BIOTECNOLOGA VEGETAL 1.

Definicin: conjunto de tcnicas, de cualquier tipo, empleadas sobre vegetales como organismos enteros o sobre alguna de sus partes (molculas, tallos, orgnulos, hojas) 2. Objetivos: mejorar las especies, obtener nuevos productos, obtener de una especie productos minoritarios tiles para la industria. 3. Cultivo in Vitro: base de la biotecnologa. Consiste en el cultivo de partes de una planta sin tener la planta. Se realiza a partir de zonas meristemticas (que poseen clulas similares a las clulas madre en animales). Estos meristemos tienen la capacidad de cultivarse y dividirse en determinadas condiciones. Mediante tcnicas de cultivo, si tomo un explanto (fragmento de una planta) y lo coloco en un medio adecuado, se induce la formacin de una nueva planta sin la necesidad de semillas .Estas plantas se llevan a maceta donde se desarrollan. aplicaciones del cultivo in Vitro:

- propagacin de especies en vas de extincin - conservar y cultivar especies de mucho valor - obtener plantas libres de enfermedades cultivando el
meristemo apical, que no tiene conexin con el resto de la planta y est libre de microorganismos.

- micropropagacin (propagacin vegetal in Vitro) rpida

de plantas ornamentales que tenemos en tubos de cultivo y fcilmente se pueden llevar a otros piases y all se colocan en invernaderos.

- Obtencin
juntamos

de

hbridos

incompatibles

sexualmente,

genomas de 2 plsmidos diferentes, que sern HBRIDOS SOMTICOS.

- Obtencin

de

plantas

homocigticas

rpidamente;

sembramos in Vitro vulos, obtenemos la mitad de los genes (haploides), damos colchicina y obtenemos un individuo diploide.

- Transformaciones genticas: introduciendo genes que nos

interesan

- Almacenamiento de plantas en poco espacio - Uso de plantas (previamente transformadas) para purificar
agua, mejorar el suelo, eliminar compuestos txicos, metales) 4. Asepsia fuentes de contaminacin: a. material plstico: se compra estril b. material de vidrio: si es nuevo se lava con agua desionizada, si se reutiliza lavar en autoclave (121) o estufa (140)

c. material metlico; en autoclave a 120, tambin al alcohol a fuego. d. Medio de cultivo: en autoclave a 120 15 min. Si hay sustancias termolbiles no se puede usar autoclave, una vez preparado se hace pasar por cmara de flujo laminar con filtro estril. e. Material biolgico: asepsia superficial con leja, luego eliminar las clulas daadas, las semillas en alcohol etlico (20 seg.) y se evapora al aire. Tambin podemos usar detergentes f. rea de trabajo y cultivo : el cultivo se desarrolla en una cmara de aire forzado. El uso de luz UV mantiene la asepsia, pero el 03 liberado es txico. Las placas se sellan con parafilm.

Procedimiento 1. limpiar el material con agua 2. preesterilizacin: 5-30 seg. con etanol 3. desinfeccin con agente tensioactivo 4. lavar con agua estril 5. diseccin con material con pinzas estriles (flambear) 6. cerrar y sellar placa con film de parafina

pruebas de esterilizacin Enturbiado (medio lquido) Aparicin de colonias Mal olor preasepsia. Para evitar posible contaminacin: almacenamiento en fro, estimulacin climtica, tratamientos preculturales 5. Medios de cultivo: el ms habitual es el medio MS, aunque no existe el medio perfecto. Puede ser: Sinttico: formados por componentes perfectamente definidos. Complejos: formado por algn compuesto no definido. Estn formados por: a. nutrientes orgnicos: sales de fosfato, N en forma de nitrato o amonio, Fe a pH= 5.2. se recurre a quelantes. b. Nutrientes orgnicos: fuente de energa porque no hacen fotosntesis, fuente de C: sacarosa, fructosa, poli OH vitaminas: biotina, tiamina.

c. Sustancias reguladoras del crecimiento: auxinas (naturales= AIA o sintticas=2,4 -D) Citoquininas (naturales =ZEA o sintticas= KIN).

d. gelificacin: aadir gelificante en medio semisol. e. Condiciones fsicas: luz/ oscuridad .T de 25. Gases: sin problemas excepto por la acumulacin de etileno. 6. Niveles de modificacin Molecular a. A nivel genmico: mapeado y aislamiento de genes de inters. mapeado: identificar genes de un rasgo determinado (tamao). Arabidopsis thaliana, Pirus taeda: deforestacin) aislamiento: los genes puede ser que se expresen

- constitutivamente: siempre y en todos los sitios. - Selectivamente: slo en una parte (fase) por ej. Cuando
florece. Podemos hacer que un gen constitutivo se exprese

selectivamente, tambin podemos silenciar los genes (que no se expresen): interesa que la almendra no produzca amigdalina. b. Control de rutas metablicas se puede modificar la actividad enzimtica. se pueden potenciar rutas minoritarias, obteniendo

metabolitos secundarios.

 hacer que una planta deficitaria en a no lo sea. mejorar la ruta de las protenas

c. Desarrollo y diferenciacin favorece el crecimiento de plantas en condiciones diferentes a las de su naturaleza favorecer el crecimiento en races controlar la talla (pinos ms largos y menos ramificados) captar energa para incrementar la biomasa hacer que los frutos duren ms tiempo tras su recogida d. Interacciones con el medio el medio puede ser :abitico, bitico(insectos, hongos) conseguir plantas resistentes al calor y tolerantes al fro plantas resistentes al ataque de patgenos -formando FITOALEXINA - lanzando compuestos al aire - organismos que protegen

 plantas resistentes a la salinidad, a la sequa Estructural (crecimiento)

- para ello, incidimos sobre los parmetros que hacen crecer

a la planta.

- Las plantas pueden crecer: aumentando el nmero de

clulas y aumentando el tamao de las clulas. El crecimiento de una planta es el sumatorio de los procesos de divisin celular y diferenciacin celular. Con la divisin se aumenta el nmero de clulas. Con la diferenciacin, incrementa la diversidad celular, no incrementa la materia orgnica.

- el crecimiento celular depender (la diferenciacin): de

relacin de crecimiento, direccin de crecimiento y capacidad de divisin.

- Para que una clula vegetal crezca hay que ablandar la

pared celular, esto se consigue, disminuyendo el pH, con auxinas, accin enzimtica. Ha de ablandarse pero no en exceso.

- Una vez ablandada, se van depositando capas de celulosa

de forma: apical (clulas alargadas y plantas de gran porte) o difusa (en tallos, frutos, crecimiento en grueso). La depositacin la dirigen los tbulos que forman el citoesqueleto celular.

- La divisin celular da lugar a la formacin de una capa de

clulas, la

divisin tambin est algo influenciada por los tbulos, si rompemos el plano de divisin creado por los tbulos: crecimiento anrquico. La divisin tambin est influenciada por la luz, el calor

- El ncleo condiciona la estructura del vegetal:

o FITMERO: estructura entre 2 hojas, formado por nudo, entrenudo, hoja y yema. o PICE: zona apical por donde crece la planta, tambin controla la salida de hojas o CLULAS TRAQUEALES: clulas conductoras. Su produccin est controlada por tbulos. o CLULAS TOTIPOTENTES: mantener sus genes y reiniciar su divisin clulas susceptibles de

7. Tcnicas ms habituales en cultivo in Vitro 1. Por semillas 2. Por esquejes

3. Por biperismo totipotentes, 4. vegetativa para

las clulas vegetales, al ser

cualquier parte de la planta vale

proliferar ORGANOGNESIS: ruta que conduce a la diferenciacin de meristemos que originarn tallos o races adventicias, respectivamente. Hay que regenerar la planta (organognesis). Cojo yemas auxiliares, para conseguir una planta clnica. Es un proceso rpido, muy til para plantas de mucho valor (slo obtenemos tantas plantas como yemas hay). Estas yemas en un medio adecuado dan tallos. Tambin podemos promover la formacin de tallos adventicios (tallos que no haba). Esto se hace cogiendo un explanto que se somete a unas condiciones adecuadas, inicialmente tengo un callo (masa de clulas indiferenciadas) en los bordes o lesiones del explanto, tras un tiempo se formarn internamente. Tras un tiempo aparecen rganos (dependiendo de si en el medio hay auxinas o citoquininas). Puede haber organognesis directa: cuando los rganos se originan directamente del explanto en ausencia de proliferacin del callo, aunque normalmente es indirecta. Puede haber variacin somoclonar cuando hay clulas que mutan espontneamente. Tambin podemos recurrir a la embriognesis somtica, con el fin de obtener embriones somticos (es una ruta alternativa a la organognesis). Un embrin somtico se forma en el cuerpo de la planta por los diferentes tratamientos, son estructuras bipolares. Para que se forme un embrin somtico, hay que inducirlo, el principal inductor son las hormonas.

