Alessandra Abro Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAO BACTERIANA DOS COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMTICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Belo Horizonte 2007

Alessandra Abro Resende

MECANISMOS GERAIS DE DEGRADAO BACTERIANA DOS COMPOSTOS HIDROCARBONETOS MONOAROMTICOS: BENZENO, TOLUENO, ETILBENZENO E XILENO (BTEX)

Monografia apresentada ao Departamento de Microbiologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Especialista Industrial. em Microbiologia Ambiental e

ORIENTADORA: Prof. Vera Lcia dos Santos

Belo Horizonte 2007

AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a Deus por sempre iluminar meus caminhos e pela proteo nos momentos difceis. A minha me Neuza, meu pai Welington e irmzinha Dani, por todo apoio, carinho e amor de uma vida. Sem eles, nada disso teria sido possvel. Aos avs, padrinhos, tios e primos, por sempre terem acreditado em mim e por todo o amor e mimo de sempre. Ao Lorenzo e s amigas queridas, Taty, Carolinas (Little e Degols), Fabi, Nana, Bia, pelo amor e compreenso, principalmente nos momentos de ausncia, pela fora, nos momentos mais difceis. Obrigada por fazerem minha vida mais repleta de alegria. A minha orientadora, Profa. Vera Lcia dos Santos, agradeo pela orientao e incentivo a percorrer novos caminhos, e aos demais professores do curso de Especializao, pela contribuio para minha formao, pela pacincia e dedicao. A todos os colegas do curso de Especializao, em especial, Lcia, Clber, Vivi e Lo, por terem tornado as sextas e sbados de estudo momentos menos rduos. Obrigado pela tima convivncia, amizade e cooperao. Aos colegas do Laboratrio de Sade Pblica / gua e do FAS, pela alegria do dia-a-dia e pela compreenso e apoio nos momentos de sufoco. A Universidade Federal de Minas Gerais pela bolsa de estudo, tornando possvel a concretizao de mais uma etapa da minha vida profissional. A todos que de alguma forma contriburam para que este momento fosse possvel, meu muito obrigado.

RESUMO
RESENDE, A.A. (2007) Mecanismos gerais de degradao bacteriana dos compostos hidrocarbonetos monoaromticos: benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX). Belo Horizonte, 2007. Monografia (Especializao), Departamento de Microbiologia do Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais.

Os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) so hidrocarbonetos monoaromticos, cuja origem no meio ambiente, em geral, est relacionada s atividades de extrao e refino de petrleo e derivados. Tais compostos so contaminantes comuns de solos e guas, entretanto, devido elevada toxicidade e carter mutagnico e carcinognico a seres humanos, fauna e flora locais, vrios esforos tm sido feitos para desenvolver estratgias de sua remoo do meio. A biorremediao, como mtodo de remoo destes hidrocarbonetos aromticos, tem sido alvo de muitas pesquisas h mais de meio sculo. Consequentemente, o entendimento dos mecanismos de biodegradao desses compostos orgnicos tem sido aprimorado desde ento. de conhecimento que os BTEX podem ser biodegradados, servindo como fonte de carbono e energia para os microrganismos, sob condies aerbias e anaerbias, incluindo neste ltimo caso condies nitrificantes, ferro e sulfato-redutoras. Na degradao bacteriana desses compostos, sob ambas as condies, podem ser observadas duas vias distintas: uma inicial, que leva formao de intermedirios centrais comuns, entre eles o catecol e o benzoil-CoA; e uma segunda, que promove a transformao dessas molculas em metablitos centrais que possam ser utilizados pela clula. Os genes que codificam as enzimas relacionadas s vias de degradao dos BTEX esto sob constante regulao por protenas especficas moduladas por substratos e intermedirios das vias e por mecanismos de regulao globais, permitindo uma resposta coordenada ao estado fisiolgico e metablico da clula. O entendimento das vias de degradao dos BTEX, de sua gentica e seus mecanismos de regulao gerais de grande relevncia para o avano das tcnicas de biorremediao. Sendo assim, este trabalho se prope a fazer uma reviso das principais vias de degradao bacteriana dos hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX descritas na literatura, bem como dos aspectos relacionados citados anteriormente, e sumarizar brevemente algumas de suas aplicaes biotecnolgicas em processos de biorremediao e potenciais implicaes ambientais.

SUMRIO
1 INTRODUO ............................................................................................................. 01 2 DESENVOLVIMENTO ............................................................................................. 03
2.1 Os BTEX e suas principais fontes .................................................................................. 03 2.2 Tratamento de stios contaminados ............................................................................... 06 2.2 A BIODEGRADAO DOS COMPOSTOS BTEX ................................................................... 08 2.2.1 As bactrias como agentes da degradao dos compostos BTEX ..................... 08 2.2.2 As vias de degradao bacteriana dos BTEX ...................................................... 12 2.2.2.1 Vias aerbias de biodegradao do BTEX ..................................................... 13 2.2.2.1.1 Etapas iniciais de degradao aerbia dos BTEX ..................................... 14 2.2.2.1.2 Oxidao dos intermedirios centrais da degradao aerbia dos BTEX ..19 2.2.2.2 Vias anaerbias de biodegradao do BTEX .................................................. 21 2.2.2.2.1 Etapas iniciais de degradao anaerbia dos BTEX ................................. 23 2.2.2.2.2 Oxidao dos intermedirios centrais da degradao anaerbia dos BTEX ................................................................................................................................... 28 2.2.3 Mecanismos de regulao enzimtica das vias catablicas relacionadas degradao bacteriana dos BTEX ................................................................................ 29 2.3 A
BIORREMEDIAO COMO ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE REAS

CONTAMINADAS POR BTEX ................................................................................................... 36

2.3.1 Tcnicas de estudo de microrganismos com potencial aplicao em processos de biorremediao ................................................................................................................ 37 2.3.2 Exemplos de processos de biorremediao em diferentes ambientes contaminados por BTEX ................................................................................................ 40 2.4 PERSPECTIVAS
QUANTO AO USO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA CONSTRUO DE

LINHAGENS COM AMPLA CAPACIDADE DE DEGRADAO ...................................................... 42

3 CONCLUSO ............................................................................................................... 44 4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................. 46

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estruturas qumicas das molculas dos compostos BTEX. ................................... 03 Figura 2 Ataque inicial do benzeno por oxigenases ............................................................ 14 Figura 3 - Reaes envolvidas na primeira etapa das vias de degradao aerbia de tolueno.16 Figura 4 Primeira etapa da via de degradao aerbia do etilbenzeno..................................18 Figura 5 Primeira etapa da via de degradao aerbia do meta-xileno .................................18 Figura 6 Degradao do catecol, intermedirio comum das vias de degradao dos BTEX, pelas vias de orto e meta clivagem............................................................................................20 Figura 7 Desenho esquemtico da utilizao microbiana dos hidrocarbonetos aromticos, evidenciando o rendimento energtico do metabolismo aerbio ou anaerbio da molcula, em funo do aceptor de eltrons utilizado.....................................................................................22 Figura 8 Potenciais reaes iniciais da via de degradao anaerbica do benzeno: carboxilao, metilao ou hidroxilao, com seus respectivos produtos, benzoato, tolueno e fenol ........................................................................................................................................ 24 Figura 9 - Primeira etapa da via de degradao anaerbia do tolueno .................................... 25 Figura 10 Etapas iniciais da via de degradao anaerbia do etilbenzeno .......................... 26 Figura 11 Etapas iniciais das vias de degradao das molculas m-xileno e o-xileno ........ 27 Figura 12 Esquema da via de degradao anaerbia do intermedirio central comum das vias: benzoil-CoA ................................................................................................................... 28 Figura 13 Esquema ilustrativo da rede de processos e sinais que regulam a capacidade metablica de degradao bacteriana dos compostos aromticos, evidenciando os trs tipos de regulao gnica: mecanismos de resposta especfica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais ..................... 30

LISTA DE TABELAS

Tabela

Parmetros fsico-qumicos de

importncia

para

mobilidade

de

hidrocarbonetos........................................................................................................................ 06 Tabela 2 Principais grupos de bactrias envolvidas na degradao dos hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX ........................................................................................... 10 Tabela 3 Protenas regulatrias representativas envolvidas no metabolismo dos BTEX....................................................................................................................................... 31

1 INTRODUO

Os compostos benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX) so hidrocarbonetos monoaromticos, cuja origem est relacionada, em geral, s atividades de extrao e refino de petrleo e derivados. Alm de participarem em boa parte da composio de combustveis fsseis, esses compostos so utilizados em vrios setores industriais, como a produo txtil e produo de pesticidas, entre outros. Os BTEX so contaminantes comuns de solos e gua. Esses compostos podem chegar ao meio ambiente atravs de descarga dos efluentes industriais, acidentes durante o processo de produo, transporte e estocagem de produtos qumicos e de produtos derivados do refino do petrleo, em especial a gasolina. A poluio causada pelos compostos BTEX um tpico de grande relevncia para a sade humana, da flora e da fauna ambientais. Esses compostos apresentam elevada toxicidade, em geral, relacionada s suas propriedades mutagnicas e carcinognicas. Alm disso, tais compostos aromticos podem causar distrbios neurolgicos, alteraes nas funes do sistema endcrino e leses em rgos como os rins e o fgado. Considerando as grandes quantidades de hidrocarbonetos contaminantes no ambiente e sua elevada toxicidade, existe uma grande preocupao em remover tais compostos do meio. Os mtodos qumicos e fsicos disponveis, muitas vezes, no so capazes de promover a remoo efetiva dos poluentes. Uma alternativa promissora a esses processos, devido ao seu custo relativamente baixo e alta eficincia, a degradao biolgica dos contaminantes, chamada de biorremediao. A biorremediao fundamenta-se na utilizao de

microrganismos capazes de degradar os compostos orgnicos, decompondo os mesmos em molculas mais simples como CO2, CH4 e H2O. Aps os carboidratos, os compostos aromticos so uma das classes de compostos orgnicos mais largamente distribudos, que constituem uma fonte importante de carbono e energia para os microrganismos. As bactrias, em especial, so um grupo de microrganismos muito versteis, capazes de transformar uma grande variedade de compostos hidrocarbonetos, o que as torna uma poderosa ferramenta para a biorremediao de stios contaminados por BTEX. A degradao bacteriana dos compostos BTEX pode ocorrer sob condies aerbias, em que o aceptor de eltrons o oxignio, e em condies anaerbias, em que o ferro (III), o nitrato e

o sulfato constituem os principais aceptores de eltrons. Em ambas as condies, as primeiras reaes de modificao do substrato apresentam certas particularidades, com relao aos mecanismos e enzimas participantes. Entretanto, tais reaes levam formao de um nmero restrito de intermedirios centrais, como por exemplo, o catecol e o protocatecuato, nas vias de degradao em condies aerbias, e o benzoil-CoA, nas vias de degradao em condies anaerbias. Os intermedirios centrais das vias so, ento, catabolizados por vias de degradao comuns, que levam formao dos metablitos centrais, como acetil-CoA, acetato e piruvato, que participam de processos importantes na clula, como o ciclo de Krebs. O aprimoramento dos conhecimentos relativos aos microrganismos potencialmente degradadores de compostos BTEX e das vias envolvidas neste tipo de metabolismo de grande relevncia para o avano das tcnicas de biorremediao de stios contaminados por BTEX. Primeiramente, porque permite a obteno de inoculantes promissores, capazes de promover a degradao dos poluentes com rapidez e eficincia. Segundo, porque permite a utilizao de tcnicas moleculares para manipulao dos componentes genticos relacionados s vias, como genes que codificam enzimas e protenas regulatrias e promotores ligados aos operons catablicos. Alm disso, as tcnicas moleculares possibilitam a obteno de microrganismos geneticamente modificados que renam caractersticas que os tornem capacitados para promover a degradao de substratos diferentes em condies ambientais diversas. A proposta deste trabalho fazer uma reviso das principais vias de degradao bacteriana dos hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX descritas na literatura, sua gentica e os mecanismos de regulao gerais, e sumarizar brevemente algumas de suas aplicaes biotecnolgicas em processos de biorremediao e potenciais implicaes ambientais.

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 OS BTEX E SUAS PRINCIPAIS FONTES

Os hidrocarbonetos so uma classe de substncias orgnicas, cujas molculas so compostas exclusivamente por tomos de hidrognio e carbono. Entre os hidrocarbonetos, podemos distinguir duas classes distintas: hidrocarbonetos alifticos e hidrocarbonetos aromticos. Os compostos alifticos podem ser divididos em aqueles de cadeia linear, cadeia ramificada e cicloalcanos. J os compostos aromticos so aqueles que possuem em sua estrutura um ou vrios anis aromticos, caracterizados pelas duplas ligaes alternadas originando um fenmeno chamado de ressonncia. O benzeno e outros alquilbenzenos so compostos aromticos que possuem apenas um anel aromtico. Entre esses hidrocarbonetos monoaromticos, encontra-se uma classe particular de compostos denominados BTEX: benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (Figura 1).
(a) (b) CH3 (c) CH2 CH3

Benzeno (d) CH3 CH3

Tolueno (e) CH3

Etilbenzeno (f) CH3

CH3 CH3 orto-xileno meta-xileno para-xileno

Figura 1 Estruturas qumicas das molculas dos compostos BTEX. (a) Benzeno, (b) tolueno, (c) etilbenzeno (d) orto-xileno, (e) meta-xileno e (f) para-xileno.

Os compostos BTEX so contaminantes comuns de solos e guas. Os BTEX so comumente utilizados em uma srie de atividades industriais, possuindo aplicaes nas mais diversas reas: extrao de metais, pintura, txtil, processamento de madeira, produtos qumicos, pesticidas, detergentes e produtos do tabaco (CHAKRABORTY & COATES, 2004). Esses hidrocarbonetos podem chegar ao meio ambiente atravs da descarga dos efluentes industriais e tambm atravs de acidentes durante o processo de produo, transporte e estocagem. Entretanto, a grande parcela do processo de contaminao pode ser atribuda s atividades de refinarias de petrleo e seus derivados, em especial, a gasolina, cuja composio pode variar de 10 a 60% de compostos BTEX (GLENSOY & ALVAREZ, 1999). No perodo de 1975 a 2001, foram relatados pela comisso mista que analisa acidentes da Petrobrs/ Repar (CREA-PR) trinta e trs acidentes envolvendo derramamento de petrleo e seus derivados no Brasil, somando milhes de litros que contaminaram solos, rios e mares. Em julho de 2000, um acidente ocorrido durante a transferncia de petrleo entre terminais no litoral de Santa Catarina foi o responsvel pela contaminao dos rios Barigi e Iguau, por cerca de 4 milhes de litros de petrleo, provocando danos significativos flora e fauna aquticas e srio risco sade dos moradores locais (revisado por TIBURTIUS et al., 2004). Talvez, mais importante do que os grandes acidentes sejam os pequenos acidentes, na maioria das vezes, no notificados, e que quando somados, apresentam um dano muito superior aos outros de maior porte. Entre esses pequenos acidentes, encontram-se principalmente a contaminao de lenis subterrneos de gua por vazamentos de derivados de petrleo em solos de garagens de caminhes e nibus e em postos de combustvel. A Agncia de Proteo Ambiental Norte Americana (EPA) estima que existam mais de 1,5 milhes de tanques subterrneos de armazenamento de gasolina nos Estados Unidos, entre os quais pelo menos 30% esto com problemas de vazamento (SILVA et al., 2002). No Brasil, existe cerca de 30 mil postos de combustveis, muitos sob risco de ocorrerem vazamentos devido ao longo tempo de vida (alguns tm mais de 25 anos), o que aumenta a probabilidade de apresentarem rachaduras ou corroso (SILVA et al., 2002). Quando ocorre uma contaminao de um curso de gua ou de um solo por petrleo ou alguns de seus derivados, eles se espalham pelo ambiente, ficando sujeitos a vrias modificaes, principalmente, em relao sua composio. Entre os fenmenos envolvidos nesse processo encontram-se a evaporao de fraes de baixo peso molecular, dissoluo de alguns

