1

Fundao Faculdade Federal de Cincias Mdicas de Porto Alegre Departamento de Cincias Morfolgicas Disciplina de Gentica

Hemofilia A

Giselle Martins Pinto Nelson Gianni de Lima Rafael Domingos Grando Lisiane Machado Luciana Mendes Johan

Porto Alegre, 07 de novembro de 2001.

Resumo

A hemofilia A um distrbio hereditrio da coagulao caracterizado por um aumento do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), fcil aparecimento de hematomas e hemorragias dentro de articulaes e msculos. Sua incidncia no sexo masculino de aproximadamente 1 para cada 5000 indivduos. Por ser uma doena de herana recessiva ligada ao X (gene localizado em Xq28), mulheres raramente so afetadas e, quando carreadoras, dificilmente apresentam evidncias clnicas da doena. Aproximadamente 30% dos casos surgem de mutao nova. A etiologia bsica desta patologia a deficincia de fator VIII da coagulao, sendo o tratamento baseado na reposio deste atravs de derivados plasmticos ou fator VIII recombinante.

Palavras-chave: hemofilia A, fator VIII, derivados plasmticos, fator VIII recombinante.

Abstract

Hemophilia A is an hereditary disorder of the coagulation cascade , characterized by prolonged activated partial-thromboplastin time, hematomas and bleeding into joints and muscles. Its incidence approaches 1 to 5000 males. Because it is an inherited Xlinked recessive disorder (gen layed at Xq28), women are seldom affected and, when carriers, rarely present any symptoms. About 30 percent of cases arise from a spontaneous mutation. The basis etiology of this disease is the coagulation factor VIII deficiency, and its treatment is based on reposition therapy with plasma-derived factors or recombinant factor VIII.

Keywords: hemophilia A, factor VIII, plasma-derived factors, recombinant factor VIII.

Introduo

As hemorragias dramticas, os efeitos da doena na histria pela sua presena nos descendentes da rainha Victoria e o papel devastador dos concentrados teraputicos na transmisso da Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (AIDS) tm feito da hemofilia A objeto de grande interesse mdico, cientfico e pblico. um dos distrbios hereditrios da coagulao mais comumente observados e uma doena sem limites tnicos ou geogrficos. Sua incidncia de aproximadamente 1 (um) para cada 5.000 nascimentos do sexo masculino,1,2 apresentando-se com padro hereditrio. Entretanto, a doena resultado de uma nova mutao gentica em aproximadamente um tero dos pacientes, logo, pode no haver histria familiar de distrbios de sangramento. Hoje se sabe que a hemofilia A causada pela ausncia, deficincia severa ou defeitos na funo do fator VIII da coagulao (fator anti-hemoflico), presente no plasma. A histria da hemofilia A, tambm chamada de hemofilia clssica, se estende desde nosso mais antigo conhecimento sobre hemostasia e coagulao at os recentes avanos da biologia molecular.3,4 Apesar de clinicamente indistinguvel da hemofilia A e de tambm ser transmitida pela herana ligada ao cromossomo X, a hemofilia B (doena de Christmas) diferente da hemofilia A, uma vez que nesses casos o fator IX da coagulao que o deficiente.5 O tratamento dessas duas condies completamente diferente, logo, o diagnstico diferencial entre essas duas doenas fundamental e deve ser realizado por medida dos fatores de coagulao.

Dados Histricos

Relatos antigos presentes no Talmude e outros escritos hebraicos mostraram que o padro de herana ligado ao cromossomo X da hemofilia A foi primeiramente reconhecido h aproximadamente 2.000 anos. O Talmude postulava que se uma mulher submetesse seus dois primeiros filhos a circunciso e eles morressem devido a sangramentos, ela no precisaria circuncisar seu terceiro filho. Alm disso, dizia tambm que se duas irms circuncisassem seus filhos e ambos morressem por sangramento, a terceira irm no precisaria submeter seu filho circunciso. A explicao oferecida era baseada em fatos reais ocorridos em que um menino, sobrinho de duas mulheres que perderam seus filhos na circunciso, foi liberado de realiz-la.3 Segundo os escritos, membros de algumas famlias tinham perda de sangue, enquanto que em indivduos normais havia reteno de sangue (isto , coagulao). A discusso da doena nas escrituras do Talmude e nos escritos de rabinos revela o notvel conhecimento daquele povo sobre este distrbio de sangramento hereditrio. Mais tarde, em 1803, John Conrad Otto descreveu padro de herana da hemofilia como uma doena ligada ao cromossomo X, observando indivduos afetados numa famlia de New Hampshire: somente o sexo masculino afetado, mas as mulheres, mesmo sem a doena, podem transmiti-la para seus descendentes do sexo masculino.6 A hemofilia ficou mais conhecida por seu efeito nas famlias reais da Europa, devido a seu aparecimento sbito entre os filhos da Rainha Victoria, da Gr-Bretanha. Ela tornou-se conhecida como a doena Real, porque se disseminou s famlias reais europias da Rssia, Prssia e Espanha atravs dos descendentes da Rainha Victoria.

Ela sempre tinha se preocupado com a qualidade do sangue da famlia real Britnica e temia profundamente que ocorresse alguma imperfeio nos descendentes da famlia Real. Victoria era uma portadora clinicamente normal e retratada como a fonte da mutao ou herdeira de uma mutao ocorrida nas clulas germinativas de seu pai, Edward Augustus, o Duke de Kent. Victoria teve um filho, Leopold, que apresentou hemofilia, e duas filhas, Alice e Beatrice, que eram portadoras e transmitiram a doena para as famlias reais da Rssia, Prssia e Espanha, devido aos casamentos arranjados entre membros das famlias reais para consolidar alianas polticas. Leopold, o oitavo filho de Victoria e nico afetado, teve uma vida curta e sofreu vrias hemorragias severas. Sempre tinha sido descrito como um menino muito delicado. Apesar de todos os cuidados de que era cercado, faleceu aos trinta e um anos devido a uma pequena queda. Conta a histria que Alix, uma das filhas de Alice (e neta de Victoria) tambm era portadora e casou-se com Nikolas II, da famlia imperial Russa, tendo quatro filhas antes do to esperado herdeiro do trono russo, Alexis, que apresentou hemorragias e hematomas em braos e pernas aps pequenos traumas, alm de hemartroses e dor. Seu pai e sua me, vendo seu sofrimento, recorreram ao monge Rasputin, no qual depositaram total confiana por acreditarem ser a nica pessoa capaz de aliviar o sofrimento de seu filho. Alguns sugerem que Rasputin utilizava tcnicas de hipnose para tranqilizar o menino e coloc-lo para dormir. Com a grande preocupao dos pais com a sade do filho, a situao do Estado Russo se deteriorava, culminando posteriormente com a Revoluo Russa. Uma vez que tanto a hemofilia A quanto a B so clinicamente indistinguveis e nenhum dos descendentes afetados da Rainha Vitria esto vivos (o ltimo, Waldemar, bisneto de Victoria, morreu em 1945 aos 4 anos de idade), ns poderemos nunca saber exatamente qual o tipo de hemofilia que eles apresentaram.8

Definio e Epidemiologia

A hemofilia A uma doena hereditria recessiva ligada ao cromossomo X que ocorre devido deficincia do fator VIII da coagulao ou a defeitos estruturais em suas molculas.9 Inicialmente, importante enfatizar que a hemofilia A um distrbio clinicamente heterogneo, o que pode ser esperado devido quantidade de defeitos diferentes no gene do fator VIII. uma doena que no respeita limites tnicos ou geogrficos, ocorrendo em todo o mundo. A hemofilia A pode ocorrer nas formas leve, moderada e severa, correspondendo a nveis de fator VIII plasmticos de 6 a 30% do normal, 2 a 5% do normal e 1% ou menos do normal, respectivamente.8 No estudo de Soucle et al (1998) para freqncia das formas da hemofilia A em seis estados americanos foram feitos 2.156 diagnsticos de pacientes com a doena. Desse, 43% (1.140) apresentaram a forma severa; 26% (684) apresentaram a forma moderada e 31% (848) apresentaram a forma leve da hemofilia A. Essa distino entre doena severa e no-severa fundamental, uma vez que as formas leves ou moderadas da doena so raramente complicadas por episdios de sangramentos espontneos em articulaes. De fato, a forma leve de hemofilia pode ser detectada em adultos aps trauma ou cirurgia, e pode no haver histria de sangramentos.9 A hemofilia A a principal doena causadora de sangramentos severos e a segunda principal causa de todos os distrbios congnitos que causam sangramentos, ficando atrs somente da doena de von Willebrand (uma doena autossmica dominante). Aproximadamente 1 (uma) em cada 5.000 crianas do sexo masculino (levando-