Puede haber embriognesis directa: si en la superficie del explanto se forma directamente el embrin. Puede haber embriognesis indirecta: si en la superficie del explanto, se forman callos y sobre este callo surge el embrin. La embriognesis puede ser: a. zigtica: el zigoto est dentro de la planta protegido por ella. b. Somtica: es ms variable.

Para inducir la formacin de un embrin somtico es imprescindible un tratamiento con auxinas (2,4-D) y una vez que se ha inducido el crecimiento del embrin hay que retirarles del medio ya que en vez de estimularse, se inhibe. Adems de auxinas, en el medio ha de haber Potasio y Prolina que desarrollan algo ms los embriones. Para el desarrollo y maduracin del embrin podemos utilizar medios, lquido o slido. Las auxinas hacen que se formen clulas ms densas de los normal que son las que luego darn el embrin. Cuando quitamos las auxinas se forman glomrulos de clulas: FASE GLOMERULAR DE EMBRIN. Los glomrulos pasan por distintas fases: Estado de corazn fase de torpedo estado cotiledn embrin 2

8. Diferencias entre embriognesis /organognesis:

- EMBRIN: estructura bipolar, surge normalmente a partir de

una clula, pices cerrados y hay conexin entre ellos.

- RGANO: formacin de estructura monopolar, surge a

partir de de varias clulas, tallos y races se forman de modo independiente, pices sin cerrar.

- EMBRIN CIGTICO: de embrin pasa a semilla - E. SOMTICO: de embrin pasa directamente a planta

9. Obtencin de plantas haploides: Las plantas haploides tienen la mitad de la dotacin cromosmica y no suelen ser viables. Podemos obtener: plantas andrognicas (2n) a partir del polen (n) o plantas ginognicas(2n) ms viables pero ms difciles de manejar a partir del vulos(n).

- ANDROGNESIS: obtener una planta a partir del polen. No

hay que esperar a que se forme el polen, quito las antenas y la coloco en un medio adecuado, pueden ocurrir 2 cosas: que se forme callo, embrin (n), o que haya embriognesis directa, embrin (n), aunque tambin pueden ser 2n. Si cultivo el polen se forma un embrin n, nunca uno 2n. Para ver si la planta formada es n o 2n lo hacemos por citometra, flujo, PCR

- MICROSPOROGNESIS: formacin normal del polen - CULTIVO NODRIZA: cultivo en el que se aprovecha un
cultivo previamente hecho como soporte.

- GINOGNESIS: obtener una planta a partir del vulo.

Obtenemos plantas

ms verdes mientras que en la andrognesis hay 60% albinas, sin clorofila que no proliferan. Es ms complicado porque no es fcil separar el vulo nitidamente.

- Fecundacin de 2 plantas filogenticamente separadas,

perdemos una dotacin cromosmica(n)ej. Hard vulgare+ h. Bulvoso. 10. Cultivo de rganos: raz + agrobacterium rizogeus: obtenemos races peludas que son muy estables.

1. INGENIERA GENTICA, TRANSFORMACIN Y MANIPULACIN: la tcnica consiste en: 1.1 Identificar los genes: una manipulacin gentica puede ser aditiva o eliminativo. 1.2 Extraccin del gen: se necesita una secuencia determinada que se corta con enzimas de restriccin que son enzimas especficas de secuenciacin que cortan por un punto determinado

1.3

Multiplicacin: amplificacin, para ello introduzco el gen en una bacteria y as se

obtienen muchas copias. 1.4 Introduccin del gen en una planta (formas alternativas):utilizo algn vector (bacteria, virus) lo ms habitual es introducirlo en un plsmido (se corta la parte del plsmido que interesa y se introduce un gen, as ya se tiene el gen en la bacteria) cuando la bacteria ataque la planta, introduce el gen, que va al genoma de la planta. El vector ms usado es el Agrobacterium. Otras alternativas son : bombardeo con partculas, proyectar partculas a gran velocidad para que se introduzcan en las clulas: MICROBIOLSTICA. Las partculas pueden ser An (caras, regulares y uniformes) o Tusteno (baratos pero irregular). Estas partculas se recubren con el gen que yo quiero meter, la ventaja es que no hay que liminar bacterias con Ab. Otro sistema es la ELECTROPROPAGACIN: utilizacin de protoplastos y una serie de liposomas. Mediante una corriente elctrica los liposomas se fusionan (con el gen dentro) con la membrana del protoplasto (clula vegetariana sin pared celular) y as el gen puede llegar al ncleo. Tambin con jeringas 1.5 Eliminacin de la bacteria: con Ab una vez el gen est dentro de la planta 1.6 Regeneracin de la planta. Marcadores. Planta transgnica: lo

primero es saber qu clulas contienen el gen, eso es sencillo porque en el gen que nos interesa, existe adems del promotor y una fase Terminal, tiene un gen marcador o de seccin. TIPO DE MARCADORES:

- de resistencia: por ej. La KANAMICINA: las clulas que

presenten resistencia a la Kanamicina, sern los que contienen el marcador y por lo tanto nuestro gen. Esto se ha rechazado porque puede resultar peligroso para los hombres

- de coloracin: se usan dos

o gen productor de antocianinas: las clulas se ponen de color azul o gen de la glucorinato sintetasa (GUS): las clulas con este gen, en presencia de un sustrato comercial, liberan un colorante azul que no es permanente.

- de fluorescencia: hay que irradiar con luz UV

gen de la luciferasa: irradian fluorescencia protena fluorescente verde (GFP): luminosidad verde. Una vez que tengo las clulas con un gen, regenero la planta y ya se tiene una planta transgnica (plantas obtenidas artificialmente mediante tcnicas de ingeniera gentica, alterando alguno de sus genes con el fin de obtener algn tipo de beneficio) Se ha encontrado una alternativa que consiste en introducir los genes en los cloroplastos y no en el ncleo celular, ya que los cloroplastos son especficos de clulas vegetales. 1.7 1.7.1 Ventajas de introducir los genes en los cloroplastos: Los genes se introducen en los cloroplastos de forma definida y no al azar 1.7.2 Una clula vegetal tiene muchas copias del cloroplasto, es ms rentable

1.7.3 La sntesis que se produce en los cloroplastos, no va a afectar al resto de la clula 1.7.4 Hay menor posibilidad de contaminacin con genes extraos si transforma los cloroplastos

2. LOGROS Y POSIBILIDADES DE LA BIOTECNOLOGA VEGETAL

2.1 En agricultura: - domesticacin de plantas: en este caso se abandona una variedad de beneficio de otra. .- el maiz antes tena muchas espigas y pocos granos, ahora se ha conseguido que con 2 espigas tengan ms granos. .- hay una serie de genes que se transmiten juntos, si se logra contar todos, tendremos una planta domesticada, pero no es posible en todos los casos. conseguir ms a menos coste: manipulando la siembra, el riego

aumentando la produccin.(aumenta el potencial gentico) - semillas resistentes a determinadas hervicidas -conseguir nuevas variedades - hacer plantas tolerantes a determinados alimentos o resistentes a sustancias txicas (aluminio citratosintetasa) - microrizas: hongos sobre las races principales, hacen que exista una capa hmeda.