componentes hidroflicos, adsoro s partculas presentes em sedimentos ou solos, oxidao fotoqumica e biodegradao (HARAYAMA et al., 2004). Tais compostos relacionados ao petrleo e seus derivados tambm apresentam uma cintica especfica quando presentes no meio. Durante migrao atravs de solos e sedimentos em cursos dgua, a frao mais polar (compostos nitrogenados, sulforados e oxigenados, nalcanos de pequena cadeia e pequenos hidrocarbonetos aromticos) capaz de maior espalhamento em superfcie e em profundidade, enquanto a frao menos polar permanece adsorvida s partculas do solo (JOVANCICEVIC et al., 2005). Em um derramamento e/ou vazamento de combustvel, uma das principais preocupaes a contaminao dos aqferos que so usados como fonte de abastecimento de gua para o consumo humano. Os maiores problemas de contaminao so atribudos aos hidrocarbonetos monoaromticos, que so os constituintes mais solveis e mveis da frao da gasolina. Esses compostos tm maior mobilidade em sistema solo-gua devido ao menor coeficiente de partio entre octanol-gua (Tabela 1), o que leva a uma lenta adsoro no solo e um transporte preferencial pela gua, provocando a contaminao de mananciais de abastecimento. Essa mobilidade aumentada pela adio de lcool na gasolina comercializada no Brasil, devido ao efeito de cossolvente do lcool (SILVA et al., 2002, TIBURTIUS et al., 2004). A contaminao de mananciais de abastecimento particularmente problemtica devido alta toxicidade dos compostos BTEX e outros alquilbenzenos. Tal toxicidade est relacionada ao potencial carcinognico e mutagnico desses compostos (SILVA et al., 2002). Os valores mximos permitidos para os diferentes hidrocarbonetos monoaromticos em guas destinadas para consumo humano, de acordo com o estabelecido pela Portaria 518/2004 do Ministrio da Sade (BRASIL, MINISTRIO DA SADE, 2004), so 5 g.L-1 para o benzeno, 170g.L-1 para o tolueno, 200g.L-1 para o etilbenzeno e 300g.L-1 para o xileno. No Brasil, o benzeno reconhecido oficialmente como um agente cancergeno pela Portaria da Secretaria de Segurana e Sade no Trabalho n 14 de dezembro de 1995 (BRASIL, SECRETARIA DE SEGURANA E SADE NO TRABALHO, 1995). Entre os casos de cncer relatados, as leucemias so as mais freqentes, resultado dos danos cromossmicos provocados pelo benzeno, principalmente em linfcitos e clulas da medula ssea de humanos e outros seres vivos. Alm do potencial carcinognico e mutagnico, os BTEX so poderosos

Tabela 1 - Parmetros fsico-qumicos de importncia para a mobilidade de hidrocarbonetos (modificada de WATTS et al., 2000). Composto Benzeno Tolueno Xileno Nonano Decano Dodecano Solubilidade em gua (mg/L)a 1760 532 163-185 0,122 0,021 0,005 Log Kaow 2,12 2,73 2,95-3,26 4,67 6,69 7,24

Kaow: Coeficiente de partio octanol-gua

depressores do sistema nervoso central, podendo levar a alteraes nas capacidades motoras e neurolgicas, bem como alteraes nos sistemas endcrinos e enzimticos (revisado por TIBURTIUS et al., 2004). No apenas o contato direto com os hidrocarbonetos monoaromticos prejudicial sade do homem. Organismos aquticos (flora e fauna) so capazes de absorver ou ingerir tais compostos, armazenando os mesmos em suas molculas proticas e reservas lipdicas. No tecido adiposo, os hidrocarbonetos encontram-se inalterados, levando a um processo de transferncia na cadeia alimentar, at atingir o homem. A ingesto e acmulo de hidrocarbonetos em doses muitas vezes pequenas podem acarretar em processos de intoxicao crnica, trazendo srias implicaes para a pesca, sade pblica e meio ambiente (SILVA et al., 2002).

2.1.1 TRATAMENTO DE STIOS CONTAMINADOS

O tratamento dos stios contaminados por BTEX de grande relevncia considerando os problemas ambientais e de sade pblica que tais compostos podem ocasionar e o tempo que os mesmos permanecem no ambiente quando nenhum procedimento a mais realizado para auxiliar a degradao natural destes compostos.

O tratamento desses poluentes pode ser realizado atravs de processos fsicos, qumicos e biolgicos. s vezes, o tratamento exige a remoo do solo ou gua contaminados, podendo ser realizado, em outras circunstncias, no prprio local. O carvo ativado muito utilizado para remoo de contaminantes orgnicos, por meio do processo de adsoro. Outro processo utilizado para remoo de compostos orgnicos pouco polares, chamado air striping, consiste na injeo de ar dentro do aqfero contaminado, a transferncia dos contaminantes volteis para a fase gasosa e sua separao por um sistema de extrao de vapor. Esses processos so eficientes, entretanto, no so destrutivos. O carvo ativado gera fases slidas saturadas com contaminantes, enquanto o air striping libera gases txicos (TIBURTIUS et al., 2004). Um processo qumico muito usado a oxidao cataltica, em que o ar aquecido a 300500C por um tempo curto. Esse processo dispendioso pelo alto gasto de energia e uso de catalisadores de elevado custo, como a platina (KIM, 2002). Entre outros processos fsicos e qumicos existentes, podemos citar: a utilizao de radiao, como microondas (CHIH-JU & TAI, 1998); e o emprego de radicais livres hidroxilas (OH) em processos oxidativos avanados, utilizando oznio, perxido de hidrognio, semicondutores, reagente de Fenton e radiao ultravioleta (FREIRE et al., 2000; WATTS et al., 2000). Devido s limitaes dos diferentes mtodos citados anteriormente, para que a remoo seja efetiva, vrios processos devem ser usados em conjunto, o que acaba elevando o custo e tempo do tratamento. Uma alternativa promissora aos processos citados anteriormente a degradao biolgica dos contaminantes, chamada de biorremediao. Segundo Tiburtius et al. (2004), a biorremediao um dos processos mais utilizados para a remoo dos BTEX e fundamenta-se na utilizao de microrganismos capazes de degradar os compostos orgnicos, decompondo os mesmos em molculas mais simples como CO2, CH4 e H2O (mineralizao). um processo de custo relativamente baixo e alta eficincia. A biorremediao s possvel graas versatilidade microbiana, no que diz respeito s vias catablicas, enzimas envolvidas e capacidade de adaptao. As principais vias catablicas de degradao dos compostos BTEX por bactrias sero abordadas nos captulos posteriores. No captulo 3 tambm ser abordado o tema da biorremediao com maior ateno.

2.2 A BIODEGRADAO DOS COMPOSTOS BTEX

2.2.1 AS BACTRIAS COMO AGENTES DA DEGRADAO DOS COMPOSTOS BTEX

Durante a primeira metade do sculo XX, um extenso nmero de vias bioqumicas, tanto de biossntese quanto de degradao, foi elucidado, e os microrganismos se tornaram exemplos primos da versatilidade da vida. Apenas entre estes seres vivos podem ser observados exemplos de tolerncia a ambientes extremos, cujas temperaturas beiram as de congelamento e ebulio da gua, ou cujos valores de pH so capazes de ir de um ponto extremo a outro na escala. No apenas a capacidade de sobreviver em ambientes extremos ilustra a versatilidade microbiana, mas tambm a rapidez com a qual os microrganismos so capazes de se adaptar e modificar seu aparato enzimtico face s novas mudanas ambientais, produzindo uma larga variedade de tipos fisiolgicos conhecidos hoje (PALLERONI, 1995). Somente entre os microrganismos, possvel encontrar atividades catablicas de grande interesse, que permitam, por exemplo, atividades como a biorremediao de ambientes altamente contaminados por compostos orgnicos recalcitrantes que so txicos para outras formas de vida superiores. Desde 1945, Claude Zobell j afirmava que os mltiplos efeitos das bactrias na formao e transformao dos hidrocarbonetos do petrleo seriam uma nova fronteira de conhecimento (revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004). Hoje, de conhecimento que grande parte das modificaes na composio dos compostos orgnicos presentes no ambiente, incluindo componentes do petrleo e produtos de seu processamento, acontece devido atividade microbiana. Em geral, os hidrocarbonetos do petrleo so degradados na seguinte ordem: n-alcanos > alcanos monocclicos > alquil benzenos > alcanos isoprenides > alquil naftalenos > alcanos bicclicos > esteranos > hopanos (SUN et al., 2005). Essa alterao pode dar-se em espaos de tempo relativamente curtos, desde alguns meses at alguns anos (JOVANCICEVIC et al., 2005). Diversos estudos tm relatado os processos de biodegradao de hidrocarbonetos aromticos e os microrganismos envolvidos na degradao desses compostos sob condies ambientais

diversas, tais como: ambientes marinhos (HARAYAMA et al., 2004; COHEN, 2002; HEAD & SWANNELL, 1999) e continentais, guas de superfcie (ANTIC et al., 2006) e subterrneas, solos e sedimentos (CAVALCA et al., 2000; PHELPS & YOUNG, 1999), condies aerbias e anaerbias (ZHANG & BENNETT, 2005; CHAKRABORTY & COATES, 2004; HOLLIGER & ZEHNDER, 1996), ambientes extremos (MARGESIN & SCHINNER a,b, 2001). As bactrias possuem uma ampla capacidade de degradar os hidrocarbonetos aromticos do grupo BTEX. Muitos outros microrganismos apresentam a capacidade de degradao desses compostos, entre eles organismos eucariotos como fungos, algas, entre outros, que tambm tm um papel importante nos processos de detoxificao de ambientes contaminados. Devido s facilidades de estudo sob condies laboratoriais das propriedades bioqumicas e genticas nas bactrias, grande parte das vias foram elucidadas atravs de investigaes utilizando esse grupo de microrganismo. Alm disso, as alteraes genticas so rapidamente expressas nos procariotos, devido natureza haplide de seus genomas. Essa caracterstica favorece a realizao de testes genticos, com a finalidade de elucidar a funo de genes e protenas envolvidas nas vias de degradao bacteriana (PALLERONI, 1995). Na literatura, encontram-se descritos vrios processos de degradao utilizando bactrias em culturas puras ou em consrcios. Os consrcios bacterianos tm especial importncia na degradao de compostos aromticos considerados recalcitrantes, na detoxificao de stios contaminados por vrios compostos diferentes (misturas) e na degradao de contaminantes em ambientes adversos (ZHANG & BENNETT, 2005). Isso porque, muitas vezes, uma nica espcie no possui todo o aparato enzimtico capaz de promover a degradao completa do composto orgnico, gerando intermedirios que so metabolizados por outras espcies. A Tabela 2 traz alguns exemplos de bactrias que, em cultura pura, foram capazes de metabolizar alguns dos compostos BTEX. Algumas delas apresentaram a capacidade de metabolizar at mais de um composto. Como ser observado posteriormente, grande parte das vias de degradao aerbia dos compostos BTEX foram elucidadas atravs de investigaes utilizando as bactrias do gnero Pseudomonas, que acabaram se tornando modelos de estudo. As bactrias desse gnero apresentam grande versatilidade metablica relatada na literatura desde o incio do sculo, podendo utilizar at 100 diferentes fontes de carbono, incluindo hidrocarbonetos alifticos,

Tabela 2 Principais grupos de bactrias envolvidas na degradao dos hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX.
Bactria (linhagem) Benzeno Dechloromonas spp. Linhagens RCB e JJ Arthrobacter sp. HCB Burkholderia pickettii pK01 Planococcus sp. ZD22 Tolueno Pseudomonas putida F1 Burkholderia pickettii pK01 Pseudomonas mendoncina KR1 Pseudomonas stutzeri OX1 Arthrobacter sp. HCB Pseudomonas putida mt-2 Cycloclasticus pugetti PS-1 Geobacter grbicium Thauera aromtica linhagens K172 e T1 Azoarcus spp. Desulfobacula toluolica Desulfobacterium cetonicum Geobacter metallireducens linhagem GS-15 Etilbenzeno Linhagens EbN1 e EB1, relacionadas ao gnero Thauera Proteobacteria marinha, linhagem EbS7 Pseudomonas sp. NBM21 Xilenos Linhagem oXyS1, relacionadas s espcies Desulfobacterium acetonicum e Desulfosarcina variabilis Linhagem mXyS1, do grupo Proteobacteria Thauera spp. e Azoarcus spp. Pseudomonas sp. NBM21 Anaerbia Nitrato redutoras Anaerbia Sulfato redutoras Aerbia Rabus & Widdel (1995) Ball et al. (1996) Kniemeyer et al. (2003) Jeong et al. (2006) Condies Anaerbia Nitrato redutoras Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Aerbia Anaerbia Fe(III) redutora Anaerbia Fe(III) e nitrato redutoras Anaerbia Fe(III) e sulfato redutoras Anaerbia Fe(III) redutora Referncia Coates et al (2001) Alvarez & Vogel (1991) Kukor & Olsen (1996) Li et al. (2006) Gibson et al. (1968) Kukor & Olsen (1996) Whited & Gibson (1991) Arenghi, et al. (1999) Alvarez & Vogel (1991) Williams & Murray (1974) Dyksterhouse et al. (1995) Anders et al. (1995) Evans et al. (1991) Chakraborty & Coates (2004) Rabus et al. (1993) Harms et al. (1999) Chakraborty & Coates (2004) Lovley et al (1989)

Anaerbia Sulfato redutoras

Harms et al. (1999)

Anaerbia Nitrato redutoras Aerbia

Hess et al. (1997), Rabus & Widdel, (1995). Jeonq et al. (2006)

mono e poliaromticos, alm dos compostos substitudos, contendo na molcula tomos de cloro, fsforo, entre outros. Algumas das molculas podem ser degradadas utilizando mais de uma via catablica (PALLERONI, 1995). Os genomas das bactrias Pseudomonas esto entre os maiores genomas bacterianos j seqenciados e contm uma grande proporo de genes regulatrios descritos na literatura. Boa parte dos genes est relacionada ao metabolismo, transporte e efluxo de compostos orgnicos, o que explica a grande capacidade de adaptao dessas bactrias em ambientes diversos (PALLERONI, 1995). Os plasmdeos associados s vias catablicas das pseudomonas tambm esto entre os mais estudados. Esses componentes genticos muito comuns nas bactrias contribuem bastante para a grande versatilidade deste grupo de organismos. Grande parte dos genes relacionados s vias catablicas de degradao descritos na literatura encontra-se presente em plasmdeos, como pWW0 de P. putida e pWW53 de P. putida MT53 (ASSINDER & WILLIAMS, 1990). Os plasmdeos catablicos, em geral, somente so mantidos em clulas bacterianas que se encontram sob presso seletiva. Esta uma importante justificativa de se trabalhar com a microbiota indgena na biorremediao de locais contaminados. Muito pouco conhecido sobre como as comunidades microbianas se tornam adaptadas presena de compostos xenobiticos. Anlises comparativas de sequncias de DNA e estudos em microcosmos experimentais tm demonstrado que a transferncia gnica entre espcies possa ter um grande impacto na evoluo bacteriana. Os efeitos da transferncia gnica so dependentes da expresso do novo material gentico nos organismos receptores e das conseqentes mudanas nas suas caractersticas fenotpicas frente aos processos de seleo natural. Uma estratgia para investigar o impacto da transferncia gnica rastrear a distribuio de genes para a biodegradao de contaminantes ambientais sob vrias condies seletivas (FULTHORPE & WYNDHAM, 1991; WYNDHAM et al., 1997). Como os genes catablicos esto frequentemente associados com plasmdeos conjugativos e, em alguns casos, com transposons, eles so ideais para investigar a influncia da mobilidade gentica no metabolismo microbiano (WYNDHAM et al., 1997; ELSAS & SMIT, 1997).

