Biossensores: estrutura, funcionamento e aplicabilidade

Simone Saad Calil1 Paulo Roberto Queiroz da Silva2

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Farmacutica. Especialista em Toxicologia pela Universidade Federal de Gois. Aluna da Ps-Graduao em Farmcia e Qumica Forense, pela Universidade Catlica de Gois/Ifar. 2 Bilogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Braslia UnB. Professor do IFAR/PUC-GO. Endereo: IFAR Instituto de Estudos Farmacuticos. SHCGN 716 Bl B Lj 05 Brasilia DF CEP: 70770732. E-mail: pqsilva@uol.com.br

Resumo
Biossensores so pequenos dispositivos que utilizam componentes biolgicos como elementos de reconhecimento, ligados a um sistema de deteco, transduo e amplificao do sinal gerado na reao com o analito-alvo. Podem ser utilizados diversos elementos, sendo os principais, atualmente, aqueles baseados em aptmeros e nanomateriais, por sua alta especificidade e sensibilidade. Seu potencial de utilizao varia desde a deteco e tratamento de doenas ou a medio de componentes nos fluidos biolgicos, at o monitoramento ambiental e preveno de contaminao e bioterrorismo. O objetivo deste trabalho foi apresentar uma reviso de bibliografia descrevendo estrutura, funcionamento e aplicabilidade dos biossensores em vrias reas tecnolgicas. Para esta reviso, foram utilizados 63 artigos, uma dissertao de mestrado e 3 livros relacionados ao tema proposto. Apesar da grande quantidade de pesquisa sobre novas tcnicas e materiais, pouco se fala sobre a toxicidade desses compostos para a sade humana e para o meio ambiente, sendo necessrios mais estudos nesse sentido. Palavras-chave: Biossensor. Transdutor. Aptmero. Nanomateriais.

Biosensors: structure, function and applicability Abstract

Biosensors are small devices that use biological components as recognition elements, which are connected to a system that detect, transduct and amplify the generated signal from the reaction with the target analyte. Can be used several elements, but the main, currently, are those based on aptamers and nanomaterials because of their high specificity and sensitivity. Their potential use ranges from the detection and treatment of diseases or measuring components in biological fluids, to the monitoring and prevention of environmental contamination and bioterrorism. The aim of this study was to present a review of literature describing structure, function and applicability of biosensors in several technology areas. For this review, were used 63 articles, a master thesis and three books related to the proposed theme. In spite of the considerable amount of research about new techniques and materials, just a little is said about the toxicity of these compounds to the human health and the environment, and further studies in this direction are needed. Keywords: Biosensor. Transducer. Aptamer. Nanomaterials.

1 INTRODUO

Os biossensores so pequenos dispositivos que utilizam reaes biolgicas para deteco de analitos-alvo (WANG, 2000). Tais dispositivos combinam um componente biolgico, que interage com um substrato alvo, a um transdutor fsico, que converte os processos de biorreconhecimento em sinais mensurveis (WANG, 2000; PATHAK et al, 2007). Seu uso traz uma srie de vantagens, pois so altamente sensveis e seletivos, relativamente fceis em termos de desenvolvimento, alm de acessveis e prontos para uso. Entretanto, h certas limitaes, como interferncias eletroquimicamente ativas na amostra, pouca estabilidade a longo prazo e problemas de transferncia de eltrons (MEHRVAR; ABDI, 2004; SONG et al, 2006). Os biossensores podem ser de deteco direta (sensor de deteco direta ou sistema no reticulado), nos quais a interao biolgica medida diretamente, havendo uso de um ligante no-cataltico, como receptores celulares e anticorpos, ou de deteco indireta (sensor marcado ou sistema reticulado), em que h o uso de anticorpos fluorescentemente marcados ou elementos catalticos, como enzimas. O sistema reticulado tem uma maior estabilidade e mais simples para usar, mas o sistema no reticulado tem melhor sensibilidade, tempo de operao mais curto e custos mais baixos (MEHRVAR; ABDI, 2004; PATHAK et al, 2007; LIU et al, 2009). H dois tipos de biossensores, dependendo da natureza do evento de reconhecimento. Dispositivos de bioafinidade, que dependem da ligao seletiva do analito-alvo ao ligante preso superfcie (por exempo, anticorpo ou sonda oligonucleotdica) e dispositivos bioanalticos, nos quais uma enzima imobilizada usada para o reconhecimento do substrato-alvo (WANG, 2000). A partir dessas informaes, o objetivo desse trabalho foi apresentar uma reviso de bibliografia descrevendo estrutura, funcionamento e aplicabilidade dos biossensores em vrias reas tecnolgicas.

