem. Palavras-chave: Cetoconazol. Estabilidade acelerada. Emulso O/A. Liberao in vitro. INTRODUO As preparaes semi-slidas constituem uma significativa proporo das formas farmacutica presentes no mercado, pois servem como carreadores para frmacos que so liberados topicamente atravs da pele. Devido

Autor correspondente: Silvia Regina Pengo Machado - Faculdade de Farmcia - Universidade de Cuiab - Av. Beira Rio, 3100 - Jardim Europa - CEP. 78015-480 - Cuiab - MT - Brasil - Telefone (65)33631044 - e-mail:silviapengo@yahoo.com.br

a seu comportamento reolgico perculiar, estas formas podem aderir superfcie da pele por um perodo de tempo suficientemente longo, propiciando um prolongamento da liberao do frmaco no stio de aplicao. Alm disso, so facilmente aplicveis e versteis, pois proporcionam a liberao tpica de uma grande variedade de molculas de frmacos (Gupta & Garg, 2002). Entre estas formas farmacuticas, destacam-se as emulses, que so uma mistura termodinamicamente instvel de dois lquidos imiscveis, constitudos de uma fase dispersa insolvel na fase dispersante e um terceiro componente que o agente tensoativo, responsvel pela unio destas duas fases (Ansel et al., 2000). As emulses so muito utilizadas na rea farmacutica para os tratamentos tpicos, devido a sua capacidade de veiculao de princpios ativos hidrossolveis e/ou lipossolveis, de diminuio da irritabilidade drmica de certos frmacos e principalmente da boa aceitao por parte do paciente (Lachman et al., 2001). O cetoconazol um derivado imidazlico com amplo espectro de ao antifngica e alguma atividade antibacteriana, utilizado no tratamento de micoses sistmicas e tpicas (Rang et al., 2000) . As formas farmacuticas na fase de desenvolvimento devem passar por ensaios que visam obteno de informaes sobre sua estabilidade, ou seja, a definio do seu prazo de validade, perodo de utilizao em embalagem e condies de armazenamento especificadas. A estabilidade de produtos farmacuticos depende de fatores ambientais como a temperatura, a umidade e a luz, e outros relacionados ao prprio produto como as propriedades fsicas e qumicas dos princpios e excipientes farmacuticos, a forma farmacutica e sua composio, o processo de fabricao, o tipo e propriedades dos materiais de embalagem (Brasil, 2005). As variaes de temperatura so os principais parmetros utilizados para induzir rpidas alteraes qumicas e fsicas nas formulaes, que so avaliadas pela quantificao do princpio ativo e pelo comportamento reolgico do sistema estudado no decorrer dos ensaios de estabilidade (Guaratini et al., 2006).

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Entre os estudos de estabilidade propostos pela legislao vigente para produtos farmacuticos (Brasil, 2005), os estudos de estabilidade acelerada utilizando temperaturas extremas, o doseamento do ativo e a determinao dos parmetros reolgicos so os mais utilizados, pois possibilitam a caracterizao de uma formulao em perodos de tempo curtos (Di Mambro et al., 2003; Tadros., 2004). Estudos preliminares da estabilidade de emulses O/A contendo cetoconazol a 2,0 % j foram realizados. Foram preparadas oito formulaes, sendo que apenas trs destas apresentaram-se estveis (Casteli et al., 2007). Alm da estabilidade, durante a fase de desenvolvimento de produtos dermatolgicos adequado empregar os ensaios de liberao in vitro para selecionar excipientes para as formulaes que possam propiciar uma atividade teraputica satisfatria. Pode-se considerar que os estudos de liberao proporcionam dados interessantes sobre as particularidades estruturais do veculo e a capacidade deste em liberar os frmacos (Sato et al., 2007). Tendo em vista o exposto, o objetivo do trabalho foi a avaliao da estabilidade acelerada de emulses contendo cetoconazol 2,0% e a determinao do perfil de liberao destes sistemas in vitro. MATERIAL E MTODOS Instrumentao A gua utilizada foi proveniente do sistema de Osmose Reversa Mod. 10 LTH, GEHAKA. Todas as substncias foram pesadas nas Balanas Digitais Semianaltica e Analtica Mod. BG 2000, GEHAKA e Mod. FA 2104 N, BIOPRECISA. As emulses foram preparadas com auxlio dos Agitadores Mecnicos Mod. 713 D, FISATOM e Mod. RW 20 DZM, IKA. Os ensaios de estabilidade foram realizados nas Cmaras Climticas 420 CLD, NOVA TICA, e Refrigerador Mod. RDE 35, ELECTROLUX. Os parmetros avaliados durante estes ensaios foram realizados com auxlio do Medidor de pH Mod. PH 300, ALPAX, do Remetro Brookfield DV III Ultra remetro Mod. RV III, BROOKFIELD, do Espectrofotmetro FEMTO 800XI e do Banho de Ultra-som Mod. USC 1400, ULTRASONIC CLEANER, UNIQUE. Os ensaios de liberao foram realizados com o auxlio da Mesa Agitadora com aquecimento Mod. RT 10 IKA- WERKE e do Banho Ultratermostatizado, Mod. 521/1D- Nova tica. Para homogeneizao das solues preparadas, utilizou-se o Agitador para tubos tipo Vrtex Mod. Lab Dancer, IKA. Materiais As emulses foram formuladas com as seguintes matrias-primas classificadas conforme a Denominao Comum Brasileira (Brasil, 2006): cido esterico (Henrifarma Ltda, SP, Brasil), cetoconazol (98,9%) -

