Unidad: Departamento:

Instituto Tecnolgico superior de Coatzacoalcos.

Edicin No. 1

Fecha de Edicin: 7/12/09

Ingeniera Bioqumica

Materia:

BIOQUIMICA II

OBJETIVO Proporcionar las bases prcticas del funcionamiento de los procesos biolgicos que le permitirn identificar las potencialidades de los productos biticos, en la obtencin de bienes y servicios. INTRODUCCION En el presente manual se pretende conjugar la parte terica con la prctica en la realizacin de diferentes tcnicas bioqumicas, cromatogrficas y espectrofotomtricas para una mejor comprensin de los procesos que pueden ocurrir en un organismo. Es de suma importancia que el alumno conozca las deferentes tcnicas actuales que pueden utilizar para poder modificar tambin a estos organismos vivos y en todo caso poder crear las condiciones de crecimiento en base al conocimiento que se tiene del metabolismo.

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BIOQUIMICA II

LINEAMIENTOS DEL LABORATORIO PRCTICA No. 1 Revisar el reglamento del Laboratorio.

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BIOQUIMICA II

MTODOS CUANTITATIVOS PARA LA IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS PRACTICA No 2

Objetivo: El alumno aprender a realizar pruebas coloridas para la identificacin de aminocidos y protenas. Introduccin: Por la presencia peptdica y la presencia de determinados grupos ( R ) las protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes originndose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa de las protenas. Por presentarse variaciones en la composicin de los aminocidos de las diferentes protenas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reaccin, ntimamente relacionado con la naturaleza de la protena analizada. PRUEBA DE LA NINHIDRINA. Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparicin de un color violceo o amarillo. Debido a que las protenas y los aminocidos, poseen est caracterstica, la reaccin sirve para identificarlos. PRUEBA DE BIURET. Es una prueba general para polipeptidos y protenas ya que sirve para reconocer las uniones peptidicas. La positividad se manifiesta por la aparicin de una coloracin violeta. PRUEBA DE COLORACIN. Es para identificar albminas, globulinas, gluteninas y prolaminas. La positividad se manifiesta por la formacin de un coagulo. PRUEBA DE SULFATO DE AMONIO. Las protenas como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio. Aparentemente la precipitacin se debe a la neutralizacin y deshidratacin de la molcula, seguida de agregacin y precipitacin. PRUEBA XANTOPROTEICA. Es un reaccin que reconoce os aminocidos que poseen un grupo bencnico (tirosina, fenilalanina, triptfano). La positividad se reconoce por la aparicin de un color amarillo o verde debido a la aparicin de nitrocompuestos. PRUEBA DE LOS GRUPOS SH. Es una prueba para identificar aminocidos azufrados y las protenas que los contiene, se reconocen por la formacin de una coloracin negra o gris.

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BIOQUIMICA II

PRUEBA DE SAKAGUCHI. Es para identificar arginina. El desarrollo de un color rojo marca la reaccin positiva. PRUEBA DE HOPKINS-COLE. Es para identificar el triptfano y las protenas que lo contienen. La positividad se reconoce por la aparicin de un anillo color violeta-rojizo. PRUEBA DE MILLON. La reaccin es debida a la presencia del grupo hidroxifenlico en la molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico no sustituido en la posicin 3,5, como la tirosina, fenol y timol, dan positiva la reaccin.

Material Tubos de ensaye Bao mara Pipeta de 5 mL Tubos para centrifuga

Aparatos e Instrumentos. Parrilla Centrifuga

Reactivos Ninhidrina al 0.1% Reactivo de biuret NaOH 10% CuSO4 al 0.5% cido actico al 30% Sol. Saturada de cloruro de sodio Sulfato de amonio al 50% cido ntrico Hidroxido de sodio al 40% Acetato de plomo al 1% Alfa-naftol Hipoclorito de sodio al 2% Reactivo de Hopkins-Cole (Mg, cido oxlico) cido sulfrico Reactivo de Milln