2 METODOLOGIA

Trata-se de uma reviso da literatura, sendo desenvolvida sob uma metodologia terica e conceitual, tendo como base livros especializados na rea, tais como, imunologia celular e molecular, entre outros, bem como o acesso a artigos publicados em peridicos indexados e disponibilizados em bases de dados como, por exemplo, SciELO, PubMed, MEDLINE e ScienceDirect. Foram priorizados os artigos publicados ao longo dos ltimos dez anos. Entretanto, artigos com data de publicao anterior e que foram julgados relevantes para a pesquisa tambm foram considerados para a construo do manuscrito.

3 ESTRUTURA DE UM BIOSSENSOR

Conforme apresentado na figura 1, os biossensores so construdos a partir de um componente que introduz a amostra, um sistema de reconhecimento molecular, um transdutor e uma unidade processadora de sinal (LEE et al, 2008).

Introduo da amostra

Sada do sinal

Analito-alvo

Unidade Elemento de Transdutor processadora reconhecimento (B) de sinal (C) (componente biolgico) (A)

Figura 1 - Configurao de um biossensor, mostrando a organizao dos seus componentes funcionais. A deteco do analito-alvo feita por um componente biolgico que gera um sinal (A), o qual convertido (B) e processado (C). Adaptado por Calil, 2011.

Os principais sistemas de introduo de amostra so os canais microfludicos e o sistema de anlise por injeo em fluxo (FIA flow injection analysis) (ROY; GUPTA, 2003; JOO et al, 2007; YANTASEE et al, 2007; MCBRIDE; COOPER, 2008). No sistema de reconhecimento est a parte que entra em contato com o analito de interesse e produz um sinal. Pode ser um receptor, enzima, anticorpo, cido nuclico,

aptmero, entre outros (PATHAK et al, 2007; CHAMBERS et al, 2008; LEE et al, 2008). Como esses reagentes j esto imobilizados no sistema, o sensor desempenha a tarefa de identificar a composio de espcies com o mnimo de interveno humana. As tcnicas mais comuns de imobilizao so adsoro fsica (interaes do tipo inica e polar e ligao de hidrognio), ligao cruzada (reticulao), ocluso ou aprisionamento, ligao covalente e covalente cruzada, encapsulamento e microencapsulamento. A estabilidade das tcnicas de imobilizao determina a sensibilidade e confiabilidade do sinal do biossensor, devido preservao dos stios ativos da molcula (MEHRVAR; ABDI, 2004; YANTASEE et al, 2007; EMBRAPA AGROINDSTRIA TROPICAL, 2008; MELO, 2008). O transdutor age como uma interface, medindo a mudana fsica ou qumica que ocorre na reao com o biorreceptor, transformando essa energia em um produto mensurvel, como massa, carga, calor ou luz. Podem ser de diversos tipos, tais como, eletroqumico, ptico, piezoeltrico e calorimtrico (MEHRVAR et al, 2000; PATHAK et al, 2007; LEE et al, 2008). A unidade processadora de sinal funciona como um detector que filtra, amplifica e analisa o sinal transduzido, tranferindo-o para um monitor ou armazenando-o em algum dispositivo (RAITERI et al, 2002; PATHAK et al, 2007).

4 COMPONENTES BIOLGICOS DOS BIOSSENSORES

Vrios componentes biolgicos apresentam-se como potenciais elementos a serem usados em sistemas de biossensores, entre eles: Enzimas. Elementos de reconhecimento baseados em enzimas catalticas so muito atraentes como biossensores devido variedade de produtos de reao mensurveis de um processo cataltico, que incluem prtons, eltrons, luz e calor. A enzima urease tem sido muito usada como um sensor para biorreconhecimento devido necessidade de determinao/monitoramento da uria tanto em aplicaes mdicas quanto ambientais (CHAMBERS et al, 2008). Os biossensores de bioluminescncia ou bioanalticos, por exemplo, so baseados na utilizao de certas enzimas com habilidade de emitir ftons como um subproduto de suas reaes. Tais biossensores possuem especificidade extremamente alta e podem distinguir clulas viveis de clulas no-viveis. Sua principal

