Mdulo 10.

ORGANELOS TRANSDUCTORES DE ENERGA: CLOROPLASTOS Y FOTOSNTESIS

PLSTIDOS Con este nombre se denomina genricamente a un grupo de organelos que producen y/o almacenan diversos productos en algas y plantas. Todos los plstidos derivan de proplstidos, que son pequeos organelos presentes en los tejidos meristemticos (tejidos en activa divisin). Los etioplastos son plstidos de hojas crecidas en ausencia de luz que cuando se exponen a la luz se transforman en cloroplastos, desarrollando una estructura mucho ms compleja (ver figura). Los amiloplastos son plstidos especiales que reservan almidn en los tejidos no fotosintticos y los cromoplastos almacenan pigmentos liposolubles.

Etapas de transformacin de un etioplasto (a) cuando se expone a la luz . En el centro de la fotografa se observa una estructura (cuerpo prolamelar) que ser el origen de los tilacoides. Luego de tan slo un minuto de exposicin a la luz el cuerpo prolamelar se organiza en laminillas (b). Al cabo de otro minuto de exposicin (c) comienzan a distribuirse las laminillas. Luego de 24 horas de exposicin a la luz (d) se observan los primeros grana (asociacin de membranas tilacoidales). En (e) puede verse un granum totalmente desarrollado.

Los cloroplastos son el tipo ms importante de plstidos: estos organelos contienen clorofila, un pigmento de color verde capaz de captar la energa que provee la luz solar para realizar la fotosntesis. Hay varios tipos de clorofilas que difieren ligeramente entre s: en las plantas terrestres las clorofilas ms comunes son las clorofilas a y b, pero en las algas hay otros tipos. Los cloroplastos tambin contienen una variedad de pigmentos amarillos y naranjas llamados carotenoides que absorben radiaciones luminosas en zonas del espectro visible donde no absorben las clorofilas y por ello se denominan pigmentos fotosintticos accesorios o auxiliares. Un alga unicelular puede contener slo un gran cloroplasto, en tanto que la clula de una hoja puede tener entre 20 y 100. Es importante sealar que los cloroplastos no son solamente sitio de sntesis y almacenamiento de hidratos de carbono, pues el ATP y el poder reductor que producen son utilizado en diferentes compartimientos para la sntesis de otros compuestos qumicos que la clula requiere para su funcionamiento. Los cloroplastos son organelos complejos, en forma tpica de disco, delimitados por dos membranas, una interna y otra externa . El espacio delimitado por la membrana interna llamado estroma (que es anlogo a la matriz mitocondrial) contiene las enzimas encargadas de sintetizar glucosa a partir de dixido de carbono, agua y energa (ATP y poder reductor) obtenida de la luz solar; tambin posee ADN, ARN y ribosomas. Dentro del estroma existe un tercer sistema de membranas que delimita compartimientos en forma de sacos aplanados, de forma discoidal, interconectados unos con otros, llamados tilacoides. El interior de este compartimiento se denomina espacio intratilacoidal. Los tilacoides se agrupan formando pilas (granum, plural grana). Tales membranas, ricas en clorofila, se asemejan a la membrana interna de la mitocondria por el hecho de que ambas intervienen en la formacin de ATP. La energa captada por las molculas de clorofila a partir de la luz solar es utilizada para excitar electrones que se utilizarn en la formacin de molculas de ATP y de poder reductor (NADPH, equivalente al

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NADH). Esta energa qumica ser luego utilizada en el estroma para obtener glucosa partir de dixido de carbono y agua.

Transporte de protenas hacia los cloroplastos Como ya se ha mencionado en captulos anteriores, casi todo el ADN de las clulas eucariticas se encuentra en el ncleo, pero los cloroplastos (al igual que las mitocondrias) contienen molculas de ADN en sus compartimientos internos, as como ribosomas, lo que les permite producir un pequeo nmero de las protenas que se encuentran en estos organelos. Sin embargo, la mayor parte de las protenas de los cloroplastos son fabricadas en los ribosomas libres del citosol, que despus son transportadas al sitio adecuado del organelo. Las protenas codificadas por el genoma del cloroplasto son relativamente pocas y usualmente se ubican en la membrana tilacoidal de los cloroplastos; en muchos casos ser trata de subunidades de protenas complejas que tienen que ensamblarse luego con otras subunidades codificadas en el genoma nuclear. Al igual que lo que ocurre en las mitocondrias, las protenas destinadas a los cloroplastos son orientadas hacia estos organelos por secuencias de seal especficas que tienen que ser reconocidas por una protena de la membrana externa del cloroplasto. De acuerdo a su ubicacin final, la protena atraviesa una o las dos membranas y as llega al estroma o a los tilacoides de los grana. En las clulas vegetales capaces de realizar fotosntesis, ambos organelos (mitocondrias y cloroplastos) estn contenidos en la misma clula, por lo que las protenas citoslicas destinadas a cada uno de ellos contienen diferentes secuencias de seal. Los cloroplastos plantean un problema adicional por poseer un tercer compartimiento (la membrana tilacoidal y el espacio intratilacoidal). Las protenas que ingresan al cloroplasto y tienen como destino este tercer compartimiento presentan una primera secuencia de seal que ser eliminada por una peptidasa de seal al entrar al estroma. Luego de hidrolizada la primera secuencia de seal queda expuesta una segunda secuencia de seal que indica que el destino final es intratilacoidal; dentro del tilacoide una segunda peptidasa de seal liberar la cadena polipeptdica definitiva, la que iniciar entonces su plegamiento. Los genomas de los cloroplastos Como ya se ha dicho, la mayora de las protenas presentes en los cloroplastos son codificadas por el ADN nuclear, pero parte de las mismas son sintetizadas en los propios organelos. Tal como se mencion al tratar las mitocondrias, el trfico de protenas est dirigido solamente desde el citosol hacia los cloroplastos; no se conoce que se exporten protenas desde el cloroplasto hacia el citosol. Del mismo modo que lo que ocurre con las mitocondrias, los cloroplastos no se originan de novo: siempre provienen de la divisin de cloroplastos preexistentes. Para que las clulas hijas posean una cantidad de cloroplastos equivalente a la que tena la clula madre sus cloroplastos deben dividirse antes de producirse la divisin celular. La divisin de los cloroplastos ocurre por fisin binaria, como en las bacterias y la divisin de su ADN se realiza del mismo modo que hemos visto para este tipo de