-infectar la planta con organismos que capten N2 y as la planta puede fijar N2. -favorecer la absorcin de H2O variando el dimetro radicular mediante modificacin hormonal, regular tamao de hoja y modificando los sistemas estomticos. -plantas resistentes a agentes biolgicos para no tener que hacer uso de pesticidas. Resistente a: Virus: hacer que la planta exprese genes sin sentido. Explanaos sin virus para obtener la planta Bacterias: con la produccin de fitoalexinas que son componentes antimicrobianos de bajo Pm, que se sintetizan y acumulan en las plantas despus de la exposicin al organismo. Su produccin se dispara por la accin de los ELICITORES. Hongos: produccin de Ab. Haciendo que se exprese la estilbeno sintetasa que provoca la sntesis de resveratol que inutiliza al hongo(en la va). Produccin de quitinasa que destruye al hongo mediante lisis (arroz resistente al hongo)

Insecto: se puede usar baculovirus: el insecto se lo come y muere Insecticidas interior. Nemtodos: casi todos los nematicidas estn prohibidos Plantas resistentes a Ab: T: introducir genes CORI 5 que la hacen resistente al fro. naturales: el Bacillus Thurigensis, al

esporular produce un cristal que si es comido por el insecto, destruye su

 desrticas)

segura:

introducir

genes

mesembriaterum

(de

zonas

hervicidas: introducir genes BAR: tolerancia a fosfatos

2.2 En alimentacin : interesa eliminar agentes que afecten a la cosecha, hacer que el coste sea menor que la produccin, aumenta el consumo de otros vegetales, aumenta el tamao de los sumideros (alta produccin alimentos/hectrea) alta calidad de los alimentos.

- protenas protenas: Animales: ms completas Ms caras Vegetales: ms carencias Ms barata -cereales: dficit de Lys

- legumbres: dficit de a azufrados - alfalfa: dficit de a azufrados

Hacemos

modificaciones

introduciendo

genes

que

aumenta el contenido en a deficitarios. - patatas transgnicas ricas en triptfano - colza americana rica en lisina - alfalfa rica en a azufrados= mejor lana - girasoles ricos en metionina - trigo con ms gluten para harinas diferentes - grasas grasas: alargar la cadena de cidos grasos; soportan mejor el calor y as podemos reutilizar el aceite. se potencian los de tipo oleico - glcidos glcidos: muchas o pocas ramificaciones del almidn para bollera, pan transformar celulosa en fructano que no aporta caloras??? menos cantidad de lignina (sabor desagradable) introduciendo un gen sin sentido/ contrasentido. alfalfa con fitasa que mejora el metabolismo - carotenoides carotenoides: usando genes (narciso y agrobacterium) se han conseguido arroz con carotenos que no hay en el arroz corriente y que provoca avitaminosis en Asia. astaxantina que da color rosita al salmn.

- minerales minerales: gen de la ferritina introducido en el arroz, as aporta 100 veces ms de Fe. eliminar cianoalanina (latinismo)de alimentos mediante cruces se ha obtenido la colza doble O que no posee cido ercico (malo) - frutos y semillas semillas: frutos que duren ms tiempo: flave-save: tomates que duran incluso un mes, alterando peptidasas. flores que duren ms tiempo: actuando sobre receptores de etileno frutos sin semillas: para mejorar el paladar, facilitar

elaboracin de tomates, Ketchup, actuando sobre auxinas. caf descafeinado del rbol: introduccin de xantin-7transferasa (enzima productora de cafena) que es una enzima sin sentido (caf con 1- 2% cafena)

NORMAS DE LA OMS PARA EL CONSUMO DE TRANSGNICOS: 1- No contener sustancias peligrosas 2- No superar la toxicidad permitida 3- Advertir la presencia de compuestos nuevos o alergnicos

2.3 Industriales

- grasa vegetal/aceites usados como combustibles (diesel) o lubricantes en hidrulica. -aceites que valen como aislantes, adhesivos, emulsionantes. -obtener algodn de colores, usando plantas de algodn transgnicas - detergentes: la subtilisina es una enzima que destruye la grasa, se est modificando para que adems sea resistente a la leja. -aditivos y colorantes -espesantes -obtencin de plsticos biodegradables mediante bacterias que son capaces se sntesis de polihidroxivaleratas. 2.4 En sanidad: .- glucobrassicina: protege el estmago .- cataratas: antileucmico .- obtencin de vacunas orales .- en tomate se ha introducido el gen spaA del tabaco que inhibe la adhesin a piezas dentales (menos caries) 2.5 En el medio ambiente. a. fitorreparacin: slo es necesario agua y sal, se eliminan metales, disolventes .- corregir los malos efectos del MAN .- FITOEXTRACCION: las plantas toman productos y los acumulan en la parte area, se cogen, se queman y se eliminan. El gen mer P y mer T eliminan compuestos orgnicos de Hg que son muy txicos. determinados genes, son

.-RILOFILTRACIN: las races, al filtrar el agua acumulan compuestos. .-FITOESTABILIZACIN: mediante el uso de compuestos que liberan las races se estabilizan y solubilizan los metales. .- FITOVOLATILIZACIN : los compuestos que se abs por el agua, se expulsan al aire y se degradan. .- RIZODEGRADACIN: las races, al ir avanzando remueven la tierra y captan sustancias que las bacterias usan para degradar sustancias txicas. b. fitodegradacin: * control hidrulico, mediante: 1. bombas hidrulicas: aprovechar el efecto de la transpiracin para hacer pasar por la planta mucha agua. 2. Corredores ribereos: usando por ejemplo lamos con baja concentracin de nitratos de 150 mg/l a 3 mg/L. 2.6 Vitaminas hidrosolubles 2.7 tica en biotecnologa vegetal: . Riesgo : ha de ser menor que el beneficio . principio de autonoma: el paciente o la poblacin ha de estar informada . Principio de justicia: los beneficios han de ser para todos . Informacin: ha de ser veraz y dada por el cientfico a. riesgos o problemas que dan las plantas transgnicas: hay que ver si el riesgo es en el producto final o en el hombre. Se exige que el riesgo se detecte antes de que el producto se use, aunque en muchos casos no es detectable. 1. problema para el hombre: que se produzcan toxinas y alergias

2. problemas para el ambiente: al introducir genes extraos en una planta, puede ocurrir: muerte de la planta, la planta se asilvestra, se pasen genes de una planta a otra= flujo transversal (slo en plantas que se polinizan por el viento) de genes, de 3 formas: polen restos de la planta exudado de hojas o races O por ltimo apilamiento de genes: que se encuentren los genes que hemos introducido por transgnesis con los que la planta ha cogido de las plantas prximas. b. patentes: propiedad intelectual: se pueden patentar productos y procesos pero no la vida, las patentes se hacen para recuperar la inversin hecha en la investigacin. Las patentes han de cumplir unos requisitos: 1. exclusin 2. novedosos. 3. reproducibles: se han de poder repetir 4. subjetividad: en cada pas hay unos requisitos 5. limitacin en el tiempo: normalmente 10 aos. Hay que etiquetar los transgnicos obligatoriamente, en EEUU no es obligatorio. innovacin: se patentan descubrimientos totalmente

3. CULTIVOS LQUIDOS: se utilizan para el cultivo de rganos (tallos, races) y clulas. 3.1 Cultivo de rganos: explanto (plntula) da callo y de ah races y tallos El cultivo de tallos se utiliza para la formacin de metabolitos secundarios. El cultivo de races se utiliza para el estudio de los requerimientos nutritivos del vegetal y para la produccin de metabolitos secundarios Se necesita plntula joven (formada en condiciones de asepsia), se asila la raz y se corta en pequeas secciones, lo que nos interesa es el meristemos apical (que no tiene conexin con el resto de la planta y estar libre de org). Se coloca en un medio adecuado con fuente de C (sacarosa) y tiamina, as se forma el callo.