2.2.2 AS VIAS DE DEGRADAO BACTERIANA DOS BTEX

A biodegradao a capacidade metablica de organismos transformarem ou mineralizarem contaminantes orgnicos em substncias simples, que possam ento se integrar aos ciclos biogeoqumicos. A intensidade da biodegradao depende de uma srie de fatores como disponibilidade de nutrientes, oxignio, valores de pH, concentrao e caractersticas dos contaminantes. Este processo, juntamente com outros processos fsicos e qumicos, responsvel pela descontaminao de ambientes contaminados por compostos orgnicos txicos como os BTEX (MARGESIN & SCHINNER, 2001). Nem sempre possvel combinar em nico microrganismo todas as caractersticas requeridas para promover a descontaminao de um ambiente. Nesse caso, a sintropia do consrcio bacteriano muito importante, pois cada membro do grupo especializado em determinada etapa da via de degradao de certo poluente (DAZ, 2004). Muitas vezes, um substrato orgnico s metabolizado na presena de outros substratos capazes de serem metabolizados pelo microrganismo. Esse tipo de processo, chamado cometabolismo, degrada parcialmente o composto orgnico, que, por sua vez, no serve como fonte de carbono para o microrganismo. O co-metabolismo comum em consrcios bacterianos que degradam hidrocarbonetos aromticos, como o benzeno (BOSSERT & COMPEAU, 1995). A biodegradao aerbia e anaerbia de hidrocarbonetos monoaromticos tm caractersticas comuns. Para a biodegradao dos compostos essencial uma reao redox, em que o hidrocarboneto oxidado (doador de eltron) e um aceptor de eltron reduzido. Existem diferentes compostos que podem agir como aceptores de eltron, entre eles o oxignio (O2), utilizado pelas bactrias aerbias, e o nitrato (NO3-), os xidos de Fe (III), o sulfato (SO42-), entre outros, utilizados pelas bactrias anaerbias (BORDEN et al., 1995). Em geral, a degradao dos hidrocarbonetos aromticos mais eficiente e rpida em condies aerbias. O oxignio o aceptor de eltrons mais comum na respirao microbiana, e o processo aerbio fornece uma grande quantidade de energia para as clulas. Em condies anaerbias, a estabilidade desses compostos grande, basta pensar no tempo de vida dos reservatrios de petrleo cru. Na degradao dos hidrocarbonetos aromticos, o oxignio

molecular atua no apenas como um aceptor de eltrons na cadeia respiratria, mas tambm como um agente reativo na oxidao da molcula (BOSSERT & COMPEAU, 1995). Por outro lado, os processos de degradao de hidrocarbonetos em condies anaerbias tm grande importncia, principalmente em ambientes contaminados, com depleo de oxignio. Nos itens a seguir, sero descritas as principais vias de degradao dos hidrocarbonetos aromticos BTEX, em ambas as condies: aerbia e anaerbia.

2.2.2.1 VIAS AERBIAS DE BIODEGRADAO DO BTEX

As enzimas envolvidas nos processos de transformao de compostos aromticos, em geral, no so distribudas em muitas classes diferentes de enzimas; as hidrolases e oxidoredutases so as mais utilizadas nas vias. As oxidoredutases so enzimas complexas, usualmente, compostas por multicomponentes proticos, que requerem cofatores como o NADH, e so, na maioria das vezes, utilizadas em vrias etapas da biocatlise (DAZ et al., 2001). Os hidrocarbonetos monoaromticos do grupo BTEX so degradados aerobicamente por microrganismos atravs de um processo oxidativo em que a primeira etapa da via d-se atravs de reaes catalizadas por enzimas oxigenases do anel aromtico que introduzem tomos de oxignio no anel aromtico ou em seus substituintes alquil (CAVALCA et al., 2000, CHAKRABORTY & COATES, 2004). As primeiras etapas das vias de degradao possuem suas particularidades para cada substrato BTEX diferente. Aps essa etapa, os hidrocarbonetos monoaromticos so transformados em intermedirios centrais comuns: os catecis e os protocatecuatos. Tais compostos intermedirios so substratos de enzimas oxigenases responsveis pela clivagem do anel aromtico, que atuam diferentemente, gerando produtos que sero metabolizados por vias centrais distintas: orto e meta clivagem. As vias centrais envolvem uma srie de reaes que produzem metablitos que participam do ciclo de Krebs, acetato e succinato, ou substratos que podem ser facilmente convertidos a intermedirios do ciclo, como o piruvato e acetaldedo (DIAZ, 2004).

2.2.2.1.1 ETAPAS INICIAIS DE DEGRADAO AERBIA DOS BTEX

Todos os compostos monoaromticos do grupo BTEX so derivados do benzeno. Sendo assim, a quebra do anel aromtico uma etapa comum a todas as vias de degradao desses compostos. Para ocorrncia da clivagem do anel aromtico necessrio diminuir a sua estabilidade termodinmica, que dificulta o ataque enzimtico, o que pode ser realizado adicionando grupos eletroflicos estrutura do anel (DIAZ, 2004). Na oxidao do benzeno pelas bactrias aerbias, essa barreira qumica foi superada por meio da utilizao do oxignio molecular, no apenas como aceptor de eltrons, mas tambm como um co-substrato na reao mediada pelas oxigenases. O ataque da molcula pode ser catalisado pelas monooxigenases, enzimas que incorporam um tomo de oxignio ao anel (Figura 2a), ou pelas dioxigenases, que incorporam dois tomos de oxignio (Figura 2b). O produto dessa reao inicial um benzeno dihidrodiol (1,2-dihidroxiciclohexa-3,5-dieno), cuja isomeria espacial (cis ou trans) depende de qual enzima catalisar a reao (RIBBONS & EATON, 1982). O benzeno dihidrodiol, por sua vez, convertido a catecol por uma desidrogenase (Figura 2).
(a) O2 H2 O H O NADH Benzeno NAD + H xido Areno H2 O H OH H OH Trans-dihidrodiol NAD + NADH OH Catecol OH

(b)

O2

H OH OH +

OH OH Catecol

NADH Benzeno

NAD +

H Cis-dihidrodiol

NAD

NADH

Figura 2 Ataque inicial do benzeno por oxigenases. (a) A reao catalisada por uma monooxigenase, que introduz um tomo de oxignio no anel aromtico, produzindo um xido areno, que, atravs de uma hidratao, forma um trans-dihidrodiol, convertido posteriormente a catecol. (b) A reao catalisada por uma dioxigenase, que introduz dois tomos de oxignio no anel, formando diretamente o cis-dihidrodiol, convertido por uma desidrogenao a catecol. As molculas de catecol produzidas so degradadas pelas vias de orto e meta clivagem.

As oxigenases que catalisam a hidroxilao do anel do benzeno requerem co-substratos doadores de eltrons, como o NADH (Figura 2). Entre os multicomponentes dessas enzimas, h um flavoprotena que recebe os eltrons do NADH e os transfere atravs da ferredoxina para a oxigenase. A oxigenase reduzida reage com o oxignio molecular e o substrato aromtico (revisado por WRENN, 1998). Como relatado anteriormente, reaes de orto ou meta clivagem do continuidade ao processo de degradao, atravs do metabolismo da molcula de catecol, produzindo intermedirios que participam do ciclo de Krebs. A degradao de compostos alquil benzenos, tais como o tolueno, etilbenzeno e xilenos, pode ocorrer inicialmente atravs da oxidao direta do anel ou, muito comumente, atravs da oxidao dos grupos laterais. Esses compostos tm sido utilizados como fonte de carbono e energia para uma grande variedade de bactrias, incluindo as pertencentes aos gneros Pseudomonas, Achromobacter e Nocardia (WRENN, 1998). Diferentes vias catablicas do tolueno encontram-se descritas na literatura, como as vias TOL, TOD, TOM, T4MO e TBU (Figura 3). Tais vias foram estudadas primeiramente em bactrias pseudomonas, mas no so exclusivas dessas bactrias. A via catablica TOL foi elucidada a partir do estudo de um plasmdeo isolado de Pseudomonas putida mt-2, que inicia o metabolismo do tolueno oxidando o seu grupo metil. Pela ao de uma monooxigenase, o tolueno convertido a benzil lcool, oxidado em seguida a benzaldedo e, conseguinte, a cido benzico, por uma desidrogenao. A hidroxilao do anel d-se a partir do cido benzico, formando um cis-benzoato dihidrodiol, convertido em seguida a catecol (WILLIAMS & MURRAY, 1974). A clivagem do catecol obtida pela meta-clivagem (Figura 3a). Bactrias contendo o plasmdeo TOL so capazes de degradar, alm do tolueno, as molculas de p-xileno e m-xileno. Comparando as habilidades de biodegradao dos compostos BTEX e naftaleno de diversas linhagens bacterianas, Glensoy & Alvarez (1999) observaram que esses trs compostos foram os mais frequentemente degradados (75% das linhagens) e sugeriram que possivelmente o plasmdeo TOL apresenta um papel muito importante na degradao dos BTEX e naftaleno.

CH2OH (a)
Benzillcool TOL

CHO

COO

COO OH

OH H

OH OH

Metaclivagem

Benzaldedo

Benzoato

Cis-benzoato dihidrodiol

Catecol

CH3 (b) H OH OH
Cis-tolueno dihidrodiol

CH3 OH OH
3-M etilcatecol

Metaclivagem

TOD

CH3
TOM

CH3 OH (c)
o-cresol

CH3 OH OH
3-M etilcatecol

Metaclivagem

Tolueno
TBU

CH3 (d)
m-cresol

CH3 OH Metaclivagem

OH CH2OH CHO COO

-

3-M etilcatecol

OH

T4MO

CH3 (e)

COOH Ortoclivagem OH

OH
p-cresol

OH
p -Hidroxi benzil lcool

OH
p-Hidroxi benzaldedo

OH
p-Hidroxi benzoato

OH
Protocatecuato

Figura 3 Reaes envolvidas na primeira etapa das vias de degradao aerbia de tolueno. (a) A via TOL tem como produto inicial um benzil lcool, que aps oxidao a cido benzico, convertido a dihidrodiol e consecutivamente, a catecol. As via TOD (b), TOM (c) e TBU (c) so iniciadas pela oxidao direta do anel, formando produtos convertidos posteriormente a 3-metilcatecol. Tambm a via T4MO (e) iniciada por hidroxilao do anel, formando, no entanto, uma molcula de protocatecuato. As molculas de catecol, 3metilcatecol e protocatecuato so metabolizadas por meta ou orto clivagem, produzindo intermedirios centrais do ciclo de Krebs (Modificada de GLENSOY & ALVAREZ, 1999).

Nas vias descritas a seguir, a degradao do tolueno iniciada pela hidroxilao do anel aromtico, levando formao dos intermedirios centrais 3-metilcatecol (vias TOD, TOM e TBU), degradado posteriormente pela via de meta clivagem, e protocatecuato (via T4MO) degradado pela via de orto clivagem. A via catablica TOD, descoberta na bactria P. putida F1, inclui a enzima tolueno dioxigenase, que adiciona dois tomos de oxignio ao anel benznico. Essa reao leva formao do cis-tolueno dihidrodiol, que convertido a 3-metilcatecol por uma reao de desidrogenao (GIBSON et al., 1968) (Figura 3b). A via catablica TOM foi elucidada em Burkholdderia cepacia G4 (inicialmente denominada P. cepacia G4), que utiliza a enzima tolueno orto -monooxigenase no ataque inicial da molcula, originando um o-cresol (SHIELDS et al., 1989) (Figura 3c). De forma similar, na via catablica TBU, descrita em B. pickettii PK01 (inicialmente denominada P. pickettii PK01), esta etapa catalisada pela enzima tolueno meta-monooxigenase para formar um mcresol (KUKOR & OLSEN, 1996) (Figura 3d). Finalmente, a via catablica T4MO ocorre em P. mendocina KR1, que utiliza a enzima tolueno para-monoxigenase para formar um p-cresol (WHITED & GIBSON, 1991) (Figura 3e). O p-cresol convertido a p-hidroxibenzil lcool, que, assim como na via TOL, oxidado a p-hidroxi benzoato. Essa molcula convertida posteriormente a protocatecuato. Alquil benzenos maiores como o etilbenzeno, isopropil, n-butil, entre outros, so degradados por Pseudomonas putida atravs da oxidao do anel benznico. Em geral, esse processo lento, e os produtos formados inicialmente so cis-dihidrodiis, como descrito na via TOD de degradao de tolueno. No caso do etilbenzeno, o produto da primeira etapa da via o etilcatecol, metabolizado pela via de meta clivagem (WRENN, 1998) (Figura 4). Quanto aos benzenos dialquil substitudos, como os xilenos, existem algumas diferenas quanto degradao de seus ismeros orto, meta e para. As molculas de m-xileno e p-xileno so convertidas a dimetilcatecis, que no so clivados pela catecol 2,3 dioxigenase de P. putida, e, portanto, no so metabolizados pela via de meta clivagem. J a Nocardia corallina capaz de metabolizar pela via de orto clivagem o produto inicial da degradao do p-xileno, o 3,6-dimetilcatecol. Entretanto, apresenta como produto final da via o 2,5-dimetil-cis,ciscido mucnico, no atingindo a mineralizao do composto aromtico (JAMISON et al, 1969).

CH2CH3

CH2CH3 H OH OH H

CH2CH3 OH Metaclivagem OH
3-etilcatecol

Etilbenzeno

Cis-etilbenzeno dihidrodiol

Figura 4 Primeira etapa da via de degradao aerbia do etilbenzeno. A via de degradao do etilbenzeno, assim como a via TOD do tolueno, iniciada pela oxidao direta do anel, formando como produto intermedirio o 3-etilcatecol, posteriormente metabolizado pela via de meta clivagem.

Nocardia sp. capaz de crescer em o-xileno, degradando inicialmente esse composto atravs da hidroxilao do anel, produzindo 3,4-dimetilcatecol. Essa bactria capaz de oxidar o 3,4dimetilcatecol pela via de meta-clivagem, formando cido actico, propionaldedo e piruvato. Entretanto, esta bactria uma exceo tanto em relao sua capacidade de oxidao de dimetilcatecis pela via de meta-clivagem, quanto capacidade de crescer em o-xilenos (WRENN, 1998). Quanto degradao dos meta e para xilenos, a primeira etapa da via de degradao compreende a oxidao do grupo metil, produzindo 3-metil benzoato, e a conseguinte oxidao do anel aromtico, mecanismo semelhante ao observado na via TOL de degradao do tolueno. A insero do oxignio ocorre no tomo de carbono ligado ao grupo carboxila. As reaes de descarboxilao e desidrogenao que se seguem, transformam o diol em metilcatecol (RIBBONS & EATON, 1982) (Figura 5).
CHO
-

CH3

CH2OH

COO

COO OH

OH H

OH OH CH3
3-metilcatecol

Metaclivagem

CH3
m-xileno

CH3
3-metil benzil lcool 3-metil benzaldedo

CH3
3-metil benzoato

CH3

CH3
3-metil cis-benzoato dihidrodiol

Figura 5 Primeira etapa da via de degradao aerbia do meta-xileno. Aps a oxidao do grupo metil, o anel aromtico oxidado, atravs de um mecanismo semelhante ao observado na via TOL de degradao do tolueno. O produto intermedirio dessa via o 3-metilcatecol.