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organismos. El ADN cloroplstico es bastante simple y, salvo en algunas algas, es de tipo circular y no parece contener histonas asociadas, al igual que en las bacterias. Por su parte la maquinaria de sntesis proteica se parece ms a la de las bacterias que a la de clulas eucariotas: los ribosomas son similares a los de Escherichia coli, tanto en su estructura como en la sensibilidad a los antibiticos; la sntesis de pptidos empieza con N-formilmetionina y no con metionina y el ADN cloroplstico puede ser transcripto por la ARN polimerasa de la E. coli para producir ARNm cloroplstico y fabricar protenas cloroplsticas. Como ya ha sido expresado antes, la existencia de una molcula propia de ADN circular en los cloroplastos, junto con otras caractersticas semejantes a las de clulas procariticas, han sido las causas de que se proponga que estos organelos evolucionaron a partir de organismos procariticos que originalmente vivieron dentro de clulas de mayor tamao y que a lo largo de la evolucin se han adaptado de manera que dejaron de ser organismos autnomos. Esta idea se ha incorporado como un elemento importante de la teora endosimbitica que se refiere al origen de las clulas eucariticas 1. Los cloroplastos constituyen el lugar en donde se lleva a cabo la fotosntesis Las plantas, las algas y algunas bacterias son productores, es decir que son los nicos organismos capaces de transformar la energa solar en energa qumica mediante el proceso de la fotosntesis. Cada ao estos destacados organismos producen ms de 200 mil millones de toneladas de nutrientes que pueden ser asimilados por los hetertrofos para obtener energa qumica, poder reductor y molculas sencillas para sintetizar sus propios componentes. De este modo, la energa qumica almacenada por los auttrofos sirve de combustible para las reacciones metablicas que mantienen la vida en la tierra. Los productores son organismos auttrofos (que se nutren a s mismos: del griego autos que significa "a uno mismo" y trophos que significa "nutricin"), es decir que se trata de organismos que fabrican sus propios alimentos a partir de materias primas inorgnicas y por lo tanto no dependen para su nutricin de otros organismos. Algunas bacterias son auttrofos quimiosintticos: son productores que fabrican sus compuestos orgnicos mediante la oxidacin de sustancias inorgnicas simples como el azufre y el amonaco. Los auttrofos quimiosintticos no requieren de luz como fuente de energa para realizar estas reacciones. La mayor parte de los productores son auttrofos fotosintticos : organismos que utilizan la luz como fuente de energa para la fabricacin de compuestos orgnicos a partir de dixido de carbono y agua. Cuando se examina al microscopio una pequea porcin de la hoja de una planta, se puede comprobar que el color verde debido a la clorofila no se encuentra disuelto en el citoplasma sino que se encuentra confinado en los cloroplastos, localizados principalmente en las clulas del mesfilo, tejido que se ubica en el interior de la hoja. Si se utiliza el microscopio electrnico puede comprobarse que los cloroplastos, al igual que las mitocondrias, poseen una membrana interna y otra externa. La membrana interna encierra una zona llena de lquido, denominada estroma, que contiene la mayor parte de las enzimas necesarias para aquellas reacciones de la fotosntesis que no requieren de luz (las reacciones que convierten el dixido de carbono en glucosa ). Como ya se ha mencionado, la membrana interna de los cloroplastos encierra un tercer sistema de membranas que forman un conjunto de sacos discoidales, aplanados e interconectados entre s, llamados tilacoides. Estas membranas tilacoides forman un tercer compartimiento en los cloroplastos, llamado espacio tilacoideo o intratilacoidal. En algunas zonas estos sacos se organizan en columnas llamadas grana. Cada granum se parece a una pila de monedas, en donde cada moneda corresponde a un tilacoide. Algunas membranas tilacoidales se extienden de un granum a otro, conformando un sistema interconectado. Los procariotes fotosintticos como las cianobacterias carecen de cloroplastos, pero poseen estructuras similares a los tilacoides que son extensiones de la membrana celular y se ubican en la periferia de la clula. La clorofila, los pigmentos fotosintticos y las enzimas necesarias para las reacciones de la fotosntesis que requieren luz se encuentran asociados a las membranas tilacoidales. Estas membranas, al igual que la membrana interna de las mitocondrias, intervienen en la sntesis de ATP.
1

Christian de Duve, The birth of complex cells, Scientific American, 274:(4): 38-45, April 1996

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FOTOSNTESIS: CAPTACIN DE ENERGA LUMINOSA Los organismos fotosintetizadores capturan la luz solar para formar ATP y NADPH (un anlogo fosforilado del NADH), molculas que son luego utilizados como fuente de energa para fabricar glcidos a partir de CO 2 y H2O. Los organismos hetertrofos aerbicos usan el O 2 para degradar los productos orgnicos ricos en energa producidos en la fotosntesis a CO 2 y H2O, generando ATP y poder reductor para sus propias actividades. El CO2 formado regresa a la atmsfera para volver a ser utilizado por los organismos fotosintetizadores. De este modo la energa solar proporciona la fuerza motriz para la ciclacin continua del CO2 y O2 atmosfricos. La ecuacin global de la fotosntesis describe una reaccin de xido-reduccin en la que el H 2O provee el hidrgeno necesario para la reduccin del CO 2 y su transformacin a glcidos (CH2O), con liberacin de oxgeno molecular: luz H2O + CO2 (CH2O) + O2 La fotosntesis abarca dos procesos: las reacciones luminosas (fotodependientes), que slo tienen lugar cuando se iluminan las plantas, y las reacciones de fijacin de carbono , mal llamadas reacciones oscuras, ya que tienen lugar tanto en presencia de la luz como en la oscuridad (sera ms correcto denominarlas reacciones fotoindependientes). En las reacciones luminosas de la clorofila y otros pigmentos absorben energa luminosa la que se conserva en forma de energa qumica en dos productos ricos en energa: ATP y NADPH. En las reacciones de fijacin de carbono se utilizan el ATP y el NADPH para reducir el CO2 a glucosa. El ATP y el NADPH producidos durante la fotosntesis tambin pueden ser utilizados para la sntesis de otros compuestos orgnicos. De qu manera transducen (transforman) las molculas de pigmentos de las membranas tilacoides la energa luminosa en energa qumica? La clave la dio un descubrimiento realizado en 1937 por Robert Hill, que demostr que cuando se exponen a la luz extractos de hoja que contienen cloroplastos en presencia de un aceptor de hidrgeno (A) se desprende oxgeno, al tiempo que tiene lugar la reduccin simultnea del aceptor de hidrgeno, segn una ecuacin actualmente conocida como reaccin de Hill. 2 H2O + 2 A 2 AH2 + O2 El aceptor de hidrgeno utilizado por Hill fue el diclorofenolindofenol (DPIP), que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida es incolora. Cuando se iluminaba el recipiente conteniendo la mezcla de reaccin, el colorante se decoloraba y se formaban burbujas de oxgeno. En la oscuridad no haba reaccin. Hill tambin demostr que la presencia de CO 2 no es necesaria para que la reaccin tenga lugar y que si est presente no participa en la reaccin, concluyendo que la produccin de oxgeno poda disociarse de la reduccin del CO2. Algunos aos ms tarde se encontr que el aceptor universal de hidrgeno en las plantas es el NADP +. 2 H2O + 2 NADP+ 2 NADPH + 2 H+ + O2

