INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS VACA GONZLEZ OSMAR GABRIEL GRUPO:

5QM2 SECCIN: 1

PRACTICA No 2 DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL MTODO DE BRADFORD INTRODUCCION

Existen varios mtodos para determinar la concentracin de protenas de una muestra, tales como la determinacin de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formacin de derivados coloreados de las protenas, base de los mtodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptdico; en el mtodo de Lowry, adems del complejo anterior tambin se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total.

El mtodo que vamos a utilizar durante estas prcticas se basa en un principio diferente: se emplea un colorante hidrofbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ac. fosfrico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una protena, origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Este mtodo depende, pues de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y lquidos orgnicos como el metanol. Su principal

ventaja es que resulta ms rpido y fcil de emplear que otros mtodos alternativos, y ms sensible que la medida de absorbancia a 280 nm. Para determinar la concentracin de protena total presente en una muestra se requiere la preparacin de una curva de calibrado empleando una protena patrn, que generalmente suele ser la seroalbmina bovina.
OBJETIVOS -Elaborara una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando un mtodo fotomtrico. - Determinara si hay diferencia estadsticamente significativa en la precisin y exactitud respecto al mtodo de Lowry. -Determinar el efecto de algunas sustancias no proteicas, que pueden interferir en el mtodo. -Analizara las ventajas y desventajas de este mtodo con respecto a otros mtodos para la determinacin cuantitativa de protenas. RESULTADOS 1.- Elaboracin de la curva de calibracin. Tabla 3. Curva de calibracin de hemoglobina Mtodo de Bradford. Tubo No. 1 2 3 4 5 Cantidad de protena (g) 23.35 53.77 74.68 95.91 127.28 Serie A 0.246 0.342 0.408 0.475 0.574

Tabla 3.1 Curva de calibracin de hemoglobina, Absorbancia 590nm. Mtodo de Bradford Tubo No. 1 2 3 4 5 Cantidad de protena (g) 25.58 53.45 72.32 92.65 130.98 Serie B 0.235 0.331 0.396 0.466 0.598

Grafica 1. Curva de calibracin de hemoglobina (Absorbancia vs Conc. Protena)

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 y = 0.003444x + 0.1469 0 25 50 75 100 125 Serie A Serie B Linear (Serie A) Linear (Serie B) y = 0.003156x + 0.1723

Coeficiente de correlacin. Serie A: 0.9968 Coeficiente de correlacion. Serie B: 0.9913 CALCULOS 1.- Para obtener la concentracin terica de protena. Partimos de 0.25 mg/ml de hemoglobina 1mg---------------------- 1000 g 0.25mg ------------------- X X=250 g 250 g--------------- 1ml X------------------------ 0.1 ml X= 25 g

2.- Para obtener concentracin de protena en serie A y serie B. Partimos de la ecuacin de la recta y= a + bx, donde y= absorbancia, a=ordenada al origen, b= pendiente y x= Concentracin de la protena. Despejamos x obteniendo lo siguiente

x=
Sustituimos valores de la serie A.

x= Sustituimos valores de la serie B x=

= 23.35g de hemoglobina

= 25.58g de hemoglobina

Se procede a realizar lo mismo para serie A y serie B cambiando los valores de absorbancia. 2.- Anlisis estadstico. Tabla 4. Replicas para el anlisis estadstico Tubo No. A590 Cantidad de protena (g) 67.10 62.45 63.61 60.71 56.35 59.55 64.77 68.84 61.87 66.52 % C.V 6.0028 1 = 65.88 2= 60.46

1 0.378 2 0.362 3 0.366 4 0.356 5 0.341 6 0.352 7 0.370 8 0.384 9 0.360 10 0.376 Tabla 5. Resultados del anlisis estadstico. X 63.177 Clculos % C.V= 1=

S 3.7924

S2 14.38

%C.V= 1=63.177+

= 6.0028% 2=79.77

60.46

INTERFERENCIA

si hay -60.46

65.88 + si hay

NO HAY INTERFERENCIA

3.-Efecto de algunas sustancias no protenicas que pueden interferir en el desarrollo de color. Tabla 6. Efecto de algunas sustancias no protenicas en el mtodo de Lowry. Tubo No. Sustancia A590 Cantidad de protena (g) 94.68 98.75 31.09 22.67 96.71 Tipo de interferencia generada Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10

