Biologa Celular 2007

Prctico de Bioqumica y Biofsica

PRCTICO de BIOQUMICA y BIOFSICA

La asistencia al prctico y la realizacin de la evaluacin (entrega) son obligatorias. Se deben respetar las listas (ver cronograma de prcticos). Los cambios de grupo deben solicitarse en la Secretara de Biologa Celular.

Introduccin.
El prctico se desarrollar durante cuatro das llevndose a cabo las siguientes actividades: 1- Estudiar la cintica de crecimiento de un cultivo de levaduras. 2- Evidenciar la gluclisis en el cultivo de levaduras, evaluando el consumo de glucosa y la produccin de CO2. 3- Evaluar el efecto de un inhibidor de la gliceraldehdo 3-P deshidrogenasa sobre el crecimiento, la va glucoltica del cultivo de levaduras y la viabilidad celular. 4- Estudiar la respiracin del cultivo de levaduras, midiendo consumo de oxgeno y evaluando el efecto de inhibidores de la cadena respiratoria. 5- Presentacin y discusin de los resultados obtenidos. El primer da las actividades estarn a cargo de los docentes del Departamento de Biofsica, los 3 das siguientes estarn a cargo de docentes del Departamento de Bioqumica.

DIA 1
Se llevarn acabo las actividades descritas en la gua de Biofsica.

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DIA 2 1. Objetivos.
1- Iniciar un cultivo de levaduras y evaluar su crecimiento en ausencia y presencia de un inhibidor de la gluclisis. 2- Evaluar la produccin de CO2 por un cultivo de levaduras en ausencia y presencia de un inhibidor de la gluclisis.

2. Fundamento Terico
El metabolismo celular es una actividad altamente coordinada, en la que muchas reacciones catalizadas por enzimas (vas metablicas) cooperan para obtener energa, y sintetizar y degradar molculas de acuerdo con las necesidades de la clula o del organismo (proliferacin, migracin, etc). Las vas metablicas que participan en estos procesos difieren en los distintos organismos sin embargo la gluclisis se encuentra altamente conservada en la evolucin. En los organismos aerbicos el piruvato producto de la gluclisis es mayoritariamente oxidado totalmente a dixido de carbono (CO 2) en la mitocondria y la energa obtenida en este proceso se utiliza para la sntesis de ATP en la fosforilacin oxidativa, siendo el oxgeno el aceptor final de electrones. Sin embargo, en determinadas condiciones, existe una va alternativa de metabolizacin del piruvato, la fermentacin, que les permite obtener energa rpidamente. Eso ocurre por ejemplo, en el msculo realizando ejercicio intenso, siendo la glucosa fermentada a lactato. De manera similar la levadura Saccharomyces cerevisiae presenta un metabolismo mixto aerbico-fermentativo regulado principalmente por los niveles de glucosa. A concentraciones altas de glucosa la levadura lleva a cabo principalmente la fermentacin alcohlica en la que el piruvato, formado en la gluclisis es convertido a etanol en dos pasos: 1) la descarboxilacin no oxidativa del piruvato a acetaldehdo catalizada por la piruvato decarboxilasa 2) la reduccin del acetaldehdo a etanol a expensas de NADH por la acetaldehdo deshidrogenasa. Se postula que en presencia de concentraciones altas de glucosa la velocidad de la gluclisis excede a la de la reaccin catalizada por la piruvato deshidrogenasa y el piruvato es convertido en etanol. En cambio, cuando las concentraciones de glucosa son bajas y hay oxgeno Saccharomyces cerevisiae no produce etanol. El pasaje de un metabolismo fermentativo a un metabolismo aerbico recibe el nombre de cambio diuxico. En este prctico evaluaremos el consumo de glucosa la formacin de CO 2 y la respiracin de la levadura asociados a la proliferacin en cultivo.

3. Procedimiento experimental
A- Evaluacin del crecimiento y el consumo de glucosa por un cultivo de levaduras. 1- Preparacin del cultivo de levaduras: Preparar en 2 matraces de 125 ml la siguiente solucin: disolver 0.1 g de levadura seca (Saccharomyces cereviseae) en 40 ml de medio de crecimiento (extracto de levadura 1%, glucosa 1%), agitar y llevar los matraces a estufa a 30o C. Agregar 0.4 ml de cloruro de mercurio (HgCl 2) 100 mM a uno de los matraces.