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Observemos que en la fotosntesis, los electrones fluyen desde el agua hacia el NADP +, en tanto que en la fosforilacin oxidativa que ocurre en la cadena respiratoria que tiene lugar en las mitocondrias sucede lo contrario: los electrones pasan del NADH al O 2, con formacin de agua. Puesto que el flujo electrnico inducido por la luz va cuesta arriba no puede transcurrir sin aporte de energa. Esta energa proviene de la luz. La absorcin de luz excita las molculas La luz es una pequea parte de un gran espectro de radiacin, el espectro electromagntico. Todas las radiaciones de dicho espectro viajan a travs de ondas. Se denomina longitud de onda a la distancia que existe entre la cresta de una onda y la de la siguiente. En un extremo del espectro se encuentran los rayos gamma, cuya longitud de onda es muy corta (menor de un nanmetro). En otro extremo del espectro se encuentran las ondas de radiacin de baja frecuencia, cuya longitud de onda es tan grande que puede medirse en kilmetros. Los diferentes colores de la luz (distintas regiones del espectro de luz) se identifican mediante sus longitudes de onda. Dentro del espectro de la luz visible el color violeta corresponde a la longitud de onda ms corta y el rojo a la longitud de onda ms larga. La luz ultravioleta tiene una longitud de onda an ms pequea y el infrarrojo una longitud de onda incluso mayor. La luz no slo se comporta como una onda, sino tambin como una partcula. Est constituida por pequeos paquetes de energa llamados fotones. La luz visible es radiacin electromagntica de longitud de onda entre 400 y 700 nm. La energa de un fotn (cuanto de luz) es mayor cuanto menor sea la longitud de onda y va de 300 kJ (radiacin violeta de 400 nm de longitud de onda) a 170 kJ (radiacin roja de 700 nm de longitud de onda). En otras palabras, la energa de un fotn es inversamente proporcional a su longitud de onda . Color Ultravioleta Violeta Azul Verde Amarillo Anaranjado Rojo Infrarrojo Rango de longitud de onda (nm) <400 400-425 425-490 490-560 560-585 585-640 640-740 >740 Energa (KJ/mol) 471 292 260 230 210 193 176 85

La capacidad de una molcula para absorber luz depende del ordenamiento de sus electrones alrededor de los ncleos atmicos en su estructura. Cuando se absorbe un fotn se eleva un electrn a un nivel energtico superior, pero el proceso ocurre segn un sistema de todo o nada: para ser absorbido el fotn ha de contener una cantidad de energa (un cuanto) que iguale exactamente la energa de la transicin electrnica. Una molcula que ha absorbido un fotn se encuentra en estado excitado que, en general, es inestable. Los electrones elevados a orbitales de energa superior usualmente vuelven rpidamente a sus orbitales normales ( estado basal), dejando ir el cuanto de energa en forma de luz (fluorescencia) y/o calor. La radiacin fluorescente es siempre de mayor longitud de onda (menor energa) que la luz absorbida. Pigmentos fotosintticos Los ms importantes son las clorofilas, pigmentos verdes con estructuras policclicas que se parecen a la protoporfirina de la hemoglobina, excepto que la posicin central est ocupada por Mg 2+ en lugar de Fe2+. La molcula est compuesta de un sistema de anillos heterocclicos (cuatro anillos pirrlicos sustituidos y un quinto anillo no pirrlico). Adems contiene una larga cadena hidrofbica de un alcohol, el fitol, esterificando a un cido sustituyente de uno de los pirroles. El sistema de anillos heterocclicos tiene una estructura con alternancia de enlaces sencillos y dobles (conjugados) que constituyen el grupo

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cromforo2 responsable de la absorcin de luz. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre dos tipos de clorofila. Una es invariablemente la clorofila a, mientras que la segunda es la clorofila b, que slo difiere de la clorofila a en que tiene un grupo aldehdo en lugar de un grupo metilo en el anillo II. La mayora de las plantas superiores contienen aproximadamente el doble de clorofila a que de clorofila b. En organismos fotosintetizadores inferiores existen otras clorofilas con pequeas diferencias qumicas. Adems de las clorofilas, las membranas tilacoidales contienen pigmentos secundarios que tambin absorben la luz, llamados conjuntamente pigmentos accesorios. Entre ellos se encuentran los carotenoides que incluyen a los carotenos, no oxigenados, y a las xantofilas, de colores rojo al amarillo y las ficobilinas que son pigmentos tetrapirrlicos pero no cclicos, presentes en algas rojas y en cianobacterias e incluyen a la ficocianina (azul) y a la ficoeritrina (roja). Espectro de accin de la fotosntesis El espectrofotmetro es un instrumento para medir la cantidad de luz que absorbe una sustancia, por lo que determina la capacidad de los distintos pigmentos para absorber radiaciones luminosas de diferentes longitudes de onda. Sin embargo, un espectro de absorcin no indica cules son las longitudes de onda ms efectivas para la fotosntesis, pues los pigmentos no se encuentran libres sino formando parte de la membrana. La efectividad relativa de las diferentes longitudes de onda en la fotosntesis est dada por el espectro de accin de la fotosntesis, que fue determinado en un experimento biolgico clsico llevado a cabo en 1833 por el bilogo alemn T.W. Engelmann, aprovechando la forma del cloroplasto en la Spirogyra, un alga que se encuentra en forma de filamentos delgados en estanques de agua fresca. Cada una de las clulas de Spirogyra contiene un cloroplasto verde esmeralda en forma de espiral embebido en el citoplasma. Engelmann supuso que si dichos cloroplastos se expusieran a un espectro luminoso producido por un prisma, la fotosntesis se llevara a cabo con mayor rapidez en aquellos puntos en los que el cloroplasto fuera iluminado por los colores que la clorofila absorbe ms rpidamente, si la clorofila fuese responsable de la fotosntesis. Cmo medir la fotosntesis en aquellos das de tecnologa tan elemental? Engelmann saba que durante la fotosntesis se produca oxgeno, y que algunas bacterias
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del griego cromos = color, foros = llevar, grupo responsable del color de la molcula

