Estudio Preliminar de las Propiedades de la Semilla de Limn Mexicano (Citrus aurantifolia swingle) para su Posible Aprovechamiento

Preliminary Study of the Properties of Mexican Lime Seed (Citrus aurantifolia swingle) for its Possible Uses
Enrique Arriola-Guevara(1)*, Tania Garca-Herrera(1,2), Guadalupe M. GuatemalaMorales(1,2), Jorge A. Garca-Fajardo(2) (1) Centro Universitario de Ciencia Exactas e Ingenieras, Universidad de Guadalajara, Calzada Marcelino Garca Barragn y Olmpica, Sector Reforma, CP 44420 Guadalajara, Jalisco-Mxico (e-mail: arriole@hotmail.com) (2) Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco, A.C. Avenida Normalistas N 800, Colonia Colinas de la Normal, CP 44270, Guadalajara, Jalisco-Mxico * autor a quien debe ser dirigida la correspondencia

Resumen Se obtuvieron propiedades clave de la semilla de limn mexicano (Citrus aurantifolia swingle) para su posible aprovechamiento en la industria de alimentos. Se consideraron propiedades fsicas, composicin, toxicidad en roedores (prueba de dosis letal media y toxicidad crnica) y actividad germicida (prueba de halos de inhibicin y efectividad germicida). La semilla contiene 21% de protenas, 39% de aceite vegetal y 29% de fibra, especialmente lignina en cantidad considerable, lo que hace viable su uso como materia prima para nutracuticos o alimentos funcionales. La toxicidad de la semilla result nula por lo que es apta para el consumo humano. Se encontr cierta 8 efectividad germicida para Candida albicans 85.77% (poblacin Inicial = 0.304*10 UFC/ml) y para 8 Escherichia coli 91.447% (poblacin Inicial = 190*10 UFC/ml), por lo que puede ser usada como ingrediente en germicidas. Palabras clave: limn mexicano, citrus aurantifolia swingle, propiedades de semillas, alimento

Abstract Key properties of seed of Mexican lime (Citrus aurantifolia swingle) were studied for potential uses by the food industry. Characteristics considered included physical properties, composition, toxicity to rodents (average lethal dose and chronic toxicity), as well as germicidal activity (inhibition rings and germicidal effectiveness). The seed contained 21% protein, 39% vegetable oil and 29% fiber, particularly lignin. The seed could potentially be used as a basic component for nutritional supplements or functional food products. The toxicity was nil, and thus seed derivatives were safe for human consumption. Some germicidal effectiveness was found against Candida albicans, 8 85.77% (starting population = 0.304*10 UFC/ml), and against Escherichia coli, 91.447% (starting 8 population = 190*10 UFC/ml), suggesting seed extracts could be used as an ingredient in germicidal products. Keywords: mexican lime, citrus aurantifolia swingle, seed properties, food