(Henrifarma Ltda, SP, Brasil), lcool ceto-estearlico e sulfato de sdio - Polawax NF (Croda, SP, Brasil), lcool ceto-estearlico e seu derivado etoxilado- Paramul J (Galena, SP, Brasil), 1,2 dibromo 2,4 dicianobuteno em 2 fenoxietanol - Merguard 1200 (Pharma Special, SP, Brasil), polmero de taurato de acriloil dimetil amnio VP; 4 - fosfato de trilauril; poli gliceril - 2 - sesquisosterato, leo de semente de flores de vero, tetra dibutil penta eritritil hidroxi hidrocinamato de glicerina-Hostacerin NCB (Pharma Special, SP, Brasil), leo mineral (Henrifarma Ltda, SP, Brasil), propilenoglicol, BHT, estearato de gliceril palmitato de Ascorbil, cido ctrico de sdio- Oxynex 20004 (Alpax, SP, Brasil), metabissulfito de sdio (Henrifarma Ltda, SP, Brasil), EDTA sdico (Henrifarma Ltda, SP, Brasil), propilenoglicol - (Galena Qumica e Farmacutica Ltda, SP, Brasil) e trietanolamina - (Henrifarma Ltda, SP, Brasil). Todos os outros reagentes possuam grau de pureza adequada. Mtodos Preparao das Emulses Foram preparadas emulses O/A que apresentaram uma frmula farmacutica bsica composta por:
Cetoconazol 2,0 % (p/p) EDTA Na 0,2 % (p/p) Merguard 1200 0,6 % (p/p) Metabissulfito de Sdio 0,2 % (p/p) leo Mineral 5,0 % (p/p) Oxynex 2004 0,2 % (p/p) Propilenoglicol 3,0% (p/p)

A Tabela 1 mostra a composio especfica de cada formulao. Tabela 1 - Composio das emulses O/A contendo Cetoconazol.
Formulaes 1 2 3 3,0 1,0 - - 8,0 - - - 10,0 - - 5,0 - - Componentes da Emulso (%) (p/p) cido Trietanolamina Hostacerin Paramul J Polawax esterico NCB NF

As emulses foram preparadas aquecendo as fases oleosa e aquosa a 75 oC e sob agitao constante verteu-se a fase aquosa sobre a oleosa, mantendo a agitao (1.000 rpm) por 30 minutos. Foram preparados trs lotes de cada formulao.

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Ensaios de estabilidade acelerada Aproximadamente 40 g de cada formulao foi acondicionada em frascos plticos de poliestireno com tampa (50 g) e submetidos a condies de temperatura variada (Wittern et al., 1985). Geladeira (4 2 C); Temperatura ambiente (37 2C) ; Estufa (45 C com umidade controlada a 75 %). As formulaes foram avaliadas a intervalos de tempo pr-determinados: 1, 15, 30, 60 e 90 dias. Os parmetros monitorados foram: Determinao do pH Em tubos de ensaio foram adicionados 1,0 g da emulso e 9,0 g de gua destilada (Ferrari, 2002). Com auxlio de vrtex as amostras foram homogeneizadas e a seguir o pH foi determinado, atravs do Medidor de pH pela insero do eletrodo. Determinao do comportamente reolgico A determinao da viscosidade e do comportamento reolgico das amostras foi realizada em um Remetro tipo cone e placa com interface a um Software Rheocalc 3.0, utilizando um spindle CP 52 e uma quantidade de amostras de 0,4 g, a 25C. As variveis contempladas neste estudo dependeram da formulao obtida. Para as formulaes 1 e 2, as medidas foram feitas em velocidades de rotao progressivamente crescentes (1-30 rpm com variao em intervalos de 3 em 3 rpm), para obter-se a curva ascendente, sendo o procedimento repetido no sentido inverso com velocidades progressivamente decrescentes (30-1 rpm), com mesmo intervalo de variao , de 3 em 3 rpm, para obteno da curva descente. Para a formulao 3, as medidas foram feitas em velocidade de rotao progressivamente crescentes (1-100 rpm com variao em intervalos de 10 em 10 rpm) para obter-se a curva ascendente, sendo o procedimento repetido no sentido inverso com velocidades progressivamente decrescentes (100-1 rpm), com mesmo intervalo de variao de 10 em 10 rpm para obteno da curva descente. Doseamento do frmaco Validao da metodologia analtica para quantificao do frmaco nas emulses O/A A validao da metodologia analtica foi realizada segundo os critrios propostos pela Resoluo da ANVISA RE n 899, de 29/5/2003 (Brasil, 2003). Os parmetros avaliados foram a linearidade, a preciso intermediria, a repetibilidade, a especificidade e a exatido. A linearidade e o intervalo foram determinados por meio da construo da curva analtica com uma soluo padro de 250 g/mL de cetoconazol em metanol. A partir desta soluo foram

realizadas diluies para obter solues do frmaco nas concentraes de 5, 10, 15, 20 e 25 g/mL. Estas amostras foram avaliadas empregando espectrofotmetro de UV no comprimento de onda de 244 nm. Preciso Para avaliar a preciso intra corrida ou repetibilidade, trs concentraes diferentes (5, 15 e 25 g/mL) foram quantificadas em triplicata, totalizando nove determinaes, sendo o resultado da anlise expresso em termos de coeficiente de variao (CV). A preciso intermediria foi avaliada por meio da comparao entre a quantificao de uma mesma concentrao (5, 15 e 25 g/mL) realizada em trs dias consecutivos, calculando-se posteriormente o CV obtido. Especificidade O ensaio de especificidade foi realizado atravs da anlise das formulaes sem princpio ativo (cetoconazol) em metanol. A quantidade de formulao contida nas solues foi equivalente a utilizada no ensaio de doseamento do ativo nos estudos de estabilidade. Estas solues foram avaliadas empregando espectrotmetro de UV no comprimento de onda de 244 nm. Exatido Para avaliar a exatido, trs concentraes diferentes (5, 15 e 25 g/mL) foram quantificadas em triplicata, totalizando nove determinaes. A exatido foi expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica correspondente. A preciso e exatido foram calculadas pelas frmulas: Preciso: % C.V. = (desvio padro/mdia) x 100 Exatido: % Bias = [concentrao mdia experimentalconcentrao terica/ concentrao terica] x 100 Determinao da quantificao de frmaco na emulso Pesou-se 0,5 g do creme contendo o frmaco e transferiu-se para o balo de 100 mL com auxlio da adio de 80 mL de metanol. O balo foi sonicado por 15 minutos, o volume total do mesmo foi completado com o mesmo solvente e homogeneizado. A seguir, o contedo foi filtrado, sendo que os primeiros 15 mL do filtrado foram desprezados. Coletou-se 5 mL do filtrado, transferiu-se para um balo de 25 mL e completou-se o volume com metanol. A amostra foi avaliada empregando-se espectrotmetro UV no comprimento de onda de 244 nm. Ensaios de Liberao in vitro Aps a seleo da formulao mais estvel, por meio do teste de estabilidade acelerada, a mesma foi submetida ao ensaio de liberao in vitro.