2.2.2.1.2 OXIDAO DOS INTERMEDIRIOS CENTRAIS DA DEGRADAO AERBIA DOS BTEX

Os compostos monoaromticos estruturalmente diferentes so degradados aerobicamente atravs de vias iniciais diversas. No entanto, os produtos intermedirios formados so comuns s vias, limitando-se a algumas molculas dihidroxi aromticas: catecis e protocatecuatos. Esses intermedirios so oxidados por vias centrais especficas que produzem intermedirios centrais do metabolismo da clula: vias de orto ou meta clivagem. Na via de meta clivagem, a quebra do anel se d prximo s duas hidroxilas do anel aromtico, sendo as reaes subsequentes ditadas pela natureza do produto da fisso do anel. Na via de orto-clivagem, a quebra do catecol se d entre as hidroxilas do catecol, sendo que um grupo inteiramente diferente de enzimas requerido para o metabolismo dos distintos produtos do anel clivado. Na via de orto-clivagem (Figura 6a), a enzima catecol 1,2-dioxigenase catalisa a incorporao de um dioxignio entre os dois grupos hidroxilas da molcula de catecol. O produto formado o cido cis,cis-mucnico (GIBSON, 1968), que convertido em mucolonato pela ao da enzima de lactonizao de cis,cis-muconato (4-carboximetil-4-hidroxi-isocrotolactona liase). Este produto, pela ao de uma isomerase, convertido a -cetoadipato enol lactona, que por sua vez constitue-se num substrato para a oxoadipato enol-lactona hidrolase formando 3oxoadipato. Finalmente, o 3-oxoadipato convertido a succinato e acetil-CoA pela ao de uma transferase (4-carboximetil-4-hidroxi-isocrotolactona liase) (ORNSTON & STANIER, 1966; KEMP & HEGEMAN, 1968). Em Pseudomonas putida, atravs da via de meta-clivagem, o catecol convertido a cido 2hidroximucnico semialdedo (DAGLEY et al., 1960) que pela ao da enzima semialdedo desidrogenase dependente de NAD+ origina 4-oxalocrotonato (NISHIZUKA et al., 1962). Na segunda via (Figura 6b), o cido 2-hidroximucnico semialdedo metabolisado pelo sistema hidrolase a 2-oxi-penta-4-enoato (SALA-TREPAT et al., 1971), o qual descarboxilado a 4hidroxi-2-oxi-valerato, pela ao de outra hidrolase. Este produto clivado pela ao de uma aldolase originando acetaldedo e piruvato.

OH (a)
ORTOCLIVAGEM Catecol 1,2dioxigenase Catecol 2,3dioxigenase METACLIVAGEM

OH COOH COOH
Catecol

(b)

O2

O2

CHO COOH OH
2-hidroximucnico semialdedo

Cis,cis-muconato

H2O O COOH C O HCOOH COOH O

2-oxipenta-4-enoato

Muconolactona

COOH C O

H2O COOH O

3-oxoadipato enol-lactona

COOH COOH
3-oxoadipato

HO
4-hidroxi-2-oxi-valerato

COOH COOH
Succinato

CH2 + CO
Acetil-CoA

+ O

COOH

Acetaldedo

CH3

SCoA

Piruvato

Figura 6 Degradao do catecol, intermedirio comum das vias de degradao dos BTEX, pelas vias de orto e meta clivagem. (a) Na via de orto-clivagem, a quebra do catecol se d entre as hidroxilas do catecol, enquanto na via de meta clivagem (b), a quebra do anel se d prximo s duas hidroxilas do anel aromtico, sendo as reaes subsequentes ditadas pela natureza do produto da fisso do anel.

2.2.2.2 VIAS ANAERBIAS DE BIODEGRADAO DO BTEX

A biodegradao anaerbia dos hidrocarbonetos aromticos BTEX foi negligenciada at a dcada de 80, particularmente por ser considerada pouco favorvel energeticamente, quando comparada degradao aerbia. Entretanto, esses compostos so utilizados como fonte de carbono por diversas bactrias anaerbias, sob condies nitrato redutoras, ferro redutoras, sulfato redutoras e condies metanognicas. O uso de outros aceptores de eltrons diferentes do oxignio baseado na disponibilidade dos compostos aceptores e na competio de diferentes tipos de microrganismos pelos doadores de eltrons. Por exemplo, a reduo de Fe (III) o mecanismo de oxidao de matria orgnica mais frequentemente observado em ambientes subsuperficiais. O nitrato um dos ons mais encontrados em guas naturais, ocorrendo geralmente em baixos teores nas guas superficiais, mas podendo atingir altas concentraes em guas subterrneas. J o sulfato o principal aceptor de eltrons para degradao anaerbia em ambientes marinhos, devido a sua alta concentrao em gua do ar (DIAZ, 2004, BORDEN et al., 1995). Em termos de energia, enquanto a degradao de compostos aromticos utilizando o nitrato e o Fe (III) como aceptores de eltrons quase to eficiente quanto a degradao aerbia, em condies sulfato redutoras e metanognicas, a quantidade de energia gerada comparativamente muito menor (DIAZ, 2004) (Figura 7). A biodegradao anaerbia o processo que prevalece em situaes onde a atividade da microbiota indgena aerbia resulta em uma rpida depleo do oxignio dissolvido, como em guas subterrneas contaminadas, solos, sedimentos e biorreatores, entre outros

(CHAKRABORTY & COATES, 2004). A biodegradao anaerbia encontra-se extensivamente revisada por vrios autores (CHAKRABORTY & COATES, 2004; SPERMAN & WIDDEL, 2000; PHELPS & YOUNG, 1998; HOLLIGER & ZEHNDER, 1996; COLBERG & YOUNG, 1995). Esse processo apresenta algumas vantagens sobre a biodegradao aerbia, tornando-se uma boa alternativa para processos de biorremediao. Os processos aerbios tm um custo elevado, pois requerem sistemas de injeo de oxignio caros e a manuteno e o gasto de energia acabam por onerar mais o processo (ZHANG & BENNETT, 2005).

Respirao
Processo aerbio O2 H2O CO2
Massa celular

Potencial redox (mV)

+ 800

Energia G0 (kJ)
- 3174,4

Aerbia (Pseudomonas)

Processo anaerbio NO3

-

NO2 (N2) CO2

Massa celular

Desnitrificao (Azoarcus)

+ 430

- 2977,3

Hidrocarbonetos aromticos

Fe

3+

Fe

2+

CO2
Massa celular
2-

Reduo Fe (III) (Geobacter)

+ 100

- 3043,3

Compostos orgnicos
Massa celular

SO4

H2S CO2

Massa celular

Reduo Sulfato (Dessulfobacterium)

- 270

- 185,4

Fermentao cidos orgnicos (ex. acetato)

H , CO2

H2, CH4 CO2

Metanognese (Methanospirillium)

- 400

- 124,3

Massa celular

Figura 7 Desenho esquemtico da utilizao microbiana dos hidrocarbonetos aromticos, evidenciando o rendimento energtico do metabolismo aerbio ou anaerbio da molcula, em funo do aceptor de eltrons utilizado. Gneros de bactrias representativos de cada tipo de metabolismo so mostrados em parnteses.

Com relao aos principais mecanismos de biodegradao anaerbia de hidrocarbonetos monoaromticos, uma importante diferena em relao aos mecanismos aerbios a introduo do oxignio atravs da gua, ao invs do uso do oxignio molecular, para formao de compostos monoaromticos oxigenados, susceptveis posterior clivagem do anel. Algumas variaes existentes entre as vias catablicas, como, por exemplo a adio do fumarato na etapa de ativao da molcula, ocorrem devido aos diferentes aceptores de eltrons utilizados (CHAKRABORTY & COATES, 2004). Assim como ocorre nas vias de degradao aerbias dos BTEX, as primeiras etapas da degradao so diferentes para cada hidrocarboneto monoaromtico com cadeias laterais

distintas. Da mesma forma, as vias de degradao apresentam um produto intermedirio comum, o benzoil-CoA. O benzoil-CoA degradado, formando intermedirios do metabolismo central como o acetil-CoA (ZHANG & BERNNETT, 2005).

2.2.2.2.1 ETAPAS INICIAIS DE DEGRADAO ANAERBIA DOS BTEX

O benzeno um dos hidrocarbonetos aromticos mais resistentes degradao sob condies anxicas. O deslocamento da nuvem de eltrons estabiliza as ligaes carbono-carbono, tornando o benzeno altamente resistente ao ataque qumico. Embora um grande nmero de artigos relate a degradao anaerbia de outros hidrocarbonetos aromticos, entre eles tolueno e xilenos, algumas investigaes anteriores descreveram o benzeno como recalcitrante (PHELPS et al., 1996). A degradao anaerbia do benzeno j foi demonstrada sob condies nitrato redutoras, Fe(III) redutoras, sulfato redutoras e metanognicas, mas, at pouco tempo atrs, nenhum organismo especfico ou gnero tinha sido associado com tal habilidade. Tambm, tal metabolismo tinha sido observado apenas em estudos envolvendo sedimentos ou consrcios microbianos (revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004, HOLLIGER & ZEHNDER, 1996). Em 2001, Coates et al. isolaram e descreveram duas linhagens bacterianas, RCB e JJ, intrinsecamente relacionadas com membros do gnero Dechloromonas. Essas linhagens de Proteobacterias foram capazes de degradar rapidamente o benzeno a CO2 na ausncia de oxignio, acoplando a oxidao do benzeno reduo do nitrato. A via bioqumica da degradao anaerbia do benzeno ainda no est elucidada, mas algumas possibilidades tm sido sugeridas (Figura 8). Entre elas esto carboxilao inicial, hidroxilao, metilao ou reduo do anel aromtico com subseqente formao do produto intermedirio, benzoil-CoA, e posterior clivagem do anel (COATES et al., 2002). Alguns estudos utilizando consrcios bacterianos degradadores de benzeno, tem apontado fenol e benzoato como possveis produtos de uma etapa inicial de degradao do benzeno (CALDWELL & SUFLITA, 2000, PHELPS et al., 2001, WEINER & LOVLEY, 1998).

Figura 8 Potenciais reaes iniciais da via de degradao anaerbica do benzeno: carboxilao, metilao ou hidroxilao, com seus respectivos produtos, benzoato, tolueno e fenol. As reaes subseqentes levam a formao do intermedirio central benzoil-CoA, clivagem do anel e oxidao a dixido de carbono. Entre os compostos BTEX, o tolueno o hidrocarboneto cujo processo de biodegradao anaerbia provavelmente o mais conhecido. Esse composto pode ser biodegradado utilizando um grande nmero de aceptores de eltrons: nitrato, Mn(IV), Fe(III), sulfato, CO2, acoplado reduo de substncias hmicas e oxi-nions clorinados (revisado por CHAKRABORTY & COATES, 2004). A primeira etapa da via de degradao anaerbia do tolueno a ativao dessa molcula pela adio do fumarato ao grupo metil, formando o produto benzilsuccinato. Esta reao catalisada pela benzilsuccinato sintase BSS - (Figura 9). Esta etapa foi descrita inicialmente por Biegert et al. (1996), que demonstraram a presena de benzilsuccinato livre como um produto intermedirio transiente nas culturas de T. aromatica contendo tolueno. Aps a formao do benzilsuccinato, este convertido ao seu derivado CoA, benzilsuccinil-CoA por uma enzima transferase, para ser ento oxidado a benzoil-CoA e succinil-CoA (LEUTWEIN & HEIDER, 1999).

COO
Fumarato

2[H] COOH

COO

Succinato

CO

CoA

CH3

COO

COO COOH

2[H]

COOH

Tolueno

Belzilsuccinato

Fenilitaconato

CO

CoA H2O

COO CoA S

Succinil-CoA

CO

CoA

CO HS CoA HO COO
-

CO2
Benzoil-CoA

2[H]

2-carboximetil3-hidroxifenilpropionil-CoA

Figura 9 - Primeira etapa da via de degradao anaerbia do tolueno. A primeira etapa envolve a ativao do tolueno pela adio do fumarato ao grupo metil. O produto formado, o benzilsuccinato, convertido ao seu derivado CoA, benzilsuccinil-CoA por uma enzima transferase, para ser ento oxidado a benzoil-CoA e succinil-CoA.

O etilbenzeno degradado por bactrias sob condies desnitrificantes e sulfato-redutoras. Em condies desnitrificantes, o etilbenzeno inicialmente ativado para a degradao atravs de uma reao de desidrogenao do carbono ligado ao anel pertencente ao grupo etil da cadeia lateral, pela etilbenzeno desidrogenase, produzindo (S)-1-feniletanol, cujo grupo hidroxila proveniente de uma molcula de gua. O (S )-1-feniletanol sofre uma segunda oxidao, formando uma acetofenona que, em seguida, metabolizada a 3-fenil-3oxopropionato (benzoil acetato), tioesterificada com CoA e, tioliticamente clivada em acetilCoA e benzoil-CoA (Figura 10a), (RABUS et al., 2002).

O (a) OH O O OH

O SCoA O SCoA O

CO 2
H2O 2[H]
etilbenzeno

2[H]

CO 2
benzoil acetato

Acetil-CoA benzoil acetil-CoA Benzoil-CoA

(S)-(-)-1-feniletanol

acetofenona

(b)

COO

COO

COO

HSCoA COO
etilbenzeno
-

Rearranjo

SCoA O

COO

1-(feniletil) succinato

1-(feniletil) O succinil-CoA

SCoA

2-(fenilpropil) malonil-CoA

fumarato

CO 2 HSCoA O
3-oxo-4-fenilpentanoil-CoA

COO

SCoA
degradao posterior

SCoA O 2[H]

H2O O 2[H]

SCoA

O
2-fenilpropionil-CoA

4-fenilpentanoil-CoA

Ciclo de Krebs

SCoA
acetil-CoA

Figura 10 Etapas iniciais da via de degradao anaerbia do etilbenzeno. (a) Via proposta para degradao anaerbia sob condies denitrificantes. (b) Via proposta para degradao anaerbia sob condies sulfato redutoras. Figura modificada de Harayama et al. (2004).

Na via de degradao anaerbia, em condies sulfato redutoras, as modificaes das cadeias laterais assemelham-se s sugeridas para a degradao anaerbia de n-alcanos. O etilbenzeno ativado pela adio de uma molcula de fumarato, formando (1-fenil-etil) succinato. Esse produto tioesterificado sob condies energticas, transformado em 1-(fenil-etil)-succinilCoA, cujo esqueleto de carbono do tioester rearranjado para permitir uma descarboxilao, formando ento 4-fenilpentanoil-CoA (Figura 10b). A rota metablica para degradao desta ltima molcula ainda no est completamente elucidada. Essa via regenera o fumarato que pode ser reutilizado na ativao de outras molculas de etilbenzeno. A etapa de ativao da molcula nessa via metablica alternativa, similar quela do tolueno descrita

anteriormente, pode ser justificada pela diferena entre os potenciais de redox dos respectivos aceptores de eltrons nitrato e sulfato (Figura 7) (KNIEMEYER et al., 2003). A degradao anaerbia dos trs ismeros estruturais do dimetilbenzeno (meta, orto e para xilenos) tem sido predominantemente estudada sob condies nitrato e sulfato redutoras. A completa mineralizao por culturas microbianas tem sido relatada para todos os xilenos, com exceo do p-xileno, cujos estudos de biodegradao na ausncia de oxignio esto relacionados a consrcios bacterianos (ZHANG & BENNETT, 2005). As reaes iniciais envolvidas na oxidao anaerbia do m-xileno so similares s de degradao do tolueno e envolvem a adio inicial de uma molcula de fumarato em um dos grupos metil para formar 3-metilbenzilsuccinato, que posteriormente oxidado a 3metilbenzoato (Figura 11). A adio do fumarato catalisada pela enzima 3metilbenzilsuccinato sintase, que, assim como a benzilsuccinato sintase (degradao do tolueno), retm um tomo de hidrognio do grupo metil durante a reao. De forma semelhante o o-xileno oxidado (Figura 11) (KRIEGER, 1999).
-

OOC
-

CH CH2

CH2

COO

fumarato CH3
-

OOC

CH

CH

COO

CH3 m-xileno
-

CH3 3-metilbenzilsuccinato OOC

-

CH CH2

CH2

COO

fumarato CH3 CH3

-

OOC

CH

CH

COO

CH3

o-xileno

2-metilbenzilsuccinato

Figura 11 Etapas iniciais das vias de degradao das molculas m-xileno e o-xileno. A degradao dos xilenos ocorre inicialmente atravs da reao de adio do fumarato a um dos grupos metil, produzindo o metilbenzilsuccinato correspondente. A formao do intermedirio benzoil-CoA, a partir dessa molcula, semelhante ao ocorrido na via de degradao anaerbia do tolueno (Figura 9).