limitao o tempo relativamente longo para anlise e a falta de sensibilidade (MEHRVAR; ABDI, 2004). Anticorpos. So produzidos pelas clulas B e so funcionalmente definidos pelo antgeno com o qual reagem. Assim, anticorpos gerais, com especificidade desconhecida (por exemplo, imunoglobulina srica IgM), so chamados de imunoglobulina at serem definidos pelo antgeno especfico (por exemplo, anti-sRBC IgM) (KLAASSEN, 2001). Todos os cinco tipos de imunoglobulina (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) so constitudas de cadeias pesadas (H) e leves (L) e regies ou domnios constantes (C) e variveis (V) (KLAASSEN, 2001). a regio V que determina a especificidade do anticorpo, pois a maioria das diferenas entre os anticorpos est em trs pequenas extenses (com aproximadamente dez aminocidos) de suas cadeias pesada (VH) e leve (VL). Essas pequenas extenses assumem estruturas em ala que, em conjunto, formam uma superfcie complementar estrutura tridimensional do antgeno ligado, sendo chamadas de segmentos hipervariveis ou regies determinantes de complementaridade (CDR). So ao todo seis alas na extremidade distal dos domnios V do receptor, sendo trs de cada domnio (VH e VL). possvel ver, por anlise cristalogrfica dos complexos antgeno/anticorpo, que os aminocidos da regio CDR formam mltiplos contatos com o antgeno (JANEWAY et al, 2007; ABBAS et al, 2008). O uso de anticorpos como elemento de reconhecimento se baseia na alta sensibilidade e especificidade das interaes antgeno/anticorpo. A maior vantagem dos chamados biossensores imunolgicos que no necessrio purificar a amostra antes da deteco (SONG et al, 2006; CHAMBERS et al, 2008). Receptores. So alvos naturais para uma grande variedade de drogas e toxinas. So protenas de natureza transmembrana e se ligam a molculas especficas chamadas ligantes, induzindo uma resposta celular especfica. A mudana conformacional no receptor induzido d lugar a eventos subsequentes, como a abertura do canal, gerao do segundo mensageiro adenil/guanil ciclase, e reaes em cascata envolvendo um grande nmero de outras protenas, incluindo as protenas G, tirosina quinases, fosfatases, fosforilases e fatores de transcrio. Seu uso em biossensores de grande interesse devido alta especificidade e afinidade pelo ligante (CHAMBERS et al, 2008). cidos Nuclicos e Aptmeros. O desempenho dos biossensores de DNA fortemente influenciado pelas propriedades fsicas do DNA, como, por exemplo, pureza e comprimento mdio da cadeia (RAVERA et al, 2007). A maioria dos biossensores de

DNA desenvolvida com base na imobilizao de uma sonda feita a partir de uma fita simples de DNA (ssDNA) na superfcie de um eletrodo marcada com um indicador eletroqumico que reconhece sua sequncia-alvo complementar (WANG, 2000; AHAMMAD et al, 2009). Recentemente, os aptmeros tm recebido grande ateno como componente de reconhecimento em biossensores (HAN et al, 2010). Os aptmeros so sequncias curtas de cidos nuclicos (ssDNA ou ssRNA) (HASEGAWA et al, 2008; CHIU; HUANG, 2009; HAN et al, 2010; HUA et al, 2010), que se ligam a vrias molculas-alvo com alta afinidade e especificidade (VESTERGAARD et al, 2007; HASEGAWA et al, 2008). So oligonucleotdeos lineares sintticos, geralmente com 15 a 40 nucleotdeos de extenso, submetidos a muitas interaes intramoleculares, as quais dobram a cadeia

oligonucleotdica (BELLUZO et al, 2008), fazendo-a adquirir uma conformao tridimensional bem definida e tornando-a capaz de se ligar ao seu alvo com alta afinidade e especificidade (ZHU et al, 2006; CHIU; HUANG, 2009). Tm sido usados na deteco de diversos ligantes, desde pequenos ons ou molculas at protenas e clulas (BELLUZO et al, 2008; CHIU; HUANG, 2009; HAN et al, 2010). Eles so produzidos sinteticamente e so comumente identificados in vitro a partir da vasta biblioteca de combinaes que compreende trilhes de diferentes sequncias, por um processo conhecido como evoluo sistemtica de ligantes por enriquecimento exponencial (Selex systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (CHIU; HUANG, 2009; MAEHASHI; MATSUMOTO, 2009; MAIRHOFER et al, 2009; HUA et al, 2010), que um processo repetitivo de ligao, separao e amplificao de cido nuclico (LOU et al, 2009), como demonstrado na figura 2. Primeiramente, uma extensa biblioteca de cidos nuclicos (mais de 105 sequncias aleatrias) incubada com as molculas-alvo para que haja a ligao destas com os nucleotdeos mais afins. As sequncias ligadas e no ligadas so separadas, sendo estas descartadas, enquanto as ligadas so dissociadas da molcula-alvo e submetidas a um processo chamado reao em cadeia da polimerase (PCR polymerase chain reaction) para amplificao. Ento o ciclo recomea (LIU et al, 2009). Normalmente, aps 5 a 15 ciclos do processo Selex, a biblioteca reduzida a um pequeno nmero de aptmeros, os quais apresentam uma afinidade particularmente alta por seu substrato (VESTERGAARD et al, 2007; CHIU; HUANG, 2009). A constante de dissociao (kd) aptmero/alvo comparvel constante anticorpo/antgeno, na ordem de picomolar a micromolar (CHIU; HUANG, 2009).