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Procedimiento PRUEBA Prueba de ninhidrina PROCEDIMIENTO En un tubo de ensaye colocar: Sustancia problema Reactivo de ninhidrina Calentar hasta ebullicin por 1 min. Deje enfriar y observe Sustancia problema Hidrxido de sodio al 10% Mezclar e ir aadiendo gota a gota el sulfato cprico al 0.5%, agitando despus de cada adicin, hasta la aparicin de un color violeta, azul o amarillo. El color violeta indica la reaccin positiva. Sustancia problema cido actico al 30% Solucin saturada de cloruro de sodio Mezcla bien y calentar a la llama por un minuto. En el caso de la albmina o globulina se presenta un enturbiamiento ms o menos intenso que persiste al enfriamiento, tambin puede observarse pequeos grumos en las paredes del tubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro Sustancia problema Sol. De sulfato de amonio al 50% Mezclar bien Dejar en reposo durante 10 min. Observe si se forma un precipitado. Centrifugar a 3000 rpm por 10 min. Observar. La reaccin positiva se manifiesta por la formacin de un precipitado, dependiendo directamente de la concentracin de albmina presente en la muestra. Sustancia problema cido ntrico conc. Mezclar bien Calentar a la llama y observar VOLUMEN 1 mL 1 mL

Prueba de biuret

1 mL 1 mL

Prueba de coagulacin

2 mL 4 gts 1 mL

Prueba de sulfato de amonio

1 mL 1 mL

Prueba xantoproteca

1 mL 0.5 mL

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PRUEBA PROCEDIMIENTO Prueba de Sustancia problema grupos SH Hidrxido de sodio al 40% Acetato de plomo al 1% Mezclar bien Calentar a la llama por 4 min. Mezclando continuamente y observar. Prueba de Sustancia problema Sakaguchi Hidrxido de sodio al 40% Alfa-naftol Hipoclorito de sodio al 2% Mezclar bien y observar Prueba de Sustancia problema Hopkins-Cole Reactivo de Hopkins-Cole (10 mg de magnesio en 250 mL de cido oxlico, se completa a 1 L con agua destilada) cido sulfrico concentrado, se deja caer lentamente por las paredes del tubo, observar. Prueba de Sustancia problema Millon Reactivo de Millon (mercurio y cido ntrico en una proporcin de 1:3, diluir con 2 volmenes de agua la solucin resultante) Observaciones y esquemas. Resultados. Conclusin

VOLUMEN 1 mL 1 mL 1 mL

2 mL 5 gts 8 gts 10gts 1 mL 3 mL

1 mL 2 mL 4 gts

Cuestionario. 1.- Cules son las aplicaciones prcticas de las pruebas? 2.- Defina los siguientes trminos: aminocidos, protenas, anlisis cuantitativo, cualitativo. Bibliografa.

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DETERMINACIN DE MUESTRA PROBLEMA DE AMINOCIDOS. PRCTICA No. 3 Objetivo. El alumno tendr la capacidad para determinar el (los) tipos de aminocidos que se presenten en una muestra problema. Introduccin. Por la presencia peptdica y la presencia de determinados grupos ( R ) las protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes originndose productos coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa de las protenas. Por presentarse variaciones en la composicin de los aminocidos de las diferentes protenas, se manifiestan diferentes colores y grados de intensidad para una misma reaccin, ntimamente relacionado con la naturaleza de la protena analizada. PRUEBA DE LA NINHIDRINA. Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparicin de un color violceo o amarillo. Debido a que las protenas y los aminocidos, poseen est caracterstica, la reaccin sirve para identificarlos. PRUEBA DE BIURET. Es una prueba general para polipeptidos y protenas ya que sirve para reconocer las uniones peptidicas. La positividad se manifiesta por la aparicin de una coloracin violeta. PRUEBA DE COLORACIN. Es para identificar albminas, globulinas, gluteninas y prolaminas. La positividad se manifiesta por la formacin de un coagulo. PRUEBA DE SULFATO DE AMONIO. Las protenas como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio. Aparentemente la precipitacin se debe a la neutralizacin y deshidratacin de la molcula, seguida de agregacin y precipitacin. PRUEBA XANTOPROTEICA. Es un reaccin que reconoce os aminocidos que poseen un grupo bencnico (tirosina, fenilalanina, triptfano). La positividad se reconoce por la aparicin de un color amarillo o verde debido a la aparicin de nitrocompuestos. PRUEBA DE LOS GRUPOS SH. Es una prueba para identificar aminocidos azufrados y las protenas que los contiene, se reconocen por la formacin de una coloracin negra o gris.

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PRUEBA DE SAKAGUCHI. Es para identificar arginina. El desarrollo de un color rojo marca la reaccin positiva. PRUEBA DE HOPKINS-COLE. Es para identificar el triptfano y las protenas que lo contienen. La positividad se reconoce por la aparicin de un anillo color violeta-rojizo. PRUEBA DE MILLON. La reaccin es debida a la presencia del grupo hidroxifenlico en la molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico no sustituido en la posicin 3,5, como la tirosina, fenol y timol, dan positiva la reaccin.