Tris 1M, pH= 7.0 Glicerol al 1% Detergente comercial 1% Dodecil sulfato de sodio al 1% Ac. Tricloroacetico al 5% Fenol Mercaptoetanol al 0.1% Tris 1M pH=10 Urea al 5% (NH4)2SO4

0.473 0.487 0.254 0.225 0.480

0.454 0.478 0.481 0.437 0.442

89.16 96.13 97.00 84.23 85.68

Positiva Positiva Positiva Positiva positiva

COMPARACION DEL METODO DE BRADFOR Y LOWRY. Bradford 67.10 62.45 63.61 60.71 56.35 59.35 64.67 68.84 61.87 66.52 Lowry 83.10 82.06 72.71 89.34 79.46 75.31 76.87 86.74 78.43 73.75 Di -16 -19.61 -9.1 -28.63 -23.11 -15.96 -12.2 -17.9 -16.56 -7.23 D= -166.63/10 D=-16.63 Di-D -16-(16.63)=0.63 -2.98 7.53 -12 -6.48 0.67 4.43 -1.27 0.07 9.4 (Di-D)2 0.3969 8.88 56.70 144 41.99 0.4489 19.62 1.6129 0.0049 88.36 z= 362.01

CALCULOS PRECISION F F= F=30.305/14.38= 2.107

Comparamos con F de tablas: 4.03 2.107<4.03 No hay diferencia significativa EXACTITUD Sd= Sd= = 6.3421

t=

t=

= - 8.29

t de tablas=2.262> -8.29

DISCUSION DE RESULTADO La determinacin de protenas por medio de este mtodo es mucho ms fcil y rpido ya que no se ocupan muchos reactivos aparte de que la reaccin se lleva a cabo en poco tiempo y el color de la solucin de cada tubo puede permanecer por 2 horas. Este mtodo es 100 veces ms sensible, En la primera fase que fue la de la elaboracin de una curva de calibracin se obtuvieron por duplicado dos series en las cuales se eligi la serie A con un coeficiente de correlacin de 0.9968 a comparacin de la serie B 0.9913, siendo as si comparamos con el mtodo de Lowry en la serie A se obtuvo un mejore coeficiente de correlacin que fue de 0.9989, eso me hara pensar que aunque es ms lento el mtodo de Lowry es ms exacto en sus resultados a comparacin de el de Bradford. En la realizacin del anlisis estadstico podemos ver que se mantienes las absorbancias constantes pero la cantidad de protena terica que debera ir en el tubo 3 no coincide con la prctica y esto puede haber sido por error de nosotros. Una de sus desventajas es que presenta interferencia con los detergentes pero es un factor que se puede corregir. En los clculos para obtener F sali un valor por debajo de el de tablas y eso nos indica que No existe diferencia significativa, el

nico problema es el de la obtencin de la t no coinciden los datos y sale un valor por debajo del valor que hay en tablas. Para obtener la t se tuvo problemas y aun asi no se tienen los mismos resultados, un factor puede ser que haya habido algn mal manejo de la calculadora y por eso nos da resultados que no estan muy relacionados. En la parte de interferencias se obtuvo que el mtodo tuvo interferencia positiva, porque debido a su composicin qumica, tiene mucha sensibilidad y nos ocasiona fallas al momento de llevar a cabo la reaccin.

CONCLUSIONES -El mtodo de Bradford es ms rpido y econmico. -El mtodo de Bradford tiene 100 veces ms sensibilidad que el de Lowry -Entre el mtodo de Lowry y Bradford conviene hacer ms el de Bradford debido a costos y tiempo.. -Se verifico la interferencia que tiene con ciertos compuestos de origen no proteico. BIBLIOGRAFIA Skoog, Douglas A; F. James Holler, T.A. Nieman. 2001. Principios de Anlisis instrumental. 5 ed, Editorial Mc Graw Hill interamericana de Espaa, Madrid,