INTRODUCCIN
En Mxico existe un nmero considerable de industrias que producen aceite de limn y que llegan a procesar, como mnimo, 500 toneladas diarias del fruto fresco, de las cuales el 1% es semilla que se tira a rellenos sanitarios (Garca, 2004). De la semilla se puede aprovechar el aceite para su uso potencial como conservador, desinfectante y antibacterial, propiedades estas que se han encontrado en las semillas de otros ctricos como la toronja y la naranja (Braddock, 1999). Asimismo, es conocido que las oleaginosas contienen algunos componentes antioxidantes debido a las insaturaciones del aceite (Fereidoon, 1997). La semilla de limn -con una cubierta dura lignocelulsica- contiene una importante cantidad de fibra, grasas y protenas, que son muy poco abundantes en el resto del fruto (Braddock, 1999). Para que la lignocelulosa sea comestible es necesario sujetarla a una operacin -comn en panadera- que consiste en su degradacin con enzimas celulasas y xilanasas para separar sus componentes: celulosa, hemicelulosa y lignina (Ponce y Prez, 2002). De acuerdo al Comit de Toxicidad de Qumicos en Alimentos y Ambiente del Reino Unido (Cassidy, 2003), la lignina es un fitoestrogeno que al ser metabolizado por la microflora intestinal humana, produce enterolactona y enterodiol, compuestos que tienen efectos hipocolesterolmicos que ayudan a prevenir las enfermedades cardiovasculares. Un fitoestrogeno es cualquier sustancia, o metabolito proveniente de una planta, que induce respuestas biolgicas en vertebrados y puede imitar o modular las acciones de estrgenos endgenos. La lignina se encuentra en frutas, vegetales y cereales. Las concentraciones ms altas de lignina se han encontrado en granos, semillas y otros alimentos ricos en fibra; en particular, la semilla de linaza (600-3700 mg/Kg) es la fuente ms alta de lignina comestible conocida. Se recomienda un consumo de 0.48 a 0.72 mg diariamente (Cassidy, 2003). Lo recomendado por el Comit de Toxicidad de Qumicos en Alimentos y Ambiente del Reino Unido ha sido tambin estudiado, validado y explicado -a detalle- por L. von Hertzen et al. (2004) y Jefferson (2005). Las caractersticas y composicin de los cidos grasos en su aceite, as como la presencia de lignina, le pueden conferir a la semilla de limn el atributo de producto nutracutico. La produccin comercial del aceite esencial de limn mexicano (Citrus aurantifolia swingle), principal producto de exportacin de la industria limonera e ingrediente de los refrescos de cola y lima-limn (Gobierno del Estado de Oaxaca, 2004), se lleva a cabo en los mismos estados productores de este ctrico. En Mxico el principal productor de limn se encuentra en Tecomn en el estado de Colima, lugar tropical donde la temperatura promedio es de 26C (Gobierno del Estado de Colima, 2004). Debido a que la semilla fresca tiene un alto contenido de humedad (68%) y una actividad acuosa de 0.98 (Garca et al, 2002), es propensa a una rpida descomposicin por ataque de hongos y bacterias (Badui, 1993), por lo que es necesario deshidratarla para su conservacin. El proceso de secado que se seleccione deber tomar en cuenta las caractersticas geomtricas y de densidad de la partcula. Se obtuvo la composicin nutricional de la semilla, se realizaron pruebas de lmite de toxicidad en roedores y determinacin de la actividad germicida segn la norma NMX-BB-040-SCFI-1999 en el extracto obtenido por prensado. Nuestro objetivo es encontrar propiedades clave de la semilla de limn para su posible aprovechamiento, evaluando caractersticas que deben tomarse en cuenta para el tratamiento de la semilla (que pudiera aprovecharse como producto nutracutico) y el potencial de su extracto como posible bactericida y fungicida.

MATERIALES Y MTODOS

Siguiendo las normas mexicanas correspondientes, se determinaron algunas caractersticas de la composicin de la semilla, como son: humedad utilizando la norma NOM-F-83-1986 (por destilacin con desplazamiento por tolueno mtodo de Dean-Stark), cenizas (por calcinacin, NMX-F-66S-1978), grasas (por mtodo Soxhlet con ter de petroleo, NMX-F-089-S-1978), protenas (cuantificando nitrgeno por digestin con cido ntrico y cido sulfrico, NMX-F-68S1980), carbohidratos (por mtodo de Lane y Eynon, NMX-F-312-S-1978), fibra (por tratamiento de la muestra desgrasada con cido sulfurico al 1.25% y su posterior calcinacin, NMX-F-90-S-1978) y presencia de almidn (prueba con reactivo de lugol, CETis No. 143, 1992). De acuerdo con lo publicado por la Biblioteca Digital de la Universidad de Chile (BDCh, 2001), el contenido calrico de la semilla deshidratada se estim a partir de los valores de cada uno de los componentes nutricionales (1g protenas = 4.1 Kcal, 1g carbohidratos = 4.1 Kcal, y 1g grasa = 9 Kcal). Se experimentaron dos tcnicas de extraccin del aceite, prensado en caliente a 60 C y por el mtodo Soxhlet (Egan et al., 1991), utilizando 3 solventes (hexano, ter y etanol). El anlisis fue por triplicado y se reportan los valores promedio de rendimiento del extracto por cada tcnica y solvente, as como la desviacin estndar. Se separ la cubierta de la semilla para determinar que cantidad de lignina contena, de acuerdo con la tcnica sugerida por Papinutti et al. (2003) por disolucin en cido sulfrico. Todas las pruebas se realizaron por triplicado y se reportan los valores promedio y su desviacin estndar. La dosis letal media, DL50, se determin aplicando las recomendaciones de la IACUC (2000) que indican que la dosis de prueba no debe ser mayor a 2000 mg/Kgindividuo. La toxicidad crnica se determin tomando como base el mtodo de las dosis repetidas (OECD TG 407-2001), suministrando a cada ratn la muestra en cantidad equivalente a 30g de fibra en un individuo de 70 Kg; esta dosis fue suministrada en su alimento a 3 ratones por 28 das. Cada prueba se hizo con semilla molida deshidratada y semilla molida deshidratada y semidesgrasada; esta ltima obtenida de la torta residual despus del prensado, que contiene en promedio un 10% de aceite en base seca. La muestra, una pasta formada por 3 partes de semilla molida (H = 5%) y una parte de agua potable, se adhiri al alimento habitual del roedor. Para detectar una posible actividad microbicida, se prepararon 4 extractos por maceracin (agua destilada, agua-hexano 3:7, agua-etanol 3:7, agua-ter 3:7) de una mezcla semilla molida-solvente 1:2, y un extracto por prensado hmedo en caliente, mezclando semilla molida-agua 1:1 y prensndola a 60C. Los extractos se usaron en el hongo Candida albicans y en bacterias gram negativa, Escherichia coli, para la prueba de halos de inhibicin (De Paula y Martins, 2000). En los extractos que presentaron inhibicin se determin la actividad germicida siguiendo la norma NMXBB-040-SCFI-1999. Tambin se hizo un estudio estadstico de dimensiones y densidad, el estudio se realiz tomando una muestra aleatoria de 50 semillas, midiendo largo, ancho y espesor de cada una de ellas con micrmetro con 0.1 mm de precisin; asimismo, tambin se midi su densidad por desplazamiento con tolueno. La esfericidad se estim de acuerdo con la Ec. 1 (Levenspiel, 2004), tomando la semilla como un ovoide, y en la que las superficies corresponden a las de esfera y partcula del mismo volumen (subndice V en la eqn. 1):