Material Tubos de ensaye Bao mara Pipeta de 5 mL Tubos para centrifuga

Aparatos e Instrumentos. Parrilla Centrifuga

Reactivos Ninhidrina al 0.1% Reactivo de biuret NaOH 10% CuSO4 al 0.5% cido actico al 30% Sol. Saturada de cloruro de sodio Sulfato de amonio al 50% cido ntrico Hidroxido de sodio al 40% Acetato de plomo al 1% Alfa-naftol Hipoclorito de sodio al 2% Reactivo de Hopkins-Cole (Mg, cido oxlico) cido sulfrico Reactivo de Milln

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Procedimiento PRUEBA Prueba de ninhidrina PROCEDIMIENTO En un tubo de ensaye colocar: Sustancia problema Reactivo de ninhidrina Calentar hasta ebullicin por 1 min. Deje enfriar y observe Sustancia problema Hidrxido de sodio al 10% Mezclar e ir aadiendo gota a gota el sulfato cprico al 0.5%, agitando despus de cada adicin, hasta la aparicin de un color violeta, azul o amarillo. El color violeta indica la reaccin positiva. Sustancia problema cido actico al 30% Solucin saturada de cloruro de sodio Mezcla bien y calentar a la llama por un minuto. En el caso de la albmina o globulina se presenta un enturbiamiento ms o menos intenso que persiste al enfriamiento, tambin puede observarse pequeos grumos en las paredes del tubo. Observe el tubo sobre un fondo oscuro Sustancia problema Sol. De sulfato de amonio al 50% Mezclar bien Dejar en reposo durante 10 min. Observe si se forma un precipitado. Centrifugar a 3000 rpm por 10 min. Observar. La reaccin positiva se manifiesta por la formacin de un precipitado, dependiendo directamente de la concentracin de albmina presente en la muestra. Sustancia problema cido ntrico conc. Mezclar bien Calentar a la llama y observar VOLUMEN 1 mL 1 mL

Prueba de biuret

1 mL 1 mL

Prueba de coagulacin

2 mL 4 gts 1 mL

Prueba de sulfato de amonio

1 mL 1 mL

Prueba xantoproteca

1 mL 0.5 mL

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PRUEBA PROCEDIMIENTO Prueba de Sustancia problema grupos SH Hidrxido de sodio al 40% Acetato de plomo al 1% Mezclar bien Calentar a la llama por 4 min. Mezclando continuamente y observar. Prueba de Sustancia problema Sakaguchi Hidrxido de sodio al 40% Alfa-naftol Hipoclorito de sodio al 2% Mezclar bien y observar Prueba de Sustancia problema Hopkins-Cole Reactivo de Hopkins-Cole (10 mg de magnesio en 250 mL de cido oxlico, se completa a 1 L con agua destilada) cido sulfrico concentrado, se deja caer lentamente por las paredes del tubo, observar. Prueba de Sustancia problema Millon Reactivo de Millon (mercurio y cido ntrico en una proporcin de 1:3, diluir con 2 volmenes de agua la solucin resultante) Observaciones y esquemas. Resultados. Conclusin

VOLUMEN 1 mL 1 mL 1 mL

2 mL 5 gts 8 gts 10gts 1 mL 3 mL

1 mL 2 mL 4 gts

Cuestionario. 1.- Cules son las aplicaciones prcticas de las pruebas? 2.- Defina los siguientes trminos: aminocidos, protenas, anlisis cuantitativo, cualitativo. Bibliografa.

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SEPARACIN DE AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y DETECCIN MEDIANTE REACCIN CON NINHIDRINA. PRCTICA No. 4 OBJETIVO. El alumno ser capaz de realizar una separacin de aminocidos en TLC FUNDAMENTO. La cromatografa en capa fina es un caso de cromatografa de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatogrfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase mvil o eluyente (disolvente B). Es una tcnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatogrfico) y de fcil desarrollo. El parmetro experimental asociado a la tcnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase mvil, y que depende de su estructura qumica y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de ejemplo, y dentro de la presente prctica, se llevar a cabo la separacin de una mezcla de aminocidos, que se revelarn e identificarn mediante la reaccin con ninhidrina. MATERIAL Placa de silicagel o papel filtro Tanque cromatogrfico Agitador de tubos Capilares Guantes de latex Tijeras REACTIVOS Lisina Triptofno Tirosina Leucina Etanol Hidrxido amnico Ninhidrina

PROCEDIMIENTO. 1.- Sobre una placa de silicagel o papel filtro se traza con un lpiz una recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de 1.5 cm aproximadamente. Nota: No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las manos, ya que se contamina con aminocidos procedentes de nuestras manos. 2.- En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminocidos con lpiz) se aplicarn tres gotas de la solucin de cada uno de los aminocidos.