Al cabo de un tiempo crecen races laterales/tallos. Subcultivo, se realiza cortando los pices de las nuevas races laterales y as sucesivamente. La nica diferencia fisiolgica entre una raz de laboratorio y una normal es que nunca se forman races con crecimiento secundario en el laboratorio y que se pierde la respuesta gravitrpica

3.2 Cultivo de clulas: Clulas aisladas en un medio lquido: suspensin celular. Este tipo de cultivo proporciona clulas relativamente homogneas que crecen en un lquido de composicin definida. El contacto con los nutrientes es grande porque deben crecer con agitacin y se facilita el intercambio gaseoso entre el medio y la poblacin. A este medio nutritivo se le pueden aadir productos exgenos fcilmente: modificando el crecimiento celular. Cualquier rgano puede ser donante de clulas, las clulas se aslan de forma mecnica (raspando, incisiones) o por tratamiento enzimtico (tto con pectinas que degradan la pectina que las une= Generalmente a partir del rgano se forma el callo y si este es suficientemente friable, en un medio adecuado y con agitacin, las clulas se separan. El medio de cultivo es similar al de formacin de callos (fuente de C, tiamina, hormonas..) Se lleva a la cmara de cultivo Se cmara de crecimiento aproximadamente 2 semanas Una vez incubadas se puede hacer el subcultivo

* Si queremos que el proceso sea ms rpido y que crezcan ms clulas, lo que hacemos es transferir un poco de clulas formados a un medio lquido. 3.3 Caracterizacin de suspensiones celulares: curva de crecimiento

DETERMINACIN DE LA CINTICA DE CRECIMIENTO CURVA SIGMOIDEA

FASE 1: FASE DE LATENCIA (LAG): no hay divisin celular FASE 2: FASE EXPONENCIAL O LINEAL: divisin celular muy activa FASE 3: FASE ESTACIONARIA: casi no hay divisin

FASE DE LATENCIA:

preparacin de las clulas para la divisin ATP y NADPH invertasa, enzima que rompe sacarosa en

glucosa y fructosa.

Pequeos aumento de RNA

FASE EXPONENCIAL:

sntesis de cidos nucleicos.

FASE ESTACIONARIA: la divisin disminuye y los nucletidos se estabilizan. Gran consumo de nutrientes Se producen metabolitos secundarios, la produccin de metabolitos secundarios est asociada a la diferenciacin celular que no es ms que una diferenciacin metablica.

3.4 Tcnicas para conocer la cintica de crecimiento.7+ ensayos de tincin diferencial. 1. Aumento de peso: peso seco/peso fresco 2. Contaje de clulas: cmara de recuento (muy fiable) 3. Calcular el volumen celular de empaquetamiento: por

sedimentacin tras centrifugacin y midiendo la altura del sedimento. 4. Contenido en protenas y DNA: observar en qu fase estn las clulas 5. Conductividad del medio: disminuye segn envejece la poblacin celular 6. Viabilidad celular: va disminuyendo

* ENSAYOS DE TINCIN DIFERENCIAL: 1. TINCIN POSITIVA: tincin de clulas vivas a: Cloruro de trifenil tetrazolium: incoloro en solucin y al reducirse queda rojo (las mitocondrias reducen el compuesto y la clula queda roja)

b: Diacetato de fluorescena: incoloro en forma de sal, pero al liberar la fluorescena se queda fluorescente. Las clulas tienen actividad estearasa en su membrana y rompe el enlace ester, por lo que quedan clulas fluorescentes. Es necesario un microscopio de fluorescencia. 2. TINCIN NEGATIVA: tien clulas muertas a. Azul de Evans: tiene alto Pm y es rechazado por las clulas vivas. Entra en clulas muertas porque su membrana ya no es selectiva. 7. Consumo de nutrientes: valoracin de azcares totales, nitratos y fosfatos. 3.5 Cultivos celulares en suspensin a. discontinuos: a lo largo del tiempo, va variando la composicin del medio, tambin vara la poblacin y el metabolismo celular b. continuos: se va aadiendo medio frasco continuamente (a distinta temperatura), la composicin del medio no vara. Con la poblacin ocurren dos cosas: 1. CERRADOS: aumenta la poblacin celular porque se can recuperando las clulas que salen con el medio 2. ABIERTOS: no hay aumento de poblacin.

APLICACIONES DEL CULTIVO DE CLULAS EN SUSPENSIN: 1. Modelo para estudio de las rutas de metabolitos secundarios. 2. Para estudio de enzimas y asilamiento de genes 3. Purificacin enzimtica 4. Manipulacin bioqumica, lo que permite incrementar la sntesis de determinadas sustancias. 5. Realizar estudios de replicacin de DNA 6. Aislamiento de mutantes 7. Seleccin de lneas tolerantes al stress 8. Seleccin de lneas resistentes a hervicidas, Ab 9. Usos industriales: produccin de metabolitos secundarios Produccin de productos no nativos Biotransformacin 1- Aislamiento de mutantes y variantes: Puede que en una planta se den mutaciones espontneas. Podemos encontrar:

- Mutaciones: son raras y ocurren con poca frecuencia.

Consiste en un cambio en la secuencia de bases de un gen. Son estables y heredables.

- Cambios cromosmicos: frecuentemente nos encontramos

con : a) eiploidas: cambio en el nmero simple de cromosomas (ej. Sndrome de Down= 23n- por lo que quedan 47n) b) polipoidas: cambio en la dotacin total de cromosomas (ej. Planta 2n a 4n) c) translocaciones: normal se separa y se une a otro cromosoma d) inversiones: se separa un trozo de cromosoma y se vuelve a unir pero en sentido contrario. 2- Mutaciones recesivas:(auxtrofo: necesita para crecer algn aminocido) Tiene la mutacin pero no se observa fenotpicamente. Es difcil conseguir mutaciones recesivas. Pueden aislarse mediante: a) aplicacin de seleccin positiva: aadir a la suspensin el metabolito del que queremos conseguir clulas resistentes. Slo sobreviven las clulas que confieran resistencia (mutantes resistentes). En la prctica es ms difcil porque al aadir el componente txico lo normal es que el grueso de la poblacin muera. Es complicado rescatar los mutantes resistentes. Para ello hacemos un PLANTING CELULAR y aadimos antimetabolito. Tomamos una alcuota. Se diluye con el medio de cultivo que contenga antimetaboliro y agar a 40. Las alcuotas diluidas han de tener densidad conocida. Se dispersa en una placa petri. Como la concentracin de clulas es escasa, las clulas quedan separadas un trozo de cromosoma

y al incubar se producen clulas clones en colonias que sern resistentes al antimetabolito. b) Seleccin negativa: las clulas mutantes no crecen. En un medio sin prolina (necesaria para el desarrollo de las clulas), se aadi bromouracilo (anlogo de prolina). La poblacin que se dividi era la salvaje. Se puso a la luz y el bromouracilo destruy a las clulas con fenotipo salvaje y sobrevivieron los mutados que se rescataron mediante plating no selectivo.