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Validao da metodologia analtica para quantificao do frmaco aps experimento de liberao in vitro Para a construo da curva analtica, utilizou-se uma soluo padro de 1 mg/mL de cetoconazol em tampo fosfato pH 7,4 /etanol (60:40). A partir desta soluo foram realizadas diluies para obter solues do frmaco nas concentraes de 10, 15, 20 , 25, 50 e 60 g/mL. Estas amostras foram avaliadas empregando espectrofotmetro de UV no comprimento de onda de 244 nm. Preciso e Exatido A preciso e exatido foram avaliadas conforme descrito anteriormente. Ensaio de liberao Teste de liberao do frmaco in vitro Foram utilizadas clulas de difuso vertical do tipo Franz, com rea de liberao de 1,13 cm2. Essas clulas so divididas em duas partes de forma que uma metade (compartimento doador) fica sobre a outra (compartimento receptor com volume de 9 mL) e entre elas a membrana. A parte inferior desta clula de difuso possui trs portas, sendo uma entrada e uma sada de lquido circulante aquecido para manter a temperatura do compartimento a 37 2 C (banho-maria termostatizado) e uma entrada que se comunica com o compartimento interno (compartimento receptor) para permitir a coleta manual da soluo receptora. A soluo receptora foi mantida a 37 2 C e agitada a 350 rpm durante todo perodo de experimento. A clula de difuso foi montada com membrana de acetato celulose com reteno para macromolculas acima de 12.0000 Daltons, (SIGMA-ALDRICH, EUA) separando o compartimento doador do receptor. A soluo tampo fosfato de sdio pH 7,4/etanol (60:40) foi colocada no compartimento receptor. Sobre as extremidades das clulas foram esticadas as membranas e o compartimento receptor foi fixado. A seguir, espalhouse uniformemente sobre a membrana 0,4 g da formulao contendo cetoconazol 2,0%. Um volume de 3 mL foi coletado da fase receptora a cada trs horas, seguido da reposio do mesmo volume com meio receptor limpo. As amostras coletadas foram quantificadas utilizando o comprimento de onda 244 nm. Para o clculo da quantidade liberada, consideraram-se as diluies que ocorreram aps a primeira coleta. Determinao da cintica de liberao do cetoconazol Foram avaliados trs modelos cinticos: (1) Zero - Ordem: quantidade liberada (g/cm2) /tempo (h); (2) Higuchi (pseudo zero ordem): quantidade liberada (g/ cm2) /tempo (h) e (3) Primeira-Ordem: Log. da quantidade liberada (g/cm2) /tempo (h).

Anlise Estatstica Os resultados dos testes de estabilidade acelerada foram submetidos aos testes de Tamhane para amostras heterogneas e de Tukey (Sokal & Rohlf, 1995) para as homogneas. As anlises estatsticas foram realizadas com programa SPSS 13.0 for Windows. Resultados Estudos de Estabilidade Acelerada Avaliao Macroscpica As formulaes desenvolvidas foram submetidas ao armazenamento em condies de temperatura e umidade especifica, 24 horas aps seu preparo e criteriosamente avaliadas antes e aps o ensaio de estabilidade acelerada. Os parmetros avaliados envolvem as alteraes fsicas e fsico-qumicas, tais como: o aspecto, a cor, o odor,o pH, o comportamento reolgico e o teor do ativo. A anlise macroscpica das formulaes 24 horas aps seu preparo das formulaes mostrou que todas se apresentavam visualmente estveis. As caractersticas organolpticas das formulaes inicialmente e posteriormente ao ensaio de estabilidade acelerada esto demonstradas na Tabela 2. Tabela 2 - Observao visual das caractersticas organolpticas das formulaes.
Formulao 1 Observao visual Inicial A emulso apresentouse homognea e de colorao branco brilhante. A emulso apresentouse homognea e de colorao amarelada brilhante. O gel-creme apresentou-se homogneo e de colorao branco brilhante. Final A emulso apresentouse homognea e de colorao branco opaco. A emulso apresentouse com consistncia fluida e de colorao rsea. O gel-creme apresentou-se com consistncia fluida e de colorao rsea.

Determinao do pH A Tabela 3 apresenta a variao do valor do pH frente s condies propostas no estudo. Os valores apresentados correspondem mdia dos valores de trs lotes de cada formulao, sob cada condio proposta. Valores calculados pelos valores originais (n=3) expressos pela mdia desvio padro, entre parnteses so apresentados os valores do coeficiente de variao em porcentagem.