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3.- Marcar con lpiz el otro extremo de la placa. 4.- Aadir al tanque cromatogrfico el eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. 5.- Se mete la placa en el tanque, se tapa y se deja desarrollar la cromatografa hasta que el eluyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo. NOTA: Realizarlo en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es txico. 6.- Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se seca dentro de la campana de gases. 7.- Posteriormente ya seca la placa se roca con un pulverizador que contiene la solucin reveladora. 8.- Continuar secando la placa con calentamiento para su revelacin. SOLUCIONES. 1.- Soluciones de los aminocidos Solucin de aminocido al 1% Aminocido 1g n-propanol 10 mL Agua destilada Hasta 100 mL

2.- Solucin de hidrxido amnico al 34% Solucin de hidrxido amnico Hidrxido amnico 34g Agua destilada Hasta 100 mL

3.- Solucin de eluyente (etanol: hidrxido amnico, en una proporcin 7:3) Solucin de eluyente Etanol 210 mL Sol. De hidrxido amnico 90 mL

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4.- Solucin reveladora (se prepara el da de uso) Solucin de ninhidrina ninhidrina 0.2 g Agua destilada Hasta 100 mL

Observaciones y esquemas. Conclusiones. Cuestionario. 1.- Defina el valor de Rf 2.- Qu se podra decir de la resolucin de la tcnica y como podra aumentarse sta? Bibliografa.

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DETERMINACIN DE UREA PRCTICA No. 5 FUNDAMENTO. La urea, representa el producto final del catabolismo proteico y es depurado por los riones mediante filtracin glomerular. Se sintetiza en el hgado a partir del amonio el cual se produce como resultado de la determinacin de aminocidos. Normalmente el nitrgeno de urea en sangre BUN) comprende slo cerca del 45% del nitrgeno no proteico. La importancia en la determinacin de nitrgeno ureico radica en que su valor es indicativo del estado del funcionamiento heptico y renal. Entre las causas de urea elevada estn las glomerulonefritis aguda, nefritis crnica, rin poliquistico, nefroesclerosis, nefrosis tubular, obstruccin del tracto urinario. Una disminucin de BUN se ha encontrado en destruccin aguda del hgado, en dietas bajas en protenas y altas en carbohidratos, mala absorcin, envenenamiento con drogas y en el embarazo.

Material Tubos de ensaye Bao mara Pipeta de 5 mL Jeringa de 3 mL Pipeta de 1 mL

Aparatos e Instrumentos. Centrifuga

Reactivos Kit para determinacin de urea

PROCEDIMIENTO. 1.- La toma de muestra se llevar a cabo de acuerdo a las indicaciones del docente 2.- Una vez obtenida la sangre se proceder a centrifugar para la obtencin de suero

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3.- Separar el suero del paquete globular y realizar la determinacin de acuerdo a la tcnica marcada en el Kit. Observaciones y esquemas. Conclusiones. Cuestionario. 1.- Cual es la importancia de la urea? 2.- Cuales son los valores lmites de urea que se pueden encontrar en el organismo de un ser humano? 3.- En que situaciones los valores lmites permitidos de urea se pueden ver alterados? Bibliografa.

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DETERMINACIN DE C. RICO PRCTICA No. 6 FUNDAMENTO. El cido rico, representa el producto final del catabolismo de purinas y es depurado por los riones mediante filtracin glomerular. Se sintetiza en el hgado a partir del amonio el cual se produce como resultado de la determinacin de aminocidos. Normalmente el c. rico en sangre BUN) comprende slo cerca del 45% de purinas. La importancia en la determinacin de cido rico radica en que su valor es indicativo del estado del funcionamiento heptico y renal. Entre las causas de c.rico elevado estn las glomerulonefritis aguda, nefritis crnica, rin poliquistico, nefroesclerosis, nefrosis tubular, obstruccin del tracto urinario. Una disminucin de BUN se ha encontrado en destruccin aguda del hgado, en dietas bajas en protenas y altas en carbohidratos, mala absorcin, envenenamiento con drogas y en el embarazo.