(1) Finalmente, se determin la actividad de agua por medio del instrumento Aqualab 3T en semilla fresca y semilla deshidratada.

RESULTADOS Y DISCUSIN

En la Tabla 1 se muestran algunas de las caractersticas de la composicin de la semilla de limn. Tabla 1. Parmetros fsicos y composicin de la semilla de limn Parmetro Media Desv. Est. Humedad semilla fresca % 68.00 0.51 Cenizas en base seca % 2.41 0.58 Grasas en base seca % 39.10 1.62 Protena en base seca % 21.27 2.16 Carbohidratos en base seca 3.26 8.96 % Fibra en base seca % 29.00 8.95 Caloras (en 100g) 450.00 55.20 Almidn (+) Lignina % 0.60 0.011 La tcnica de extraccin del aceite con la que se obtiene el mejor rendimiento es utilizando ter etlico. En el caso del hexano y el ter como solventes, se observ que, para eliminar totalmente el solvente, es necesario mantener por tiempos largos la mezcla al vaco, lo que causa que el aceite se oxide, por lo que en este caso es recomendable la obtencin del aceite por prensado en caliente a 60C (Tabla 2). Tabla 2. Rendimiento de la extraccin de aceite por diferentes tratamientos. Tratamiento Hexano Etanol ter etlico Prensado Media % 29.00 25.00 39.10 11.06 Desv. Est. % 3.47 6.17 1.62 2.06

La toxicidad de la semilla result nula segn las pruebas de dosis letal media y toxicidad crnica hechas en roedores alimentados con semilla molida deshidratada y semilla molida deshidratada y desgrasada; la descripcin del experimento se muestra en la tabla 3. La actividad microbicida se evalu por la tcnica de discos de inhibicin y por reto microbiano, segn la norma NMX-BB-040SCFI-1999, que indica que un producto etiquetado como germicida, debe tener 99.999% de efectividad en 30 segundos de contacto a la concentracin de uso recomendada cuando la cuenta 8 viable inicial se encuentre entre 75 y 125*10 UFC/ml. De acuerdo con los resultados que se muestran en la Tabla 4 donde P.I. Poblacin Inicial, y UFC, Unidades Formadoras de Colonias-, los extractos obtenidos por maceracin de la materia prima, no tienen ninguna actividad microbicida; mientras que el extracto obtenido por prensado hmedo en caliente tiene una efectividad alta. Tabla 3. Evaluacin de la toxicidad en semilla de limn Tipo de estudio DL50 Toxicidad Crnca Descripcin Dosis Mxima Semilla molida Dosis fija (28 das) Semilla molida Dosis 2, 3, 5 g/kgraton Resultado Negativo

Equivalente a Negativo. Sin 100 g en humano dao aparente de 70 kg en rganos

DL50 Toxicidad Crnca

Dosis Mxima Semilla molida semidesgrasada Dosis fija (28 das) Semilla molida semidesgrasada