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tenan especial atraccin por reas de alta concentracin de oxgeno. Por tanto, determin el espectro de accin observando hacia cules clulas de Spirogyra se dirigan estas bacterias y encontr que se concentraban en las localizadas en las regiones azul y roja del espectro. El hecho de que las bacterias no se dirigiesen hacia esas zonas en ausencia de la Spirogyra, demostr que dichas bacterias no eran atradas simplemente por la luz roja o azul, sino por la presencia del oxgeno liberado durante la fotosntesis. Sin embargo, el espectro de accin de la fotosntesis difiere un poco del espectro de absorcin de la clorofila pura. Esto se explica por dos razones: la primera es que los cloroplastos contienen adems de clorofila pigmentos accesorios en cantidades importantes, como carotenoides (en las plantas) o ficobilinas (en algas rojas y de cianobacterias) y que absorben luz que la clorofila reflejara y estos pigmentos accesorios transfieren luego por resonancia su energa de excitacin a las molculas de clorofila; la segunda, como ya hemos dicho, es que los pigmentos al estar insertos en la membrana tilacoidal varan el espectro de luz que pueden absorber respecto a los pigmentos en solucin. La presencia de pigmentos accesorios permite a las algas utilizar con mayor eficacia la luz verde del espectro, en comparacin, por ejemplo, con los crisantemos. Esto constituye un importante mecanismo de adaptacin, ya que permite que las algas vivan en hbitats acuticos profundos, en donde la luz roja, tan efectiva para la fotosntesis en otros habitats, ha sido absorbida durante el paso de la luz a travs del agua. La clorofila canaliza la energa absorbida a centros de reaccin fotoqumicos Los pigmentos de las membranas tilacoidales que absorben luz estn ordenados en conjuntos o dispositivos funcionales denominados fotosistemas. En los cloroplastos de espinaca cada fotosistema contiene unas 200 molculas de clorofilas y unas 50 de carotenoides. Todas las molculas de pigmentos pueden absorber fotones, pero slo unas pocas pueden transducir la energa luminosa a energa qumica. Un complejo transductor consiste en varias molculas de clorofila combinadas con un complejo proteico que tambin contiene quinonas fuertemente unidas; este complejo se denomina centro de reaccin fotoqumico. Las otras molculas del fotosistema se denominan molculas recolectoras de luz o antenas. Su funcin es absorber energa lumnica y transmitirla a velocidad muy elevada al centro de reaccin en donde tienen lugar las reacciones fotoqumicas que se describirn ms adelante. Las molculas de clorofila en las membranas tilacoidales estn ligadas a protenas integrales de membrana (fijadoras de clorofila a o b, o protenas CAB 3) que orientan a la clorofila con respecto al plano de la membrana y le confieren propiedades para la absorcin de la luz ligeramente diferentes de las de la clorofila libre. Cuando una molcula de clorofila (o un pigmento accesorio) absorbe un fotn se excita y en lugar de emitir fluorescencia transfiere la energa por resonancia a una molcula de clorofila vecina y retorna a su estado basal. El proceso se repite varias veces hasta que se excita la clorofila del centro de reaccin, donde se promueve el pasaje de un electrn a un orbital de energa superior, de donde finalmente es cedido a un aceptor electrnico vecino que forma parte de la cadena de transportadores de electrones y que darn como resultado final la generacin de ATP y de NADPH. Las membranas tilacoides tienen dos tipos de fotosistemas, cada uno de ellos con su centro de reaccin y su conjunto de molculas antena. Los dos fotosistemas tienen funciones distintas y complementarias. El fotosistema I tiene un centro de reaccin denominado P700 y una elevada proporcin de clorofila a en relacin con la clorofila b. El fotosistema II, con su centro de reaccin P680, contiene cantidades aproximadamente iguales de ambas clorofilas y puede tener tambin clorofila c. Todas las plantas superiores, algas y cianobacterias tienen ambos fotosistemas, pero las bacterias fotosintticas, que no desprenden oxgeno, slo tienen el fotosistema I, ya que no utilizan el agua como dador de tomos de hidrgeno sino al sulfuro de hidrgeno (SH 2) o directamente al hidrgeno molecular. La absorcin de luz por el fotosistema II inicia el proceso Cuando la energa de excitacin llega al centro de reaccin del fotosistema II, se genera una molcula de potencial de reduccin muy negativo, el P680* (P680 excitado), que finalmente cede su electrn a una serie de quinonas (plastoquinona y otras), que son capaces de tomar protones del medio.
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CAB = chlorophyll a/b binding proteins

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Para poder continuar con el proceso, el P680 + debe adquirir un electrn para volver a su estado basal. Ese electrn podra provenir de un gran nmero de compuestos orgnicos o inorgnicos, pero el gran salto evolutivo lo dieron los antecesores de las cianobacterias, que adaptaron el fotosistema II para aprovechar los electrones de agua, el producto ms abundante que exista. Para ello crearon un complejo de escisin del agua, que contiene cuatro iones manganeso. La absorcin secuencial de cuatro fotones, cada uno de los cuales produce la prdida de un electrn del centro de Mn, produce un agente oxidante que est en condiciones de tomar cuatro electrones del agua, generando cuatro protones y una molcula de oxgeno, proceso denominado fotlisis del agua (ruptura de la molcula de agua por efecto de la luz). 2 H20 4 H+ + 4 e + O2