Material Tubos de ensaye Bao mara Pipeta de 5 mL Jeringa de 3 mL Pipeta de 1 mL

Aparatos e Instrumentos. Centrifuga

Reactivos Kit para determinacin de c. rico

PROCEDIMIENTO. 1.- La toma de muestra se llevar a cabo de acuerdo a las indicaciones del docente 2.- Una vez obtenida la sangre se proceder a centrifugar para la obtencin de suero

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3.- Separar el suero del paquete globular y realizar la determinacin de acuerdo a la tcnica marcada en el Kit para la determinacin de c. rico. Observaciones y esquemas. Conclusiones. Cuestionario. 1.- Cual es la importancia del cido rico? 2.- Cuales son los valores lmites de c. rico que se pueden encontrar en el organismo de un ser humano? 3.- En que situaciones los valores lmites permitidos de c. rico se pueden ver alterados? Bibliografa.

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EXTRACCIN DE ADN PRCTICA No. 7 FUNDAMENTO. Los cidos nucleicos son las bases primarias de la composicin del ADN dependiendo de la conformacin que tengan estas molculas su estructura se puede clasificar en primaria que bsicamente es el arreglo lineal o acomodo de los cidos nucleicos, estructura secundaria que es bsicamente la doble hlice y por ltimo la estructura terciaria que se refiere al superenrollamiento que presenta la cadena del ADN para su acomodo en la Procin nuclear de la clula.

Material Tubos de ensaye de 20 x 200mm Pipeta de 5 mL y 10 mL Vasos p.p. de 250 mL Agitador de vidrio Porta objetos y cubreobjetos Mortero con pistilo Papel filtro Embudo de filtracin Fruta de pulpa suave Cuchillo o bistur

Aparatos e Instrumentos. Microscopio

Reactivos SDS (dodecil sulfato de sodio) Alcohol Azul de metileno

PROCEDIMIENTO. 1.- Cortar la fruta en trozos pequeos y adicionarla en el mortero con pistilo y moler hasta la formacin de una masa 2.- Una vez obtenida la masa en un vaso p.p. colocar 20 mL de SDS y adicionar la masa 3.- Aparte en un tubo de 20 x 200mm colocar aprox. 10 mL de alcohol y enfriar

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4.- De la sol. Obtenida de la unin de la pulpa con el SDS, filtrarla y lo obtenido (aprox. 5 mL) adicionarlo al tubo de alcohol previamente enfriado. 5.- Va a observar la formacin de una masa gelatinosa (ADN) al tubo agregarle una gota de azul de metileno y tomar una muestra y colocarla en el portaobjetos. Observaciones y esquemas. Conclusiones. Cuestionario. 1.- A que nos referimos cuando hablamos sobre el genoma humano? 2.- Cuales son los componentes del ADN? 3.- Explique la teora de Watson y Crick. Bibliografa.

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EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE M.O PRCTICA No. 8 FUNDAMENTO. Los cidos nucleicos son las bases primarias de la composicin del ADN dependiendo de la conformacin que tengan estas molculas su estructura se puede clasificar en primaria que bsicamente es el arreglo lineal o acomodo de los cidos nucleicos, estructura secundaria que es bsicamente la doble hlice y por ltimo la estructura terciaria que se refiere al superenrollamiento que presenta la cadena del ADN para su acomodo en la Procin nuclear de la clula.

Material Tubos de ensaye de 20 x 200mm Pipeta de 5 mL y 10 mL Vasos p.p. de 250 mL Agitador de vidrio Porta objetos y cubreobjetos Mortero con pistilo Papel filtro Embudo de filtracin Fruta de pulpa suave Cuchillo o bistur

Aparatos e Instrumentos. Microscopio

Reactivos SDS (dodecil sulfato de sodio) Alcohol Azul de metileno

PROCEDIMIENTO. 1.- Cortar la fruta en trozos pequeos y adicionarla en el mortero con pistilo y moler hasta la formacin de una masa 2.- Una vez obtenida la masa en un vaso p.p. colocar 20 mL de SDS y adicionar la masa 3.- Aparte en un tubo de 20 x 200mm colocar aprox. 10 mL de alcohol y enfriar

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4.- De la sol. Obtenida de la unin de la pulpa con el SDS, filtrarla y lo obtenido (aprox. 5 mL) adicionarlo al tubo de alcohol previamente enfriado. 5.- Va a observar la formacin de una masa gelatinosa (ADN) al tubo agregarle una gota de azul de metileno y tomar una muestra y colocarla en el portaobjetos. Observaciones y esquemas. Conclusiones. Cuestionario. 1.- A que nos referimos cuando hablamos sobre el genoma humano? 2.- Cuales son los componentes del ADN? 3.- Explique la teora de Watson y Crick. Bibliografa.