O processamento do metilbenzilsuccinato formado semelhante ao descrito para o benzilsuccinato, formado durante a degradao anaerbia do tolueno (Figura 9). Os produtos formados so metablitos centrais da clula (LEUTWEIN & HEIDER, 1999).

2.2.2.2.2 OXIDAO BTEX

DOS INTERMEDIRIOS CENTRAIS DA DEGRADAO ANAERBIA DOS

O produto intermedirio comum das vias de degradao anaerbia dos BTEX o benzoilCoA. O anel aromtico do benzoil-CoA reduzido pela benzoil-CoA redutase e, posteriormente, clivado por hidrlise (HARAYAMA et al., 2004). A molcula formada degradada por -oxidao, produzindo trs moles de acetil-CoA, um metablito central do ciclo de Krebs, e um mol de CO2 para cada mol de hidrocarboneto, como mostrado na Figura 12 (HOLLIGER & ZEHNDER, 1996).

O C

SCoA

O C

SCoA

O C

SCoA O

O C

SCoA 3 Acetil-CoA + CO
2

COOH
Benzoil-CoA

4e

H2O HIDRLISE -OXIDAO

REDUO

Figura 12 Esquema da via de degradao anaerbia do intermedirio central comum das vias: benzoil-CoA. O benzoil-CoA sofre reduo, produzindo produtos alicclicos, para posteriormente, ser clivado por hidrlise. Os produtos lineares formados so transformados no metablito central, acetil-CoA, por meio da -oxidao.

2.2.3 MECANISMOS DE REGULAO ENZIMTICA DAS VIAS CATABLICAS RELACIONADAS

DEGRADAO BACTERIANA DOS BTEX

As bactrias regulam o metabolismo em resposta a uma ampla variedade de flutuaes ambientais, incluindo alteraes de temperatura, pH, nvel de oxignio, nutrientes e at variaes na densidade populacional. Existem dois mecanismos bsicos de regulao em uma clula. Um destes controla a atividade de uma enzima pr-existente, denominado regulao ps-traducional. O outro tipo de regulao controla os nveis da protena, ou mesmo sua presena e ausncia, sendo o controle, portanto, ao nvel transcricional ou traducional. A inibio da atividade enzimtica pode ser obtida atravs de vrios processos, entre eles: processamento de enzimas sintetizadas na forma inativa, inibio por retroalimentao (feedback) e modificao enzimtica pela adio covalente de grupos especficos, como o adenosina monofosfato (AMP) e o desoxiadenosina monofosfato (DMP). A inibio por retroalimentao um dos principais mecanismos de regulao da atividade enzimtica. Nesse caso, o produto final de uma via pode vir a inibir a atividade de uma enzima do incio da via, regulando sua prpria biossntese. A ligao desse produto em um stio diferente do stio ativo da enzima, chamado stio alostrico, modifica a estrutura da protena, reduzindo sua eficincia de ligao ao substrato. Esse processo revertido, quando o nvel do produto final cai, alterando o equilbrio da reao (MADIGAN et al., 2004). A inibio da atividade enzimtica um mecanismo de regulao bastante refinado, muito comum para enzimas constitutivas, essenciais no metabolismo da clula, sendo sintetizadas continuamente, mantendo concentraes semelhantes em todas as condies de crescimento. Por outro lado, as enzimas induzidas, so necessrias apenas em determinadas reaes enzimticas. Sendo assim, a sntese dessas enzimas ocorre somente sob condies especficas, sofrendo uma grande influncia dos mecanismos de controle da expresso gnica (MADIGAN et al., 2004). As bactrias apresentam um extensivo repertrio de genes metablicos e regulatrios, responsveis pela grande capacidade de adaptao desses microrganismos a diferentes ambientes aerbios e anaerbios. Os genes relacionados s vias de degradao de hidrocarbonetos monoaromticos e outros xenobiticos expressam, em geral, enzimas induzidas, e esto sujeitos a pelo menos trs tipos de regulao da sntese enzimtica:

mecanismos de resposta especfica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais (Figura 13) (SHINGLER, 2003).

Figura 13 Esquema ilustrativo da rede de processos e sinais que regulam a capacidade metablica de degradao bacteriana dos compostos aromticos, evidenciando os trs tipos de regulao gnica: mecanismos de resposta especfica a reguladores transcricionais, mecanismos de resposta global e mecanismos de respostas comportamentais (modificado de SHINGLER, 2003). Primeiramente, diversos reguladores transcricionais tm as atividade controlada por sinais ambientais, entre eles, os compostos aromticos. As protenas regulatrias especficas e promotores permitem que os operons catablicos sejam transcritos apenas e em nvel suficiente para garantir uma adequada resposta metablica ao substrato particular presente em abundncia no meio, que possa servir como fonte de carbono e energia. So vrias as protenas regulatrias de transcrio envolvidas no metabolismo dos BTEX (Tabela 3). Estas protenas so capazes de responder a uma gama de compostos, em geral, substratos especficos ou intermedirios das vias de degradao, denominadas molculas efetoras. A ativao de sinal para os membros da famlia LysR, por exemplo, relativamente especfica, estando relacionada a algum intermedirio produzido no incio da via. No caso do CatR, protena regulatria da via de orto-clivagem de degradao do catecol, a sntese de

Tabela 3 Protenas regulatrias representativas envolvidas no metabolismo dos BTEX (adaptada de SHINGLER, 2003). Protena
54

Via de degradao Tolueno Tolueno Tolueno/xileno

Bactria/Plasmdeo R. pickettii PKO1 P. stutzeri OX1 P. putida mt-2 (TOL pWW0) P. putida F1 P. putida WCS358 P. putida mt-2 (TOL pWW0) P. putida P. putida

Referncia Byrne & Olsen (1996) Arenghi et al. (1999) Inouye et al. (1988)

Famlia -dependente

TbuT TouR XylR TodS/ TodT PobC XylS BenR

Famlia LysR

Sistema de dois componentes

Tolueno 4-Hidroxibenzoato Tolueno Benzoato Catecol

Lau et al. (1997) Bertani et al. (2001) Spooner et al. (1986) Cowles et al. (2000) Rothmel et al. (1990)

Famlia AraC / XylS

CatR

R. Ralstonia e P. Pseudomonas

catecol 1,2-dioxigenase induzida pelo produto de sua ao, o cis,cis-muconato (SHINGLER, 2003). J as protenas regulatrias que respondem a substratos primrios podem ser menos especficas, respondendo a vrios compostos estruturalmente anlogos, no susceptveis metabolizao, como, por exemplo, o XylR. A protena XylR, codificado por gene do operon TOL presente no plasmdeo pWWO do catabolismo de tolueno e xileno, pertence a uma extensa famlia de ativadores transcricionais, a famlia 54-dependente. Ela atua se ligando a elementos enhancer e regulando a transcrio a partir de um grupo distinto de promotores reconhecidos pela holoenzima RNA polimerase - 54 (Tabela 3). Os fatores correspondem a subunidades da RNA polimerase responsveis pelo reconhecimento do promotor. A protena XylR ativa o promotor Pu do operon do plasmdeo pWW0 para converso do tolueno e m/pxilenos a benzoato e alquilbenzoatos correspondentes, mas tambm responde a compostos anlogos estruturalmente, como benzil lcoois e benzil aldedos cloro e alquil substitudos (SHINGLER, 2003). Os mecanismos de resposta especfica respondem no apenas a sinais especficos presentes no meio, mas tambm aos mecanismos de resposta global, que constituem um segundo nvel de

regulao da expresso gnica. Os circuitos de regulao global podem sobrepor os mecanismos regulatrios especficos, acoplando os nveis de transcrio gnica ao estado fisiolgico e metablico da bactria (Figura 13) (PRIETO et al., 2004). Os mecanismos de resposta global so mecanismos regulatrios que respondem aos sinais ambientais regulando a expresso de muitos genes. Um dos mecanismos de resposta global mais estudado a represso catablica. Na represso catablica, a sntese de vrias enzimas no relacionadas, principalmente as catablicas, inibida quando as clulas encontram-se em um meio contendo uma fonte de carbono mais prontamente utilizvel, tal como a glicose. A represso catablica foi inicialmente denominada efeito glicose, porque a glicose foi a primeira substncia descrita com capacidade de iniciar a represso enzimtica. O exemplo deste sistema mais bem caracterizado est relacionado ao catabolismo da lactose em Escherichia coli, em que a glicose atua desde o controle da entrada da lactose na clula at a inibio da transcrio das enzimas catablicas (MADIGAN et al., 2004). No caso das bactrias pseudomonas, os substratos preferenciais que exercem a represso catablica so o acetato e os intermedirios do ciclo de Krebs, como o succinato, piruvato, succinil e acetil-CoA (COLLIER et al., 1996). O succinato tem sido usado como o componente modelo para estudar a represso catablica de compostos aromticos (DUETZ et al., 1994). Em Pseudomonas putida mt-2, succinato reprime a expresso da via para o catabolismo de tolueno e xileno ao nvel transcricional e, numa menor extenso, a via de meta-clivagem (DUETZ et al., 1994). Mller et al. (1996) demonstrou que succinato tambm reprime a transcrio da via de meta clivagem codificada por genes cromossmicos de P. putida linhagem H. A glicose reprime a transcrio de genes da via de degradao do tolueno (operon TOL) presentes no plasmdeo pWW0. Esse mecanismo de represso catablica est relacionado ao de genes pts, que codificam componentes de um sistema PTS (sistema fosfotransferase) alternativo no ligado geneticamente ao operon da via, provavelmente interceptando o circuito de regulao XylR por uma rota diferente. Apesar de serem mecanismos frequentemente observados na regulao das vias catablicas de pseudomonas, pouco se conhece sobre seus mediadores ou detalhes do processo (revisado por SHINGLER, 2003). Poucas protenas j foram relatadas como participantes da represso catablica em pseudomonas, mas sabe-se que o controle desse mecanismo independente de cAMP

(MAcGREGOR et al., 1991). Morales et al. (2004) demonstrou que a protena Crc (catabolite repression control), a primeira descrita, est envolvida no apenas no controle da expresso de genes implicados no metabolismo de alguns acares e compostos nitrogenados, mas tambm na expresso de genes pertencentes a vias centrais relacionadas com o metabolismo de compostos aromticos. Entre os genes modulados negativamente pelo Crc esto alguns requeridos para assimilao do benzoato, pela via do catecol, e do 4-OHbenzoato, pela via do protocatecuato. Alm dos mecanismos de resposta especfica e global, Shingler (2003) relata um terceiro nvel de regulao em que os compostos aromticos podem impactar o desempenho do catabolismo provocando respostas comportamentais. Respostas quimiotticas presena de compostos aromticos tm sido descritas sendo induzidas coordenadamente com os genes relacionados ao seu catabolismo, sugerindo uma estratgia bacteriana integrada para se locomover em direo aos compostos aromticos e degrad-los (Figura 13) (PANDEY & JAIN, 2002, PARALES & HARWOOD, 2002). O mecanismo da quimiotaxia complexo e envolve muitas protenas. As bactrias empregam um tipo de sistema de dois componentes para detectar as alteraes na concentrao de um agente qumico, regulando assim, a movimentao flagelar. No sistema de dois componentes, o sinal externo no diretamente transmitido protena regulatria, sendo detectado primeiramente por uma protena sensora especfica e, ento, transmitido de forma alterada a uma protena reguladora de resposta (MADIGAN et al., 2004). As protenas sensoras envolvidas no mecanismo da quimiotaxia so denominadas protenas quimiotticas aceptoras de metil (PQM), sendo todas protenas transmembranas. A maquinaria quimiottica de algumas bactrias envolve vrias protenas: em P. putida j foram relatadas 25 ou mais PQMs, em comparao com as cinco enzimas relatadas em E. coli (PARALES & HARWOOD, 2002). As enzimas PQMs esto em contato com as protenas citoplasmticas, CheA e CheW. Ao se ligar a um agente qumico, as PQMs transmitem o sinal detectado, juntamente com CheW, atravs de mudanas conformacionais para a protena citoplasmtica CheA, uma enzima histidina autoquinase que atua como doadora do grupo fosforil para outras protenas reguladoras de resposta, que atravs de uma cascata de fosforilao, afetam o movimento de rotao flagelar (MADIGAN et al., 2004).

Em alguns casos, os componentes sensoriais de resposta a compostos aromticos so cotranscritos com os genes requeridos para o seu catabolismo. Esse o caso do componente sensorial NahY PQM-similar, relacionado ao sistema de quimiotaxia de P. putida direcionada ao naftaleno. Em P. putida F1, o tolueno foi capaz de induzir respostas quimiotticas a uma larga variedade de compostos, inclusive alguns no metabolizados pela via TOD. Nesse sistema, mutantes defeituosos quanto ao catabolismo do tolueno retiveram a resposta quimiottica, enquanto a inativao de sistema regulatrio TodS/TodT abolia a resposta quimiottica (revisado por PARALES & HARWOOD, 2002, SHINGLER, 2003). Existem vrios trabalhos e revises que tratam dos mecanismos de regulao das vias de degradao de compostos aromticos (TROPEL & VAN DER MEYER, 2004, MORALES et al., 2004, PRIETO et al., 2004, SHINGLER, 2003). Trabalhos experimentais de investigao da capacidade catablica de microrganismos especficos ou grupos de microrganismos relatam interaes entre substratos aromticos, capazes de aumentar ou diminuir a capacidade metablica de uma linhagem. Glensoy & Alvarez (1999) relataram a ocorrncia de interaes benficas ao testar a capacidade de degradao de BTEX de 55 linhagens de bactrias. Esses autores observaram que muitas linhagens apresentavam-se incapazes de degradar alguns desses compostos quando eles estavam isolados no meio, apresentando tal capacidade apenas quando os mesmos encontravam-se concomitantes, indicando a interao benfica entre os substratos. As interaes benficas entre substratos podem aumentar a capacidade catablica de diversas linhagens, possivelmente induzindo enzimas das vias de degradao ou por mecanismos de co-oxidao. A molcula de tolueno , em geral, um bom indutor de enzimas, sendo capaz de promover a degradao de outros BTEXs em condies aerbias e desnitrificantes. Entretanto, j foi reportado que o tolueno, em alguns casos pode ser um inibidor competitivo da degradao do benzeno (revisado por GLENSOY & ALVAREZ, 1999). O conhecimento dos mecanismos regulatrios que controlam a expresso das vias catablicas relacionadas degradao bacteriana dos BTEX de grande importncia para aplicao desses microrganismos em processos de biorremediao. O entendimento desses mecanismos permite a obteno de mutantes que perderam a capacidade de inibir a sntese de determinadas protenas reguladoras e, portanto, que sejam capazes de produzir as enzimas das

vias de degradao de hidrocarbonetos aromticos, at ento enzimas induzidas, de forma constitutiva. Alm disso, algumas protenas regulatrias do catabolismo de compostos aromticos so capazes de detectar no ambiente os nveis de substratos aromticos cujas vias de catabolismo fazem parte do maquinrio celular ao qual pertencem. Por essa propriedade, essas protenas reguladoras sensoriais podem ser incorporadas a biossensores celulares para o monitoramento de poluentes biodegradveis em ambientes contaminados (KEANE et al., 2002, HAY et al., 2000). Em geral, essas clulas utilizadas como biossensores acoplam promotores relacionados a genes das protenas regulatrias com um gene reprter, cuja expresso detectada atravs de fluorescncia ou bioluminescncia. Tais microrganismos constituem potenciais sistemas para mensurar a qualidade de guas, solos e atmosferas (TROPEL & VAN DER MEER, 2004, SHINGLER, 2003).