3- Agentes mutagnicos: Se utilizan para aumentar la frecuencia de las mutaciones. Pueden ser: a) Agente qumico: anlogos de base

(bromouracilo), con muy alta toxicidad b) Agentes fsicos: radiaciones con luz UV, rayos Xy rayos , que producen daos en los pares de bases del DNA. Hay que dejar que el cultivo se exprese 2 o 3 generaciones para que se exprese la mutacin. CULTIVO DE UNA NICA CLULA Obtener un clon que provenga de una nica clula se puede hacer mediante:

1- Plating: no es fiable al 100% porque pueden caer 2 clulas juntas y no se detectan. Lo mejor es sacar una clula con una pipeta y ver al copio. 2- Cultivo nodriza: en un tubo de ensayo se cultiva el callo del que se ha sacado la suspensin celular: se pone en un papel de filtro sobre el que se coloca una nica clula. El callo dar todas las seales fisico-qumicas y hormonales que la clula necesite para crecer. Para bloquear la divisin celular, el callo se irradia con luz UV. 3- Tcnica de la microcmara: variante del cultivo nodriza, usando un medio acondicionado. Sencillo y barato. Sobre una porta se colocan los cubres que quedan levantados, entre ambos se pone una gota de parafina y sobre ella el medio nutritivo con una clula. Encima se pone un tercer cubre. Queda una cmara con un ambiente ideal para que la clula crezca y se divida el callo, lo que ocurre en medio slido. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PROTOPLASTOS Un protoplasto es una clula vegetal desprovista de pared celular, se usan para hacer:

- estudios de regeneracin de la pared celular - estudios de regeneracin de membranas - estudios de transformacin gentica
1. Aislamiento de protoplastos 1) Hay que quitar la pared celular, lo mejor es un tratamiento enzimtico que rompa los componentes de la pared, que son :

 polisacridos: celulosa=celulasas; hemicelulosa= hemicelulasas; pectinas= pectinasas, en realidad es una mezcla de las 3. 2) Hay que tener en cuenta que las clulas vegetales tienen una gran vacuola llena de agua por lo tanto hay que mantener las condiciones osmticas (medio hiperosmtico). Interesa que exista plasmlisis, se separa la membrana de la pared celular= medio hipertnico. 3) Tener pH de 5.7 o 5.8, en oscuridad, tiempo de incubacin de 4 a 24 h, T de digestin es aproximadamente 24= el proceso se acelera aumentando la temeperatura a 37 4) Aadir soluciones protectoras ClCa y Cl2Mg en altas concentraciones 5) El tejido determina que queramos obtener el protoplasto, ha de ser un tejido joven, preferentemente tejido folial, adems de ser una planta sana y vigorosa. RESUMEN: 1. Se incuba el tejido donador en un medio con agente osmtico (sorbitol o manitol) y un protector de la membrana plasmtica (Cl2Mg). En 1hora se logra la separacin de la membrana por plasmolisis (en medio hiperosmtico) 2. El tejido plasmalizado se incuba en presencia de enzimas, en oscuridad y a T ambiente durante 4 a 24 horas. Pasado ese tiempo tenemos: protoplastos, clulas rotas, clulas que no se han digerido, fragmentos de pared celular.

3. Purificacin de protoplastos: puede hacerse de dos formas: a) filtracin-centrifugacin: la mezcla se hace pasar por un filtro donde quedan retenidos los fragmentos grandes. El filtrado se centrifuga y en el fondo queda lo que ms pesa, normalmente protoplastos. Quitamos el sobrenadante y el sedimento se resuspende en el e medio de cultivo sonde se vayan a cultivar esas clulas. La centrifugacin se repite 4 o 5 veces. *INCONVENIENTES: en el 5 centrifugado se recupera poco; es un proceso largo; pueden romperse los protoplastos b) Flotacin: se filtra y centrifuga para quitar la solucin enzimtica, los protoplastos se resuspenden en una solucin de sacarosa (alta densidad) y volvemos a centrifugar (10min). Los protoplastos son estructuras esfricas, las dems clulas no lo son. Al ser esfricas son menos densas, por lo tanto tras centrifugar los protoplastos quedarn en la superficie. Se recuperan con una pipeta y se comprueba que estn vivos. 2. Cultivo de protoplastos: hacemos un test de viabilidad para ver si el protoplasto an est vivo (protocolos de tincin) El medio de cultivo debe tener la misma composicin que el medio utilizado para obtener el callo= sales y hormonas, adems de un agente osmtico (glucosa, sacarosa) El objetivo es que el protoplasto se divida y a largo plazo una planta. El medio puede ser: lquido (sin agitacin), lquido sobre slido, y medio slido (similar al plating) 3. Resultados

- Los protoplastos duran poco, ya que la pared celular se

regenera rpidamente (24-72 horas)

- Una vez regenerada la pared celular comienza la divisin

celular

- (NO HAY MITOSIS SIN PARED CELULAR) - Cuando la regeneracin de la pared no es completa, hay
una falsa divisin conocida como GEMACIN( en las partes de la pared celular no se ha regenerado, el citoplasma se expande)

- Si

se

agotan

las

reservas,

hacemos

subcultivos,

normalmente utilizamos callos. El medio de cultivo es nuevo y con agente osmtico aunque en menor cantidad (podemos eliminar el agente osmtico a partir del tercer subcultivo) APLICACIONES DEL CULTIVO DE PROTOPLASTOS 1. Estudio de receptores 2. Estudio de flujos inicos 3. Estudio de regeneracin de la pared celular 4. Estudio de transformacin gentica( un gen aislado, y con dotacin gentica completa) TRANSFORMACIN GENTICA:

- Se pude hacer en un gen aislado o alterando la dotacin

gentica completa=

obtener hbridos.

- En la naturaleza la nica forma de obtencin hbridos es por

reproduccin sexual. Pero mediante el empleo de protoplastos, podemos obtener 2 clulas somticas (hbridos)= HIBRIDACIN SOMTICA: obtencin de hbridos mediante la fusin de 2 protoplastos.

- qu ocurre cuando los protoplastos distintos se fusionan?

spA y spB o Fusin de 2 protoplastos de misma sp: homocarionte o Fusin de 2 protoplastos de distinta sp:

heterocarionte o Fusin de ncleos en heterocariontes: sincarionte/ hbrido verdadero o Si en un heterocarionte se destruye un ncleo: heteroplasto/cbido (no es un hbrido)

- El proceso de fusin de protoplastos puede ser espontneo

o inducido: a) F. espontnea: ocurre con poca frecuencia y es producido por repulsin de cargas ya que cuando una clula pierde la pared celular se quedan con una membrana fuertemente negativa. b) F. Inducido: por agentes qumicos o agentes fsicos: Ttos qumicos: el objetivo es neutralizar las cargas, el pH es alto (10.7) para la

neutralizacin de cargas, se procede a una incubacin de protoplastos en polietilen glicol (15 min) (aglutinamiento/acercamiento de protoplastos)a 37C con lo que se producen la fluidificacin de membranas *No pueden fundirse ms de dos protoplastos porque a partir de clulas polinucleares no se puede obtener una planta (regenerar una planta) Ttos fsicos: electrofusin: se aplica un campo de corriente alterna (que provoca aglutinamiento de clulas) y posteriormente un campo de corriente continua (rotura de la membrana)OOOOOO: fusin de protoplastos (OO OO O) 1. Rescate de hbridos: recuperacin de protoplastos fundidos - La mayora de las tcnicas se basan en: 1) Pruebas de complementacin gentica (para mutantes recesivos) Auxtrofo para poliuria Auxtrofo para glutamina

En un medio sin pro y sin glu: se complementan dando un hbrido

Albino en gen X

Albino en gen Y

Hbridos verdes: se complementan y donde uno tiene la mutacin, pero el otro no y al revs, as crecen las plantas 2) Pruebas de complementacin fisiolgica (para requerimiento del cultivo) Planta albina que Planta que no verde

regenera en medio X

regenera medio X

en

Cultivando productos de fusin en medio X, se regeneran los hbridos 3) Pruebas de rescate visual: se aplica cuando no es posible la aplicacin de las anteriores 2. Caractersticas que ha de tener una planta hbrida/ Ensayos para confirmar que tenemos una planta hbrida: a) caractersticas morfolgicas de la planta: ej. Tallo de una planta y hojas de otra. b) Caractersticas enzimticas: en la planta hbrida, las isoenzimas deben ser el total de ambas sp. HBRIDOS ASIMTRICOS: cuando la dotacin gentica (parte) de una de las sp se pierde. A pesar de ello estas plantas son totalmente frtiles. c) Caractersticas citolgicas: ej 14+16: el hbrido tendr 30 cromosomas. las plantas hbridas deben poder propagarse por semillas

TRANSFORMACIN GENTICA EN PLANTAS Utilidad:

- Obtener plantas resistentes a infecciones - Obtener plantas resistentes a T extremas - Obtener plantas resistentes a sequa, salinidad - Obtener plantas que tengas menor la fotorespiracin - Incrementar el valor nutricional de una cosecha - Prolongar la vida media de almacenamiento - Introducir
enzimas bacterianas responsables de la

captacin de N2 (por algunas bacterias) en la planta: aumentamos la produccin.