La absorcin de luz por el fotosistema I crea un poderoso agente reductor Los procesos fotoqumicos que ocurren en el fotosistema I son similares a los que se han indicado para el fotosistema II. La captura de un fotn por una de las molculas antena y su traslado hasta el P700 origina una molcula excitada ( P700*) que transfiere su electrn a una serie de aceptores entre quienes se encuentran una protena hierro-sulfurada (Fe-S), la ferredoxina (Fd) y finalmente la ferredoxina-NADP+ oxidorreductasa, que transfiere los electrones al NADP + para formar NADPH. Como consecuencia de la cesin de un electrn, la molcula de P700 ha quedado con dficit electrnico (P700 +), el que es satisfecho porque una protena soluble que contiene cobre y que pertenece al fotosistema II (plastocianina) le cede sus electrones. El complejo de los citocromos une los fotosistemas II y I Los electrones almacenados en las quinonas del fotosistema II se transportan al P700 del fotosistema I a travs del complejo de los citocromos y de la plastocianina. El complejo de los citocromos es muy similar al complejo III de la cadena respiratoria: recibe electrones de una quinona y se los cede a una protena soluble (la plastocianina, en el cloroplasto, en lugar del citocromo c de las mitocondrias). Al igual que en la mitocondria, tambin se bombean protones, pero en este caso desde el estroma hacia el

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interior del espacio tilacoidal. Dado que este espacio es pequeo, la entrada de un nmero reducido de protones tiene un efecto pronunciado, que alcanza a 3 unidades de pH (pH 8 en el estroma y pH 5 en el espacio tilacoidal), con lo que la concentracin de protones interna es 3000 veces superior a la del estroma, generando una importante fuerza motriz para la sntesis de ATP.

Acoplamiento de la sntesis de ATP al flujo de electrones impulsado por la luz En 1954 Arnon descubri que si se aadan ADP y fosfato inorgnico a la reaccin de Hill, se generaba ATP, proceso al que se denomin fosforilacin fotosinttica, o simplemente fotofosforilacin, para distinguirla de la fosforilacin oxidativa que se produce durante la respiracin mitocondrial. A diferencia de lo que ocurre con respiracin mitocondrial, no est bien establecida la estequiometra del proceso, pero se estima que por cada par de electrones transportados se forman una o dos molculas de ATP. La enzima responsable de la sntesis de ATP en los cloroplastos es un complejo muy similar al que opera en las mitocondrias: una protena transmembrana homloga a la mitocondrial que permite el pasaje de protones y un complejo de protena perifrica tambin homloga a la de las mitocondrias, ubicada hacia el espacio estromtico, que permite la sntesis de ATP a expensas de ADP + Pi, con lo que tanto la orientacin de la ATP sintasa como el sentido de paso de los protones son opuestos a los de las mitocondrias. Sntesis fotosinttica de glcidos Las plantas verdes contienen en sus cloroplastos una maquinaria enzimtica nica para catalizar la conversin del CO2 en compuestos orgnicos sencillos (reducidos), proceso que se denomina fijacin del CO2 o fijacin del carbono. Las reacciones que dan lugar a la fijacin y reduccin del dixido de carbono forman parte de una ruta cclica elucidada a principios de la dcada del 50 por Melvin Calvin y a menudo se la denomina ciclo de Calvin 4. La fijacin del CO2 tiene lugar en tres fases: 1. Fijacin del CO2 en una unin orgnica, lograda a travs de la condensacin de seis molculas de dixido de carbono con otras tantas de una pentosa, la ribulosa-difosfato, formando seis molculas de un intermediario inestable que se descompone en 12 molculas de 3-fosfoglicerato
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Melvin Calvin (1918-1997) recibi el Premio Nobel en 1961 por su aporte al conocimiento de la fotosntesis de hidratos de carbono

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2. Reduccin del 3-fosfoglicerato a gliceraldehdo-3-fosfato . El poder reductor (NADPH) generado en las reacciones luminosas se utiliza para reducir las 12 molculas de 3-fosfoglicerato a gliceraldehdo-3fosfato. De ellas, dos molculas se utilizan en la sntesis de una molcula de glucosa-fosfato que podrn utilizarse luego en la sntesis de almidn. 3. Regeneracin de la pentosa difosfatada. Diez de las doce molculas de gliceraldehdo-3-fosfato se utilizan para la regeneracin de las 6 molculas de ribulosa-difosfato. De este modo el proceso cclico permite la conversin continua de CO 2 en triosas y hexosas fosfato.

Fase 1. Fijacin del CO2 y conversin en 3-fosfoglicerato. La enzima que cataliza la incorporacin del CO 2 en forma orgnica es la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxidasa (rubisco). Est constituida por ocho subunidades grandes (56 kDa c/u) y ocho subunidades pequeas (14 kDa c/u), lo que hace un total de 560 kDa. Est localizada en el estroma del cloroplasto, donde constituye alrededor del 50% de la protena total del cloroplasto. Es la enzima ms abundante de la biosfera. La enzima cataliza la incorporacin del CO 2 a la ribulosa-1,5-bisfostato y la rotura del intermedio inestable de seis carbonos que se forma, generando dos molculas de 3fosfoglicerato. Fase 2. Conversin de 3-fosfoglicerato en gliceraldehdo-3-fosfato Ocurre en dos pasos que bsicamente significa el proceso inverso de la gluclisis. La diferencia estriba en que el cofactor necesario para la reduccin es el NADPH y no el NADH. En el primer paso el 3fosfoglicerato es convertido a 1,3-bisfosfoglicerato por la quinasa correspondiente a expensas del ATP; en