2.3 A

BIORREMEDIAO

COMO

ALTERNATIVA PARA

TRATAMENTO

DE

REAS

CONTAMINADAS POR BTEX

As atividades antropognicas tm sido as principais responsveis pelo lanamento de quantidades considerveis de hidrocarbonetos no ambiente. Muitos desses compostos so altamente txicos aos seres humanos, fauna e flora locais e, por isso, a necessidade de remoo desses hidrocarbonetos dos meios contaminados. Mtodos fsicos e qumicos comumente usados, alguns deles j descritos neste trabalho, no so sempre efetivos na remoo dos compostos e, muitas vezes, podem acabar gerando compostos poluentes adicionais. Sendo assim, a remoo desses compostos atravs da atividade microbiana tem sido estudada como uma alternativa bastante interessante, quando comparada aos tratamentos convencionais, visto que economicamente vivel e, em geral, no deixa resduos secundrios. Um eficiente processo de biodegradao envolve fatores relacionados s condies ambientais e microbiota disponvel. Entre as condies ambientais, alm dos fatores requeridos para o crescimento microbiano (atividade de gua, temperatura, pH, presso, fontes de C e N, entre outros), algumas caractersticas relacionadas aos compostos contaminantes podem limitar o processo de biodegradao: biodisponibilidade, toxicidade e concentrao (BOSSERT & COMPEAU, 1995). A biodisponibilidade dos compostos de extrema relevncia, pois, para que ocorra a degradao, o composto deve estar livre no meio, de forma que possa ser transportado para o interior da clula. Entre os contaminantes orgnicos muito comum a adsoro dos compostos em partculas do solo, ficando parcialmente indisponveis para o microrganismo. Esse fenmeno comum entre compostos apolares, cuja solubilidade em gua muito baixa (ex. n-alcanos de cadeia longa). No caso dos BTEX, a adsoro no to preocupante, visto que tais compostos, como tratado na introduo deste trabalho, apresentam solubilidade relativamente alta em gua (Tabela1). A concentrao e a toxicidade do contaminante tambm devem ser estimadas, de forma a no inibir o crescimento bacteriano. Alm disso, a presena de compostos bioquimicamente incompatveis com o catabolismo efetivo do composto alvo, isto , misturas inibitrias, podem inibir o processo.

Por fim, a microbiota disponvel deve apresentar resistncia aos compostos contaminantes e possuir as vias metablicas para degradao dos mesmos. Todos os fatores citados anteriormente devem ser analisados em conjunto a fim de decidir se o tratamento dos resduos deve ocorrer in situ ou ex situ (ex. biorreator), alm de auxiliar na escolha do tipo de estratgia adotada para o processo de biorremediao (bioestimulao, bioaumentao, condies aerbias ou anaerbias etc). A pesquisa de microrganismos com potencial de degradao dos BTEX e das vias metablicas envolvidas de alta relevncia no apenas para a compreenso dos processos de biorremediao, mas tambm para a obteno de microrganismos, que podem ser utilizados como inoculantes, com alto potencial de degradao e caractersticas de adaptabilidade. Alm disso, o estudo de interferentes dos processos de alta relevncia, visto que o uso dessa microbiota potencialmente degradadora de hidrocarbonetos requer o entendimento de todos os aspectos fisiolgicos, microbiolgicos, ecolgicos e bioqumicos envolvidos na transformao dos poluentes. Assim, possvel desenvolver tcnicas que permitam o uso eficiente desses microrganismos no campo.

2.3.1 TCNICAS

DE ESTUDO DE MICRORGANISMOS COM APLICAO POTENCIAL EM

PROCESSOS DE BIORREMEDIAO

Entre as tcnicas de estudo dos microrganismos com potencial uso em processos de biorremediao encontram-se as tcnicas tradicionais de cultivo, isolamento e caracterizao fisiolgica, morfolgica e bioqumica, e as tcnicas de Biologia Molecular. As tcnicas tradicionais de cultivo apresentam uma grande limitao: apenas uma pequena porcentagem de microrganismos presentes no ambiente capaz de crescer sob condies laboratoriais. A necessidade de desenvolver novas tcnicas de cultivo com a finalidade de isolar algumas bactrias que no so cultivveis em meios tradicionais eminente. Alguns pesquisadores tm utilizado preferencialmente meios de cultura oligotrficos para crescimento de

microrganismos isolados de ambientes naturais, em detrimento dos meios ricos em fontes de carbono. Button et al. (1993), utilizando como meio de cultura a gua do mar, foram capazes de obter uma recuperao de 2-60% das bactrias presentes no ambiente marinho, taxa superior encontrada normalmente utilizando mtodos de cultivo tradicionais (menor do que

0,1%). Wang et al. (1996) isolou a bactria oligotrfica Cycloclasticus oligotrophus capaz de degradar hidrocarbonetos aromticos, utilizando a mesma tcnica. Uma segunda explicao da incapacidade de serem cultivados poderia estar relacionada com o fato de tais microrganismos no serem capazes de crescer em culturas puras, considerando que requerem para seu crescimento substncias produzidas por outros microrganismos. Alm desses dois fatores, muitos outros tm sido apontados como interferentes, entre eles a ausncia de fatores de crescimento, danos por estresses oxidativos e induo da ao de fagos lisognicos durante perodos de inanio (revisado por HARAYAMA et al., 2004). Uma variedade de metodologias foi desenvolvida nos ltimos anos para o estudo da estrutura da comunidade microbiana, dentre outras, a anlise de atividade enzimtica; a anlise de perfil de protenas celulares, de componentes da parede celular ou da cadeia respiratria, como a anlise de cidos graxos metil-ester e cidos graxos fosfolipdicos (RAJENDRAN et al., 1992); e anlise de cidos nuclicos, DNA total ou RNA ribossomal da comunidade (ANDERSON & CAIRNEY, 2004). As tcnicas de Biologia Molecular tm permitido uma melhor estimativa da diversidade microbiana nos ambientes, o que no foi possvel durante muito tempo utilizando apenas as tcnicas tradicionais de cultivo. Vrias tcnicas moleculares que tm como alvo o estudo do gene da subunidade 16S do RNA ribossomal (rDNA) de bactrias vm sendo utilizadas. Os mtodos para a anlise comparativa de seqncias de rDNA incluem, geralmente, etapas de extrao de DNA da amostra e amplificao das seqncias de interesse pela reao em cadeia polimerase (PCR), utilizando iniciadores com a especificidade desejada. As seqncias amplificadas podem ser clonadas e seqenciadas ou analisadas com base em seus perfis eletroforticos. Por sua vez, os principais mtodos usados para a obteno de perfis eletroforticos relacionados com a filogenia so a ARDRA ("Amplified rDNA restriction analysis"), que se baseia no princpio de que os stios de restrio no operon do rRNA so conservados; a DGGE/TGGE ("Denaturing or temperature gradient gel electrophoresis"), que fornece informaes sobre a variao na seqncia em uma mistura de fragmentos de PCR de comprimento idntico com base na mobilidade diferencial em um gel de acrilamida com gradiente de desnaturante crescente ou de temperatura crescente (EICHNER et al., 1999); a anlise de polimorfismo de conformao das fitas simples do DNA amplificado (SSCP), que se baseia na mobilidade eletrofortica diferenciada das estruturas dobradas do ssDNA

(STACH et al., 2001); anlises de restrio do DNA ribossomal marcado terminalmente (TRFLP); e a tcnica de hibridizao local FISH (fluorescence in situ hybridization), cujas sondas tm como alvo molculas de rRNA. Essas tcnicas representam grandes avanos nesta rea e tm sido introduzidas no estudo da ecologia microbiana, revelando uma enorme diversidade antes inesperada, principalmente, em relao a ambientes pouco explorados como o ambiente marinho (HARAYAMA et al., 2004). Tcnicas moleculares que tm como alvo de estudo genes relacionados com metabolismo especfico dos microrganismos tm sido muito utilizadas, juntamente com os testes de biodegradao laboratoriais, para determinao do potencial catablico microbiano. Cavalca, et al. (2000) estudaram populaes de microrganismos potencialmente degradadores de BTEX em subsolos contaminados por esses compostos. Esses autores isolaram quinze linhagens de bactrias dos gneros Pseudomonas e Alcaligenes, cujo DNA extrado foi submetido PCR visando a amplificao de genes-chave no processo de biodegradao por diferentes vias catablicas: catecol 2,3 dioxigenase (xylE), tolueno dioxigenase (subunidade maior da enzima) (todC1 ) e (xylA,M). A amplificao desses genes conseguida atravs da utilizao de iniciadores consenso, determinados atravs da anlise de seqncias gnicas alvo de bactrias modelo. Os resultados dos testes moleculares, tanto de identificao de microrganismos, quanto de deteco da atividade biodegradadora devem ser sempre acompanhados de testes tradicionais. Em um trabalho com linhagens isoladas de reservatrio de Petrleo, Cunha, et al. (2006) obtiveram alguns resultados divergentes entre os testes moleculares e ensaios tradicionais de cultivo e degradao, indicando que mais estudos devem ser realizados a fim de determinar seqncias de oligonucleotdeos iniciadores para grupos de microrganismos potencialmente degradadores, mas pouco explorados, e tambm, para novos genes (e, consequentemente, novas enzimas) que podem estar envolvidos no catabolismo dessas espcies. Para os testes tradicionais de biodegradao, as culturas isoladas so crescidas em meios contendo indutores de enzimas das vias catablicas as quais se deseja explorar, e tambm crescidas em meios contendo hidrocarbonetos como fonte exclusiva de carbono. Os testes de biodegradao podem ser realizados atravs de mtodos qualitativos, que consistem na observao a olho nu de alterao no meio pelo crescimento microbiano, como, por exemplo, a alterao de uma pelcula de leo sobre a superfcie do meio de cultura, muito usado como teste de triagem, e mtodos quantitativos, como a deteco inicial e final das concentraes

dos hidrocarbonetos adicionados ao meio atravs de tcnicas de cromatografia (ex. cromatografia gasosa e cromatografia lquida de alta performance), deteco de produtos intermedirios comuns a vrias vias catablicas, testes de cintica utilizando extratos enzimticos das culturas induzidas, entre outros. O monitoramento da ocorrncia de biodegradao de hidrocarbonetos aromticos pode ser feito atravs de biomarcadores: intermedirios especficos de vias metablicas. Uma vez detectados no ambiente, podem ser indicativos da presena de uma populao microbiana ativa utilizando o composto contaminante. Para ser utilizado como biomarcador, a substncia deve ser detectvel em amostras de solo, gua e sedimentos, deve ser especfica para uma via catablica particular e no deve ser gerada, em geral, por atividade antropognica. Exemplos de biomarcadores comumente utilizados so o benzilsuccinato, para oxidao de tolueno e metilbenzilsuccinato, para xilenos (CHAKRABORTY & COATES, 2004).

2.3.2 EXEMPLOS

DE PROCESSOS DE BIORREMEDIAO EM DIFERENTES AMBIENTES

CONTAMINADOS POR BTEX

Existem vrios relatos na literatura de processos de biorremediao bem suscedidos em diversos tipos de ambientes. Bradley & Chapelle (1995) demonstraram a aplicabilidade de tcnicas de biorremediao em um aqufero no Alaska. Esses autores conseguiram observar uma rpida mineralizao de tolueno, a 5C e sob condies aerbias, no sedimento do aqfero contaminado por petrleo. As taxas de mineralizao conseguidas por estes autores foram comparveis s descritas para aqferos temperados (~20C), indicando que o processo de biorremediao in situ no prejudicado pela temperatura, nessa situao. Em um trabalho de investigao da biodegradao de BTEX em solos alpinos a 10C, foi observada uma reduo de contaminantes significativamente mais baixa (76%) do que a observada em solos temperados (20C), ao contrrio do observado por Bradley & Chapelle (1995) (revisado por MARGESIN & SCHINNER, 2001). Trabalhos envolvendo bactrias termfilas demonstraram que, predominantemente, os bacilos, possuem um grande potencial para a converso de poluentes ambientais, incluindo todas as grandes classes (MLLER et al., 1998). Taylor et al. (1998) patentearam um

processo de descontaminao onde h o acoplamento da tcnica de stripping tcnica de biorremediao utilizando microrganismos termfilos, para rpido tratamento de solos a grandes profundidades. Uma descontaminao primria realizada submetendo uma parcela do solo a aquecimento (atravs da injeo de vapor e resistncia eltrica) para vaporizao de parte dos contaminantes, removidos por extrao a vcuo. A parcela residual, no extrada com a vaporizao, ento metabolizada por microrganismos termfilos, visto que o ambiente ficaria aquecido por um tempo longo aps a primeira etapa de remoo dos contaminantes. Processos de biorremediao intrnseca em solos ridos de desertos tm sido estudadas, principalmente em reas onde ocorrem comumente guerras e onde existe grande atividade de extrao de petrleo. Um grande problema nesses locais a necessidade de irrigao constante do meio. O uso de gua do mar para o processo de irrigao prejudicial por aumentar a salinidade, inibindo o processo de biodegradao, enquanto o uso de gua continental nos solos desrticos leva a um processo de lixiviao, reduzindo a salinidade do solo. O uso de gua salina diluda (0,5%m/v) e reflorestamento tm sido testados como alternativas aprazveis na biodegradao dos hidrocarbonetos contaminantes de solos desrticos (revisado por MARGESIN & SCHINNER, 2001). Alguns trabalhos na literatura relatam a eficincia dos processos de biorremediao, em condies anaerbias, em aquferos cuja concentrao de oxignio muito baixa (BAKER et al., 1987, BATTERMAN, 1983). Os processos anaerbios so muito utilizados para depurao de guas residurias municipais e industriais, principalmente em biorreatores, devido ao seu menor custo e eficincia comprovada. Entretanto, eles tm recebido menor ateno em relao aos aerbios, quanto a detoxificao de stios contaminados por petrleo e derivados (ZHANG & BERNETT, 2005). Os exemplos anteriores justificam a necessidade de mais pesquisas relacionadas s tcnicas de biorremediao, no apenas em reas cujas caractersticas do meio so adversas ao crescimento microbiano, mas em todos os tipos de ambientes, em condies aerbias e anaerbias, visto que cada situao nica, e generalizaes nem sempre so satisfatrias. Demonstraes da biodegradao dos BTEX no campo, em ambientes continentais e marinhos, so necessrias para aumentar nossos conhecimentos sobre a eficincia desse processo.

2.4 PERSPECTIVAS

QUANTO AO USO DA BIOLOGIA MOLECULAR NA CONSTRUO DE

LINHAGENS COM AMPLA CAPACIDADE DE DEGRADAO

A utilizao de microrganismos como alternativa para o tratamento de ambientes contaminados tem sido bem vista por boa parte dos estudiosos, levando em considerao a grande capacidade microbiana de adaptao e utilizao de vrios tipos de compostos como fonte de carbono. As vrias evidncias de detoxificao natural de ambientes contaminados nos levam a reconhecer o papel da microbiota indgena na degradao dos compostos contaminantes. Entretanto, cada vez mais, a quantidade de resduos lanados no ambiente tem sido maior, bem como o nmero de compostos recalcitrantes que acompanham essa contaminao, o que dificulta a ao microbiana. A utilizao da tecnologia do DNA recombinante para obteno de microrganismos geneticamente modificados (MGMs) com mltiplas capacidades de degradao tem sido vista como uma alternativa para biorremediao de ambientes contaminados por xenobiticos recalcitrantes, a maioria associada s reas de despejo de resduos industriais. Linhagens recombinantes, apesar de alguns resultados de sua aplicao ainda serem discutveis, tm sido exploradas e apresentaram algum sucesso no aumento do desempenho de bactrias da microbiota indgena. Como discutido na seo anterior, a presena de poluentes no ambiente altera a estrutura das comunidades microbianas indgenas estimulando, principalmente, o aumento de classes de microrganismos resistentes aos contaminantes. Essa resistncia, especialmente em relao aos compostos orgnicos aromticos, d-se, por exemplo, por alteraes na composio das membranas lipdicas bacterianas (citoplasmtica e membranas externas). Equipar bactrias solvente-tolerantes com maquinarias catablicas apropriadas pode ser um avano promissor para os propsitos da biorremediao (PIEPER & REINEKE, 2000). A obteno de recombinantes utilizando bactrias adaptadas a ambientes especficos foi realizada por Lange et al. (1998). Estes autores construram uma bactria recombinante Deinococcus radiodurans, um dos organismos mais resistentes radiao que se conhece, atravs da clonagem dos genes tod em seu cromossomo. Essa bactria recombinante capaz de expressar a enzima tolueno dioxigenase (TOD) e apresenta a habilidade de degradar tolueno, clorobenzeno, 3,4-dicloro-1-buteno e indol.