- Mejorar el aspecto (para el consumidor) - Para obtener sustancias que no son de origen vegetal
(interfern, Ac, vacunas) CMO HACERLO?

1. Identificar:

el carcter que queremos introducir (gen que confiera

resistencia a Ab+) 2. Asilar el gen: gracias a las enzimas de restriccin que cortan el DNA en secuencias especficas de nucletidosy luego las DNA ligasas que permiten la unin de 2 extremos cohesivos de 2 hebras de DNA. Al aislar el gen , hay que obtener mltiples copias, para ello lo clonamos, existen molculas que lo hacen , llamados VECTORES DE CLONACIN: plsmidos, bacterifagos. Los plsmidos no tiene vida independiente, se multiplican dentro de sus huspedes, con esto podemos transformar genticamente un vegetal. 3. Transformacin gentica de plantas, puede hacerse: a. transformacin directa: hacen falta protoplastos, para

introducir el plsmido en el protoplasto podemos incubar el protoplasto con el plsmido que contiene el gen de inters, para que el plsmido se introduzca en el protoplasto. mediante: inyeccin , PEG+ Cl2Ca y electrosporacin inconvenientes: protoplasto(solucin MICROBIOLSTICA). El gen no se suele incluir en el cromosoma y es degradado. ventajas: til para hacer expresin transitoria del gen b. transformacin indirecta. Agrobacterium tumefaciens utiliza un taxi molecular que lleva nuestro gen a su destino llamado VECTOR DE TRANSFORMACIN. difcil regenerar una planta a partir de

Vector de clonacin (gen) dirige directamente al

TAXI MOLECULAR

planta, mejor si se

Vector de transformacin ncleo AGROBACTERIUM TUMEFACIENS: gram +, un cromosoma y diversos plsmidos, el ms conocido es plsmido Ti. 1. Induce la divisin celular: tumor 2. Al cultivar el tumor en un medio con sales minerales y sacarosa, las clulas se dividen indiscriminadamente (sin necesidad de hormonas) 3. Al incubar esas clulas tumorales en presencia de Ab, la bacteria muere pero las clulas siguen proliferando.

- La bacteria le ha conferido algo a la clula vegetal que le ha

dado un nuevo carcter indefinidamente.

- Plsmido Ti (tumor inducing) cuando la bacteria invade la

clula le transfiere los genes oncognicos y los genes de las opinas (a especiales). En condiciones normales, se liberan las opinas, que son una fuente de C y N para la propia bacteria. Se transfiere una secuencia conocida como T-DNA que se caracteriza porque est circundando por una secuencia de 25 pares de bases, repetidas e imperfectas que reciben el nombre de borde izquierdo y borde derecho. Se transfiere lo que est en medio. Hay varios oncogenes: iaaM Indolactico (auxina) ica H codifican para la sntesis de c.

 ipt

codifica para la sntesis de isopentilalanina que tambin en una citoquinina

Por lo tanto la bacteria al introducir estas hormonas, le da a la clula la capacidad de dividirse pero no de regenerarse. QU NECESITA AGROBACTERIUM PARA INFECTAR LA PLANTA?

- genes VIR - Bordes izquierdo y derecho - Genes CHV: estn fuera del plsmido (transfieren el T-DNA)
en el cromosoma. Proceso: 1. herida: se liberan al suelo fenoles que son agentes quimiotcticos 2. la bacteria se dirige hacia la herida de la planta 3. tiene que existir contacto fsico entre la bacteria y la planta. Los genes chv son los que permiten este acercamiento, son genes constitutivos que estn codificando continuamente. 4. Introduccin del T-DNA: los genes VIR funcionan como un opern. El primer gen de esta secuencia es el VIR-A que es un gen constitutivo que se est expresando continuamente, pero los fenoles liberados hacen que se sobreexprese, generando mltiples copias de la protena VIR-A, el fenol que lo produce es la ACETOSIRINGONA. Esta sobreexpresin, hace que se active un segundo gen que estaba silenciado es el gen VIRR-G que a su vez activa otros genes (VIR O2 y VIR E2) los productos de estos genes son enzimas que actan parecido a las endonucleasas. Estas enzimas rompen el

DNA por unos sitios que ellos reconocen, por el borde derecho e izquierdo, pero slo se libera una de las hebras de DNA (cadena simple) y se une a uno de los extremos. COMPLEJO T VIR D2 VIR E2

Este complejo T, abandona la bacteria, penetra en la clula vegetal y se dirige al ncleo (ayudados por otros genes VIR-B). Una vez en el ncleo, las dos protenas lo dirigen a un cromosoma (al azar) y se incorpora al genoma vegetal. Se integra una cadena simple que gracias a la maquinaria de la clula vegetal se replica. ** se logr eliminar el T-DNA de Agrobacterium y meterle un gen resistente a Kanamicina. Esta bacteria es contacto con clulas de tabaco les hizo plantas resistentes a kanamicina. Podemos hacerlo utilizando un plsmido o 2 plsmidos. Manejar el plsmido Ti no es fcil, se han diseado 2 sistemas o vectores de transformacin. Para que se incluya el gen ha de estar entre el borde derecho e izquierdo (dentro del complejo T) 1. VECTORES O SISTEMAS COINTEGRADOS: tenemos el

plsmido de E. coli en el cual se introduce el gen que quiero transferir. Adems se introduce un gen de resistencia a kanamicina. Tambin hay un plsmido Ti (totalmente modificado). El plsmido Ti debe tener los genes de virulencia y los bordes para que el plsmido Ti pueda infectar a una clula vegetal, le quitamos el TDNA y se sustituye por informacin gentica del plsmido anterior (E. coli) Introducimos el plsmido Ti en Agrobacterium que pasa a tener plsmido de E. coli. Dejamos que la bacteria se multiplique y tambin los plsmidos. Puede que al dividirse se mezclen ambos plsmidos (recombinaciones). En este caso, tendremos la bacteria con su cromosoma y un solo plsmido con

los genes de virulencia, el gen resistente a Kanamicina y parte del plsmido de E. coli. Vector cointegrado: un plsmido Ti modificado. 2. VECTORES O SISTEMAS BINARIOS: usamos 2 plsmidos. La bacteria tiene su cromosoma, un plsmido de E. coli y un plsmido Ti. El de E.coli con el gen forneo y una resistente a Kanamicina. El plsmido Ti conserva los genes de virulencia. En los genes que se quieran transferir, adems de la secuencia modificadora, para que el gen se exprese se necesita un promotor que indica cuntas copias, cundo u dnde y tambin una secuencia terminadora: PROMOTOR-CODIFICADOR-TERMINADOR MDULO DE EXPRESIN= GEN QUIMRICO

Adems del gen Quimrico, debemos tener un gen marcador que nos indique si la informacin gentica de la clula est modificada o no. PROCESO DE INFECCIN Y OBTENCIN DE PLANTAS

TRANSGNICAS:

- El ms usado es el sistema de disco de hoja. - A los discos de hoja se les aade una solucin de bacterias
que contengan el gen que queremos transferir, se deja aproximadamente 2horas.

- Se secan los discos con papel de filtro y se llevan a un

medio de cultivo que contenga auxinas y citoquininas aproximadamente 2 das.

- Hay que eliminar a la bacteria - A los dos das se aade un Ab que mate a la bacteria
(cefotaxina contra Arobacterium) y aadimos el marcador que si es de seleccin se aade Kanamicina. Las clulas resistentes a este Ab sern la que se regeneren.

- Agrobacterium slo es til para dicotiledneas.