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De acordo com a Tabela 3 somente a Formulao 1 mostrou-se estvel em relao ao valor de pH durante todo perodo do ensaio, com diferenas de valores de desvio dentro do limite de variao aceitvel 10%. Tabela 3 - Avaliao dos pH das formulaes durante o ensaio de estabilidade acelerada.
Tempo (dias) Temperatura Formulaes (C) 1 0 4 37 45 15 4 37 45 30 4 37 45 60 4 37 45 90 4 37 45 O= oxidou. 7,93 0,27 (3,4) 7,78 0,15 (1,9) 7,87 0,24 (3,1) 7,77 0,25 (3,2) 7,77 0,25 (3,2) 7,77 0,25 (3,2) 7,80 0,20 (2,6) 7,70 0,20 (2,6) 7,73 0,15 (1,9) 7,70 0,40 (5,2) 7,80 0,15 (1,9) 7,60 0,25 (3,3) 8,57 0,20 (2,3) 8,23 0,32 (3,9) 8,47 0,20 (2,4) 2 7,50 0,10 (1,3) 7,43 0,15 (2,0) 7,47 0,15 (2,0) 6,65 0,25 (3,7) 6,81 0,48 (7,0) 6,55 0,19 (2,9) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5,77 0,06 (1,0) 5,83 0,06 (1,0) 5,80 0,00 (0) 5,83 0,10 (1,7) 5,80 0,13 (2,2) 5,47 0,03 (0,5) 5,65 0,03 (0,5) 5,66 0,10 (1,8) 0 0 0 0 0

A anlise da quantidade de frmaco presente nas emulses no decorrer do ensaio de estabilidade acelerada foi realizada e os resultados correspondem formulao 1, pois esta foi nica que se apresentou estvel at o fim dos trs meses.
1,6 1,4

Log [cetoconazol] (ug/mL)

1,2 1 4C 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 37C 45C

Tempo (dias)

Figura 1. Quantificao do cetoconazol, expresso em log dos valores das concentraes de Cetoconazol pelo tempo, na formulao 1 durante o ensaio de estabilidade acelerada. As barras verticais indicam o desvio padro de 3 lotes da formulao em cada temperatura.
600

massa de cetoconazol liberado/rea (ug/cm2)

0 0

500 400 300 200 100 0 0 5 10 15 Tempo (horas) 20 25 30

Determinao da concentrao de cetoconazol

Tendo em vista que um dos objetivos do trabalho foi determinar a estabilidade qumica das formulaes e avaliar o perfil de liberao do frmaco in vitro, fez-se necessrio o desenvolvimento e a validao de uma metodologia analtica sensvel e reprodutvel para a realizao do doseamento do cetoconazol. O mtodo proposto foi baseado no trabalho de Kedor-Hackmann et al., (2006). A anlise estatstica dos dados por regresso linear indicou uma relao de linearidade entre as absorbncias (nm) e as concentraes do frmaco (g/mL), de acordo com a equao y = 0,0396x - 0,1002 e r = 0,9860. A especificidade um parmetro analtico essencial para confiabilidade do mtodo, os resultados mostraram que nenhum dos componentes da formulao ou mesmo o solvente (metanol), apresentou absorbncia no mesmo comprimento de onda do cetoconazol.

Figura 2. Massa de Cetoconazol acumulada na soluo receptora de clulas de Franz equipadas com membrana de acetato de celulose normalizada pela rea de contato em funo do tempo. As barras verticais indicam o desvio padro de 6 clulas. A fim de conseguir quantificar o frmaco diretamente na fase receptora durante os ensaios de liberao foi validada uma nova curva analtica. O mtodo analtico proposto mostrou-se linear, pois a anlise estatstica dos dados por regresso linear indicou uma relao de linearidade entre as absorbncias e as concentraes do frmaco, de acordo com a equao y = 0,0215x - 0,0135 e r = 0,9992. Em relao escolha do meio receptor adequado para utilizao no experimento de liberao in vitro, os resultados obtidos demonstram que a adio do etanol aumentou a dissoluo do cetoconazol em tampo fosfato pH 7,4 (13,07 g/mL para 870 g/mL), possibilitando a garantia das condies sink durante o teste de liberao do frmaco in vitro a partir da formulao desenvolvida.

Tabela 5 -Avaliao da preciso intra-corrida (repetibilidade) e inter-corridas (intermediria) e da exatido do mtodo analtico.
Concentrao (g/mL) 5 15 25 Repetibilidade Intermediria Exatido (%)* (%)* (%)* 1,0707 1,8303 0,8440 4,8435 1,2784 0,6678 2,2660 4,9046 1,3878

*valores correspondem ao coeficiente variao em porcentagem

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Tabela 6 - Avaliao da quantidade de cetoconazol durante o ensaio de estabilidade acelerada.

Tempo Temperatura (dias) (C) 0 4 37 45 15 4 37 45 30 4 37 45 60 4 37 45 90 4 37 45 Concentrao de Cetoconazol (g/mL) 19,90 0,012 19,89 0,017 20,06 0,083 18,81 0072 18,75 0,015 18,42 0,011 18,44 0,016 18,58 0,06 18,12 0,019 18,14 0,021 18,27 0,014 18,19 0,025 (%) 99,5 99,45 100,3

94,05 93,55 92,1 92,2 92,9 90,6 90,7 91,35 90,95 90,55 90,35 90,4

18,11 0,020 18,07 0,018 18,08 0,019

Valores calculados pelos valores originais (n = 3) expressos pela mdia desvio padro

Tabela 7 - Avaliao da preciso intra-corrida (repetibilidade) e inter-corridas (intermediria) e da exatido do mtodo analtico.
Concentrao (g/mL) 10 20 60 Repetibilidade (%)* 3,31 2,87 3,63 Intermediria (%)* 5,85 0,89 3,30 Exatido (%)*

1,6357 0,5038 2,5969

*valores correspondem ao coeficiente variao em porcentagem.