Outro exemplo de tentativas de obteno de bactrias recombinantes capazes de promover a biorremediao em ambientes extremos poludos foi a clonagem de genes relacionados s vias de degradao de hidrocarbonetos aromticos em bactrias acidfilas Acidophilium cryptum (QUENTMEIER & FRIEDRICH, 1994), A clonagem de genes de tolerncia em bactrias com potencial de degradao de hidrocarbonetos aromticos tambm uma alternativa. Esta estratgia j foi realizada atravs da transferncia do operon de E. coli pro U (um importante locus relacionado osmorregulao) para linhagens de Pseudomonas capazes de degradar petrleo cru. O uso desses microrganismos na remediao de ambientes salinos reduz os custos com diluies e outros processos de purificao antes necessrios para reduo da salinidade (MARGESIN & SCHINNER, 2001). Uma outra estratgia para obteno de recombinantes com capacidade superior de biodegradao a combinao de segmentos catablicos de diferentes organismos em uma nica linhagem, levando obteno de vias metablicas completas em bactrias, antes incapazes de degradar completamente um composto xenobitico, que produziam metablitos intermedirios ou at mesmo txicos. Outras formas de otimizar a biodegradao consiste no uso de mutaes sitio-dirigidas que aumentam a atividade de enzimas das vias catablicas, alterao de promotores, tornando-os mais fortes, e a alterao de mecanismos de regulao a favor dos processos de degradao dos contaminantes (PIEPER & REINEKE, 2000). Talvez uma das dificuldades do uso das linhagens recombinantes seja a instabilidade dos genes clonados quando os mesmos se encontram em plasmdeos. Uma soluo para esse problema tem sido a utilizao de mini-transposons para integrar os genes nos cromossomos e estabiliz-los nas linhagens (PIEPER & REINEKE, 2000). Os avanos das tcnicas moleculares permitiro obter mais informaes sobre os mecanismos de degradao dos compostos aromticos, estrutura e funo de genes, promotores, molculas reguladoras e enzimas, bem como novas rotas metablicas, oferecendo maiores possibilidades otimizao dos processos catablicos, atravs dos MGMs. Entretanto, apesar das linhagens recombinantes constiturem uma boa alternativa para uso nos processos biorremediadores, so necessrios mais estudos para aplicao dessa microbiota no campo, a fim de evitar a gerao de outros impactos ambientais, alm da contaminao pelos xenobiticos pr-existentes.

3 CONCLUSO

A elevada taxa de mortalidade (cerca de 6,5 milhes de pessoas morrem de cncer anualmente) e o fato de que os tratamentos para estas doenas serem dispendiosos, demorados e normalmente trazerem muito sofrimento aos doentes, expem claramente os benefcios potenciais do desenvolvimento de tcnicas eficientes para a remoo de agentes txicos como os compostos BTEX do meio ambiente. Tendo em vista que a grande maioria dos compostos orgnicos derivados do petrleo presentes no meio ambiente sofre modificaes devido ao dos microrganismos, a alternativa da biorremediao como processo de remoo desses resduos tem sido amplamente aceita e estudada, considerando sua eficincia e custo relativamente baixo. Ainda existe uma grande necessidade de estudos a fim de determinar quais so os microrganismos biodegradadores, suas principais vias catablicas e as condies timas para uma eficiente biodegradao desses poluentes (temperatura, nutrientes, presso de oxignio etc). Tais estudos possibilitam o desenvolvimento de tcnicas que permitam o uso eficiente de microrganismos com alta capacidade de degradao no campo. Uma rea ignorada pelos pesquisadores a caracterizao de culturas enriquecidas. Os consrcios bacterianos so particularmente importantes para a degradao de compostos considerados recalcitrantes. Por esse motivo, a elucidao da ecologia desses grupos de organismos crtica. Tambm necessrio expandir as reas de conhecimento quanto s diversas condies ambientais nas quais esses organismos podem estar presentes e que, eventualmente, podem estar sujeitas contaminao por BTEX, entre elas encontram-se as condies extremfilas, apontadas anteriormente neste trabalho: reas desrticas e reas polares, altas profundidades no oceano, condies altamente salinas e de pHs variados. Alm disso, tambm importante delegar maior ateno aos processos de degradao em meios exauridos de oxignio. Apesar dos processos de degradao de BTEX sob condies anaerbias serem mais lentos do que aqueles que ocorrem em condies aerbias, eles constituem um componente significante na remoo de poluentes devido grande abundncia

de outros aceptores de eltrons em relao ao oxignio dissolvido e, em sistemas de biorremediao, requerem menor interveno humana. O crescente interesse pelos processos anaerbios, somado aos recentes avanos na tecnologia molecular e bioqumica e na instrumentao analtica, permitiro que novas linhagens continuem sendo isoladas e novas enzimas e vias metablicas, elucidadas. O isolamento e caracterizao das enzimas e genes envolvidos no catabolismo de degradao dos compostos BTEX possibilitam, atravs da engenharia gentica, a obteno de microrganismos com potencial elevado de biodegradao, capazes de resistir bem s condies do meio e competio com a microbiota natural do solo (SINGH & WALKER, 2006). Uma melhor compreenso dos mecanismos que controlam a expresso desses genes tambm necessria por contribuir na descoberta de novos genes e protenas envolvidas na regulao, podendo contribuir bastante na construo de MGMs com grandes habilidades para degradao dos compostos BTEX, que possam ser utilizados para otimizao dos processos de biorremediao. Alm disso, a maquinaria regulatria pode ser usada no desenvolvimento de tcnicas de biomonitoramento, biosensores e dispositivos de biossegurana para controle ambiental.

4 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALVAREZ, P.J.J., & VOGEL, T.M. Substrate interactions of benzene, toluene, and paraxielene during microbial degradation by pure cultures and mixed culture aquifer slurries. Appl. Environm. Microbiol. v. 57, p. 2981-2985, 1991. ANDERS, H., KAETZKE, A., KAEMPFER, P., LUDWIG, W., FUCHS, G., Taxonomic position of aromatic-degrading denitrifying pseudomonad strains K-172 and KB740 and their description as new members of the genera Thauera, as Thauera aromatic sp. nov., and Azoarcus, as Azoarcus evansii sp. nov., respectively members of the betasubclass of the Proteobacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. v. 45, p. 327-333, 1995. ANDERSON IC, CAIRNEY JW. Diversity and ecology of soil fungal communities:

increased understanding through the application of molecular techniques. Environ Microbiol. v. 6, n. 8, p. 769-779, 2004. ANTIC, M.P, JOVANCICEVIC, B.S, ILIC, M., VRVIC, M.M., SCHWARZBAUER, J. Petroleum pollutant degradation by surface water microorganisms. Envir. Sci. Pollut. Res. v. 13, n.5, p. 320-327, 2006. ARENGHI, F.L., PINTI, M., GALLI, E., AND BARBIERI, P. Identification of the Pseudomonas stutzeri OX1 toluene-oxylene monooxygenase regulatory gene (touR) and of its cognate promoter. Appl. Environ. Microbiol. v. 65, p. 40574063, 1999. ASSINDER, S. J., & WILLIAMS, P. A.. The TOL plasmids: determinants of the catabolism of toluene and the xylenes. Adv. Microb. Physiol. v. 31, p. 169, 1990. BALL, H.A., JOHNSON, H.A., REINHARD, M., SPORMANN, A.M. Inicial reactions in anaerobic ethylbenzene oxidation by a denitrifying bacterium strain EB1. J. Bacteriol. v. 178, p. 5755-5761, 1996. BARKER J.F., PATRICK, G.C, MAJOR, D.W. Natural attenuation of aromatic hydrocarbons in a shallow sand aquifer. Ground Water Monit. Rev. v. 7, p. 64-71, 1987.

BATTERMAN g., a large scale experimento on in situ biodegradation of hydrocarbon in the subsurface. In: Ground water in water resources planning, v.II. Proc. Int. Symp. IASA Publication 142. Int. Assoc. Hydrol. Science, London, p.93, 1983. BERTANI, I., KOJIC, M., AND VENTURI, V. Regulation of the p-hydroxybenzoic acid hydroxylase gene (pobA) in plantgrowth-promoting Pseudomonas putida WCS358. Microbiology v. 147, p. 16111620, 2001. BIERGET, T., FUCHS, G., HEIDER, J., Evidence that anaerobic oxidation of toluene in the denitrifying bacterium Thauera aromtica is initiated by formation of benzylsuccinate from toluene and fumarate. Eur. J., Biochem. v. 238, p. 661-668, 1996. BORDEN, R.C., GOMES, C.A., BECKER,M.T., Geochemical indicators of intrinsic bioremediation. Ground Water v. 33, p. 180-189, 1995. BOSSERT, I.D, & COMPEAU, G.C, Cleanup of Petroleum Hydrocarbon Contamination in Soil In: Young, L.Y & Cerniglia, C.E (ed) Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals, editado por, Wiley-Liss Inc., Nova Iorque, p. 77-125,1995. BRADLEY, P.M., CHAPELLE, F.H., Rapid toluene mineralization by aquifer

microorganisms at Adak, Alaska: implications for intrinsic bioremediation in cold environment. Environm. Sci. Technol. v. 29, p. 2778-2781. BRASIL. Ministrio da Sade (MS) Portaria 518 de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade, e d outras providncias. Braslia, 2004. BRASIL, Secretaria de Segurana e Sade no Trabalho (SSST) Portaria n 14 de 20 dezembro de 1995. Reconhece a ao cancergena do benzeno e regulamenta aes de produo, transporte e armazenamento do benzeno em empresas. Braslia, 1995. BUTTON DK, SCHUT F, QUANG P, MARTIN R, ROBERTSON BR. Viability and Isolation of Marine Bacteria by Dilution Culture: Theory, Procedures, and Initial Results. Appl Environ Microbiol. v. 59, n. 3, p. 881-891, 1993. BYRNE, A.M., AND OLSEN, R.H., Cascade regulation of the toluene-3-monooxygenase operon (tbuA1UBVA2C) of Burkholderia pickettii PKO1: role of the tbuA1 promoter

(PtbuA1) in the expression of its cognate activator, TbuT. J. Bacteriol. v. 178, p. 63276337, 1996. CALDWELL, M.E., SUFLITA, J.M., Detection of phenol and benzoate as intermediates of anaerobic benzene biodegradation under differente terminal electron-accepting conditions. Environ. Sci. Technol. v. 34, p. 1216-1220, 2000. CAVALCA, L., GENNARO, P. COLOMBO, M., ANDREONI, V., BERNASCONI, S., RONCO, I., BESTETTI, G. Distribution of catabolic pathways in some hydrocarbondegrading bacteria from a subsurface polluted soil. Res. Microbiol. v. 151, p. 877887, 2000. CHAKRABORTY, R. & COATES, J.D., Anaerobic degradation of monoaromatic hydrocarbons. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 64, p. 437-446, 2004. CHIH-JU, G.J. & TAI, H.S. Application of granulated activated carbon packed-bed reactor in microwave radiation field to treat BTX. Chemosphere. v. 37, p. 685-698, 1998. COATES, J.D., CHAKRABORTY, R. LACK, J.G, O CONNOR, S.M., COLE, K.A., BENDER, K.S., ACHENBACH, L.A., Anaerobic benzene oxidation coupled to nitrate

reduction in pool culture by two strains of Dechloromonas. Nature, v. 411, p. 1039-1043, 2001. COATES, J.D., CHAKRABORTY, R., MCINERNEY, M.J. Anaerobic benzene

biodegradation a new era. Res. Microbiol. v. 153, p. 621-628, 2002. COHEN, Y. Bioremediation of oil by marine microbiol mats. Int. Microbiol. v. 5, p. 189193, 2002. COLLIER, D.N., HAGER, P.W., PHIBBS, P.V. JR, Catabolite repression control in the Pseudomonads. Res. Microbiol. v. 147, p. 551561, 1996. COLBERG, P.J.S. & YOUNG, L.Y., Anaerobic degradation of nonhalogenated homocyclic aromatic compounds coupled with nitrate, iron, or sulfate reduction. In: Young, L.Y & Cerniglia, C.E (ed) Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals, editado por, Wiley-Liss Inc., Nova Iorque, p. 307-330,1995.

COWLES, C.E., NICHOLS, N.N., HARWOOD, C.S. BenR, a XylS homologue, regulates three different pathways of aromatic acid degradation in Pseudomonas putida. J. Bacteriol. v. 182, p. 63396346, 2000. CUNHA, C. D., ROSADO, A. S., SEBSTIAN, G.V., SELDIN, L. VON DER WEID, I. Oil biodegradation by Bacillus strains isolated from the rock of an oil reservoir located in a deepwater production basin in Brazil. Appl. Microb. Biotech. v.73, n. 4, p. 949-959, 2006. DAGLEY, S.W., EVANS, W.C., RIBBONS, D.W. New pathways in the oxidative metabolism of aromatic compounds by microorganisms. Nature, v.188, p.560-566, 1960. DAZ, E. Bacterial degradation of aromatic pollutants: a paradigm of metabolic versatility. Int. Microbiol. v. 7, p. 173-180, 2004. DAZ, E., FERRNDEZ, A., PRIETO, M.A., GRCIA, J.L. Biodegradation of aromatic compounds by Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Ver. v. 65, n. 4, p. 523-569, 2001. DUETZ, W.A., MARQUES, S., JONG, C., RAMOS, J.L., ANDEL, J.G. Inducibility of the TOL catabolic pathways in Pseudomonas putida (pWWO) growing on succinate in continuous culture: evidence of carbon catabolte repression control. J. Bacteriol. v.176, p.2354-2361, 1994. DYKSTERHOUSE SE, GRAY JP, HERWIG RP, LARA JC, STALEY JT. Cycloclasticus

pugetii gen. nov., sp. nov., an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium from marine sediments. Int J Syst Bacteriol. v. 45, n. 1, p. 116-123, 1995. EICHNER CA, ERB RW, TIMMIS KN, WAGNER-DOBLER I. Thermal gradient gel

electrophoresis analysis of bioprotection from pollutant shocks in the activated sludge microbial community. Appl Environ Microbiol. v. 65, n. 1., p.102-109, 1999. ELSAS, J.D.V., SMIT, E. Plasmid transfer between bacteria in soil microcosms and the field. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., v.1, p.9-16, 1997. EVANS, P.J., MANG, D.T., KIM, K.S, YOUNG, L.Y., Anaerobic degradation of toluene by a denitrifying bacterium. Appl. Environ. Microbiol. v. 57, p. 1139-1145, 1991. FREIRE, S.R., PELEGRINE, R., KUBOTA, L., DURAN, N., PERALTA-ZAMORA, P. Quim. Nova, v. 23, p. 504, 2000.