*** en el tomate, se introduce un gen que transfiere rigidez a la pared del tomate. Se introduce el gen responsable del deterioro de la pared en antisentido que bloquea la produccin de la protena responsable. ***Agrobacterium rhizogens= tiene un plsmido Bi

CULTIVO

DE

TEJIDOS

PARA

LA

OBTENCIN

DE

METABOLITOS

SECUNDARIOS 1. Metabolito primario: sustancia esencial para el desarrollo de las funciones vitales de la planta. Adems su distribucin es generalizada en toda la especie. Las clulas lo usan para multiplicarse. 2. Metabolito secundario: sustancia que no es esencial para el desarrollo de las plantas. Suelen estas restringidos a ciertas especies, incluso a ciertos momentos de la vida de una planta. MECANISMO DE DEFENSA. a. RUTA DEL C, SIKMICO: met 1: lignina. Met 2 taninos b. RUTA DEL ACETATO- MECALONATO: met 1: fitol. Met 2:digoxinas c. RUTA DEL ACETATO- MALONATO: met 2: poliacetileno. 3. Funciones de los metabolitos secundarios:

1. Contribuyen al desarrollo de la planta generalmente. 2. Defensa frente a herbvoros: repelentes 3. defensa frente a org: fitoalexinas 4. defensa entre plantas: compuestos alelopticos 5. atraccin: insectos para polinizacin, bacterias beneficiosas, insectos predadores de otros insectos, animales que dispersen semillas. ELICITOR: sustancias que activan/inducen estimulacin metablica. Todo aquello que desencadena una actividad metablica, ej: produccin de fitoalexinas. Pueden ser biotinas: agente biolgicos o abiticos: agentes fisico/qumicos En cultivo in Vitro, si aado el elicitor, se obtiene la fitoalexina que puede tener inters econmico. ESTOMAS: poros que se encuentran en la superficie foliar, formados por dos clulas de guarda, cuyos movimientos regulados por la turgencia controlan el tamao del poro y de este modo regulan el intercambio gaseoso. CLON: individuo genticamente exactamente igual a otro PRECURSOR: sustancia utilizada para inducir la sntesis de un compuesto SUSPENSIN CELULAR: conjunto de clulas en medio lquido. Muy heterogneas gentica y cinticamente. Muy inestables.

NECESIDADES DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL CRECIMIENTO EN SUSPENSIONES CELULARES

- Se habla de una evolucin similar a la de una muestra

microbiana, llega un momento en que tiende a detenerse( se han acabado los nutrientes)

- Es lo menos frecuente, la produccin de metabolitos

depende del nmero de clulas ( a mayor crecimiento, mayor produccin)

- Cuando cesa el crecimiento de clulas, aumenta la

produccin de metabolitos (lo ms frecuente). El material obtenido por el metabolito primario es lo que las clulas utilizan para multiplicarse (crecer). Cuando ya no crecen ms, usan los metabolitos secundarios. La produccin inicial, no se tiene en cuenta, lo que valoramos es la produccin final. Necesitamos una masa celular muy grande para iniciar la produccin en el Biorreactor. 3. hay que disear un medio de crecimiento para obtener un gran crecimiento y por lo tanto una gran produccin (ms sencillo pero menos frecuente) 4. hay que disear 2 medios, uno para el crecimiento y otro para la produccin. Para el crecimiento, usamos el medio inicial, variando poca cosa. Una vez establecido el medio de crecimiento hay que manipularlo para mejorar la produccin, medios que detengas el crecimiento y que induzcan una mejora en la produccin. Se suele manipular sobre todos los niveles de fosfato y nitrgeno. Tomamos la suspensin y reducimos algn componente (p o N) y vemos con cual obtenemos los mejores resultados. Normalmente disminuye el P se incrementa la produccin y se detiene el crecimiento. Otro ag. Nutritivo es la fuente de C (sacarosa). Lo que ha dado resultado es el incremento de niveles de sacarosa, se incrementa la produccin de metabolitos secundarios ya que como tiene energa suficiente, el metabolito primario que en un segundo plano, aunque realmente lo que ocurre es que se produce un stress osmtico y el crecimiento se detiene y se induce la formacin de metabolitos secundarios.

El metabolito secundario normalmente es un mecanismo de defensa. Tambin es muy efectivo disminuyendo N y sacarosa, aunque el resultado depende de cada especie. Ej: silimarina: eliminando Ca++, duplicamos la produccin aadiendo Li, tambin hay incremento por estrs. EJ: DIGITALIS: Si sustituyo Sr por Ca no aumenta la produccin, hay una relacin especial. El Li tambin aumenta la produccin por estrs. El nivel hormonal tambin se puede manipular, del balance hormonal tambin depende la diferenciacin (que d races o tallos). En general los regmenes hormonales que favorecen la produccin de metabolitos secundarios son los que potencian la diferenciacin, sobretodo si la diferenciacin va encaminada a la obtencin de embriones somticos. En la prctica esto no es aplica porque si queremos incrementar la produccin un medio y otro diferente para la diferenciacin. Los parmetros fsicos tambin se manipulan, normalmente para el

mantenimiento del cultivo (pH, T, luz, aireacin) modificacin pH: afecta a la toma de nutrientes. Cambios en permeabilidad de la membrana.

- Lo normal es usar un pH ptimo para el crecimiento (5-6) y

el mismo para el medio de produccin (mejor no modificar) T: ocurre lo mismo Luz: tiene un efecto importante. Va ha variar el tipo de metabolitos (ej. Nicotina en ausencia de luz). Depende de cada especie y del metabolito. En la mayora de los casos se requiere luz. El problema de aportar luz es que se incrementen los costes en energa y en enfriar porque la luz calienta, por lo tanto se prefiere una menor produccin y as disminuimos los costes, a no ser que si al aumentar la

produccin los costes no sean demasiado altos y por lo tanto compensa ese aporte de luz. *los cultivos celulares aunque ests verdes no realizan la fotosntesis, por eso, hay que aportar sacarosa. El OL se manipula para el mantenimiento de cultivos a gran escala. El O2 es necesario para las mitocondrias para obtener energa, ya que no realizan la fotosntesis. A nivel de laboratorio no se manipula el O2. Ya tenemos la lnea celular, hemos seleccionado los dos mediosahora a nivel industrial usamos BIORREACTORES. EMPLEO DE BIORREACTORES PARA OBTENER METABOLITOS

SECUNDARIOS

1. Sistemas de biorreactores El metabolismo que se produce se acumula en la clula, no sale al exterior, por lo tanto para obtenerlo, tengo que destruir el cultivo. Tenemos dos tipos de biorreactores: a. Continuo: vamos metiendo nutrientes en el medio, tubo por sonde hay una entrada del medio, por otro lado extraigo el medio pobre que arrastra a los metabolitos, pero esto es lo menos frecuente porque normalmente los metabolitos no estn en el medio. b. Tandas: destruyo la clula para tomar el metabolismo y lo pongo en otro medio (ej. Matraz es un sistema de tandas). A nivel industrial se usan biorreactores, tandas ms grandes. tiles cuando el metabolismo secundario se queda dentro de la clula. Es el ms usado.

c. Semicontinuo: variante, variedad de tandas, en vez de vaciar el biorreactor totalmente, slo se vaca la mitad. De la mitad que se vaca se obtiene el producto (destruyendo las clulas), y rellenamos con la mitad y lo que haba acta como inoculo para nueva produccin. d. Multifsico: 2 fases normalmente. Un biorreactor para

desarrollar la biomasa (crecimiento) 1. se retira el medio (no es bueno para ka produccin) y ponemos otro medio (en el mismo reactor) 2. Se pasa a otro biorreactor con el medio produccin(usamos dos biorreactores) 2.Diseo de la estructura del biorreactor - condicionado por el tamao de las clulas - hay que tener en cuenta: Necesidad de administrar nutrientes a las clulas Necesidad de administrar oxgeno a las clulas. Hay problemas derivados de la estructura celular (A TENER EN CUENTA EL SISTEMA DE AGITACIN) -Clulas grandes y pared rgida (la agitacin hace que las clulas choquen y se produce el efecto cizalla o tijera que puede provocar ruptura de la pared celular. adecuado para la