Nucleotdeos

Sequncias no ligadas

(A)

(B) Sequncias ligadas

(C)

PCR (D)

(E) Molculas-alvo Figura 2 - Descrio do processo Selex. Os nucleotdeos so incubados com as molculas-alvo (A), as sequncias ligadas so separadas das no ligadas (B) e so dissociadas da molcula-alvo (C). feita a amplificao por PCR (D) e o ciclo reiniciado (E). Adaptado por Calil, 2011.

Apesar

da

afinidade

aptmero/analito-alvo

ser

comparvel

afinidade

anticorpo/antgeno (VESTERGAARD et al, 2007), os aptmeros apresentam diversas vantagens que os tornam preferveis no desenvolvimento de biossensores (BELLUZO et al, 2008). Algumas dessas vantagens so: possuem estrutura mais simples (ZHU et al, 2006); so de fcil armazenamento (YAO et al, 2010); sua sntese fcil (LEE, 2008) e leva a estruturas altamente reprodutveis (VESTERGAARD et al, 2007), o que os torna mais baratos (MAEHASHI; MATSUMOTO, 2009); so mais estveis, por possurem maior resistncia desnaturao (LEE, 2008; CHIU; HUANG, 2009); possuem afinidade e especificidade por ligantes que no so reconhecidos por anticorpos, como ons ou pequenas molculas (HAN et al, 2010); so quimicamente modificados com maior facilidade (ZHU et al, 2006); e a funo de aptmeros imobilizados regenerada mais facilmente (YAO et al, 2010).

5 TRANSDUTORES

Vrias tambm so as opes de transdutores a serem acoplados aos componentes biolgicos dos biossensores, entre eles: Eletroqumicos Movimento de ons e difuso de espcies eletroativas (EMBRAPA AGROINDSTRIA TROPICAL, 2008). So os biossensores mais comumente utilizados nos testes de monitoramento e diagnstico em anlises clnicas (MEHRVAR; ABDI, 2004; GAUA et al, 2005). Suas principais vantagens so baixo custo, alta sensibilidade, screening rpido e estabilidade (SONG et al, 2006). Podem ser amperomtricos, potenciomtricos ou condutimtricos (MEHRVAR; ABDI, 2004).

Amperomtricos. Baseados na medida da corrente resultante da oxidao ou reduo eletroqumica de uma espcie eletroativa, momento em que ocorre a transferncia de eltrons do analito para o eletrodo ou vice-versa. A direo do fluxo de eltrons depende das propriedades do analito e pode ser controlada pela aplicao de um potencial eltrico no eletrodo. Uma clula amperomtrica pode conter dois ou trs eletrodos (THVENOT et al, 2001; WANGet al, 2008). Potenciomtricos. Baseados na determinao da diferena de potencial entre o eletrodo indicador e o de referncia ou dois eletrodos de referncia separados por uma membrana seletiva permevel, em que no h fluxo de corrente significativa entre eles (THVENOT et al, 2001). Condutimtricos. Baseados na medio de mudanas na condutncia, devido ao uso de enzimas que, ao catalisar reaes, produzem ou consomem espcies inicas, alterando a quantidade de portadores de carga mvel no eletrlito. A condutividade a funo linear da concentrao inica, porm, no especfica para um dado tipo inico (MELO, 2008; WANG et al, 2008). pticos Fibra ptica, guia de onda planar, ressonncia de superfcie de plasma (SPR surface plasmon resonance) (THVENOT et al, 2001). So particularmente atraentes para aplicao em sistemas de deteco direta. So baseados na medio da luz observada ou emitida como um resultado de uma reao qumica ou biolgica. Em tais biossensores, fibras pticas so usadas para guiar as ondas de luz a detectores adequados, como um eletrodo ou semicondutor (MEHRVAR; ABDI, 2004). Piezoeltricos Alterao de massa ou microviscosidade, onda de cisalhamento e superfcie acstica (THVENOT et al, 2001; EMBRAPA AGROINDSTRIA TROPICAL, 2008). Baseados no princpio de revestir a superfcie do biossensor com uma substncia biologicamente ativa que se liga seletivamente. A superfcie revestida colocada em uma soluo contendo analitos, os quais se ligam substncia ligante. Ento, a massa do cristal aumenta enquanto a frequncia de ressonncia das oscilaes diminui proporcionalmente (MEHRVAR; ABDI, 2004). Cristais de quartzo tm sido muito utilizados em sistemas piezoeltricos, pois sua frequncia pode oscilar na faixa de megahertz (106 ciclos/segundo) de maneira proporcional massa do cristal, alm de serem muito sensveis s variaes de massa. Essa alta sensibilidade levou criao de um sensor denominado microbalano de cristal de quartzo (QCMB), que capaz de detectar as