se em conta a populao geral, sua incidncia de aproximadamente 1 para cada 10.000 nascimentos) afetada pela hemofilia A, ao passo que a incidncia da doena de von Willebrand de 1 para cada 1.000 nascimentos, afetando ambos os sexos16. A incidncia da hemofilia A em mulheres extremamente rara, devido necessidade de homozigose para expresso do fentipo, aparecendo numa freqncia de 1 em cada 25.000.000.7 J na hemofilia B mais rara aproximadamente 1 (uma) em cada 30.000 crianas do sexo masculino afetada (levando-se em conta a populao geral, sua incidncia de aproximadamente 1 para cada 60.000 nascimentos).8 Apesar de pacientes com hemofilia leve apresentarem sangramentos excessivos somente aps trauma ou cirurgia, os portadores da forma severa tm uma mdia anual de 20 a 30 episdios de sangramento aps pequenos traumas, particularmente em articulaes e msculos. Em alguns desses pacientes os episdios podem ser at mais freqentes. Estes sintomas diferem substancialmente dos gerados por defeitos plaquetrios ou da doena de von Willebrand, nos quais predominam os sangramentos das mucosas.9 Antes da efetiva terapia de reposio ser introduzida no fim dos anos 60, a hemofilia causava morte e distrbios severos numa idade precoce. Na Sucia, um registro nacional para causas de morte estabelecido no sculo XVIII tornou possvel a documentao das mudanas na expectativa de vida dos pacientes portadores de hemofilia. A expectativa de vida mdia de pacientes portadores de hemofilia severa aumentou para 11,4 anos de 1831 a 1920; para 20 anos de 1921 a 1960 e para 56,8 anos de 1961 a 1980.11 Durante este mesmo perodo, a expectativa de vida da populao masculina geral tambm aumentou, mas somente de 61,7 para 75,6 anos. Infelizmente, a epidemia de AIDS mudou novamente o prognstico dos pacientes portadores da hemofilia A. Dados de 289 famlias de um grande centro americano de hemofilia mostraram um declnio na expectativa mdia de vida de 68 anos (de 1971 a 1980) para somente 49 anos (de 1981 a 1990).12 Milhares de pacientes com hemofilia A e sem outros fatores de risco para HIV apresentaram diagnstico de AIDS, sendo que muitos desses pacientes morreram. Apesar do nmero de novos casos em pacientes hemoflicos estar diminuindo, existem

ainda muitos pacientes HIV positivos hemoflicos com risco de desenvolver AIDS,13,14,15 mas que ainda no manifestaram sinais e sintomas da doena.

10

Padro de Herana

A herana de fentipos recessivos ligados ao X segue um padro bem definido e facilmente reconhecido. Uma mutao recessiva ligada ao X expressa-se fenotipicamente em todos os homens que a recebem, mas apenas nas mulheres que so homozigticas para a mutao. Em conseqncia, os distrbios ligados ao X geralmente se restringem aos homens e, exceo dos raros heterozigotos manifestos, quase no so vistos nas mulheres. Uma outra caracterstica desse padro que o gene responsvel pela afeco transmitido de um homem afetado para todas as suas filhas. Os filhos do sexo masculino de qualquer uma dessas filhas tm uma chance de 50% de herd-lo. O gene jamais se transmite diretamente do pai para o filho, mas sim de um homem afetado para todas as suas filhas. Outra caracterstica que o gene pode transmitir-se ao longo de uma srie de mulheres portadoras e, os homens afetados numa famlia so aparentados atravs das mulheres. Finalmente, as mulheres heterozigticas geralmente no so afetadas, mas algumas expressam a afeco com intensidade varivel. Nos raros casos em que a mulher afetada, ela deve ser filha de pai afetado e me carreadora. A hemofilia A tambm pode ocorrer em mulheres com hemizigose para mutao do fator VIII, como resultado de um defeito na lyonizao (inativao) do cromossomo X. Alguns casos de hemofilia A tm sido relatados em pacientes com anormalidades no cromossomo X como Sndrome de Turner e mosaicismo do X.9 Se uma mulher carreadora tiver seu cromossomo X normal inativado, ela apresentar as manifestaes clnicas tpicas desta patologia.

11

Deve-se ressaltar, no entanto, que aproximadamente 30% dos casos de hemofilia A surgem de novas mutaes, no havendo histria familiar deste distrbio.

12

Etiologia e Patognese

A hemofilia A um distrbio heterogneo resultante de defeitos no gene que codifica o fator VIII da coagulao, o que leva a uma reduo dos seus nveis circulantes funcionalmente ativos. A reduo na atividade pode ser devida a uma diminuio na quantidade do fator VIII (protena), presena de um fator VIII funcionalmente anormal ou a uma combinao de ambos. Para que o fator VIII seja um cofator efetivo do fator IX, ele precisa ser clivado pela trombina, numa reao que resulta na formao de um heterodmero composto pelos domnios A1A2 e A3C1C2 em um complexo com clcio (ver anexo 1). Os fatores VIII e IX ativados associam-se na superfcie das plaquetas ativadas para formar um complexo de ativao do fator X, dando seqncia cascata da coagulao. Na presena do fator VIII ativado, a taxa de ativao do fator X pelo fator IX extremamente aumentada. No surpresa que a hemofilia A e hemofilia B apresentem manifestaes clnicas similares, uma vez que tanto o fator VIII quanto o IX (ativados) so necessrios para formar o complexo de ativao do fator X. Em pacientes com hemofilia A, a formao do cogulo retardada porque a gerao de trombina est marcadamente diminuda. Alm disso, o cogulo que formado frivel e facilmente desalojado, levando a sangramento excessivo e cicatrizao deficitria.9 A fisiopatogenia da hemofilia A ser melhor discutida ao longo do trabalho.

13

Apresentao Clnica

A hemofilia clssica caracterizada por sangramentos excessivos em vrias partes do corpo. Hematomas em tecidos moles e hemartroses so altamente caractersticos da hemofilia. Essa doena tem sido largamente classificada em leve, moderada e severa, mesmo havendo alguma sobreposio entre essas categorias. Tabela 1 Manifestaes clnicas da hemofilia. Classificao Severa Nvel de fator VIII (ativo) At 1% do normal Achados Clnicos Hemorragias e hemartroses espontneas, requerindo reposio de fator VIII. Moderada Leve De 2% a 5% do normal De 6 a 30% do normal Hemorragias secundrias a traumas ou cirurgias. Hemorragias secundrias a traumas ou cirurgias, raras hemorragias espontneas. Muitos pacientes com hemofilia severa podem apresentar sangramentos sem ter sofrido trauma conhecido alm dos associados com sua atividade diria. As hemartroses tornam-se freqentes a partir do momento em que o paciente comea a caminhar. Sem um tratamento efetivo, as hemartroses recorrentes podem ocorrer em paci-

14

entes jovens e so altamente sugestivas de hemofilia severa. Nesses casos resultam na artropatia crnica do paciente hemoflico. Os pacientes severamente afetados tambm esto sujeitos a srias hemorragias que podem dissecar os tecidos planos, podendo levar ao comprometimento de rgos vitais. Entretanto, os episdios de sangramentos so intermitentes e alguns pacientes podem passar semanas ou meses sem apresentar hemorragias. Exceto por hemorragias intracraniais, a morte sbita devido a hemorragias extremamente rara. Os pacientes hemoflicos moderadamente afetados podem apresentar hematomas ocasionais e hemartroses, normalmente associados a um trauma conhecido. Esses pacientes geralmente apresentam 2 a 5% de atividade do fator VIII. Apesar das hemartroses ocorrerem em pacientes moderadamente afetados, a artropatia associada menos debilitante do que a presente em pacientes severamente afetados.9 Os pacientes com a forma leve da hemofilia A (6 a 30% de atividade do fator VIII) apresentam episdios de sangramento infreqentes e a doena pode no ser diagnosticada por anos. Ela pode ser descoberta devido a sangramento excessivo no ps-operatrio, aps trauma e em pacientes que praticam esportes de contato (por movimentos bruscos, quedas, etc). A maioria dos portadores que apresentam nveis de 50% na atividade do fator VIII geralmente no apresenta hemorragias, mesmo em procedimentos cirrgicos. Entretanto, portadores com nvel de fator VIII abaixo de 50% de atividade podem apresentar sangramentos excessivos aps trauma (partos, cirurgias, etc) e por essa razo necessria a mensurao do fator VIII nas pacientes portadoras do gene para hemofilia A. Hematomas Os hematomas so caractersticos da deficincia de fatores da coagulao. As hemorragias no tecido conjuntivo subcutneo ou em msculos podem ser vistas com ou sem traumas conhecidos. Uma vez formados, os hematomas podem se estabilizar e ser absorvidos lentamente sem tratamento. Entretanto, em hemoflicos moderados ou severos, os hematomas tm tendncia a estenderem-se progressivamente, dissecando -

15

reas contguas. Os hematomas retroperitoneais podem dissecar o diafragma em direo ao peito; e os tecidos moles do pescoo, podendo resultar em comprometimento das vias areas. Eles podem tambm comprometer a funo renal quando obstrurem os ureteres. As hemorragias ocorrem em msculos seguindo uma ordem de freqncia: panturrilhas, coxas, glteos e antebraos so as regies que apresentam os msculos mais comumente afetados. Hematomas nessas reas podem levar a contraturas musculares, paralisias nervosas e atrofia muscular. Sangramentos na lngua ou em seu frnulo so particularmente freqentes em crianas jovens e comumente resultam de traumas. Hemartroses Os sangramentos em articulaes respondem por aproximadamente 75% dos sangramentos de hemoflicos. Qualquer junta pode ser envolvida, mas freqentemente h uma articulao alvo, que a articulao propensa a sangramentos repetidos. As juntas mais comumente afetadas so os joelhos, cotovelos, tornozelos, ombros, punhos e quadris, respectivamente. Algumas vezes as hemartroses so precedidas por leve desconforto articular, que num perodo de minutos a horas, torna-se progressivamente doloroso. A junta afetada pode aumentar de volume, tornar-se aquecida e exibir limitao aos movimentos. A hemartrose do joelho mais facilmente detectada pelo exame fsico do que os sangramentos no cotovelo ou ombro. Entretanto, hemorragias repetidas numa articulao podem resultar em destruio extensa da cartilagem articular, hiperplasia sinovial e outras alteraes reacionais no osso e tecidos adjacentes. Uma das maiores complicaes de hemartroses repetidas a deformidade articular, complicada por atrofia muscular e contraturas dos tecidos moles. Osteoporose e cistos sseos subcondrais podem se desenvolver, ocorrendo progressiva reduo do espao articular, que pode ser observada nos radiogramas. A instituio de terapia apropriada precoce, inclusive ortopdica, pode reduzir e at mesmo prevenir estas alteraes.