A Figura 2 apresenta o perfil de liberao do cetoconazol presente na formulao por meio das massas mdias de Cetoconazol encontradas em cada tempo de coleta de amostra da soluo receptora, normalizada pela rea de contato da clula. A Tabela 8 relaciona os parmetros cinticos de liberao in vitro do cetoconazol presente na formulao 1 por meio do modelo de cintica zero ordem, Higuchi (pseudo zero ordem e primeira ordem. Tabela 8 - Parmetros cinticos da curva de liberao in vitro do cetoconazol na formulao 1.
Modelo Cintico 0a ordem Higuchi 1 ordem
a

Parmetros J (g/cm2/min.) 0,428 2,939 0,028 r 0,991 0,999 0,935

Discusso Os sistemas emulsionados fluidos e semi-slidos so amplamente utilizados em produtos farmacuticos e cosmticos para a veiculao de frmacos e ativos

cosmticos para pele. No passado. este sistema era utilizado devido a sua simplicidade e elegncia como veculo para os frmacos, mas atualmente se sabe que as propriedades coloidais dos mesmos podem influenciar a biodisponibilidade dos ativos de vrias formas. Estas interaes entre o ativo/veculo e o veculo/pele conjuntas interferem na disponibilidade que o ativo atinge na superfcie da pele permanecendo ou penetrando atravs do estrato crneo (Eccleston, 1997). Assim, essencial que durante a formulao de uma forma farmacutica se avalie as caractersticas das matrias-primas, do frmaco e do processo produtivo, a fim de garantir a estabilidade fsica, qumica e microbiolgica. Os estudos de estabilidade acelerada so destinados a aumentar a velocidade de degradao qumica e modificao fsica de uma substncia ou alterar as caractersticas da forma farmacutica (ANFARMAG, 2006). Tambm conhecidos como estudos de estabilidade normal ou exploratria, tm como objetivo fornecer dados para prever a estabilidade do produto, o tempo de vida til e a compatibilidade da formulao com o material de acondicionamento (Brasil, 2005). Em relao s caractersticas fsico-qumicas do frmaco, o cetoconazol deve ser conservado em recipientes hermeticamente fechados e ao abrigo da luz, pois facilmente oxidvel e fotossensvel. Assim sendo, aconselhvel que toda formulao contendo este frmaco contenha um sistema antioxidante composto como o sulfito de sdio 0,2% ou o metabissulfito de sdio 0,2%. Alm disso, recomenda-se que o ativo seja conservado em temperatura ambiente (25C) e protegido de temperaturas superiores a 40C (Pharmapress, 2006). As bases auto-emulsionveis utilizadas apresentam caractersticas distintas. De acordo com a literatura tcnica, o Polawax NF uma cera auto-emulsionante no-inica que permanece estvel em ampla faixa de pH, 3 a 12, como tambm na presena de altas concentraes de eletrlitos (Croda, 2005). O Paramul J tambm uma base auto-emulsionante no-inica, porm com uma faixa de estabilidade em relao ao pH mais estreita, 5 a 7 (Galena, 2005). J o Hostacerin NCB uma base de carter aninico que permanece estvel com pH entre 4 e 9 (Pharmaspecial, 2005). Analisando em conjunto as caractersticas fsico-qumicas da base e do ativo nas formulaes e os resultados apresentados na Tabela 3, observou-se que embora as formulaes 2 e 3 apresentassem valores de pH dentro da faixa aceitvel para estabilidade das bases, ambas demonstraram indcios de perda de sua estabilidade no decorrer do ensaio. Este fato se deve s condies de temperatura e umidade extremas empregadas no teste. Isto possibilitou a degradao do cetoconazol nas formulaes mesmo com a presena do sistema antioxidante. Peparo (2001) apresentou resultados semelhantes em relao formulao mais estvel fsica e quimicamente para

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Tabela 4 - Comportamento reolgico das formulaes submetidas ao teste de estabilidade acelerada.

Avaliao do comportamento reolgico

A Tabela 4 apresenta o comportamento reolgico das formulaes durante o ensaio de estabilidade acelerada. Os valores apresentados correspondem mdia de trs lotes de cada formulao sob condies especficas.

Formulaes IF IC IF IC

3 IF

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0,42 0,04 0,47 0,04 0,51 0,07 3046,06 416,28 23387,5 354,26 0,31 0,02 2731,86 392,89 28757,5 108,19 0,39 0 780,86 18,24 777,99 25,87 3148,58 364,82 23194 134,35 0,35 0 779,64 33,97 10054 258,80 10027 296,98 10238 249,3 0,43 0,01 0,43 0,01 0,44 0,02 0,45 0,02 0,36 0 0,43 0,07 1723,12 56,225* 10026 569* 0,45 0,025 1933,69 26,64* 18958 3789,5* 0,36 0,04 1770,53 51,89* 15149,6 284,15* 0,39 0,03 769,95 0 782,84 18,24 677,68 29,46 10481,5 532,5 9108 492,14 10197,5 98,28 0,43 0,005 0,46 0,007 0,42 0 0,41 0,02 0,37 0,007 0,51 0,05 1508,14 46,77* 11963,5 427,05* 1928,18 70,15* 13557,5 275,06* 1640,43 46,77* 14980 2200,51* 0,37 0,03 0,42 0,02 0,41 0,09 O O O O O O O O O 0,43 0,03 0,41 0,05 0,4 0,03 1445,3 70,15* 1739,66 84,18* 1620,59 9,35* 14641,5 2,12* 16572 206,34* 23534,5 201,40* 0,37 0,01 0,37 0,021 0,27 99,87 O O O O O O O O O 0,43 0,007 0,39 0,01 0,47 0,16 O O O O O O O O O O O O O O O O O O

Tempo

Temper.