variaes de nanogramas que ocorrem em sua massa quando o alvo se liga ao sensor (WANG et al, 2011). Calorimtricos Tambm chamados de termstor (THVENOT et al, 2001). Detectam substratos baseados no calor envolvido nas reaes bioqumicas do analito com uma substncia biolgica ativa adequada, como uma enzima. A forma mais utilizada acopla as substncias diretamente ao termstor, que detecta o calor envolvido na reao bioqumica. A maior parte do calor em reaes enzimticas perdida para o meio sem ser detectada. A perda do calor diminui a sensibilidade dos biossensores calorimtricos (MEHRVAR; ABDI, 2004).

6 NANOTECNOLOGIA

Anlises em nanoescala tm sido desenvolvidas para estudar interaes em nvel celular e molecular em tempo real, fornecendo biossensores com sensibilidade muito alta quando comparados aos mtodos convencionais (KOHLES et al, 2011). Vrios tipos de dispositivos baseados nos princpios da nanotecnologia tm sido incorporados aos biodispositivos para aumentar a relao sinal/rudo, reduzir o tempo de resposta, aumentar a estabilidade e a sensibilidade, e obter um limite de deteco em concentraes entre nanomolar e picomolar (CHOI et al, 2007; PERIASAMY et al, 2009). Nanopartculas, nanofios e nanotubos tm sido largamente aplicados em biodispositivos como nanomatrizes, nanobiossensores e sistemas microanalticos (lab on a chip) (CHOI et al, 2007; WANG et al, 2009). Nanobiossensores so nanosensores usados para a deteco de materiais qumicos ou biolgicos. Esses sensores podem ser eletronicamente acoplados para responder ligao de uma nica molcula. Prottipos demonstraram deteco de cidos nuclicos, protenas e ons. Esses sensores podem operar em fase gasosa ou lquida e utilizam regimes de medio de baixa tenso, alm de detectar ligantes diretamente, no havendo necessidade de marcadores caros e complicados, corantes fluorescentes e nem caros e grandes sistemas de deteco ptica. Isso faz com que esses sensores sejam baratos e portteis, podendo ser aplicados em diversas situaes para deteco e monitoramento (JAIN, 2007).

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Os nanossensores incluem sensores com nanoporo nico, sensores com sondas encapsuladas por incorporao biologicamente localizada (Pebble probes encapsulated by biologically localized embedding), sensores SPR, sensores mecnicos usando nanocantilever, transstores de efeito de campo (FET field-effect transistors) com nanofios de silcio ou carbono e sensores com nanoeletrodos eletroqumicos (CHOI et al, 2007).

6.1

Nanomateriais Nanomateriais podem ser preparados utilizando-se diversos compostos, como

metais, polmeros, carbono e componentes biolgicos (DRBOHLAVOVA et al, 2009). So classificados como metlicos, semicondutores, magnticos e baseados em carbono (WANG et al, 2009). Nanopartculas Metlicas ouro (Au) e prata (Ag) propriedade intrnseca: SPR. So partculas metlicas quase esfricas, que exibem interessante propriedade ptica. As ondas de luz que incidem nas nanopartculas metlicas podem produzir uma oscilao coletiva dos eltrons condutores em seu ncleo. Isso ocorre por meio do acoplamento de luz em uma forma ressonante para os eltrons livres no metal. Essas oscilaes so chamadas superfcie de plasma e so dependentes do tamanho e forma da nanopartcula, da constante dieltrica do meio e da distncia entre as partculas. Nanopartculas de ouro esto entre as mais estudadas e utilizadas, devido sua fcil preparao, estabilidade, funcionalizao qumica da superfcie bem estabelecida e propriedades ptico-eletrnicas nicas (WALKEY et al, 2009; WANG et al, 2009). Semicondutores Chamados quantum dots, geralmente compostos por ZnS ou CdSe propriedade intrnseca: fluorescncia e luminescncia. Os quantum dots (QD) ou, pontos qunticos, so cristais de tamanho nanomtrico com, em mdia, 2 a 20 nm. Nessas dimenses, esses nanocristais so considerados eletronicamente zero-dimensionais e exibem um confinamento quntico nas trs dimenses. So geralmente compostos de alguns milhes de tomos, mas apenas um pequeno nmero de eltrons ( 100) livre (DRBOHLAVOVA et al, 2009; WALKEY et al, 2009; WANG et al, 2009). As vantagens dos QD sobre os corantes fluorescentes so diversas, incluindo um amplo espectro de absoro com um limite de emisso muito estreito, um alto rendimento quntico e uma resistncia fotodegradao e degradao ptica ou qumica (ERICKSON et al, 2008).