16

Pseudotumores As leses pseudotumorais so raras, porm complicaes perigosas da hemofilia.9 A maioria dos pseudotumores no est associada com dor a menos que haja crescimento rpido ou compresso nervosa. Quando o volume do cisto aumenta, ele pode comprimir e destruir os msculos adjacentes, nervos e osso. Alguns crescem tanto e envolvem tantas estruturas que se tornam inoperveis. Os pseudotumores desenvolvem-se primariamente no fmur, pelve e tbia, mas podem ocorrer em qualquer local, inclusive o osso temporal. Os pequenos ossos das mos e dos ps so mais freqentemente afetados em pacientes jovens. s vezes pode ser difcil diferenciar pseudotumores de tumores malignos. Bipsias com agulha devem ser evitadas pelo risco de infeco e hemorragia. O nico tratamento efetivo a remoo completa da massa. Se o pseudotumor no for completamente removido, ele pode recidivar. Hematria Virtualmente todos os hemoflicos severamente afetados podem apresentar episdios de hematria. A urina pode apresentar colorao marrom ou avermelhada, dependendo do nvel do sangramento. Muitos desses sangramentos originam-se da pelve renal, alguns se originam do rim e, apenas ocasionalmente ocorrem nos dois lugares. Apesar de alguns considerarem uma leso estrutural como causa da hematria, a pielografia intravenosa e ecografias do trato gnito-urinrio geralmente no mostram leses, exceto presena de cogulos. Se a colorao da urina clareia durante a mico, deve-se suspeitar de sangramento do trato gnito-urinrio baixo. As clicas renais severas podem ocorrer quanto os cogulos obstruem os ureteres. Se a hematria for mnima, sem dor e a histria do paciente no refere patologias do trato gnito-urinrio, o mdico est autorizado a aguardar alguns poucos dias que o sangramento cesse. No entanto, se ele continuar, o tratamento com fator VIII pode ser necessrio.

17

Complicaes neurolgicas As hemorragias intracranianas so o evento mais perigoso nos pacientes hemoflicos. As hemorragias no SNC podem ser espontneas, mas geralmente so precedidas por traumas, mesmo que leves. Os sintomas geralmente ocorrem logo aps o trauma, mas em algumas situaes, eles podem aparecer aps dias ou semanas. Os pacientes hemoflicos com dores de cabea incomuns, especialmente se forem intensas, devem ser sempre investigados quanto presena de hemorragias intracranianas e hematomas subdurais. Quando se suspeita de sangramentos intracranianos, o paciente deve ser imediatamente tratado com fator VIII. As compresses de nervos perifricos so complicaes freqentes de hematomas musculares, particularmente nas extremidades. A compresso do nervo femoral por um hematoma no iliopsoas pode resultar em perda sensitiva da parte ntero-lateral da coxa, fraqueza e atrofia do quadrceps e perda do reflexo patelar. O ulnar o segundo nervo perifrico mais afetado. Os sangramentos nos msculos da panturrilha podem levar a contraturas do tendo de Aquiles. Em resumo, os sangramentos podem ocorrer em qualquer msculo e podem ser seguidos por permanentes defeitos neuromusculares. Hemorragia em mucosas Os sangramentos das membranas mucosas so comuns em hemofilia. Epistaxe e hemoptise freqentemente resultam de infeces ou traumas e sugerem leso de estruturas locais envolvendo o trato respiratrio. As lceras ppticas ocorrem com uma freqncia cinco vezes maior em hemoflicos adultos do que na populao geral.9 O uso de antiinflamatrios para aliviar os sintomas da artropatia do hemoflico uma causa freqente das hemorragias gastrointestinais. Por essa razo, a ingesto de antiinflamatrios (como aspirina) deve ser cuidadosamente verificada na investigao da etiologia de cada sangramento.

18

Sangramentos ps-cirrgicos As cirurgias geralmente resultam em sangramentos excessivos no local da ferida operatria. Os sangramentos podem se arrastar por horas e at mesmo por dias. As cirurgias nesses pacientes so caracterizadas por uma cicatrizao deficiente devido a pobre formao de cogulos. Com uma terapia de reposio de fator VIII apropriada, hemorragias intra e ps-operatrias podem ser prevenidas. As extraes dentrias so os procedimentos cirrgicos mais freqentes nos hemoflicos. A retirada dos dentes-de-leite oferece pouco risco, mas as extraes dos dentes permanentes podem resultar em sangramentos excessivos que podem persistir por muitos dias at que o tratamento seja administrado.

19

Papel do Fator VIII na Coagulao Sangnea

A manuteno da hemostasia aps uma leso ou rompimento vascular alcanada basicamente por 4 mecanismos. O primeiro deles o espasmo vascular, que instantaneamente reduz o fluxo de sangue a partir do vaso rompido. O segundo a formao do tampo plaquetrio, que, em muitas vezes, o suficiente para manter a hemostasia, no necessitando, portanto, da formao de cogulo sangneo. O terceiro mecanismo a formao do cogulo sangneo, no qual agem os fatores da coagulao. O quarto e ltimo mecanismo da hemostasia inicia aps a formao do cogulo, podendo seguir dois caminhos distintos: o da organizao fibrosa ou simplesmente o da dissoluo da crase sangnea.27 Para o melhor entendimento da fisiopatologia da hemofilia A nos deteremos especificamente no fator VIII, uma protena ausente ou presente em pequenas quantidades no sangue destes pacientes, agindo como cofator na via intrnseca da coagulao, considerada a principal via de ativao da coagulao na maioria das circunstncias.7 A via intrnseca comea com uma alterao no sangue ou exposio deste ao colgeno do vaso traumatizado. Esta alterao sangnea causa ativao do fator XII ou de Hageman (XII XIIa) e liberao de fosfolipdeos plaquetrios que contm a lipoprotena chamada de fator 3. O fator XIIa ativa enzimaticamente o fator XI ou antecedente plasmtico da tromboplastina (PTA), na presena de cininognio HMW (alto peso molecular), reao esta acelerada pela pr-calicrena. O fator XIa ativa o fator IX ou fator Christmas que, quando ativado, atua em conjunto com o fator VIIIa, fosfolipdios pla-

20

quetrios e com o fator 3 das plaquetas traumatizadas, ativando o fator X. (ver anexo 1) Apesar da fundamental participao do fator VIII nesse processo, mesmo quando presente em concentraes relativamente baixas no plasma, o organismo conseguir assegurar uma adequada funo de pr-coagulao. Somente uma reduo substancial deste fator (maior que 70%) capaz de levar a distrbios sangneos tpicos da hemofilia A. importante salientar que os fatores IXa e Xa so proteases do tipo serina que tm a capacidade de formarem complexos ligadores de membrana com cofatores especficos, que so protenas no enzimticas: fator VIII no caso do fator IXa e fator V no caso do fator Xa. O complexo fator VIIIa/IXa conhecido como complexo Xase, que cliva o fator X, ativando-o. O fator Xa age com o fator Va formando o complexo protrombinase ou ativador da protrombina.7 A funo destes cofatores acelerar a velocidade das reaes em milhares de vezes. O fator VIII circula no plasma como um grande complexo glicoprotico nocovalente com o fator de von Willebrand (FvW), uma protena multimrica, acentuando a sntese de fator VIII, protegendo-o contra a protelise e aumentando sua concentrao no stio da leso vascular. Durante muito tempo, esta interao causou muita confuso, sendo que somente na dcada de 70 que se conseguiu fazer a distino entre esses dois fatores.1 No entanto, o fator VIII s poder fazer parte do complexo X-ase quando ele conseguir se separar do FvW, visto que esta ligao impede sua ao sobre as superfcies fosfolipdicas de clulas danificadas e plaquetas aderidas. Esta separao requer a clivagem da cadeia leve do fator VIII pela trombina ou pelo fator Xa.1 A atividade da via intrnseca medida pelo TTPA. Observou-se que pacientes com deficincia do fator XII ou do cininognio HMW (com TTPA prolongado) no apresentavam episdios de sangramento, demonstrando, portanto, que esses fatores no so importantes para a ativao fisiolgica da cascata da coagulao. No entanto, a deficincia do fator XI est claramente relacionada a sintomas de sangramento. Este aparente paradoxo parece ser explicado pela recente demonstrao da ativao do fator XI pela trombina e sua auto-ativao pelo fator XIa.7