IC

(dias)

(C)

2924,87 149,81

15596,5 213,75

37

3125,43 60,81

17094 412,67

45

2751,7 0

12388,5 105,5

15

2014,17 32,75

16406,5 138,22

37

1964,55 159,03

20595 294,17

45

2146,45 70,71

16887 557,06

30

2162,99 74,83

15779 274,35

37

2116,69 46,77

18811 603,86

Estabilidade Liberao Emulses Cetoconazol

45

2348,20 130,96

13551 232,08

60

1991,01 18,70*

14426 255,72*

37

2010,85 9,35*

15827 256,55*

45

1812,41 112,25*

13927,5 188,61*

90

11828,96 116,93

13394,5 294,64*

37

1577,6 4,68*

14009 204,71*

45

1825,64 30,31*

12945,67 684,79*

= viscosidade mnima; IC= ndice de consistncia, IF= ndice de Fluxo e O= oxidou.

Valores calculados pelos valores originais (n=3) expressos pela mdia desvio padro. * p< 0,05

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Estabilidade Liberao Emulses Cetoconazol

veicular este frmaco (base auto-emulsionante e sistema antioxidante). Skiba et al., (2000), estudaram a estabilidade de formulaes aquosa contendo cetoconazol. Os resultados obtidos mostraram que as mesmas apresentaram uma maior estabilidade qumica quando armazenados a temperatura ambiente (25C) durante at seis meses em faixa de pH 5,0 a 9,0. Uma taxa de degradao alta foi constatada na formulao com pH 1,0. Este fato sugere que o cetoconazol susceptvel especificamente a catlises cidas. Paralelamente foi realizado um ensaio de estabilidade acelerada (25C e 50C) com uma formulao preparada com pH 7,0. Mesmo com neutralidade, houve uma perda de 5,0% e 15% do cetoconazol presente nas formulaes acondicionadas respectivamente na temperatura ambiente e na estufa 6 meses aps o incio do ensaio A reologia definida como a cincia que estuda o fluxo e a maneira como os materiais respondem aplicao de uma fora ou tenso (Tonzar, 2006). As caractersticas reolgicas so propriedades importantes a serem consideradas na fabricao, na estocagem e na aplicao de produtos de uso tpico (Leonardi & Campos, 2001). Em relao aos parmetros reolgicos avaliados, sabe-se que o ndice de consistncia (IC) est relacionado com a prpria viscosidade do produto, ou seja, com a resistncia ao fluxo, enquanto o ndice de fluxo (IF) est relacionado com o comportamento da curva, ou seja, indica o grau de pseudoplastia do material; quanto mais prximo de 1, menor a pseudoplastia (Leonardi et al., 2000). Outro parmetro importante a viscosidade aparente mnima que representa a viscosidade do produto a uma dada faixa de taxa de deformao () (Martin, 1993). Os valores de , IC e IF das formulaes 1 e 3 (Tabela 4), no apresentaram diferenas significativas (p< 0,05) at o primeiro ms de estudo. Porm, aps este perodo, a formulao 3 apresentou sinais fsicos de instabilidade (perda visvel de sua viscosidade) o que comprometeu a continuidade do estudo. Contrariamente, a formulao 1 apresentou-se visualmente estvel at final do estudo, mas foi observada uma diferena significativa (p<0,05) nos valores de , IC e IF para os perodos de 60 e 90 dias. Pela anlise do IF e pelos reogramas obtidos, podese verificar que todas as emulses estudadas apresentaram comportamento pseudoplstico e a presena de rea de histerese, ou seja, os materiais apresentaram tixotropia. Os produtos tixotrpicos tendem a ter maior vida de prateleira, pois durante o armazenamento estes apresentam viscosidade constante, o que dificulta a separao dos constituintes da formulao (Martin, 1993). Alm dessa vantagem, os produtos com essas caractersticas so de bastante interesse, pois as formulaes se deformam durante a aplicao, ou seja, tornam-se mais fludas facilitando o espalhamento e recuperando a viscosidade inicial no momento em que se encerra a aplicao, o que evita que o produto escorra (Gaspar & Maia Campos, 2003). Os estudos reolgico e a determinao da

concentrao de ativo nas formulaes representam uma completa, racional e necessria ferramenta para predizer o comportamento fsico das amostras durante tempo de prateleira determinado (Tadros et al., 2004). A validao de mtodos analticos um processo por meio do quais estudos estatsticos so utilizados para garantir que o mtodo proposto atenda s exigncias desejadas. Para validar preciso definir parmetros analticos, tais como linearidade, exatido, preciso e especificidade (Gil et al., 2007). A linearidade um dos mais importantes passos na anlise qumica e reflete a proporcionalidade entre a concentrao do analito e a resposta obtida (absorbncia) (Peng & Chiou, 1990). Para a construo da curva analtica necessrio usar um nmero suficiente (5 amostras) de solues padro em diferentes concentraes para definir adequadamente a relao entre a concentrao analito (g/ mL) e a resposta obtida (absorbncia). Cada concentrao preparada se adicionando um volume apropriado de soluo estoque soluo secundria, sendo que este volume deve ser sempre menor ou igual a 2 % do volume total da amostra (Bressolle et al., 1996). As solues preparadas para a construo da curva analtica tambm foram utilizadas para realizao dos experimentos de preciso e exatido. Com os resultados obtidos, realizou-se um grfico relacionando as concentraes das solues (g/mL) e as absorbncias obtidas (nm) e por meio da anlise de regresso linear, obteve-se a equao da reta e o respectivo r (coeficiente de correlao linear). Segundo critrio da RE 899/2003, o coeficiente de correlao (r) deve ser no mnimo igual a 0,99. O valor do coeficiente obtido experimentalmente para a validao do mtodo analtico para a quantificao do frmaco diretamente na formulao durante o ensaio de estabilidade acelerada foi menor que o indicado pela legislao. Isto pode ter ocorrido devido s caractersticas fsico-qumicas do cetoconazol (fotoinstabilidade e fcil oxidao) e tambm pela alta volatilidade do solvente utilizado para a preparao das solues (metanol). A especificidade depende de quanto o mtodo indiferente presena na amostra de espcies que poderiam interferir na determinao do analito (Leite, 1998). Portanto, a especificidade analisada para certificar que o mtodo utilizado no sofrer interferncia das formulaes ou substncias presentes na amostra. A preciso de um mtodo analtico corresponde medida de erro aleatrio entre as leituras efetuadas com a mesma amostra, e pode ser expressa como a porcentagem do coeficiente de variao (C.V. %) ou desvio padro relativo das medidas das replicatas. A exatido (E) uma medida de erro sistemtico ou Bias e definida como a relao entre o valor medido e o valor terico. De acordo com literatura tcnica, o Guia Para Validao de Mtodos Analticos e Bioanalticos (Brasil, 2003), os desvios mximos aceitveis em relao preciso de um mtodo analtico devem ser definidos de acordo com a metodologia empregada, a concentrao do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do