2, 3, 5 g/kgraton

Negativo

Equivalente a Negativo. Sin 100 g en humano dao aparente de 70 kg en rganos

En la Tabla 5 se muestran los valores de los parmetros fsicos medidos. En base a esta informacin, la semilla de limn resulta ser un slido D de la clasificacin de Geldart. De acuerdo con Levenspiel (2004), un posible mtodo eficiente- de secado seria tratar la semilla en secadores del tipo de lecho fuente. Los valores obtenidos para la actividad del agua, antes y despus del secado, indican la conveniencia de someter la semilla a este tratamiento antes de procesarla. Marcal y Mrquez (1991) recomiendan que los granos sean secados hasta una humedad promedio de entre 10 y 13% para no sufrir dao estructural y conservarse de forma adecuada con los mtodos de almacenamiento tradicionales. Por otra parte, Badu (1999), recomienda una actividad de agua ptima de 0.1, para granos, harinas y cereales.

CONCLUSIONES
La semilla de limn no es txica; adems de contener protenas, aceite vegetal y fibra, especialmente lignina en cantidad considerable, su utilizacin como complemento alimenticio o ingrediente en nutracuticos o alimentos funcionales para consumo humano se considera una alternativa viable. El extracto obtenido por prensado tiene actividad bactericida importante, puede ser usado como ingrediente en desinfectantes y sanitizantes, no cumple con la norma NMX-BB-040-SCFI-1999, por lo que se recomienda hacer pruebas con un extracto purificado para tener un panorama ms amplio de este aspecto y verificar si se tiene un bactericida de amplio espectro. La forma, dimensiones y densidad de la semilla de limn la sitan como un solido D en la clasificacin de Geldart, lo que la hace adecuada para su secado con lechos fuente. Tabla 4. Evaluacin de la actividad microbicida.

Tabla 5. Parmetros fsicos de la semilla de limn Parmetro Media Desv. Est.

Actividad de agua semilla fresca Actividad de agua semilla seca (al sol, 3 sesiones de 8 h) Longitud caracterstica promedio (cm) Densidad semilla fresca (g/cm3) Densidad semilla seca (g/cm3) Esfericidad

0.98 0.22 0.99 1.10 0.81 0.78

0.01 0.28 0.24 0.04 0.04 0.12

AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo de la Universidad de Guadalajara, del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (Becario 127458) y del Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco (Mxico).

REFERENCIAS
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La resonancia magntica detecta semillas en mandarinas

Jos Blasco Semillas en mandarinas son difciles de detectar con rayos x radiografa y la tomografa computarizada, pero se distinguen fcilmente mediante imgenes por resonancia magntica.
16 de enero 2012, SPIE Noticias. DOI: 10.1117/2.1201201.004049

Ausencia de semillas es una propiedad deseable en la produccin de fruta, incluida la agricultura mandarina, y es explotado por los comerciantes como un factor en la toma de un producto competitivo. Cuando se producen las semillas, que afecta el precio de las mandarinas, causando prdidas econmicas para los productores y disminuir el prestigio de su fruto. Las primeras mandarinas cosechadas en cada temporada son cultivares de 'Clementinas' y 'Satsumas', que son excelentes en calidad y, en teora, no producen semillas. Sin embargo, para prolongar la temporada de cosecha, los productores en Espaa y otros pases han introducido variedades de mandarinas tardas, como 'Fortune', que se puede extender la temporada hasta abril. Por desgracia, estas plantas pueden polinizacin cruzada con otras variedades, como 'Clementinas', la produccin de semillas de ambas variedades. Este resultado es un grave problema para los exportadores espaoles que venden a mercados como el de EE.UU.. Actualmente, las semillas pueden ser detectados slo por mtodos destructivos, basado en el examen de las muestras de fruta representativas de cada lote. Sin embargo, estos mtodos lento el proceso de seleccin y no garantizan la calidad de todos los frutos. Tcnicas de visin por ordenador se utilizan para automatizar la inspeccin de la calidad externa de los productos 1, 2 agrcolas. De manera similar, las tcnicas de imagen no invasivas utilizadas tradicionalmente en 3, la medicina se puede utilizar para inspeccionar la calidad interna de los productos agrcolas. 4 Somos perseguir este enfoque mediante el desarrollo de nuevas tcnicas no destructivas para inspeccionar la calidad interna de la fruta. En particular, se ha evaluado recientemente de rayos x radiografa, tomografa computarizada (TC) y la resonancia magntica (MRI) para las mandarinas inspeccin.

Figura 1. Imagen de tomografa computarizada de dos mandarinas. Una semilla es visible en el mandarn izquierda. Las semillas son difciles de detectar mediante tcnicas de rayos X porque las semillas y la pulpa tienen densidades similares. La fruta utilizada en los experimentos eran 15 mandarinas, seleccionados por nuestros expertos internos. Un total de 10 mandarines eran de la variedad 'Fortune' y las semillas contenidas, mientras que los otros cinco eran de la variedad 'Reina' y supuestamente sin semillas.