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Magnticos

Exemplo:

Fe3O4

propriedade

intrnseca:

magnetismo.

Nanopartculas magnticas, como as de xidos de ferro, possuem uma habilidade nica de se moverem simplesmente pela influncia de um campo magntico externo. Alm de magnticas, so no porosas e muito estveis (WANG et al, 2009). As chamadas nanopartculas superparamagnticas de xido de ferro (SPIO) contm um ou vrios ncleos de xido de ferro superparamagntico (magnetitas) suspensos em uma matriz no magntica. Esses ncleos consistem em um gro nico ou um conjunto de gros superparamagnticos, os quais so magnetizados na presena de um campo magntico, alinhando seus plos na direo do campo externo. Quando o campo removido, os momentos magnticos randomizam, de modo que a magnetizao lquida do conjunto retorna a zero. Esse processo chamado relaxao e resulta das relaxaes Browniana e de Nel (ARRUDA et al, 2009; DEMAS; LOWERY, 2011). Baseados em carbono Exemplo: fulereno e nanotubos de carbono (CNT) propriedade intrnseca: condutividade e propriedades eletrnicas e mecnicas. Nanotubos de carbono so uma rede hexagonal de tomos de carbono, que podem ser vistos como uma ou mais camadas de folhas enroladas em um cilndro com dimetro em uma escala nanomtrica. Seu comprimento varia de alguns micrmetros at centmetros, e pode ser de parede simples (SWCNT), de parede dupla (DWCNT) ou de parede mltipla (MWCNT). Suas propriedades permitem que ele interaja com alguns compostos orgnicos aromticos, podendo ser usado na concepo de nanodispositivos com a ajuda de adsoro nocovalente de enzimas e protenas nas paredes laterais dos CNT, o que resulta em estruturas contendo unidades qumicas e bioqumicas (LU et al, 2006; YOGESWARAN et al, 2008; WANG et al, 2009). Os biossensores baseados em CNT podem ser de primeira gerao (baseados na deteco de H2O2 ou O2 envolvidos em reaes enzimticas), de segunda gerao (por meio da utilizao de um mediador de transferncia de eltrons) ou de terceira gerao (baseado na transferncia direta de eltrons de enzimas ou protenas) (GONG et al, 2005).

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7 USOS/APLICAES

7.1

Deteco de microorganismos e toxinas bioterrorismo e biossegurana Na rea de biodefesa, os agentes biolgicos so considerados mais difceis de serem

detectados e combatidos do que os agentes qumicos. O interesse no desenvolvimento de novos biossensores tem sido largamente direcionado pelos recentes avanos relacionados necessidade de se detectar e identificar rapidamente ameaas patognicas (ERICKSON et al, 2008; LUI et al, 2009). Um srio problema o risco de passageiros internacionais transportarem doenas infecciosas. Uma ferramenta para atenuar os riscos seria a deteco desses patgenos ainda dentro da aeronave, antes do desembarque de passageiros e tripulao. Um biossensor apropriado para uso em aeronaves comerciais precisa ter alta probabilidade de deteco e baixa probabilidade de falsos alarmes, ser capaz de detectar patgenos rapidamente e em concentraes no letais, ser relativamente barato para ser produzido em larga escala e ser compacto e leve (HWANG et al, 2011). Outro aspecto importante na biossegurana a deteco de patgenos e toxinas em amostras de alimentos, amostras clnicas e ambientais. Utilizando uma clula potenciomtrica baseada em um chip de silcio, com grnulos paramagnticos como portadores slidos de sondas de DNA, Gabig-Ciminska et al (2004) detectaram clulas vegetativas e esporos de estirpes de Bacillus, com base em seus genes codificadores de toxinas, em amostras no purificadas de esporos e lisados celulares. Banerjee et al, em 2008, demonstraram ser possvel a avaliao da citotoxicidade de microrganismos patognicos, no caso Listeria e Bacillus, e suas toxinas, com a utilizao de um hibridoma de clulas B de mamferos imobilizado em uma matriz de colgeno. Os autores indicam haver um grande potencial na utilizao de sensores baseados em clulas na deteco de patgenos e toxinas, segurana alimentar e toxicantes qumicos. Tambm em 2008, Stratis-Cullum et al desenvolveram um imunossensor com sistema de deteco por quimioluminescncia, que utilizou um teste como o ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) para amplificao do sinal, e que teve como alvo os esporos do Bacillus glogibii, uma espcie substituta do Bacillus anthracis. Em um teste de ELISA, imobiliza-se um anticorpo especfico para o alvo desejado em um suporte ou plataforma, no qual se ligar o antgeno. Com a combinao de um mtodo sensvel com