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mtodo, no se admitindo valores superiores a 5%. Embora no esteja especificado na legislao, os valores de desvios permitidos para exatido so os mesmos da preciso. Os resultados da validao (Tabelas 5 e 7) mostraram que os mtodos analticos propostos mostraram-se lineares, especficos, precisos e exatos. Segundo o Guia para Estabilidade de Produtos Farmacuticos, para fins de prazo de validade provisrio de 24 meses, ser aprovado o relatrio de estabilidade acelerada (6 meses) ou de longa durao (12 meses) que apresentar variao 5,0 % do valor declarado do princpio ativo. Caso as variaes de doseamento estejam entre 5,1 e 10 % no estudo acelerado, o prazo de validade provisrio ser reduzido para 12 meses (Brasil, 2005). Conforme resultados descritos na Tabela 6, estima-se que o prazo de validade para esta formulao seja de 12 meses, pois a perda de principio ativo durante os 3 meses do ensaio de estabilidade acelerado foi de 10 % A avaliao da velocidade de degradao de um medicamento possibilita estimar o seu prazo de validade. Entende-se por prazo de validade, o tempo durante o qual o produto poder ser utilizado e para medicamentos caracterizado pelo tempo durante o qual o frmaco perde no mximo 10% de sua integralidade. Os estudos de cintica de uma reao conferem aos estudos de estabilidade suporte fsico-qumico e matemtico, correlacionando o prazo de validade com a velocidade das reaes. As reaes qumicas podem ser classificadas quanto cintica degradao qumica em: a) Zero Ordem, b) Primeira Ordem e c) Segunda Ordem (Gil et al., 2007). O estudo da velocidade de degradao da qumica e do modo como influenciada por fatores como a concentrao do frmaco ou do reagente, o solvente empregado, as condies de temperatura e presso e a presena de outros reagentes qumicos na formulao denominada cintica de reao (Ansel et al., 2007). De acordo com a Figura 1, a degradao do cetoconazol nesta emulso seguiu uma cintica de reao de primeira ordem, o que comum para maioria dos frmacos submetidos a testes de estabilidade. Na cintica de primeira ordem, a perda do frmaco diretamente proporcional concentrao remanescente. Conseqentemente, a concentrao varia de modo exponencial com o tempo, de forma que a representao grfica do logaritmo da concentrao contra o tempo resulta em uma reta (Ortega & Netz, 2002). No desenvolvimento de uma forma farmacutica, os estudos do perfil de liberao in vitro servem para avaliar a quantidade de frmaco liberado em funo do tempo. Os testes in vitro constituem um controle qualitativo e quantitativo do sistema de liberao e fornecem informaes para estudos posteriores in vivo e ainda para os estudos clnicos. A realizao dos estudos in vitro importante, visto que reduz o nmero de amostras consideradas adequadas para a realizao dos testes in vivo (Amidon et al.,1995). Para a avaliao das formas farmacuticas

emulsionadas de uso dermatolgico, a literatura cientfica relata o uso estudos de liberao (membrana sinttica), permeao e reteno cutnea (membrana natural) in vitro, utilizando a clula de difuso ou de Franz (Franz, 1975, 1978). O sistema de difuso de Franz bastante utilizado devido ao seu baixo custo, boa reprodutibilidade dos resultados e realizao em pequeno espao de tempo, comparativamente a outras tcnicas (Leveque et al., 2003). Uma terapia efetiva nas enfermidades cutneas requer que o agente ativo seja liberado no stio de infeco, em concentraes adequadas para produzir o efeito farmacolgico. No caso de infeces superficiais da pele, onde o agente patognico reside sobre ou entre as camadas mais externas da pele, o produto teraputico deve ser liberado no estrato crneo em concentraes adequadas para inibir o crescimento do agente patognico (Pershing et al., 1994). Para produtos dermatolgicos, estes estudos so realizados de modo que o frmaco seja liberado da formulao onde est veiculado, e se difunda atravs de uma membrana que pode ser de origem artificial ou natural (humana ou animal) para uma soluo receptora (OECD, 2004). Nos estudos de liberao in vitro, os parmetros devem ser escolhidos com critrio, simulando as condies in vivo. necessria a escolha da membrana sinttica adequada, a manuteno da temperatura prxima fisiolgica (37C), a agitao constante do fluido receptor e a escolha do fluido receptor ideal, considerando-se o pH, a isotonicidade e as condies sink. Neste ensaio foi empregada uma membrana sinttica de acetato de celulose que recomendada pelo FDA (U.S. FDA/CDER, 1997), pois no reage com a formulao ou o meio receptor, permevel ao frmaco e no determinante da taxa de liberao (Shah et al., 1998). Na Figura 2, possvel observar que o perfil de liberao permaneceu linear com o tempo. importante ressaltar que o desvio padro entre as seis clulas de cada experimento foi adequado, indicando boa preciso do mtodo, ou seja, baixa variabilidade entre as rplicas dos ensaios de liberao. A taxa de liberao de um frmaco a partir de determinada formulao depende diretamente das caractersticas fsico-qumicas do veculo e do frmaco (Santoyo et al., 1996). A liberao do frmaco a partir do veculo que o contm prerrogativa para a penetrao na pele. O frmaco deve estar disponvel na superfcie da pele para que haja difuso atravs do estrato crneo. As principais caractersticas da formulao que iro governar essa etapa so a solubilidade do frmaco no veculo e a atividade termodinmica. Entretanto, uma vez disponvel para penetrao na superfcie da pele, a penetrao e a permeao iro depender da capacidade do frmaco de atravessar a camada crnea da pele, e de caractersticas como lipofilicidade e tamanho da molcula, alm de modulao da formulao por meio da adio de