FURTHORPE, R. A., WYNDHAM, R.C. Transfer and expression of the catabolic plasmid pBRC60 in wild bacterial recipients in a freshwater ecosystem. Appl. Environ. Microbiol., v.57, p.1546-1553, 1991. GIBSON, D.T, ZYLSTRA, G.I., CHAUHAN, S., Biotransformations catalized by toluene dioxygenase from Pseudomonas putida F1. In: Silver, S. (ed) Pseudomonas:

biotransformations, pathogenesis and evoluting biotechnology. American Society for Microbiology. Washington DC, p. 121-132, 1990. GIBSON, D.T. Microbial degradation of aromatic compounds. Science, v.161, p.1093-1097, 1968. GLENSOY, N. & ALVAREZ, P.J.J. Diversity and correlation of specific aromatic hydrocarbon biodegradation capabilities. Biodegradation. v. 10, p. 331-340, 1999. HARAYAMA, S., KASAI, Y., HARA, A. Microbial communities in oil-contaminated seawater. Curr. Opin. Biotech. v. 15, p. 205-214, 2004. HARMS, G.T, ZENGLER, K., RABUS, R., AECKERSBERG, F., MINZ, D., ROSSELLOMORA, R., WIDDEL, F., Aerobic oxidation of o-xylene, m-xylene and homologous alkylbenzenes by new types of sulfate-reducing bacterium. Appl. Environ. Microbiol. v. 65, p. 999-1004, 1999. HAY, A.G., RICE, J.F., APPLEGATE, B.M., BRIGHT, N.G., SAYLER, G.S. A bioluminescent whole-cell reporter for detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4dichlorophenol in soil. Appl. Environ. Microbiol., v. 66, p. 45894594, 2000. HEAD, I.M. & SWANNELL, R.P.J. Bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminants in marine habitats. v. 10, p.234-239, 1999. HESS, A., ZARDA, B., HAHN, D., HANER, A., STAX, D., HOHENER, P., ZEYER, J., In situ analisys of denitrifying toluene and m-xylene degrading bacteria in a diesel fuelcontaminated laboratory aquifer colunm. Appl. Environ. Microbiol. v. 65, 2136-2141, 1997. HOLLIGER, C. & ZEHNDER, J.B. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons. Curr. Opin. Biotech. v. 7, p. 326-330, 1996.

INOUYE, S., NAKAZAWA, A., NAKAZAWA, T. Nucleotide sequence of the regulatory gene xylR of the TOL plasmid from Pseudomonas putida . Gene, v. 66, p. 301306, 1988. JAMISON VW, RAYMOND RL, HUDSON JO. MICROBIAL HYDROCARBON COOXIDATION. III. Isolation and Characterization of an alpha, alpha'-Dimethyl-cis, cisMuconic Acid-producing Strain of Nocardia corallina. Appl Microbiol. v. 17, n. 6, p. 853856, 1969. JEONG E, HIRAI M, SHODA M. Removal of p-xylene with Pseudomonas sp. NBM21 in biofilter. Biosci Bioeng. v.102, n. 4, p. 281-287, 2006. JOVANCICEVIC, B., ANTIC, M.P., SOLEVIC, T.M., VRVIC, M.M., KRONIMUS, A., SCHWARZBAUER, J. Investigations of interactions between surface water and petroleumtype pollutants. Envir. Scien. & Pollut. Res. v. 12, n.4, p. 205-212, 2005. KEANE, A., PHOENIX, P., GHOSHAL, S., LAU, P.C. Exposing culprit organic pollutants: a review. J. Microbiol. Methods, v. 49 p.103119, 2002 KEMP, M.B., HEGEMAN, G.D. Genetic control of -ketoadipate pathway in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol., v.96, p.1488-1499, 1968. KIM, S.C. The catalytic oxidation of aromatic hydrocarbons over supported metal oxideJ. Hazard. Mater. v. 91, p. 285-299, 2002. KNIEMEYER, O., FISCHER, T., WILKES, H., GLOCKNER, F., WIDDEL, F., Anaerobic degradation of ethylbenzene by a new type of marine sulfate-reducing bacterium. Appl. Environ. Microbiol. v. 69, p.760-768, 2003. KRIEGER, C.J., Initial reactions in anaerobic oxidation of m-xylene by a denitrifying bacterium Azoarcus sp. Strain T. J. Bacteriol. v. 181, p. 6403-6410, 1999. KUKOR, J.J., & OLSEN, R.H., Genetic organization of a meta cleavage pathway for catechol produced from catabolismo of toluene, benzene, phenol, and cresol by Pseudomonas pickettii PKO1. J. Bacterol. v. 173, p. 4587-4594, 1991. LANGE, C.C., WACKETT, L., MINTON, K.W., DALY, M.J. Engeneering a recombinant Deinococcus radiodurans for organopollutant degradation in radioactive mixed waste environments. Nature Biotech. v. 16, 1998.

LAU, P.C., WANG, Y., PATEL, A., LABBE, D., BERGERON, H., BROUSSEAU, R. A bacterial basic region leucine zipper histidine kinase regulating toluene degradation. Proc Natl Acad Sci USA, v. 94 p. 14531458, 1997. LEUTWEIN, C., HEIDER, J. Anaerobic toluene-catabolic pathway in denitrifying Thauera aromtica: activation and beta-oxidation of the first intermediary, (R)-(+)-benzylsuccinate. Microbiology, v. 145, p. 3265-3271, 1999. LI H, LIU YH, LUO N, ZHANG XY, LUAN TG, HU JM, WANG ZY, WU PC, CHEN MJ, LU JQ. Biodegradation of benzene and its derivatives by a psychrotolerant and moderately haloalkaliphilic Planococcus sp. strain ZD22. Res Microbiol. v.157, n. 7, p. 629-636, 2006. LOVLEY, D.R., BAEDECKER, N.J., LONERGAN, D.J., COZZARELLI, I.N., PHILIPS, E.J.P., SIEGEL, B.I, Oxidation of aromatic contaminants coupled to microbial iron reduction. Nature, v. 339, p. 297-299. 1989. MAcGREGOR, C.H., WOLFF, J.A., ARORA, S.K., PHIBBS, P.V. Cloning of a catabolic repression control (crc) gene from Pseudomonas aeruginosa, expression of the gene in Escherichia coli, and identification of the gene product in Pseudomonas aeruginosa . J. Bacteriol., v. 173, p.7204-7212, 1991. MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Regulao da expresso gnica. In: MADIGAN et al., Microbiologia de Brock . (Trad. KIAW, C.M.), 10 edio, So Paulo: Pearson Education do Brasil, 2004. Cap. 8, p. 193-215. MARGESIN, R. & SCHINNER, F. (a) Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons of hydrocarbons in extreme environments. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 56, p. 650-663, 2001. MARGESIN, R. & SCHINNER, F. (b) Potencial of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles, 5, p. 73-83, 2001. MORALES, G., LINARES, J.F., BELOSO, A., ALBAR, J.P., MARTNEZ, J.L., ROJO, F. The Pseudomonas putida Crc global regulator controls the expression of genes from several chromosomal catabolic pathways for aromatic compounds. J. Bacteriol. v. 186, n.5, p. 13371344, 2004.

MLLER, C., PETRUSCHKA, L., CUYPERS, H., BURCHHARDT, G., HERMANN, H. Carbon catabolic repression of phenol degradation in Pseudomonas putida is mediated by the inhibition of the activator protein PhlR. J. Bacteriol., v. 178, p.2030-2036, 1996. MLLER, R., ANTRANIKIAN, G., MALONEY, S., SHARP, R. Thermophilic degradation of environmental pollutants. In: Antranikian, G (ed.) Biotechnology of extremophiles. (Advances in Biochemical Engeneering/Bio-technology). v. 61, Springer, Berlin Heidelberg New York. p. 155-169. NISHIZUKA, Y., ICHIYAMA, A., NAKAMURA, S., HAYAISHI, O. A new metabolic pathway of catechol. J. Biol. Chem., v.237, p.268-270, 1962. ORNSTON, L.N., STANIER, R.Y. The conversion of catechol and protocatechuate to bketoadipate by Pseudomonas putida. IV. Regulation. J. Biol. Chem., v.241, p.3800-3801, 1966. PALLERONI, N.J., Microbial Versatility In: Young, L.Y & Cerniglia, C.E (ed) Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals, editado por, Wiley-Liss Inc., Nova Iorque, p. 3-25, 1995. PANDEY, G. & JAIN, R.K., Bacterial chemotaxis toward environment pollutants: role in bioremediation. Appl. Environm. Microbiol. v. 68, p. 5789-5795, 2002. PARALES, R.E. & HARWOOD, C.S., Bacterial chemotaxis to pollutants and plant-derived aromatic molecules. Curr Opin Microbiol. v. 5, p. 266-273, 2002. PHELPS, C.D. & YOUNG, L.Y. Anaerobic biodegradation of BTEX and gasoline in various aquatic sediments. Biodegradation. v. 10, p. 15-25, 1999. PHELPS, C.D., ZHANG, X., YOUNG, L.Y, Use of stable isotopes to identify benzoate as a metabolite of benzene degradation in sulphidogenic consortium. Environ. Microbiol. v. 3, p. 600-603, 2001. PHELPS, C.D., KAZUMI, J., YOUNG, L.Y. Anaerobic degradation of benzene in BTX mixtures dependent on sulfate reduction. FEMS Microbiol. Lett. v. 145, p. 433, 1996. PIEPER, D. & REINEKE, W. Engeneering bacteria for bioremediation. Curr. Opin. Biotech. v.11, p. 262-270 , 2000.

PRIETO, M.A., GLAN, B., TORRES, B., FERRNDEZ, A., FERNNDEZ, C., MINAMBRES, B., GARCA, J.L., DAZ, E. Aromatic metabolism versus carbon availability: the regulatory network that controls catabolism of less-preferred carbon sources in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev. v. 28, p. 503-518, 2004. QUENTMEIER, A. & FRIEDRICH, C.G, Transfer and expression of degradative and antibiotic resistence plasmids in acidophilic bactria. Appl. Environ. Microbiol. v. 60, p. 973-978, 1994. RABUS R, KUBE M, BECK A, WIDDEL F, REINHARDT R. Genes involved in the anaerobic degradation of ethylbenzene in a denitrifying bacterium, strain EbN1. Arch Microbiol. v. 178, n. 6, p. 506-516, 2002. RABUS, R. & WIDEL, F., Anaerobic degradation of ethylbenzene and aromatic hydrocarbons by new denitrifying bactria. Arch Microbiol. v. 163, p. 96-103, 1995. RABUS, R., NORDHAUS, R., LUDWIG, W., WIDDEL, F., Complete oxidation of toluene under strictly anoxic conditions by a new sulfate-reducing bacerium. Appl. Environ. Microbiol. v. 59, p. 1444-1451, 1993. RAJENDRAN N, MATSUDA O, IMAMURA N, URUSHIGAWA Y. Variation in Microbial Biomass and Community Structure in Sediments of Eutrophic Bays as Determined by Phospholipid Ester-Linked Fatty Acids. Appl Environ Microbiol. v. 58, n. 2, p. 562-571, 1992. ROTHMEL, R.K., ALDRICH, T.L., HOUGHTON, J.E., COCO, W.M., ORNSTON, L.N., CHAKRABORTY, A.M., Nucleotide sequencing and characterization of Pseudomonas putida catR: a positive regulator of the catBC operon is a member of the LysR family. J Bacteriol, v. 172, p. 922931, 1990. SALA-TREPAT, J. M., EVANS, W. C. The meta-cleavage of catechol by Azotobacter species. 4-oxalocrotonato pathway. Eur. J. Biochem., v.20, p.400-413, 1971. SHIELDS, M.S., MONTGOMERY, S.S., CHAPMANN, P.J, CUSKEY, S.M & PRITCHARD, P.H., Novel pathway of toluene catabolism in the trichloroethylene-degrading bacterium G4. Appl. Environ. Microbiol. v. 55, p. 1624-1629, 1989.

SHINGLER, V. Integrated regulation in response to aromatic compounds: from signal sensing to attractive behaviour. Environ. Microbiol. v. 5, n. 12, p. 12261241, 2003. SILVA, R.L.B., BARRA, C.M., MONTEIRO, T.C.N, BRILHANTE, O.M. Estudo da contaminao de poos rasos por combustveis orgnicos e possveis consequncias para a sade pblica no Municpio de Itagua, Rio de Janeiro, Brasil. Cad. Sade Pblica Rio de Janeiro. v. 18, n.6, p. 1599-1607, 2002. SPERMANN, A.M. & WIDDEL, F. Metabolism of alkylbenzenes, alkanes, and other hydrocarbons in anaerobic bacteria. Biodegradation. v.11, p. 85-105, 2000. SPOONER, R.A., LINDSAY, K., AND FRANKLIN, F.C. Genetic, functional and sequence analysis of the xylR and xylS regulatory genes of the TOL plasmid pWW0. J. Gen. Microbiol. v. 132, p. 13471358, 1986. STACH JE, BATHE S, CLAPP JP, BURNS RG. PCR-SSCP comparison of 16S rDNA sequence diversity in soil DNA obtained using different isolation and purification methods. FEMS Microbiol Ecol. v. 36, n.2-3, p. 139-151, 2001. SUN, Y., CHEN, Z., XU, S., CAI, P., Stable carbon and hydrogen isotopic fraction of individual n-alkanes accompanying biodegradation: evidence from group of progressively biodegraded oils. Org. Cheochem. v. 36, p. 225-238, 2005. TAYLOR, T.R., JACKSON, K.J., DUBA, A.G., CHEN, C.I., In situ thermally enhance biodegradation of petroleum fuel hydrocarbons and halogenated organic solvents. Patent US5753122, 19 de maio de 1998. TROPEL, D. & VAN DER MEER, J.R. Bacterial transcriptional regulators for degradation pathways of aromatic compounds. Microb. Mol. Biol. Revie. v. 68, n. 3, p. 474-500, 2004. TIBURTIUS, E.R.L., ZAMORA, P.P., LEAL, E.S. Contaminao de guas por BTXs e Processos utilizados na remediao de stios contaminados. Quim. Nova. v. 27, n. 3, p. 441446, 2004. WANG Y, LAU PC, BUTTON DK. A marine oligobacterium harboring genes known to be part of aromatic hydrocarbon degradation pathways of soil pseudomonads. Appl Environ Microbiol. v. 62, n. 6, p. 2169-2173, 1996.

WATTS, R.J., HALLER, D.R, JONES, A.P., TELL, A.L. A foundation for the risk-based treatment of gasoline-contaminated soils using modified Fenton's reactions. J. Hazard. Mater. v.76, p.73, 2000. WEINER, J., LOVLEY, D.R., Anaerobic benzene degradation in petroleum-contaminated sediments after inoculation with a benzene-oxidizing enrichment. Appl. Environ. Microbiol. v. 64, p. 775-778, 1998. WHITED, G.M., & GIBSON, D.T, Toluene-4-monooxygenase, a three-component enzyme system that catalyses the oxidation of toluene to p-cresol in Pseudomonas mendoncina KR1. J. Bacteriol. v. 173, p. 3010-3016, 991. WILLIAMS,, P.A. & MURRAY, K., Metabolismo f benzoate nd methylbenzoates by Pseudomonas putida (arvilla) mt-2: evidence for the existence of a TOL plasmid. J. Bacterol. 120, p. 416-423, 1974. WRENN, A.B., Biodegradation of aromatic hydrocarbons. Revisado por SWARD, R.E. em abril, 1998. Disponvel em: <http://www.cee.umd.edu/~eseagren/bioAHC97.htm> Acesso em 02 de fevereiro de 2007. WYNDHAM, R.C., NAKATSU, C.H., FULTHORPE, R.R., HOLLAND, B.A., PEEL, M.C. The phylogenetic distribution of transposable dioxygenase genes. In: Progress in Microbial Ecology. Martins, M.T (eds). Brazilian Society for Microbiology, 1997. ZHANG, C. & BENNETT, G.N. Biodegradation of xenobiotics by anaerobic bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. v. 67, p. 600-618, 2005. ZOBELL, C.E., The role of bactria in the formation and transformation of petroleum hydrocarbons. Science, v. 102, p. 364-369, 1945.