- Tienden a formar agregados, las clulas tienden a disminuir y el reparto de nutrientes y O2 no es muy equitativo. A TENER EN CUENTA POR EL SISTEMA DE AIREACIN: - Hay cierta cantidad de material celular libre (protenas) que con el aire (agitacin) tiende a formar espuma. En el biorreactor si genera espuma (sobre todo en superficie), la espuma se adhiere a la pared y sistemas fijos del biorreactor, todas las clulas que hay en la espuma no son tiles para la produccin por lo tanto hay que evitar la formacin de espuma. Tambin hay que tener en cuenta las posibilidades de iluminacin. a. con agitacin mecnica: con entrada y salida de aire, con palos de agitacin (2 palas separadas de giro, hlice que sube y baja, distintas palas pequeas, una nica pala plana grande. PROBLEMAS: generan aumento de la fuerza de cizalla, son costosos, consumen energa. Peligro de contaminacin porque hay muchos sistemas fijos. dentro de estos hay una variante, giran en torno a su eje; eso produce la agitacin (no palas). Puede ser (cilindro hueco y doble cilindro) VENTAJAS: se incrementa la relacin entre superficie y volumen. Como el eje es ajeno/exterior, se evita contaminacin al ser mayor la superficie, se facilita la iluminacin PROBLEMAS: para este volumen (tengo que dejas espacio), necesito un

biorreactor muy grande b. con agitacin por aire i. biorreactor de burbujas(forma de baln): maya que fragmenta el aire en pequeas burbujas (difusor de aire) las burbujas al ascender a parte de aportar O2, agita disminuye la fuerza de cizalla, es bueno para clulas frgiles aumentan los problemas de formacin de espumas ii. biorreactor de elevacin por aire: con dos cmaras, por dentro lleva un compartimiento que se comunica con otro exterior. entra aire a Presin se forman burbujas, que bajan por la camisa exterior se mejora el burbujeo, hay flujo, menor fuerza de cizalla mejora el reparto de nutrientes el ms usado aunque forman espuma, se aade un agente

antiespumante. Tambin hay biorreactores que combinan agente mecnica con aire, la pala hace que disminuya la espuma.

iii. biorreactor a chorro: turbina que gira y crea una corriente que incrementa la velocidad de reparto. Aumenta la fuerza de cizalla para mejorar el reparto. iv: hay unos biorreactores modernos ( en

experimentacin): tienen palas, baja fuerza de cizalla, todo gira en el mismo sentido y es antiespumante. TCNICAS PARA MEJORAR LA PRODUCCIN (una vez que tenemos el biorreactor adecuado) Tambin alternativas a las suspensiones celulares. 1. Adicin de percusores: el metabolito secundario entra en competencia con el primario y este es esencial para las clulas. Tenemos una ruta metablica: A metabolito primario A Metabolito secundario A (ramificacin) El que funcione hacia Ao A depende de lo que la clula necesite. Puede ocurrir que: A sea abundante y forme suficiente A y tambin podemos obtener A. En vez de A (metabolito comn), si le doy un precursores de la ruta de A, el metabolito M, lo toma y el A pasa a A y M a A sin necesidad de competencia. Los precursores son ms efectivos cuanto ms prximos estn al producto

final= BIOTRANSFORMACIN (aadir precursores, uno o dos pasos enzimticos anteriores para obtener el producto final). En suspensiones celulares hay problemas: entrada del precursor dentro de la clula. que se estimule la transformacin que puede el precursor atravesar la membrana celular, pero haciendo pequeas modificaciones, podemos hacer que penetre la membrana. Ej: la digoxina es una transformacin de la digitoxina (la digoxina no atraviesa las membranas, pero s la metil-digoxina. Ser rentable si el precursor es barato o se puede obtener por sntesis. La digoxina no la producen todos los Digitalis. El precursor, al aadirlo puede resultar txico para la clula. 2. Elicitacin Otra tcnica empleada para mejorar la produccin, es el uso de ELICITORES que son sustancias que actan sobre el agente invasor (fitoalexina) es un sistema de defensa de las plantas. Se ha comprobado que el inductor es un producto de la propia planta. El elicitor es el que produce fitoalexinas, que no slo se forman por ataques bianos, tambin por estrs (lluvia cida, luz UV, T extremas). El elicitor induce la estimulacin metablica= formacin de fitoalexinas. Se puede n diferenciar 2 tipos de elicitores: E. biticos: agentes biolgicos E. abitico: agente fsico-qumico

ELICITOR: todo aquello que desencadena una actividad metablica. En cultivo in Vitro, si aado al cultivo el elicitor, se obtiene la fitoalexina (metabolito que de forma natural no existe en la planta o en el cultivo in Vitro) que puede tener inters econmico. Ej: glycine max (soja) para obtener gliceolina. . la produccin de gliceolina es proporcional a la C del elicitor. Thalictrum rugosum: berberina . llega un momento en el que si C. elicitor es muy alto, la produccin de berberina disminuye. ALTERNATIVAS A LAS SUSPENSIONES CELULARES PARA OBTENER METABOLITOS SECUNDARIOS 1. Usar clulas inmovilizada: Fijar las clulas que tengo en

suspensin a un soporte; hay distintos sistemas de fijacin: a. Adherir las clulas a una superficie (poco en plantas, ms para org) b. Incluir las clulas en el interior de un sistema, hay 2: i. Polimerizacin: al polimerizar, atrapa las clulas. Al polimerizar, se forma una maya y atrapa a las clulas. Usamos agar, se forman bolas, con cmaras en el interior que permiten el paso de nutrientes. ii. Obtener el polmero y hacer que las clulas invadan los canales del

polmero. Se usa poliuretano (esponja) con tamao de poro muy pequeo, se mete en el matraz con la suspensin y las clulas van entrando. Por ambos sistemas se obtienen clulas fijajas. Se suele polimerizar por goteo (clulas + agente polimerizante) 2. Ventajas sobre suspensiones celulares. a. Al estar atrapadas, las clulas mantienen el contacto, la comunicacin es intensa y estable. b. Se restringe el crecimiento de forma fsica, no se altera el estado de la clula. No se deja espacio para crecer. Al estar restringido el crecimiento, se incrementa la produccin c. La mayor facilidad en la manipulacin de las condiciones del cultivo d. Se mejora la recuperacin del producto, hay algunos metabolitos secundarios que se liberan mejor al medio. En principio se pueden usar los mismos biorreactores, pero se prefiere disear otros (ya que el medio es diferente) son incluso ms sencillas. A. Se puede usar una columna de matriz fija, se introduce el medio y se hace que pase por la matriz de perfusin. Esto ser til cuando el producto se libere al medio fcilmente. B. Tambin se puede usar una columna con lecho fluido, en el

cual est la maya. El problema es que inmovilizar clulas es muy caro y slo se hace cuando la produccin es interesante. 3. Cultivar rganos in Vitro. Se pueden cultivar tanto rganos areos como races. Lo primero que se cultiv fueron races (antes que clulas). Las races se pueden formar a partir de otra raz, cortada de la planta o bien a partir de callos. Hay una alternativa, usando A rhizogenes que invaden races, transfiriendo genes (activan anpina (azcar), no vlido para la raz, pero si a la bacteria, activan la sntesis de auxinas. La diferencia es que obtengo races transformadas, las cuales no necesitan que al medio le aadamos hormonas porque la sntetizan ellas mismas. Crecen a ritmo alto. Tienen gran cantidad de pelos radicales: races pilosas/peludas. Si el metabolismo se produce en la raz, es uncultivo interesante de realizar. Ej: Nicotina: si se sintetiza en la raz, aunque luego vaya a la hoja. Aqu si sera til el cultivo in Vitro de races. El cultivo de tallos, se hace a partir de yemas apicales, que se multiplican. Tambin puede ser a partir de la planta, a partir de callo o usando A. tumefaciens que transfiere que se estimule la produccin de citoquininas. El crecimiento de parte area es menor que el de las races. Presenta problemas de esterilidad. La invasin de bacterias produce teratomas o llagas. Se usan biorreactores de niebla, no hay agitacin. Se genera una niebla del medio que se difunde sobre races o tallos.