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2- Toma de muestras del medio de incubacin: A los 0, 0.5, 1, 2, 5 y 24 horas de iniciada la incubacin, tomar muestras de 4 ml de material de los matraces 1 y 2 (volcar sobre tubos de centrfuga rotulados). No olvide agitar los matraces antes de la toma de la muestra. Tomar 0.5 ml de cada tubo y agregar 4.5 ml de agua para medir turbidez (absorbancia a 600 nm). Centrifugar el resto de la muestra inmediatamente durante 3 minutos y separar los sobrenadantes (volcando en tubo de plstico parte del sobrenadante, evitando la contaminacin con el precipitado). Guardar los sobrenadantes en tubos rotulados y congelar para realizar la determinacin de la concentracin de glucosa al da siguiente. B- Evaluacin de la produccin de CO2. Preparar en 2 matraces de 125 ml la siguiente solucin: disolver 0.2 g de levadura seca (Saccharomyces cereviseae) en 45 ml de una solucin de glucosa 10 mM. Agregar 0.5 ml de cloruro de mercurio 100 mM a uno de los matraces. Colocar un tubo de ensayo con 2 ml de una solucin de rojo fenol pH 7.4 y taparlos para evitar el intercambio gaseoso con el exterior. Llevar los matraces a la estufa a 30C, y observar las variaciones de color en la solucin de rojo fenol luego de 24 hs.

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DIA 3 1. Objetivos.
1- Utilizacin de un mtodo espectrofotomtrico para determinar la concentracin de glucosa. 2- Determinacin del consumo de glucosa por los cultivos de levaduras, en ausencia y presencia de un inhibidor de la gluclisis. 3- Observacin de los cultivos al microscopio ptico. Ensayo de viabilidad

2. Fundamento terico
Espectrofotometra Cuando un haz de luz blanca atraviesa una masa de agua pura no sufre modificaciones; pero si al agua se le aade permanganato de potasio, la luz que emerge es de color violeta. La solucin de permanganato de potasio permite el paso de luz azul y roja, pero absorbe las dems radiaciones del haz incidente. Analizaremos el fenmeno de la absorcin de luz por una solucin: la figura 1 representa un recipiente transparente que contiene una solucin de una sustancia determinada; sta es atravesada por un haz de luz monocromtica. Si se miden las intensidades del haz incidente (Io) y del emergente (I) se observa que esta ltima es menor que la primera. Esto se debe a que parte de la radiacin que recibi la sustancia en solucin es absorbida por sus molculas. Fig. 1 Io I

l (cm ) La cantidad de luz absorbida por la sustancia depende del nmero de molculas interpuestas en el trayecto del haz, de la naturaleza de la sustancia en solucin y de la longitud de onda () de la luz monocromtica empleada. As para una misma sustancia y para una misma longitud de onda la cantidad de luz absorbida depende de la concentracin de la sustancia en solucin y del espesor de la masa de solucin interpuesta (l). Se define transmitancia (T) a la relacin: T= I/Io La ecuacin que relaciona la transmitancia con la concentracin del soluto (c) y con el espesor de la masa de solucin interpuesta (l) se conoce con el nombre de Ley de Lambert y Beer: T= 10-.c.l : coeficiente de extincin molecular, depende de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda del haz incidente.