21

Estrutura do Fator VIII

O gene do fator VIII est localizado no topo do brao longo do cromossomo X (Xq28). Trata-se de um gene de grande tamanho com 186 kilobases (kb), representando 0,1% da constituio total do cromossomo X.29,30 Este gene constitudo por 26 xons, correspondendo a um RNA mensageiro (RNAm) de 9 kb. Dos 26 xons, 24 variam em comprimento de 69 a 262 pares de bases. Os xons 14 e 26 contm 3106 e 1958 pares de bases, respectivamentes, constituindo os maiores xons. Em relao aos ntrons, seis deles so maiores que 14 kb. Incomumente, o ntron que separa os xons 22 e 23 contm a ilha CpG associada com duas transcries adicionais chamadas F8A e F8B. O F8B transcrito na mesma direo que o gene do fator VIII, usando um xon prprio mais os xons 23 a 26 do fator VIII. J o F8A no contm ntrons e transcrito na direo oposta ao gene do fator VIII. Alm disso, duas cpias de F8A esto implicadas em quase metade dos casos de hemofilia A severa via mecanismo de inverso parcial.28 O RNAm do fator VIII codifica um polipeptdeo de 2351 aminocidos, do qual um peptdeo hidrofbico de 19 aminocidos removido durante a secreo,1 formando conseqentemente o fator VIII como uma protena plasmtica de 2332 aminocidos que circula ligado ao FvW, que age como carreador do fator VIII na circulao. O fator VIII constitudo por uma estrutura com seqncias repetidas, onde encontramos trs domnios A (A1, A2 e A3), dois domnios C (C1 e C2) e um grande domnio B central. Este domnio B, codificado pelo xon 14, no tem sua funo claramente esclarecida, contudo parece exercer a funo de conexo. Visto que fatores VIII recombinantes, cujo domnio B estava ausente, mantinham sua funo relativamente

22

normal, mostrando, portanto, que pode ser dispensvel.1 importante salientar que os Fatores V e VIII apresentam estruturas semelhantes, alm de exercerem a funo de cofator na cascata da coagulao. Durante a ativao do fator VIII, o domnio B clivado, resultando em duas cadeias que juntas representam 70% da massa molecular. A cadeia pesada constituda pelos domnios A1 e A2, j a cadeia leve pelos domnios A3, C1 e C2. Entre o domnio A2 e A3 est o domnio B. (ver anexo 2) Embora o fator VIII seja sintetizado como um polipeptdeo de cadeia simples, uma protease ainda indefinida cliva a protena imediatamente aps a sua sntese, tornando o fator VIII plasmtico um heterodmero, cuja cadeia leve de 80 kDa divalente e a cadeia pesada um complexo clcio-dependente que contm quantidades variveis do domnio B. No entanto, posteriormente ocorre a clivagem do fator VIII plasmtico pela trombina ou fator Xa nos stios 372 e 1689 da arginina, essencial para a liberao do fator VIII ligado ao FvW, permitindo que o fator VIII se ligue superfcie fosfolipdica e interaja com o fator IXa. Alm dessas clivagens citadas acima, h ainda uma outra clivagem no essencial no stio 740 da arginina pela ao da trombina ou fator Xa, convertendo a cadeia pesada em um fragmento de 92 kDa.1 A clivagem no stio 372 da arginina, citada anteriormente, converte a cadeia pesada em dois fragmentos, um de 54 kDa e outro de 44 kDa,
31,32,33,34

ambos essenci-

ais para a atividade pr-coagulante. Ao mesmo tempo, um pequeno fragmento da cadeia leve clivado para separar o fator VIII do FvW. Esta clivagem leva ativao do fator VIII, o qual composto pelos fragmentos 54 kDa e 44 kDa da cadeia pesada e pelo fragmento 72 kDa da cadeia leve. Estudos demonstraram que a etapa limitante na ativao do fator VIII a clivagem da cadeia pesada no stio 372 da arginina. O mesmo estudo demonstrou que a associao do fator VIII com o FvW causa um aumento de oito vezes na eficincia de catalizao da trombina na clivagem da cadeia leve, o mesmo no ocorrendo na clivagem dos resduos 372 e 740. importante salientar que a clivagem inicial e a ativao do fator VIII podem ser devido a uma pequena quantidade de fator Xa formado pelo complexo cataltico do fator tecidual e do fator VIIa. Contudo, a formao do fator Xa por este mecanismo

23

rapidamente reprimida por uma via de inibio do fator tecidual. Conseqentemente, o fator X passa a ser clivado pelo fator IXa, sendo este mecanismo acelerado por feedback positivo gerado pela trombina que ativa o fator VIII. A funo de cofator exercida pelo fator VIII prontamente perdida, no pela ao de protelise pela trombina ou fator Xa, mas sim pela prpria instabilidade molecular deste fator que resulta da dissociao de suas subunidades. A protena C ativada tambm exerce papel importante na inativao, clivando-o nos stios 336 e 562 da arginina.35,36,37

24

Gentica Molecular

Existe um amplo espectro de defeitos genticos que atingem o gene do fator VIII. A caracterizao das mutaes tem sido feita de maneira lenta, devido ao grande tamanho do gene, que permite que haja vrios pontos de mutaes que no afetam stios da enzima de restrio, microdelees que esto abaixo dos limites de resoluo do Southern blotting e mutaes dentro de ntrons. Recentemente, algumas limitaes puderam ser solucionadas com o uso da tcnica de eletroforese por gel com gradiente de desnaturao, permitindo a deteco de alteraes em um nico nucleotdeo, e da tcnica que se baseia no uso da transcrio reversa do RNA mensageiro por PCR (RTPCR). Aproximadamente um tero dos pontos de mutaes que ocorrem no fator VIII esto localizadas no dinucleotdeo CpG, considerado um ponto quente para mutao no genoma humano.28 Youssoufian et al. (1987) chegou a esta concluso ao observar que citosina metilada pode espontaneamente desaminar a tiamina, resultando numa transio C para T no DNA.38 Alm deste ponto, um grande nmero de mutaes de um nico par de base tem ocorrido no stio da endonuclease de restrio Taq1. A Taq1 reconhece a seqncia TCGA, e mutaes neste stio podem ser diretamente detectadas pela perda deste stio de clivagem.28 Os diversos defeitos genticos que atingem o gene do fator VIII podem ser agrupados em vrias categorias: rearranjos, substituio de uma nica base de DNA levando tanto a uma substituio de aminocidos (missense) ou a um trmino prematuro na cadeia peptdica (nonsense ou mutao em parada), delees na seqncia genti-

25

ca variando de um nico par de base a todo gene, ou ainda, insero de DNA de tamanho varivel. Rearranjos Gnicos Consistem basicamente em uma nica inverso responsvel por mais de 40% de todos os casos de hemofilia A severa. Durante muito tempo tentou-se descobrir a causa de mutaes em pacientes severos por amplificao por PCR de todos os 26 xons. No entanto, somente em 50% dos casos estas mutaes foram encontradas. No restante dos pacientes, todas as seqncias dos xons foram normais, sugerindo que alguns casos de hemofilia A eram devido a mutaes fora da regio codificadora do fator VIII. Contudo, com a utilizao do RT-PCR do RNAm neste pacientes, verificou-se que no era possvel a amplificao entre os xons 22 e 23. Hoje sabido que em todos esses pacientes h uma grande inverso e translocao dos xons 1 a 22, juntamente com os ntrons, com os xons 23 a 26, cujo mecanismo uma recombinao homloga entre o gene F8A no ntron 22, cuja funo ainda desconhecida, e uma cpia F8A extragnica de 400 Kb 5 do gene do fator VIII. Ou seja, h uma mutao no ntron 22 devido presena de duas reas no topo do cromossomo X (2 cpias de gene A) com seqncias homlogas a uma nica cpia dentro do ntron 22 do gene do fator VIII. Assim, a inverso ocorre devido a uma recombinao homloga entre o pequeno gene A dentro do ntron 22 e uma das duas cpias adicionais do gene A localizadas distantes do fator VIII, resultando na inverso do segmento do gene do fator VIII que inclui os xons 1-22. Isto leva a uma remoo da terminao C da protena codificada pelos xons 23-26, ocasionando uma perda completa da funo deste fator. Com esta descoberta, por meio da anlise feita por Southern blotting, que detecta esta inverso com o uso da enzima de restrio BclI e o gene A como probe, agora pode-se identificar o defeito em aproximadamente 45% dos casos de Hemofilia A severa.28 Sabe-se que um nico erro no crossing-over durante a meiose espermatognica pode levar fragmentao do gene, com subseqente formao de gametas mutados. Esta descoberta traz implicaes clnicas importantes, visto que as mulheres geradas