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Estabilidade Liberao Emulses Cetoconazol

promotores de penetrao (Bemvindo, 2006). Outro fator importante para a velocidade de liberao a viscosidade da formulao, pois quanto maior for a viscosidade da preparao, maior a probabilidade de que esse frmaco seja liberado lentamente. De acordo com Tabela 8, a liberao in vitro do cetoconazol na formulao 1 segue o modelo cintico de Higuchi ou pseudo zero ordem, indicando que a liberao do frmaco a partir do sistema ocorre por mecanismo de difuso (Serra, 1998). O grfico de quantidade de frmaco acumulado no meio receptor em funo do tempo fornece o perfil de liberao e o fluxo de passagem do frmaco a partir da formulao para a soluo receptora representado pela inclinao da parte reta da curva (Shah et al., 1989). O tempo lag outro parmetro avaliado, pois determina o tempo necessrio para que o sistema entre em equilbrio e calculado por extrapolao da reta de regresso linear at o eixo do tempo (Zatz, 1993). Assim sendo, aplicando o tratamento matemtico de regresso linear no intervalo de tempo de coleta de trs a 12 horas (trs em trs horas) foi possvel determinar o fluxo (22,492 g/cm2 X h) e o tempo lag (duas horas). Entre as emulses desenvolvidas, somente a formulao 1 apresentou estabilidade fsica e qumica satisfatria durante os ensaios de estabilidade acelerada. O perfil de liberao in vitro foi adequado para sistema proposto, pois o frmaco foi liberado em concentraes e tempo pertinentes com o uso proposto. Uma prxima etapa do trabalho avaliar a reteno e permeao do sistema desenvolvido, utilizando membranas biolgicas provenientes de orelha de porco.

Tests, over 3 months at 3 different temperatures (4C, 37C and 45C). The characteristics assessed during the test were the organoleptic properties, pH, rheological behavior and drug concentration. The most stable emulsion was subjected to an in vitro release test in a Franz diffusion cell system. The ketoconazole in both the formulation and receptor phase was determined by UV spectrophotometry at 244 nm. The O/W emulsion prepared with cetearyl alcohol and polyethylene glycol (PEG20) stearate was the only one that maintained its physicochemical characteristics throughout the test. The in vitro release test demonstrated that the drug was released gradually, exhibiting pseudo zero-order kinetics. Keywords: Ketoconazole. Accelerated stability. O/W emulsions. In vitro release test. REFERNCIAS Amidon GL, Lennerns H, Vinod PS, Crison JR. A theoretical basic for a biopharmaceutical drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vitro bioavailability. Pharm Res. 1995; 12: 413-20. ANFARMAG - Associao Nacional dos Farmacuticos Magistrais. Encar te Tcnico Ed 61. Formas farmacuticas emulsionadas: sinais de instabilidade e ensaios de estabilidade acelerada. [citado 2006 Out 20]. Disponvel em: http://www.anfarmag.org.br. Ansel HC, Popovich NG, Allen Jr. LV. Farmacotcnica: formas farmacuticas e sistemas de liberao de frmacos. 6.ed. So Paulo: Editorial Premier; 2000. Ansel HC, Popovich NG, Allen Jr. LV. Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems. 8th ed Londres: Lippincott Willians & Wilkins; 2007. Bemvindo, CS. Estudo comparativo da liberao e penetrao cutnea de nitrato de miconazol de emulses tpicas. [Tese] Rio de Janeiro: Faculdade de Farmcia, UFRJ, 2006. Brasil. Resoluo n 1 de 29 de Julho de 2005. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, no uso de suas atribuies autoriza ad referendum, a publicao do Guia para a Realizao de Estudos de Estabilidade. Dirio Oficial da Unio, 01 ago. 2005. Seo 1, Suplemento 146, p1. Brasil. Resoluo RDC n 211 de 17 de novembro de 2006. Aprova as instrues para utilizao da lista das Denominaes Comuns Brasileiras e a lista das Denominaes Comuns Brasileiras -DCB 2004 para substncias farmacuticas. Dirio Oficial da Unio, 20 nov 2006. Seo 1, Suplemento 221, p1. Brasil. Resoluo RE n 899 de 29 de Maio de 2003. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, determina a

AGRADECIMENTOS A Fundao de Amparo Pesquisa do Mato Grosso (FAPEMAT) pelo apoio financeiro ao projeto e pelas bolsas de Iniciao Cientficas concedidas aos alunos. A Faculdade de Farmcia da Universidade de Cuiab pelo apoio financeiro. ABSTRACT O/W Emulsion Containing 2.0% Ketoconazole: Accelerated Stability Test and in vitro Release The goal of this work was to develop and assess the physicochemical stability of O/W emulsions containing 2.0% ketoconazole and to determine their in vitro release profile. These formulations were prepared with self-emulsifying bases that differed in their chemical characteristics. The stability of the system was assessed, as recommended in the Guide to Drug Product Stability

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