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c: es la concentracin molar del soluto l: es el espesor de la masa de solucin interpuesta expresada en cm (paso ptico). Se define absorbancia (A) o densidad ptica (D.O) al cologaritmo de la transmitancia: A= - log T A= .c.l Las medidas de transmitancia se expresan como porcentaje y las de absorbancia en unidades de absorbancia (U.A). Espectro de absorcin: Como ya mencionamos la absorbancia de una sustancia depende de la longitud de onda. El grfico de la absorbancia de una sustancia en funcin de la longitud de onda constituye el espectro de absorcin de esa sustancia. Determinacin de la concentracin de un soluto por medida de la absorbancia: De acuerdo a la expresin lineal de la Ley de Lambert y Beer (A= .c.l) para una sustancia dada y a una longitud de onda dada, dejando constante l, la absorbancia vara nicamente con la concentracin. Este es el fundamento de la aplicacin de la medida de absorbancia para la determinacin de la concentracin de una sustancia en solucin. Dado que generalmente se utilizan cubas de espesor de 1 cm (l): A= .c, de donde = A/c. Es as que para determinar la concentracin (c) basta comparar su absorbancia con la de una solucin de concentracin conocida. La grfica de absorbancia en funcin de la concentracin de la solucin patrn a una longitud de onda dada se denomina curva de calibracin. El rango de concentraciones dentro del cual se cumple dicha relacin es aquel en el que la curva es ajustable a una recta. La pendiente de esta recta corresponde al coeficiente de extincin molecular (). Por lo tanto, para valores mayores de pequeas variaciones de concentracin determinarn mayores variaciones de absorbancia. De lo anterior se deduce que las longitudes de onda a las cuales se deben realizar las medidas de absorbancia deben ser aquellas que correspondan a mayores valores de . El espectrofotmetro: es el instrumento mediante el cual se realizan las medidas de absorbancia y transmitancia. Consta de: fuente de luz: pueden ser lmparas que emiten luz de diferentes longitudes de onda: ultravioleta (200 a 400nm), visible (400 a 750 nm) e infrarrojo. monocromador: es un dispositivo para descomponer la luz policromtica procedente de la fuente, en haces de luz monocromtica. un diafragma: permite controlar la cantidad de luz que incide sobre la solucin y la pureza del haz monocromtico. cubeta: recipiente transparente donde se coloca la muestra. transductor fotoelctrico: est destinado a transformar en corriente elctrica el haz de luz emergente. La intensidad de la corriente que genera es proporcional a la intensidad de luz que recibe.
ampermetro: mide la intensidad de la corriente, expresando los valores en % de transmitancia o unidades de absorbancia.3.

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3. Procedimiento experimental.
A. Determinacin de espectrofotomtrico: la concentracin de glucosa por un mtodo

En soluciones alcalinas calientes, los glcidos reductores reducen al 3-5 dinitrosaliclico (DNS) para dar glcidos oxidados y 3-amino-5-nitrosaliclico, compuesto de color anaranjado intenso con pico de absorbancia a 550 nm. Dicha absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de glcidos reductores y por tanto el mtodo puede utilizarse para cuantificar glucosa realizando una curva de calibracin. 1- Preparacin de una solucin de glucosa: Teniendo en cuenta que el peso molecular de la glucosa es 180 g/mol, preparar por pesada 50 ml de una solucin 10 mM. 2- Realizacin de una curva de calibracin y determinacin de la concentracin de glucosa de las muestras del cultivo. a- Utilizando la glucosa 10 mM preparar por dilucin soluciones de concentraciones conocidas de glucosa y agregar 0.5 ml de DNS a cada tubo (ver tabla): Curva de calibracin del DNS con glucosa: tubo B 1 2 3 4 5 glucosa10 mM (ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1 H2O (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 DNS (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 [Glucosa] (mM)

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b- Tomar 0.1 ml de las muestras obtenidas a partir de los sobrenadantes de los cultivos de levaduras. Agregar a cada tubo 0.9 ml de agua y luego 0.5 ml de DNS. c- Incubar todos los tubos en bao a 100 oC durante 5 minutos. Finalizada la reaccin, diluir todos los tubos agregando 3 ml de agua destilada y leer la absorbancia en espectrofotmetro a 550 nm de longitud de onda, contra blanco de la curva de calibracin. B. Observacin de los cultivos y ensayo de viabilidad. Preparar de los dos cultivos una mezcla de 0.5 ml del cultivo con 0.1 de una solucin del colorante vital Trypan Blue (0.4%). Esperar 5 minutos a temperatura ambiente. Realizar un preparado fresco de cada cultivo y observar al microscopio ptico.

4. Anlisis de los resultados.

1- Graficar absorbancia a 600 nm en funcin del tiempo para los cultivos de levaduras en ausencia y presencia del inhibidor. 2- Graficar A550nm en funcin de [glucosa] (curva de calibracin). Obtener 550nm . 3- Graficar concentracin de glucosa en funcin del tiempo para los cultivos de levaduras en ausencia y presencia del inhibidor.