26

destes gametas podem ser carreadoras da mutao, mesmo na ausncia de uma histria familiar. Na verdade, estudos familiares demonstraram que a origem para tal inverso quase que exclusivamente de um gameta de um homem normal. Recentemente, determinou-se que os dois tipos mais comuns de inverses so a cpia distal de F8A, responsvel por 35% dos casos de hemofilia A severa, enquanto que o crossing-over com a cpia proximal responsvel por aproximadamente 7% dos casos.28 Substituio de nica Base H aproximadamente 309 tipos diferentes de substituies de base nica descritos. Destas, 85% levam alterao de um nico aminocido mutao missense; 14% levam criao de um cdon de parada mutao nonsense, enquanto que em casos espordicos, o splicing do RNAm do fator VIII pode estar alterado ou ausente. O cdon do aminocido arginina (CGA, CGC, CGG) freqentemente afetado por mutaes nos pontos quentes. Dependendo de qual segmento do DNA afetado, poderemos observar tanto cdon de parada (TGA) como um cdon para o glutamato (CAA), cistina (TGC) ou glicina (GGC). Mutaes missense podem interferir na ativao ou funo do fator VIII, resultando em vrios tipos de fentipos que variam de moderado a severo, dependendo do tipo especfico do aminocido substitudo. Por exemplo, algumas substituies de diferentes aminocidos tm sido observadas substituindo a arginina do cdon 372, stio no qual a trombina age para ativar o fator VIII.28 Mutaes nonsense resultam, quase que invariavelmente, em hemofilia A severa, devido formao de uma molcula de fator VIII truncada. Delees As delees presentes no gene do fator VIII contribuem para 5% dos casos de hemofilia A,1,9 sendo freqentemente associadas doena severa. Estas delees podem ocorrer nas clulas germinativas tanto masculinas como femininas. Foram dividi-

27

das arbitrariamente em grandes delees e pequenas delees, cujo limite de 100 pares de bases. Grandes Delees Neste grupo, h delees desde menos que 1 kb at mais que 210 kb, deletando praticamente todo o gene. O mecanismo mais provvel das grandes delees a recombinao no-homloga., sendo responsvel por aproximadamente 5% dos casos severos de hemofilia A. Estas grandes delees quase que invariavelmente levam doena severa, cuja atividade plasmtica do fator VIII no pode ser medida e antgenos no detectados. H apenas 3 relatos de casos de doena moderada envolvendo grandes delees dos xons 22 e xons 23-24 associados. Estas delees podem ser resultado do splicing do RNAm que deleta o xon 22 ou ambos xons 23 e 24, com subseqente secreo de fator VIII hipoativo pela perda dos aminocidos 52 ou 98 respectivamente.38 importante salientar que estes pacientes tm um grande risco (38%) de desenvolverem inibidores do fator VIII, ou seja, anticorpos anti-fator VIII, embora ainda no haja correlao bvia entre o tamanho da deleo e a tendncia a desenvolver estes inibidores.28 Pequenas Delees Neste grupo h delees desde 1 at 86 pares de bases, que esto distribudas atravs dos xons e quase todas associadas doena severa. H relatos, porm, em que pequenas delees que no alteram a matriz de leitura do gene resultam em doena moderada.9 No entanto, se compararmos estes pacientes com os de grandes delees, veremos que o risco de desenvolverem inibidores para o fator VIII menor (9,6%).28 A maioria destas delees produz mutaes do tipo frameshift (mudana de matriz de leitura) e conseqentemente abolio da expresso do fator VIII. H um pon-

28

to quente de uma deleo A simples num segmento de 9 bases A nos cdons 11911194, onde uma nica insero tambm foi vista.28 Inseres As inseres relatadas at ento variam em tamanho de 1 par de bases a 2,1 kb, todas elas associadas doena severa. A insero L1 (LINE-1) caracterizada por elementos genticos encontrados no genoma humano que carregam similaridade ao DNA da transcriptase reversa retroviral.38 No entanto, o nvel de antgeno do fator VIII no conhecido, conseqentemente, no se sabe se esta protena variante inativa ou expressada em grau inferior ao normal.

29

Diagnstico

Diagnstico Clnico Em pacientes hemoflicos, a tendncia ao sangramento diretamente relacionada deficincia de fator VIII da coagulao presente no plasma. Os sangramentos podem ocorrer em qualquer local. Entretanto, os stios mais comumente afetados so as articulaes (joelhos, tornozelos e cotovelos), os msculos e o trato gastrointestinal. Hemartroses espontneas so to caractersticas da hemofilia que podem ser consideradas virtualmente como diagnsticas para a doena. Pacientes com a forma leve de hemofilia sangram somente aps grandes traumas ou cirurgias; aqueles com hemofilia moderada sangram aps traumas mdios ou cirurgias; e aqueles com hemofilia severa podem sangrar espontaneamente. Muitos hemoflicos so atualmente infectados pelo HIV devido transmisso pela infuso de concentrados do fator VIII no passado, sendo que muitos tm desenvolvido a AIDS. A trombocitopenia imune associada infeco pelo HIV pode agravar a tendncia a sangramentos. Diagnstico Laboratorial Na hemofilia A, o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) est prolongado. Entretanto, as outras medidas da coagulao, incluindo contagem de plaquetas, tempo de pr-trombina (TP), tempo de sangramento e nvel de fibrinognio so normais. Nveis plasmticos ativos do fator VIII da coagulao encontram-se reduzidos, mas as medidas do fator de von Willebrand so normais.

30

Se misturarmos uma amostra de plasma de um paciente hemoflico com plasma normal, o TTPA da mistura ser normal. Falhas na normalizao dos valores do TTPA aps a mistura indica que o plasma do paciente hemoflico apresenta anticorpos inibidores do fator VIII. Cabe ressaltar tambm que o achado de plaquetopenia em pacientes hemoflicos nos indica a possibilidade de haver trombocitopenia imune, causada pela associao com infeco pelo HIV16. Diagnstico Gentico A introduo da reao em cadeia da polimerase (PCR) para a amplificao especfica in vitro de curtos segmentos de DNA tem revolucionado a anlise das mutaes no DNA. O DNA genmico pode ser retirado de um paciente hemoflico, por exemplo, pela coleta e separao de glbulos brancos sangneos. Aps, todo o segmento, inclusive as zonas de juno (splicing) entre xons podem ser amplificadas pelo uso de um primer especfico para a determinada seqncia de DNA: os segmentos amplificados podem ento ser diretamente seqenciados para indicar a presena de qualquer um dos defeitos possveis causadores de hemofilia A. H, entretanto, dois problemas com esta abordagem da anlise do gene do fator VIII: 1) o grande tamanho da regio codificadora 26 xons com mais de 9 Kb de seqncias codificadoras a serem estudados; e 2) essa estratgia pode no detectar rearranjos gnicos (inverses) onde a seqncia de xons esteja inalterada. Estas e outras consideraes devem ser analisadas para adoo de outras estratgias que, dependentes do PCR, trazem facilidade e rapidez na identificao desses defeitos, como o RT-PCR. Para a deteco de mutaes missense, uma variedade de mtodos baseados em gel tem sido usados para avaliar um xon em particular por seqenciamento (Michaelides et al 1994), ao passo que rearranjos no-delecionais podem ser detectados pelo mtodo de Southern blotting usando um probe correspondente regio F8A do ntron 22 (Lakich et al 1993). Diagnstico Diferencial

31

Inicialmente, a hemofilia A deve ser distinguida de outras patologias que causem um tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) prolongado. Atravs de exames laboratoriais (dosagem dos fatores da coagulao) este diagnstico diferencial facilmente feito quando encontramos nveis de fator VIII reduzidos.16 Tabela 2 Diagnstico diferencial das causas de TTPA prolongado. Causas que podem gerar um TTPA prolongado: Deficincias congnitas de fatores - Fatores de contato - Fator XII - Fator XI - Fator IX (hemofilia B) - Fator VIII (hemofilia A e doena de von Willebrand) Anticoagulantes - Anticorpo anti-fator VIII - Lpicos - Heparina Clinicamente, a hemofilia A indistinguvel da B (deficincia de fator IX), e apenas estudos laboratoriais podem distinguir estas duas patologias. Nos casos de hemofilia A leve a moderada, necessria uma diferenciao da doena de von Willebrand. Como o fator de von Willebrand liga-se ao fator VIII na circulao e o estabiliza, a deficincia grave do fator de von Willebrand acompanha-se de reduo dos nveis de fator VIII. Isso porque h uma diminuio na meia-vida do fator VIII, pois o fator de von Willebrand (seu carreador) encontra-se diminudo ou ausente. Todavia, ao contrrio da hemofilia, a doena de von Willebrand herdada como carter autossmico dominante, e o paciente pode apresentar uma histria de sangramento do tipo vascular16. Na triagem, o tempo de sangramento deve estar visivelmente prolongado na doena de von Willebrand, ao passo que encontra-se dentro do limite na hemofilia. A investigao adicional deve demonstrar a presena de deficincia ou anormalidade do fator de von Willebrand, com agregao deficiente das plaquetas mediada pelo

32

antibitico ristocetina na doena de von Willebrand, mas no na hemofilia.18,19 Se persistir qualquer dvida quanto ao diagnstico, pode ser til efetuar exames laboratoriais nos membros da famlia, a fim de determinar o padro da herana da deficincia. Uma outra investigao importante das famlias de pacientes hemoflicos identificar quais as mulheres que so portadoras do gene para hemofilia A. Elas podem ser identificadas pela presena de baixa atividade coagulante do fator VIII, mas com nveis normais de antgenos do fator VIII.