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baixo sinal de fundo (quimioluminescncia) e de um amplificador de sinal (ELISA), foi demonstrada a deteco de 5x105 esporos. J em 2009, McGovern et al fabricaram e examinaram trs sensores piezoeltricos microcantilever para detectar in situ e em tempo real esporos do Bacillus anthracis em uma suspenso aquosa. Esses sensores consistiam de uma camada de zirconato de chumbo ligado a uma camada de vidro, com anticorpos anti-Bacillus anthracis imobilizados na superfcie e apresentaram sensibilidade de deteco de 10 esporos/mL, especificidade de 1:1000 quando em suspenso com os interferentes Staphylococcus aureus e a Pseudomonas aeruginosa , e confiabilidade (MCGOVERN et al, 2009).

7.2

Cncer: deteco e tratamento Na tentativa de criar alternativas menos txicas para o tratamento do cncer, Papo

et al (2003) criaram um peptdeo catinico curto diastereomrico composto de D- e Lleucinas, lisinas e argininas, que possuem toxicidade seletiva para clulas cancergenas e inibem significativamente a formao de metstase pulmonar em camundongos (86%), sem efeitos colaterais detectveis. Com a utilizao de um biossensor com uma bicamada lipdica aplicada sobre a superfcie do chip, utilizando SPR para detectar mudanas em seu ndice de refrao, investigou-se o mecanismo de ao do peptdeo, sendo demonstrada sua alta seletividade para clulas cancerosas. O fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) um regulador da angiognese e estimula a vascularizao em tumores slidos. Seu nvel srico um indicador til da presena de um tumor e biossensores baseados em aptmeros, por exemplo, podem ser utilizados para detect-lo, o que favoreceria um diagnstico mais efetivo (NONAKA et al, 2010). J os nanodispositivos microfludicos permitem um alto rendimento e uma anlise muito eficiente de sequncias gnicas, expandindo grandemente a habilidade para caracterizao da composio gentica e revolucionando a especificidade do diagnstico e dos tratamentos. Nanomateriais que tenham ao menos uma dimenso menor que 100 nm so comparveis em tamanho a muitas molculas biolgicas. Tais dimenses permitem que sejam incorporados s clulas para deteco por imagem tanto in vitro quanto in vivo, para mecanismos de entrega de drogas a alvos especficos e para o direcionamento de quimioterpicos para clulas tumorais (WANG, X. et al, 2009).

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Chen et al (2010) utilizaram nanobastes de ouro (GNR) revestidos com multicamadas de polieletrlito como contraste ptico multifuncional para a deteco de clulas tumorais por imagem. A modificao na superfcie dos GNR aumenta sua estabilidade qumica e facilita sua absoro por clulas do cncer por meio de interao eletrosttica. O experimento comprovou que GNR modificados podem ser utilizados como agentes de contraste ptico para deteco por imagem in vitro de clulas de cncer, apresentando grande potencial para futura utilizao in vivo.