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DIA 4 1. Objetivo.
12Evaluar el consumo de oxgeno de un cultivo de levaduras. Realizacin de la evaluacin.

2. Fundamento terico
El piruvato producido en la gluclisis puede tener diversos destinos. En la levadura a concentraciones bajas de glucosa y en presencia de oxgeno sufre una descarboxilacin oxidativa a acetil CoA y es oxidado totalmente a CO 2 en el ciclo de Krebs. En esta va metablica tambin se oxidan completamente los esqueletos carbonados de aminocidos, cidos grasos y otras biomolculas. Los electrones derivados de estas reacciones de oxidacin son transportados por el NADH y el FADH 2 a la cadena respiratoria donde el aceptor final es el oxgeno que se reduce a agua. Este proceso conocido como respiracin mitocondrial puede estudiarse midiendo el consumo de oxgeno en el medio utilizando un electrodo de Clark. El electrodo de Clark1 consiste de un nodo de plata/cloruro de plata (B) que rodea a un ctodo de platino (A), ambos estn inmersos en una solucin de KCl saturada (C) y separados de la solucin problema por una fina membrana de tefln (D) permeable al oxgeno, sujetada por una anillo (E). Los electrodos estn polarizados a un voltaje de 0.6 V (F). En el ctodo los electrones reducen a las molculas de oxgeno a agua (reaccin 1) y en el nodo la plata slida (Ag) cede electrones formando cationes (Ag+) que se combinan con los aniones cloruro (reaccin 2). 4H+ + 4e- + O2 2 H2O (1) 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e-

(2)

La transferencia de electrones desde el nodo hasta el ctodo produce una corriente entre los dos electrodos que puede medirse (G) y es proporcional a la presin parcial de oxgeno en la muestra y por tanto a la concentracin de O2. A 20C el agua equilibrada con aire tiene una concentracin de O2 de 260 M.

El electrodo de Clark fue desarrollado por el Dr. Leland Clark en 1956 para medir la

concentracin de O2 de la sangre.

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3. Procedimiento experimental
Evaluacin del consumo de oxgeno por un cultivo de levaduras. 1Calibracin del oxmetro: Agregamos 3 ml de agua destilada a la cuba del oxmetro, burbujeamos con una transfer y esperamos 5 minutos. Colocamos el electrodo de Clark en la cuba cuidando que no queden burbujas y esperamos a que la seal se estabilice. Calibramos el oxmetro al 100 %. Fijamos la velocidad del registrador en 20 cm/hora. 2Consumo de oxgeno de levaduras cultivadas sin y con un inhibidor de la gluclisis: Preparamos diluciones al de los cultivos de levadura utilizados hasta ahora. Para esto tomamos 2 ml de cada uno de los cultivos levaduras (cultivados en presencia o ausencia de HgCl2) los colocamos en 2 tubos y agregamos 6 ml de agua. Tomamos 3 ml de levaduras las colocamos en la cuba del oxmetro, colocamos el electrodo de Clark y medimos el consumo de O2 en el tiempo. Repetimos la operacin con las levaduras tratadas con HgCl2. Comparamos la velocidad de consumo de oxgeno en los dos cultivos. 3Efecto de un inhibidor de la cadena respiratoria sobre el consumo de oxgeno de las levaduras: Colocamos 3 ml del cultivo de levaduras en la cuba del oxmetro, colocamos el electrodo de Clark y medimos consumo de oxgeno en el tiempo. Antes de que la concentracin de oxgeno sea menor a un 60% agregamos con una jeringa 0.1 ml de cianuro de potasio (KCN) 1 mM ([KCN]final = 33 M). Medimos el consumo de oxgeno en el tiempo. Comparamos la velocidad de consumo de oxgeno, antes y despus del agregado de cianuro de potasio.

4. Anlisis de los resultados.

Medir la pendiente del registro de concentracin de oxgeno en funcin del tiempo. a) Calcular la velocidad de consumo de oxgeno de las levaduras cultivadas en ausencia y en presencia de HgCl2. b) Calcular la velocidad de consumo de oxgeno antes y despus de agregar KCN.