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el segundo la deshidrogenasa que requiere NADPH reduce al 1,3-bisfosfoglicerato a gliceraldehido-3fosfato con produccin de fosfato inorgnico. El destino del fosfoglicerato es variado: a) la mayor parte de l se recicla para regenerar la pentosa fosfato que da inicio al proceso, b) puede convertirse en hexosa fosfato y dar lugar a la sntesis de almidn, que como almidn primario se conserva en el cloroplasto y c) puede abandonar el cloroplasto y dar lugar a la formacin de sacarosa o degradarse mediante la va glicoltica con produccin de energa. Fase 3. Regeneracin de la ribulosa-1,5-bisfosfato a partir de triosas fosfato Dado que la primera reaccin de fijacin del carbono consiste en la unin del dixido de carbono a una pentosa difosfatada (la ribulosa-difosfato), se debe regenerar sta constantemente para que el flujo de CO2 a glcidos sea continuo. Para ello se forman intermedios de 3, 4, 5, 6 y 7 carbonos en un proceso que convierte triosas (10 molculas de gliceraldehdo fosfato) en pentosas (6 molculas de ribulosa 1,5difosfato). Las 10 molculas de gliceraldehdo fosfato recorren el siguiente camino, hasta llegar a regenerar las 6 molculas de ribulosa-difosfato:
a)

4 gliceraldehdo fosfato (C3)

2 fructosa-fosfato (C6) 2 eritrosa-fosfato (C4) y 2 xilulosa-fosfato (C5) 2 sedoheptulosa-fosfato (C7) 2 xilulosa-fosfato (C5)+ 2 ribosa-fosfato (C5)

b) 2 gliceraldehdo fosfato (C3) + 2 fructosa-fosfato (C6) c) 2 gliceraldehdo fosfato (C3) + 2 eritrosa-fosfato (C4) d) 2 gliceraldehdo fosfato (C3) + 2 sedoheptulosa-fosfato (C7)

De este modo se utilizaron las 10 molculas de gliceraldehdo-fosfato para generar las 6 molculas de pentosa requeridas (las 4 xilulosas fosfato y las 2 ribosas fosfato son llevadas a 6 ribulosa fosfato por isomerasas especficas) Cada glucosa fosfato sintetizada a partir de CO 2 y H2O cuesta 12 NADPH y 18 ATP El resultado neto del ciclo de Calvin es la conversin de seis molculas de dixido de carbono y una de fosfato en una de glucosa-6-fosfato. Para ello ser necesario que se condensen 6 de ribulosa-1,5difosfato con otras tantas de CO 2 para dar un intermedio inestable (18 carbonos) que se descompone dando lugar a 12 molculas de 3-fosfoglicerato. Estas 12 molculas de 3-fosfoglicerato se reducen a 12 molculas de 1,3-difosfoglicerato con el consumo de 12 ATP y luego se utilizan 12 NADPH para obtener finalmente 12 molculas de gliceraldehdo-3-fosfato. Dos de las doce molculas de gliceraldehdo-3-fosfato son el resultado neto del proceso ; las otras diez se reordenan para formar 6 molculas de ribulosa-5-fosfato. Falta ahora regenerar las seis molculas iniciales, por lo que se consumen 6 ATP adicionales para pasar la ribulosa-5-fosfato a ribulosa1,5-difosfato. La fuente de ATP y NADPH son las reacciones luminosas ocurridas en el tilacoide. En la oscuridad cesa la produccin de ATP y NADPH, por lo que tambin cesa la fijacin del CO 2 (de all el error de denominar reacciones oscuras a las reacciones de fijacin del CO 2). La glucosa-6fosfato producida es convertida por la fosfoglucomutasa en glucosa-1-fosfato, material de partida para la sntesis del almidn por las fosforilasas. Fotorrespiracin La rubisco no es especfica para el CO 2, ya que el O2 compite con ste por el sitio activo de la enzima. Aparentemente la evolucin de la rubisco produjo un sitio activo incapaz de discriminar bien entre ambos sustratos, quizs debido a que gran parte de la evolucin tuvo lugar antes de que el oxgeno fuese un componente importante de la atmsfera. El problema es que la condensacin de la ribulosa--difosfato con el oxgeno no permite la

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fijacin de carbono, sino que se forma un intermediario inestable oxigenado que se descompone en una molcula de 3-fosfoglicerato y otra de fosfoglicolato (de dos carbonos). A travs de un proceso en el que intervienen tres organelos (el cloroplasto, el peroxisoma y la mitocondria, dos molculas de glicolato (en total 4 carbonos) son reconvertidas en 3-fosfoglicerato y dixido de carbono. En el proceso total se consume oxgeno en los tres compartimientos subcelulares (cloroplasto, peroxisoma y mitocondria) y se produce dixido de carbono, como en la respiracin (de ah el nombre de fotorrespiracin), pero el proceso es energticamente desfavorable. Si bien la fijacin del CO 2 es predominante en relacin a la fijacin del O 2 (alrededor de tres veces), la fotorrespiracin es un derroche de energa y puede llegar a inhibir la produccin de biomasa hasta en un 50%. Esto ha llevado a que muchas plantas, especialmente de climas clidos, hayan desarrollado adaptaciones como las que se indican a continuacin. Algunas plantas tienen un mecanismo que impide la fotorrespiracin. Plantas C 3 y C4 Se dice que la mayor parte de las plantas son plantas C 3, porque el principal producto de la fijacin del dixido de carbono es un compuesto de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Algunas plantas, llamadas plantas C4, son capaces de fijar dixido de carbono muy eficientemente mediante la formacin intermedia de un compuesto de cuatro carbonos, el oxalacetato. De todos modos estas plantas utilizan el ciclo de Calvin para producir carbohidratos, pero primero incorporan el dixido de carbono en el oxalacetato. Las plantas C4, que tpicamente crecen en condiciones de altas intensidades luminosas y temperatura, tienen alta velocidad fotosinttica, alta velocidad de crecimiento, baja o nula velocidad de fotorrespiracin y baja velocidad de prdida de agua. De hecho, una de las principales diferencias entre las plantas C3 y C4 es que estas ltimas no se saturan, ni siquiera en presencia de las intensidades de luz ms elevadas de la naturaleza. Para ello han modificado su estructura anatmica, en la que el mesfilo (tejido fotosinttico) adopta una disposicin en corona (de all el nombre de estructura Kranz, corona, en alemn) que rodea a las clulas de la vaina del haz (que a su vez rodean al tejido conductor) y que a diferencia de lo que ocurre en las plantas C 3 son muy ricas en cloroplastos. El ciclo de Calvin se realiza en las clulas de estas vainas y las reacciones de la va C4 se llevan a cabo en las clulas del mesfilo, dando un claro significado funcional a la diferencia anatmica antes mencionada. La caracterstica esencial de la ruta C 4 es que concentra el dixido de carbono en la clula. El dixido de carbono entra en la hoja a travs de pequeos poros llamados estomas, los cuales se abren y cierran en respuesta a factores como el contenido de agua y la intensidad de la luz. Cuando los estomas se cierran, el abastecimiento de dixido de carbono disminuye y en las plantas C3 la fotosntesis disminuye de modo considerable. Las reacciones de la va C 4 incrementan la fijacin de dixido de carbono, de manera que an en circunstancias adversas, la fotosntesis, y por ende el crecimiento de la planta, se lleva a cabo con gran eficiencia. Entre las plantas agresivas y de crecimiento rpido que utilizan la va C4 se encuentran la caa de azcar, el maz, el sorgo y la gramilla. El rendimiento de los cultivos de plantas C 4 es dos o tres veces ms alto que el de plantas C3. Si este mecanismo pudiera incorporarse por medios genticos a otras