33

Diagnstico Pr-Natal e Aconselhamento Gentico

Embora os avanos no tratamento tenham melhorado significativamente o prognstico de pacientes com hemofilia severa, as complicaes do tratamento, incluindo doenas virais e formao de inibidores (anticorpos contra o fator VIII exgeno), alto custo, e necessidade freqente de hospitalizao, geram um nus fsico, psicolgico e financeiro para os pacientes, familiares e sistema de sade. Por estas razes, muitas mulheres parentes de pacientes hemoflicos desejam saber suas reais chances de transmitir a doena. Embora algumas possam ser identificadas como carreadoras baseando-se apenas na histria familiar (filhas de pais hemoflicos), mulheres cujos irmos ou parentes mais distantes so afetados desejam mais do que apenas uma probabilidade estatstica.1 A combinao de anlises laboratoriais pode determinar o status de carreadora ou no carreadora com mais de 95% de sensibilidade em aproximadamente 80% das mulheres avaliadas.39,40,41 Mais recentemente, a anlise do DNA, atravs do mtodo de PCR (polymerase chain reaction), tem sido utilizada para determinao de mulheres carreadoras.42 Dada a habilidade de amplificar e seqenciar cada xon, numerosas mutaes no gene do fator VIII foram identificadas. Logo se tornou evidente que 40 a 50% das mutaes causadoras de hemofilia severa eram indetectveis pelos antigos mtodos de clonagem gnica por resultarem de uma inverso das seqncias de DNA dentro do ntron 22, que excisado do gene do fator VIII. Estas mutaes somente foram detectadas a partir da introduo do mtodo de RT-PCR.43 Mutaes especficas so atualmente utilizadas para a identificao direta de genes com finalidade de diagnstico pr-natal e anlise de pacientes carreadoras.

34

A anlise das mutaes tambm pode ser usada no estudo da predisposio de cada paciente ao desenvolvimento de anticorpos que inativem o fator VIII.8 Dependendo do tipo de mutao do gene do fator VIII, o portador ter diferentes chances de desenvolvimento de inibidores. At a amniocentese se tornar disponvel na dcada de 1970, muitas mulheres que eram carreadoras ou potencialmente carreadoras eram aconselhadas a evitar a gravidez. Quando a determinao do sexo por anlise citogentica se tornou disponvel, algumas gestantes carreadoras escolhiam interromper gestaes envolvendo fetos masculinos em pases cujo aborto era permitido, mesmo sabendo que a chance do filho ser hemoflico era de 50%. Em 1979, a fetoscopia assistida por ultrassonografia tornou possvel a obteno de amostras de sangue fetal entre a 18 e 20 semana de gravidez atravs de cordocentese, e o diagnstico de hemofilia se tornou mais acessvel com o advento de imunoensaios sensveis ao fator VIII.1 Desde 1985, o diagnstico pr-natal se tornou possvel durante a 8 e 10 semana de gestao atravs da anlise do DNA de amnicitos (amniocentese) ou material das vilosidades corinicas.44

35

Tratamento

O tratamento bsico da hemofilia A consiste na restituio da atividade deficiente do fator VIII, mas no se limita a isso. O manejo clnico destes pacientes vai muito alm da reposio do fator deficiente. Eles devem ser avaliados rotineiramente em centros especializados por equipes multidisciplinares. Embora a avaliao geral do paciente dependa de sua condio fsica, ela deve incluir uma anamnese completa e uma avaliao do sistema musculoesqueltico, com recomendaes para programas de exerccios e conselhos para uma boa higiene oral. Para a reposio do fator VIII deficiente, devemos optar entre a utilizao de derivados plasmticos ou de fator VIII recombinante. Segurana, custo e disponibilidade so os principais fatores a serem levados em conta na hora de decidirmos o tratamento para cada paciente. Devido disponibilidade reduzida de fatores recombinantes, os fatores derivados do plasma, atualmente muito mais seguros que no passado, constituem a terapia mais utilizada.1 Os maiores problemas da utilizao destes derivados so sua capacidade de transmitir agentes infecciosos e de induzir a formao de inibidores do fator VIII. Na metade da dcada de 1980, 60 a 70% dos pacientes com hemofilia severa na Europa Ocidental e nos Estados Unidos tornaram-se infectados com o vrus da imunodeficincia humana (HIV), adquirido atravs de concentrados plasmticos.8 Os derivados plasmticos aceitos no momento so o crioprecipitado e o plasma fresco, no sendo utilizado sangue total. A segurana dos fatores derivados do plasma depende da carga viral do concentrado plasmtico e do grau de inativao destes vrus. Os procedimentos atualmente utilizados para a inativao de vrus incluem aquecimento do concentrado a altas

36

temperaturas (80 C ou mais), aquecimento do concentrado at 60 C em soluo com vapor, e a adio de uma mistura de um solvente orgnico e um detergente ao concentrado.45,46 A mistura solvente-detergente amplamente usada devido a sua alta efetividade em inativar os vrus da hepatite B e C e o HIV, entretanto esta mistura no inativa vrus sem envelope lipdico. Esta falha levou a surtos de hepatite A em pacientes hemoflicos.46 Como resultado, hoje so utilizados pelo menos dois procedimentos de inativao viral. Duas preparaes de fator VIII recombinante foram liberadas pelo FDA (Food and Drug Administration) no incio da dcada de 1990. Estudos clnicos demonstraram sua excelente eficcia e a alta correlao entre a dose administrada e os nveis de fator VIII alcanados no plasma.47,48,49,50 Nenhum anticorpo foi formado contra as protenas animais utilizadas na produo dos fatores recombinantes e nenhuma transmisso viral foi verificada. Em pacientes hemoflicos previamente tratados com derivados plasmticos, o fator VIII recombinante freqentemente desencadeou a formao de novos inibidores, limitando sua utilizao neste grupo de hemoflicos. J entre os pacientes previamente no tratados, 25 a 30% desenvolveram inibidores nas primeiras 10 a 20 infuses. Entretanto, em um tero a um meio destes pacientes, os inibidores rapidamente desapareceram ou permaneceram em ttulos muito baixos; assim sendo, a incidncia de inibidores permanentes em altos ttulos no foi maior do que os esperados 10 a 15% encontrados nos pacientes tratados com derivados plasmticos,51,52 levando a crer que os fatores recombinantes no so mais imunognicos do que os fatores derivados do plasma. A escolha do produto adequado para a reposio de fator VIII deve levar em conta trs fatores: os fatores derivados do plasma esto se tornando mais seguros, os fatores recombinantes custam duas a trs vezes mais que os derivados, e a capacidade de produzir fatores recombinantes ainda limitada, podendo gerar perodos de escassez desses fatores. Levando-se em considerao que os fatores recombinantes so considerados to seguros quanto os derivados do plasma, quase todos os pacientes com hemofilia na maioria dos pases recebem derivados plasmticos. Nos Estados Unidos, 60% dos pacientes com hemofilia severa recebem fatores recombinantes. A Itlia e a Inglaterra do prioridade para o uso de fatores recombinantes em pacientes recente-

37

mente diagnosticados, previamente no tratados e em pacientes que ainda no desenvolveram infeces contagiosas pelo tratamento com derivados plasmticos.8 Como curiosidade, em 1985 Lewis et al. publicaram o caso de um paciente hemoflico com cirrose por hepatite crnica viral, adquirida com a terapia de reposio de fatores plasmticos, submetido a um transplante heptico de um doador normal. No perodo ps-operatrio foram detectados nveis quase normais do fator VIII no sangue do paciente.53 Ressaltamos, entretanto, que o transplante heptico no deve ser considerado uma modalidade teraputica, pois seu alto custo e complicaes impedem sua larga utilizao. Um dos problemas de maior dificuldade no manejo clnico da hemofilia o desenvolvimento de anticorpos contra o fator VIII em alguns pacientes. O fator VIII uma protena estranha em muitos pacientes com hemofilia severa, e 10 a 20% destes pacientes desenvolvem formas de inibidores do fator VIII.1 Pacientes cuja hemofilia devido a grandes delees ou mutaes nonsense so mais suscetveis a formar inibidores, embora a deficincia de fator VIII por outras mutaes possa tambm causar aparecimento de inibidores. Em um amplo estudo de coorte com pacientes com hemofilia A, dos quais um quarto possua inibidores, aqueles portadores de mutaes missense e pequenas delees tiveram baixa incidncia de inibidores (4 e 7%, respectivamente), ao passo que naqueles com inverses envolvendo o ntron 22, grandes delees, e mutaes nonsense tiveram uma incidncia muito maior (34%, 36% e 38%, respectivamente).54 Estudos familiares sugerem que as caractersticas da resposta imune herdada afetam a formao de inibidores, entretanto estudos de histocompatibilidade ainda no identificaram um padro que seja consistentemente ligado a qualquer predisposio ou resistncia formao de inibidores. Anticorpos anti-fator VIII usualmente levam a distrbios severos da crase, com sangramentos importantes. O TTPA prolongado, mas os nveis de fribrinognio, TP (tempo de protrombina) e contagem de plaquetas no so afetados. A presena de anticorpos deve der suspeitada em qualquer sangramento severo associado a um TTP prolongado. O diagnstico confirmado por testes combinados e in vivo pela incapacidade de elevar os nveis de fator VIII atravs de concentrados de fator VIII. O tratamen-