En primer lugar, estudiamos las dos tcnicas de rayos x, es decir, la radiografa y la TC. Adquirimos imgenes de la fruta utilizando equipos mdicos pertenecientes al Hospital Quirn (Valencia, Espaa). Los mandarines fueron colocados en grupos de cinco. Siguiendo las recomendaciones de la operadora, las imgenes de la TC fueron adquiridas mediante la configuracin de 140kV y 20 mA (ver Figura 1 ). Para cada conjunto de frutas, adquirimos 50 rebanadas transversales: cada corte fue de 2 mm de espesor y no hubo diferencias entre cortes contiguos. Por lo tanto, fue tomar imgenes de todo el volumen de cada mandarina. Adems, dos imgenes radiogrficas que muestran una proyeccin coronal de las mandarinas se obtuvieron con el equipo sintonizado a 49kV y 42 mA, as como 49kV y 32mA. Las densidades de las semillas y la pulpa son lo suficientemente cerca que estn representados por niveles de gris similares en las imgenes. Por esta razn, el algoritmo que hemos desarrollado para detectar las semillas en las imgenes se basa en la extraccin de bordes y la codificacin. Sin embargo, el uso de esta tcnica con las imgenes de TC y radiografa detecta slo el 10% de las semillas (una semilla se consider detecta si se encontr en ninguna de las imgenes). No hubo detecciones falsas.

Figura 2. deteccin de semillas utilizando formacin de imgenes por resonancia magntica. (A) El mandarn. (B) Las semillas separadas del fondo por un algoritmo de segmentacin de umbral. (C) 2 Extrado contornos de las semillas. reas> 4 mm se identifican como semillas. (D) Fotografa del mandarn despus de ser cortado abierto.

Para la parte de resonancia magntica del estudio, se adquiri imgenes de mandarinas utilizando un escner que tiene un imn permanente de 0.2T capaz de explorar objetos con un dimetro mximo de 160 mm. Uno de nuestros principales esfuerzos fue estudiar qu secuencias de pulsos producen el mayor contraste en las imgenes entre las semillas y la pulpa.Al ajustar correctamente los parmetros tales como el tiempo de eco (T E ) y el tiempo (T repeticin R ), se obtuvo una secuencia de adquisicin de imgenes que este contraste mejorado (vase la figura 2 ). Otro factor limitante importante era el tiempo de adquisicin, lo que podra llevar desde unos pocos segundos a varios minutos, dependiendo de la secuencia de pulsos empleada. Como las imgenes tenan un buen contraste entre las semillas y la pulpa, se podra utilizar un mtodo de segmentacin de umbral para separar las semillas del fondo. A continuacin, el contorno de cada objeto se analiz y se calcul su rea. Hemos identificado un objeto como una 2 semilla si tena un rea> 4 mm . Este sistema ha detectado 100% de las semillas sin detecciones falsas. Las imgenes fueron obtenidas en 7s usando una secuencia spin-echo con T E = 18 ms y T R = 50 ms. En resumen, la RM demostr ser superior a la TC y radiografa de rayos x para detectar semillas en mandarinas. El sistema de resonancia magntica detecta todas las semillas correctamente sin detecciones falsas. No fue posible discriminar entre semillas y la pulpa utilizando consistentemente CT o rayos X imgenes debido a sus densidades similares. Por lo tanto, la RM es una tcnica adecuada para separar mandarinas sin semillas y sin semillas no invasiva y no destructiva. El mtodo es seguro y potencialmente podra aplicarse en lnea. El siguiente paso en este trabajo es el de reducir el coste de los equipos y el tiempo necesario para adquirir y procesar las imgenes. Los experimentos descritos aqu utilizan equipos mdicos costosos configurado para obtener imgenes de alta calidad del cuerpo humano. Para convertir esta demostracin de laboratorio en un sistema prctico y rentable, la tecnologa MRI necesita ser desarrollado, optimizado para inspeccin en lnea de frutas y verduras en las fbricas agrcolas.

Jos Blasco Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) Moncada, Espaa Jos Blasco era un analista de sistemas en IBM, Espaa, antes de unirse IVIA en 1996 y recibi su doctorado en Informtica por la Universidad Politcnica de Valencia en 2001. l se centra en la visin por computador para aplicaciones agrcolas, publicando ms de 20 artculos en revistas internacionales y contribuir a varias patentes.

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