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especies vegetales, se podra incrementar de modo importante la produccin de alimento en algunas regiones del mundo. El cometido del ciclo C4 es simplemente incrementar la concentracin de dixido de carbono dentro de las clulas de la vaina, de modo que el ciclo C 3 se verifique ah. La operacin del ciclo C 4 sirve para incrementar la concentracin de dixido de carbono dentro de las clulas de la vaina del haz unas 10 a 60 veces en comparacin con la de las clulas de las plantas que slo tienen la va C 3. BIBLIOGRAFIA
Alberts, B., A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, D. Bray, K. Hopkin, K. Roberts y P. Walter (2003). Essential Cell Biology. Garland Science, Taylor & Francis Group, New York & London, 2 nd edition.

COOPER, G.M. (2002). La Clula. 2 edicin. Marbn Libros, S.L., Espaa. (traducido de la 2 edicin inglesa, 2000).
LODISH, H., A. BERK, S.L. ZIPURSKY, P. MATSUDAIRA, D. BALTIMORE & J. DARNELL. Biologa Celular y Molecular, Editorial Mdica Panamericana, 2002. Nelson D.L. y M.M. Cox (2001) "Lehninger Principios de Bioqumica", Ediciones Omega S.A. (versin espaola de la 3a. edicin inglesa, Worth Publishers, New York). PURVES, K.W., D. SADAVA, G.H. ORIANS & H.C. HELLER (2003) Vida. La Ciencia de la Biologa, 6. Edicin. Editorial Mdica Panameicana (traducido de la 6 edicin inglesa, 2001).

CUESTIONARIO
1. Las cianobacterias son procariotes y, en consecuencia, carecen de cloroplastos. cmo es posible que se los considere organismos fotosintticos? 2. El ADN que se encuentra dentro de los cloroplastos es realmente funcional o se trata de un resabio evolutivo? 3. El hecho de contar con un ADN circular y ribosomas del tipo procariote proporciona algn indicio sobre el origen de los cloroplastos? 4. Cuando una clula fotosinttica se divide los cloroplastos existentes se reparten entre las clulas hijas? se reduce el nmero de cloroplastos en cada divisin celular? 5. Cul es la importancia de los pigmentos fotosintticos? Podra tener lugar la fotosntesis sin ellos? 6. Qu es lo que se pretende indicar cuando se habla de espectro de accin de la fotosntesis? 7. Engelmann realiz una experiencia iluminando los filamentos del alga filamentosa Spirogyra con las diferentes radiaciones que componen el espectro visible, en presencia de bacterias aerobias. Cul fue el objetivo de la experiencia y cmo interpret los resultados obtenidos? 8. Qu es lo que demuestra la experiencia de Hill? 9. Cul es el resultado de las reacciones luminosas y en qu se utilizan los productos obtenidos? 10. Por qu se dice que es incorrecta la denominacin reacciones oscuras para referirse a las reacciones de fijacin del dixido de carbono? 11. Qu analoga puede encontrar entre la cadena de transporte electrnico de la cadena respiratoria mitocondrial y los fotosistemas de los tilacoides cloroplsticos? 12. La fotorrespiracin fue simultnea con la fotosntesis o apareci posteriormente durante el curso de la evolucin? Fundamente su respuesta 13. Existe alguna relacin entre la fotorrespiracin y la especificidad de sustrato de la rubisco ( ribulosabis- fosfato carboxilasa oxidasa, enzima responsable de la fijacin del dixido de carbono)? 14. Cul es la razn por la que las plantas C4 son ms eficientes que las plantas C3? 15. Existe alguna relacin entre la estructura de las hojas de las plantas C4 y el tipo de fotosntesis que realizan? 16. Qu ocurre cuando se expone a la luz una suspensin de cloroplastos activos en presencia de diclorofenolindofenol (DPIP)? Qu ocurre si en el mismo tubo se ha adicionado un inhibidor de la reaccin de Hill? 17. Qu tipo de pigmentos se extrajeron en el trabajo prctico y mediante qu tcnica se logra separarlos?

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18. Qu sustancias acumulan los amiloplastos?