38

to de escolha ciclofosfamida, usualmente combinada com prednisona. Plasmaferese para reduzir os nveis de inibidores tambm pode ser til.16 Em pacientes com hemofilia A leve ou moderada, assim como naqueles com doena de von Willebrand, pode ser usado desmopressina (1-deamino-8-Dvasopressina, ou DDAVP), um anlogo sinttico da vasopressina que aumenta a liberao e, por conseguinte, os nveis de fator VIII e do fator de von Willebrand.55,56 Uma vantagem bvia da desmopressina a ausncia de transmisso de doenas e formao de inidores. Embora haja grande variao entre os pacientes, uma dose intravenosa de 0,3 g por quilograma geralmente aumenta os nveis de fator VIII e fator de von Willebrand trs a cinco vezes em relao aos valores basais pr desmopressina em pacientes com deficincia de fator VIII leve ou moderada. Apesar de todos estes avanos no tratamento da hemofilia A, ainda permanece como um desafio para a sociedade o fato de que quatro quintos dos pacientes hemoflicos, principalmente em pases subdesenvolvidos, no recebem qualquer tipo de tratamento.57 A alternativa atual que surge a produo e purificao em larga escala do fator VIII extrado do leite de animais transgnicos, sendo um tipo mais barato de terapia de reposio do fator VIII em pases mais pobres.

39

Doenas Secundrias em Pacientes Hemoflicos

Antes do advento dos procedimentos de inativao viral, a maioria dos pacientes hemoflicos que foram submetidos ao tratamento com fatores plasmticos tornou-se cronicamente infectada pelos vrus da hepatite B, hepatite C e HIV. Estes vrus podem ter srias conseqncias a mdio e longo prazo alm da cirrose heptica e da sndrome da imunodeficincia adquirida: nessas pessoas tambm comum o desenvolvimento de certos tipos de tumores. Um estudo de coorte em pacientes hemoflicos infectados pelo HIV mostrou que a freqncia de sarcoma de Kaposi foi duzentas vezes maior do que a apresentada pela populao geral20. Este mesmo estudo encontrou uma freqncia de linfoma no Hodgkin aproximadamente vinte e nove vezes maior do que a presente na populao geral.20 A cirrose heptica, que se estabelece em dez a vinte por cento dos pacientes hemoflicos cronicamente infectados pelos vrus da hepatite B ou C, aumenta o risco para aparecimento de carcinoma hepatocelular. Estudos mostraram que em pacientes hemoflicos o risco para desenvolvimento deste carcinoma trinta vezes maior que o da populao geral.21 A introduo de terapias anti-retrovirais altamente ativas tem reduzido a morbidade e a mortalidade de pacientes hemoflicos infectados pelo HIV.22,23 Entretanto, combinaes teraputicas que incluem inibidores da protease parecem aumentar a suscetibilidade desses pacientes a sangramentos espontneos, particularmente em locais incomuns, tais como os dedos e articulaes do punho.24,25 A possibilidade de que

40

terapias anti-retrovirais possam aumentar o risco de doenas cardiovasculares precoces em pacientes hemoflicos26 ainda tema de discusso.

41

Terapia Gnica

De todas as doenas genticas, as hemofilias (especialmente a A), apresentam a combinao de fatores que lhes tornam provavelmente as candidatas mais favorveis terapia de reposio gnica. As manifestaes clnicas destas doenas so atribuveis a falta de um nico produto gnico (fator VIII ou IX) que circula no plasma em pequenas quantidades.8 No necessrio um controle muito rigoroso da expresso gnica, visto que um pequeno aumento nos nveis dessa protena (fator VIII) melhora substancialmente os sintomas nos casos severos. O tratamento atualmente disponvel consiste na reposio peridica de produtos plasmticos humanos ou protenas recombinantes que so sintetizadas em tecidos de cultura. A teraputica ideal seria aquela que proporcionasse produo endgena contnua destes fatores, protegendo o paciente de sangramentos e agentes infecciosos que possam estar presentes nas terapias de reposio. Teoricamente, este objetivo pode ser alcanado com a terapia gnica.58 Alguns estudos vm analisando a viabilidade de uma terapia gnica baseada na liberao de fatores virais, os quais seriam responsveis pela expresso do fator VIII. Dois obstculos so encontrados nos estudos em animais. Os vetores baseados nos vrus da leucemia murina de Moloney inicialmente produziram apenas pequenas quantidades de fator VIII devido instabilidade do RNA mensageiro deste fator. Este problema foi corrigido atravs de manipulao dos vetores e uso de DNA complementar (cDNA). Estas mudanas aumentaram grandemente (de 100 a 1000 vezes) os ttulo de vetores virais, mas a transferncia gnica inadequada (transduo) in vivo permanece um problema, visto que os vetores necessitam diviso celular do hospedeiro para uma integrao eficiente.59

42

Atualmente, est em andamento um estudo em pacientes com hemofilia A severa, no qual a terapia baseada na injeo intravenosa de vetores de retrovrus da leucemia murina contendo cDNA para o fator VIII que no possui o domnio B. Os resultados deste estudo ainda no foram publicados.58 Em junho de 2001, Roth et al. publicaram os resultados de um estudo em pacientes submetidos a um tipo diferente de terapia gnica, sem vetores virais. A tcnica se baseia na introduo do gene do fator VIII em fibroblastos da pele ex vivo por eletroforese seguida de implantao destas clulas na cavidade peritoneal dos pacientes.60 Os autores encontraram nveis detectveis de fator VIII em quatro dos seis pacientes que receberam estas clulas; dois pacientes obtiveram nveis superiores a 1,0% do normal, considerado o limiar teraputico. Nenhum dos pacientes desenvolveu inibidores contra o fator VIII. O uso de fator VIII recombinante pde ser diminudo em trs pacientes com os maiores nveis de atividade do fator, e o nmero de episdios de sangramento espontneo diminuiu substancialmente. Entretanto, os nveis de fator VIII foram progressivamente diminuindo e se tornaram indetectveis 10 meses aps a administrao dos fibroblastos modificados em trs dos quatro pacientes. O declnio dos nveis de fator VIII pode ser atribudo ao silenciamento do gene, clearance imunolgico dos fibroblastos, ou senescncia dos fibroblastos primrios aps extensivo crescimento ex vivo. A escolha da via intraperitoneal para a administrao das clulas, embora tcnicamente simples, problemtica por diversas razes. Primeiro, a inabilidade de recuperao destas clulas para anlise deixa muitas questes sem resposta. Uma delas o mecanismo do declnio da expresso gnica; entretanto, h outras potenciais complicaes deste procedimento. Por exemplo, estes pacientes formam adeses como resultado de um processo inflamatrio no peritnio tentando eliminar as clulas ectpicas? E o que acontece com os fibroblastos submetidos s suas capacidades quase mximas de diviso? A transformao maligna plausvel sob estas circunstncias?58 Afora estas questes, os resultados apresentados por Roth et al. so promissores. Nveis detectveis de fator VIII no plasma ainda no tinham sido alcanados por terapia gnica antes deste estudo. A afirmao de que nveis de fator VIII acima de 1,0% so teraputicos ainda discutvel. Mesmo assim, inegvel que o futuro da he-

43

mofilia passa por estes estudos gnicos que investiguem a real capacidade de fazer com que o paciente hemoflico produza seu prprio fator VIII.

44

Referncias Bibliogrficas

1. Hoyer LW. Hemophilia A. N Engl J Med 1994;330:38-47. 2. Levine PH. Clinical manifestations and therapy of hemophilias A and B. In: Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW, eds. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. 2nd ed. Philadelphia: J.B. Lippincott, 1987:97-111. 3. Ingram GIC. The history of haemophilia. J Clin Pathol 1976;29:469-79. 4. White GC II, Shoemaker CB. Factor VIII gene and hemophilia A. Blood 1989;73:1-12. 5. Bloom AL. Inherited disorders of blood coagulation. In: Bloom AL, Thomas DP, eds. Haemostasis and thrombosis. 2nd ed. Edinburgh, Scotland: Churchill Livingstone, 1987:393-436. 6. Otto JC. An account of an hemorrhagic disposition existing in certain families. Med Repos 1803;6:1-4. 7. Rimoin DL, Connor JM, Pyeritz RE. Emery and Rimoins Principles and Practice of Medical Genetics. 3 th edition, 1996:1651-60. 8. Mannucci PM, Tuddenham EGD. The Hemophilias From Royal Genes to Gene Therapy. N Engl J Med, Vol. 344, No. 23, June 7, 2001. 9. Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ. Williams Hematology. 5th edition, 1995:1413-23. 10. Kitchens CS. Occult hemophilia. Johns Hopkins Med J 1980;146:255-9.