7.3

Anlise de fluidos biolgicos Os testes atuais para glicose em pacientes diabticos fazem um furo na pele para

retirada de sangue, o que, alm de causar dor e inconveniente, limita o monitoramento frequente de acar. Por isso, bastante desejvel o desenvolvimento e teste de um sensor para glicose que seja no invasivo, de baixo custo, porttil e sem fio. Uma das alternativas testar a glicose utilizando-se o condensado do exalado pulmonar (EBC). Em 2010, Chu et al desenvolveram um dispositivo de integrao nitreto de glio-alumnio/nitreto de glio (AlGaN/GaN) com transstores de alta mobilidade eletrnica (HEMT) baseado em sensores de pH, glicose e ons cloreto em um nico chip. Para glicose, foi imobilizada a enzima glicose oxidase em nanobastes de xido de zinco (ZnO). Apesar de a atividade da enzima glicose oxidase ser altamente dependente do pH da soluo, e poder ser reduzida para 80% em pH de 5 a 6, em um tampo com pH de 7,4, o sensor apresentou uma resposta rpida (menos de 5 segundos) e foi capaz de detectar uma ampla faixa de concentraes, de 0,5 nM a 125 M. Com o objetivo de criar um biossensor para medio de glicose que fosse insensvel s variaes de pH, Garrett et al (2008) desenvolveram uma protena indicadora de glicose (GIP) com a unio de uma protena de ligao de glicose isolada de E. coli, uma protena fluorescente ciano e uma protena fluorescente amarela pH-insensvel. O resultado foi medido pelo mtodo FRET (fluorescence resonance energy transfer) e a resposta glicose foi quase inalterada para pH de 7,3 a 5,3. Os autores sugerem o uso de seu biossensor na medio de glicose intracelular de maneira no invasiva, por meio dos nveis de glicose intersticial. Guarise et al desenvolveram, em 2006, um nanossensor baseado em colides de ouro, para detectar duas proteases: a trombina, envolvida na coagulao sangunea e

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trombose, e o fator letal, um componente da toxina produzida pelo Bacillus anthracis. Os autores apontam que, apesar de no ser to sensvel quanto os mtodos baseados em ELISA ou imuno-PCR, seu sensor possui sensibilidade comparvel ou at melhor que aqueles baseados no mtodo FRET e pode ser utilizado para anlises preliminares de fluidos biolgicos. Em outro estudo, utilizaram o tecido do cogumelo Agaricus bisporus como elemento de reconhecimento molecular para etanol em um biossensor por

quimioluminescncia com sistema de deteco FIA. O mtodo foi utilizado para determinao de etanol em fluidos biolgicos e bebidas, com resultados satisfatrios, apresentando resultados lineares na faixa de 0,001 a 2 mmol/L, com limite de deteco de 0,2 mol/L (HUANG; WU, 2006). Em 2009, Laiwattanapaisal et al desenvolveram um sistema porttil on-chip para determinao de baixos nveis de albumina na urina, que se baseou em uma reao de imunoaglutinao, em que foi formado um complexo entre a albumina e anticorpos imobilizados em esferas de ltex. O imunossensor consistiu de um sistema microfludico de polidimetilsiloxano (PDMS), no qual foram inseridas amostras de urina diludas e foi detectada a mudana ocorrida na absorbncia aps a imunoaglutinao por meio de um espectrmetro porttil miniatura de fibra ptica. O limite de deteco obtido foi 0,81 mg/L, o que, apesar de ser considerado bem abaixo de outros mtodos, suficiente para a deteco do estgio de microalbuminria indicativo de nefropatia em pacientes diabticos. Os autores consideraram o mtodo de fcil manuseio, baixo custo, boa reprodutibilidade e total portabilidade para anlises em campo (LAIWATTANAPAISAL et al, 2009).

8 CONSIDERAES FINAIS

O desenvolvimento e utilizao de biossensores tem sido um importante avano em diversas reas. Cada vez mais, novas tcnicas e materiais so testados e as possibilidades de aplicao aumentam. O uso de biossensores na deteco precoce e tratamento de cncer, por exemplo, ser uma importante ferramenta para uso na medicina e no desenvolvimento de frmacos, pois, alm de ser uma forma de tratamento menos invasiva e nociva ao paciente, a deteco precoce aumenta as chances de sucesso no tratamento.

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Destaque tambm para o uso na deteco de armas qumicas e, principalmente, biolgicas, tanto em ambientes quanto em gua, solo e alimentos. Como a deteco desses agentes , em geral, demorada, o risco de contaminao torna-se maior. Nesse caso, os biossensores permitem uma anlise em tempo real e in loco, o que favorece uma ao mais rpida e efetiva das autoridades no combate ao terrorismo. Entretanto, so necessrios mais estudos relacionados toxicidade desses novos materiais, tanto para o meio ambiente quanto para a sade humana. Os nanomateriais, por exemplo, apresentam diversos metais pesados em sua composio que so conhecidamente txicos. Alm disso, por seu tamanho reduzido, esses compostos interagem grandemente com o ambiente tanto externo quanto fisiolgico.

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