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Mdulo 10. TRABAJO EXPERIMENTAL

OBJETIVOS GENERALES Que el alumno: Verifique la existencia de reacciones fotodependientes (luminosas) en los cloroplastos. Observe la morfologa de cloroplastos y amiloplastos en clulas vegetales. Efecte la extraccin y separacin de pigmentos fotosintticos de hojas. I. OBSERVACIONES MICROSCOPICAS OBJETIVO Las observaciones indicadas tienen como objetivo poder constatar diferencias en la morfologa y distribucin de los plstidos segn el material que se analice. 1. Cloroplastos en forma de cinta en el alga verde filamentosa Spirogyra 2. Cloroplastos en clulas del mesfilo adheridas a la epidermis foliar, observados en desgarrado de hojas de hiedra. 3. Cloroplastos en corte transversal de hoja de pera. 3. Amiloplastos de tubrculos de papa observados con y sin agregado de solucin diluida de Lugol. II. FOTOSINTESIS. REACCION DE HILL OBJETIVO El objetivo de la experiencia es comprobar la generacin de poder reductor durante la etapa lumnica de la fotosntesis. Como aceptor final de los electrones de la fotlisis del agua se emplear un oxidante artificial (2,6-diclorofenolindofenol, DPIP). Se evaluar el efecto de diferentes factores (oscuridad, inhibidor de la fotosntesis y calor) sobre la reaccin. FUNDAMENTO Se conoce como reaccin de Hill a la reaccin fotoqumica en la que los electrones provenientes de la fotlisis del agua producen la reduccin de un oxidante natural (NADP +) o artificial (2,6diclorofenolindofenol, sales frricas, etc.). En el trabajo prctico se pondr de manifiesto la reaccin de Hill que tiene lugar en los cloroplastos. Para ello se utilizar DPIP como oxidante artificial, el que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida es incolora. Podr observarse adems la formacin de burbujas como consecuencia del oxgeno liberado en la reaccin. luz, cloroplastos 2 DPIP + 2H2O METODOLOGA DEL ENSAYO Aislamiento de cloroplastos: Utilizar 8 hojas medianas de espinaca (deben estar bien verdes y turgentes), eliminar los pecolos y la nervadura central y cortarlas en pequeos trozos. Este procedimiento, as como todos los dems pasos en los que se utilice la suspensin de cloroplastos, deben realizarse en bao de hielo y con soluciones fras para conservar la estructura de los organoides de inters. En un mortero colocado en bao de hielo poner las hojas cortadas junto con una cucharadita de arena (previamente lavada) y 50 ml de solucin fra de sacarosa 0,5 M. Triturar durante 2 a 3 minutos hasta lograr un extractivo de color verde oscuro. Filtrar el triturado a travs de gasa para eliminar restos vegetales groseros. 2 DPIPH2 + O2

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Centrifugar el filtrado en 4 tubos durante 5 minutos a 2000 rpm para eliminar el material celulsico.

La mayor parte de los cloroplastos quedarn en suspensin en el sobrenadante. Colectar los sobrenadantes y centrifugarlos durante 10 minutos a 3000 rpm. Descartar los sobrenadantes y resuspender suavemente los sedimentos que contienen los cloroplastos en 3 ml de buffer fosfatos 0,1 M de pH 7 fro, usando una pipeta Pasteur. Reunir las suspensiones de cloroplastos en un nico tubo (suspensin A) mantenido en fro hasta el momento de usar. Experiencias a realizar: a) Colocar una gota de la suspensin A entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio. b) Tomar 3 ml de suspensin A y calentar hasta ebullicin durante 2 minutos ( suspensin B) c) Rotular cinco tubos (nmeros 1 a 5), para ser utilizados de acuerdo al protocolo siguiente: Buffer fosfatos 0,1 M de pH 7 Inhibidor Suspensin A Suspensin B DPIP Luz Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 (*) Tubo 4 7ml 7ml 7ml 7ml + 1ml 1ml 1ml 1ml 6 gotas 6 gotas 6 gotas 6 gotas + + + Tubo 5 7ml 1ml +

(*) El Tubo 3 debe estar recubierto con papel de aluminio antes de colocar los reactivos d) Colocar cada uno de los reactivos en el orden listado, manteniendo los tubos en bao de hielo. e) Mezclar bien el contenido de los tubos por inversin de los mismos 2 veces. Para tapar se puede emplear un trocito de polietileno. f) Para exponer los tubos a la luz colocar la gradilla frente a una lmpara de 75 w durante 10 minutos. g) Observar si se produjeron cambios de coloracin. III. EXTRACCION DE PIGMENTOS FOLIARES OBJETIVO Se trata de extraer, separar cromatogrficamente y diferenciar distintos pigmentos fotosintticos liposolubles presentes en clulas vegetales. FUNDAMENTO La acetona permite la extraccin de la totalidad de los pigmentos vegetales, tanto hidrosolubles como liposolubles. El agregado de hexano y luego agua al extractivo nos permite separar por particin los pigmentos liposolubles en la capa superior de hexano. Por cromatografa de adsorcin en capa fina se logra la separacin de las clorofilas (a y b) y los distintos tipos de pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), dado que cada una de estas sustancias presenta diferente polaridad. METODOLOGA DEL ENSAYO a) Extraccin de pigmentos liposolubles

Colocar en un mortero 20 ml de acetona. Cortar en tiras finas una hoja mediana de espinaca,
colocando las tiras en acetona a medida que son cortadas. Incorporar al mortero una cucharadita de arena lavada. Triturar y macerar con ayuda del piln el material vegetal durante 5 minutos, reponiendo la acetona en caso en que se evapore en exceso. Filtrar por papel el extracto resultante a un tubo de ensayo grande o probeta. Agregar al extractivo acetnico obtenido 1 ml de hexano y mezclar bien.

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Adicionar 40 ml de agua a la mezcla hexano-acetona, mezclar con suavidad para no emulsionar y

dejar separar las dos fases que se han formado. Empleando una pipeta Pasteur con tetina separar la fase superior, la que se recibe en un tubo de Kahn, que constituye la muestra para las cromatografas. Esta muestra debe estar totalmente exenta de agua (no opalescente). b) Cromatografa en capa fina Solventes hexano hexano-acetona (80:20) acetona

Siembra y desarrollo de la cromatografa

Colocar 2 ml de solvente de desarrollo en el frasco tipo Borrel que servir de pequea cuba
cromatogrfica.

Colocar 3 gotas del extractivo en el punto de siembra, el que estar situado cerca del borde inferior
de la placa, pero a una altura tal que no quede sumergido al introducirlo en la cuba. El solvente debe evaporarse luego del agregado de cada gota.

Introducir la placa sembrada dentro de la cuba cromatogrfica, taparla y dejar ascender el solvente

hasta que el frente del mismo est a 0,3 cm del borde superior. Comparar los cromatogramas obtenidos con los distintos solventes de desarrollo a los efectos de seleccionar el que permita obtener una mejor resolucin Analizar los resultados obtenidos. Nota: las placas deben activarse en estufa durante 1 hora a 110 oC y luego mantenerse en desecador antes de ser utilizadas.