45

11. Larsson SA. Life expectancy of Swedish haemophiliacs, 1831-1980. Br J Haematol 1985;59:593-602. 12. Smit C, Rosendaal FR, Varekamp I, et al. Physical condition, longevity, and social performance of Dutch haemophiliacs, 1972-85. BMJ 1989;298:235-8. 13. Goedert JJ, Kessler CM, Aledort LM, et al. A prospective study of human immunodeficiency virus type I infection and the development of AIDS in subjects with hemophilia. N Engl J Med 1989;321:1141-8 14. Holman RC, Rhodes PH, Chorba TL, Evatt BL. Survival of hemophilic males with acquired immunodeficiency syndrome with and without risk factors for AIDS other than hemophilia. Am J Hematol 1992;39:275-82. 15. Jackson JB, Sannerud KJ, Hopsicker JS, et al. Hemophiliacs with HIV antibody are actively infected. JAMA 1988;260:2236-9. 16. Tierney LM, Mcphee SJ, Papadakis MA. Current Medical Diagnosis & Treatment 2001, 40th edition (548-549). 17. Hoyer LW. Immunochemical properties of factor VIII and factor IX inhibitors. Blood Coagul Fibrinolysis 1991;2:11-5. 18. Tuddenham EG. von Willebrand factor and its disorders: an overview of recent molecular studies. Blood Rev 1989;3:251-62. 19. Ruggeri ZM. Structure and function of von Willebrand factor: relationship to von Willebrand' s disease. Mayo Clin Proc 1991;66:847-61. 20. Rabkin CS, Hilgartner MW, Hedberg KW, et al. Incidence of lymphomas and other cancers in HIV-infected and HIV-uninfected patients with hemophilia. JAMA 1992;267:1090-4. 21. Colombo M, Mannucci PM, Brettler DB, et al. Hepatocellular carcinoma in hemophilia. Am J Hematol 1991;37:243-6.

46

22. Palella FJ Jr, Delaney KM, Moorman AC, et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med 1998;338:853-60. 23. Domingo P, Guardiola JM, Ris J, Nolla J. The impact of new antiretroviral regimes on HIV-associated hospital admissions and deaths. AIDS 1998;12:529-30. 24. Racoosin JA, Kessler CM. Bleeding episodes in HIV-positive patients taking HIV protease inhibitors: a case series. Haemophilia 1999;5:266-9. 25. Wilde JT, Lee CA, Collins P, Giangrande PL, Winter M, Shiach CR. Increased bleeding associated with protease inhibitor therapy in HIV-positive patients with bleeding disorders. Br J Haematol 1999;107:556-9. 26. Soucie JM, Nuss R, Evatt B, et al. Mortality among males with hemophilia: relations with source of medical care. Blood 2000;96:437-42. 27. Guyton AC, Hall JE. Tratado de Fisiologia Mdica. 9 ed. Guanabara Koogan, 1997:421-9. 28. The Molecular Pathology of Haemophilia A. Review Article.

http://europe.cfc.mrc.ac.uk. 29. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM, et al. Characterization of the human factor VIII gene. Nature 1984;312:326-30. 30. Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM, et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature 1984;312:342-7. 31. Lollar P, Parker CG. Subunit structure of thrombin-activated porcine factor VIII. Biochemistry 1989;28:666-74. 32. Pittman DD, Millenson M, Marquette K, Bauer K, Kaufman RJ. A2 domain of human recombinant-derived factor VIII is required for procoagulant activity but not for thrombin cleavage. Blood 1992;79:389-97.

47

33. Fay PJ, Haidaris PJ, Smudzin TM. Human factor VIIIa subunit structure: reconstruction of factor VIIIa from the isolated A1/A3-C1-C2 dimer and A2 subunit. J Biol Chem 1991;266:8957-62. 34. Eaton D, Rodriguez H, Vehar GA. Proteolytic processing of human factor VIII: correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity. Biochemistry 1986;25:505-12. 35. Fulcher CA, Gardiner JE, Griffin JH, Zimmerman TS. Proteolytic inactivation of human factor VIII procoagulant protein by activated human protein C and its analogy with factor V. Blood 1984;63:486-9. 36. Walker FJ, Fay PJ. Regulation of blood coagulation by the protein C system. FASEB J 1992;6:2561-7. 37. Fay PJ, Smudzin TM, Walker FJ. Activated protein C-catalyzed inactivation of human factor VIII and factor VIIIa: identification of cleavage sites and correlation of proteolysis with cofactor activity. J Biol Chem 1991;266:20139-45. 38.Youssoufian H, Kazazian HH Jr, Phillips DG, et al. Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature 1986;324:380-2. 39. Zimmerman TS, Ratnoff OD, Littell AS. Detection of carriers of classic hemophilia using an immunologic assay for antihemophilic factor (factor VIII). J Clin Invest 1971;50:255-8. 40. Klein HG, Aledort LM, Bouma BN, Hoyer LW, Zimmerman TS, DeMets DL. A cooperative study for the detection of the carrier state of classic hemophilia. N Engl J Med 1977;296:959-62. 41. Varekamp I, Suurmeijer TPBM, Brocker-Vriends AHJT, et al. Carrier testing and prenatal diagnosis for hemophilia: experiences and attitudes of 549 potential and obligate carriers. Am J Med Genet 1990;37:147-54. 42. Lalloz MRA, McVey JH, Pattinson JK, Tuddenham EGD. Haemophilia A diagnosis by analysis of a hypervariable dinucleotide repeat within the factor VIII gene. Lancet 1991;338:207-11.

48

43. Lakich D, Kazazian HH Jr, Antonarakis SE, Gitshier J. Inversions disrupting the factor VIII gene are common cause of severe hemophilia A. Nat Genet 1993;5:236-41. 44. Gitschier J, Lawn RM, Rotblat F, Goldman E, Tuddenham EGD. Antenatal diagnosis and carrier detection of haemophilia A using factor VIII gene probe. Lancet 1985;1:10934. 45. Mannucci PM. The choice of plasma-derived clotting factor concentrates. Baillieres Clin Haematol 1996;9:273-90. 46. Mannucci PM, Gdovin S, Gringeri A, et al. Transmission of hepatitis A to patients with hemophilia by factor VIII concentrates treated with organic solvent and detergent to inactive viruses. Ann Intern Med 1994;120:1-7. 47. Schartz RS, Abildgaard CF, Aledort LM, et al. Human recombinant DNA-derived antihemophilic factor (factor VIII) in the treatment of hemophilia A. N Engl J Med 1990:323:1800-5. 48. Lusher JM, Arkin S, Abildgaard CF, Kogenate Previously Untreated Patient Study Group. Recombinant factor VIII for the treatment of previously untreated patients with hemophilia A: safety, efficacy, and development of inhibitors. N Engl J Med 1993:328:453-9. 49. Bray GL, Gomperts ED, Courter S, et al. A multicenter study of recombinant factor VIII (Recombinate): safety, efficacy, and inhibitor risk in previously untreated patients with hemophilia A. Blood 1994;84:2428-35. 50. White GC II, Courter S, Bray GL, Lee M, Gomperts ED. A multicenter study of recombinant factor VIII (Recombinate) in previously treated patients with hemophilia A. Thromb Hamost 1997;77:660-7. 51. Luscher JM. Factor VIII inhibitors: etiology, characerization, natural history, and management. Ann N Y Acad Sci 1987;509:89-102. 52. McMillan CW, Shapiro SS, Whiteshurst D, Hoyer LW, Rao AV, Lazerson J. The natural history of factor VIII:C inhibitors in patients with hemophilia A: a national cooperative study. II. Observations on the initial development of factor VIII:C inhibitors. Blood 1988;71:344-8. 53. Lewis JH, Bontempo FA, Spero JA, Ragni, MV, Starzl, TE. Liver transplantation in a hemophiliac. New Eng. J. Med 1985;312: 1189-1190.

49

54. Schwaab R, Brackmann HH, Meyer C, et al. Haemophilia A: mutation type determines risk of inhibitor formation. Thromb Haemost 1995;74:1402-6. 55. de la Fuente B, Casper CK, Rickles FR, Hoyer LW. Response of patients with mild and moderate hemophilia A and von Willebrand' s disease to treatment with desmopressin. Ann Intern Med 1985;103:6-14. 56. Mannucci PM. Desmopressin: a nontransfusional hemostatic agent. Annu Rev Med 1990;41:55-64. 57. Bird A, Isarangkura P, Almagro D, Gonzaga A, Srivastava A. Factor concentrates for hemophilia in the developing world. Haemophilia 1998;4:481-5. 58. Miller DG, Stamatoyannopoulos G. Gene therapy for hemophilia. N Engl J Med 2001;344:1782-4. 59. Miller DG, Adam MA, Miller AD. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replacing at the time of infection. Mol Cell Biol 1990;10:4239-42. 60. Roth DA, Tawa NE Jr, OBrien JM, Treco DA, Selden RF. Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A. N Engl J Med 2001;344:1735-42.